Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56171

⸱

20 sierpnia 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Streszczenie

Pozyskiwanie mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) to proces, w którym z zarodków preimplantacyjnych tworzone są pluripotencjalne linie komórkowe. Linie te zachowują zdolność do samoodnawiania się lub różnicowania w określonych warunkach. Ze względu na te właściwości mESC są użytecznym narzędziem w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i badaniach inżynierii tkankowej. W artykule opisano prosty protokół uzyskiwania linii mESC o wysokiej skuteczności derywacji (60-80%) poprzez hodowlę blastocyst z permisywnych szczepów myszy na komórkach karmiących w określonym pożywce uzupełnionej czynnikiem hamującym białaczkę. Protokół może być również stosowany do skutecznego wyprowadzania linii mESC z niepermisywnych szczepów myszy, poprzez proste dodanie koktajlu dwóch małocząsteczkowych inhibitorów do pożywki pochodnej (pożywki 2i). Podano szczegółowe procedury dotyczące przygotowania i hodowli komórek żywicielskich, pobierania i hodowli zarodków myszy oraz wyprowadzania i hodowli linii mESC. Protokół ten nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzony w dowolnym laboratorium posiadającym podstawową wiedzę z zakresu hodowli komórek ssaków.

Wprowadzenie

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) to pluripotencjalne komórki pochodzące z embrionów preimplantacyjnych, które zachowują zdolność do samoodnawiania się lub różnicowania w określonych warunkach1. Opierając się na tych właściwościach, ESC stały się użytecznym narzędziem w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i badaniach inżynierii tkankowej2.

ESC zostały po raz pierwszy uzyskane z preimplantacyjnych zarodków myszy, dając początek mysim liniom ESC (mESC) o niskim sukcesie3,4. Przez lata skuteczność derywacji pozostawała niska ze względu na trudności w utrzymaniu pluripotencji in vitro. Oprócz obecności komórek zasilających5, które poprawiają efektywność wyprowadzania, promują przyłączanie się do kolonii i zwiększają stabilność kariotypową6, kilka modyfikacji protokołu prowadzi do poprawy utrzymania pluripotencji. Najważniejsze z nich to dodanie czynnika hamującego białaczkę (LIF) do pożywki hodowlanej mESC7,8, wykorzystanie zarodków z 129S2 permisive background9 oraz hodowla mESC z pożywką uzupełnioną zdefiniowaną surowicą, wolną od potencjalnych czynników różnicujących10. Niedawne przekonujące dowody wykazały, że dodanie koktajlu dwóch małocząsteczkowych modulatorów szlaków sygnałowych do pożywki hodowlanej mESC (znanej jako 2i) jest najlepsze dla utrzymania pluripotencji. Koktajl 2i składa się z połączenia inhibitora MEK PD0325901, który zmniejsza sygnały różnicowania poprzez hamowanie szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), oraz inhibitora GSK3β CHIR99021, który zwiększa przeżywalność komórek przy niskiej gęstości poprzez aktywację szlaku Wnt11.

W tym artykule opisujemy prosty protokół do efektywnego wyprowadzania linii mESC z blastocyst myszy. Postępujemy zgodnie ze standardowymi procedurami, hodując zarodki ze szczepów permisywnych na komórkach żywicielskich w pożywce pochodnej uzupełnionej LIF i zamiennikiem surowicy12. Zgodnie z tym protokołem, linie mESC mogą być wyprowadzane z wydajnością równoważną do tych uzyskiwanych w pożywce 2i. Mimo to, 2i można dodać, aby uniknąć ewentualnych problemów z utrzymaniem pluripotencji lub podczas pracy ze szczepami niedopuszczającymi plonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt opisanych w poniższych sekcjach zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach i Ludziach Universitat Autònoma de Barcelona oraz przez Departament d'Agricultura, Ramaderia, Pesca i Alimentació Generalitat de Catalunya (protokół #8741).

1. Inaktywacja i przechowywanie ogniw zasilających

UWAGA: Ludzkie fibroblasty napletka (HFF-1) zostały wcześniej zamrożone w 1 ml roztworu do zamrażania składającego się z 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywane w ciekłym azocie do momentu użycia.

  1. Rozmrozić kriogeniczną fiolkę HFF-1 (1 ml), zanurzając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Dodaj rozmrożoną zawartość fiolki kriogenicznej do wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionego 10% FBS, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10.
  3. Rozcieńczone komórki (10 ml) należy rozsiać w kolbie T75 i wyhodować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Następnego dnia zmień podłoże, aby wyeliminować resztki DMSO. Usuń pożywkę i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS.
  5. Hoduj HFF i zmieniaj pożywkę co 48 godzin, aż kultura osiągnie etap zlewania. Może to potrwać około 7 do 10 dni.
  6. Aby przygotować roztwór inaktywacyjny, należy rozcieńczyć mitomycynę C w DMEM uzupełnioną 10% FBS w końcowym stężeniu 10 μg/ml. Inkubować komórki z roztworem inaktywacyjnym przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Usuń roztwór inaktywacyjny i trzykrotnie przepłucz komórki 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby wyeliminować pozostałości mitomycyny C.
  8. Aby odłączyć inaktywowane komórki, dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby upewnić się, że są odłączone (obiektyw 10x z aperturą numeryczną 0,3 lub NA). Jeżeli tak nie jest, inkubować je jeszcze przez kilka minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Sprawdź komórki ponownie pod odwróconym mikroskopem.
  10. Odpipetować roztwór pipetą Pasteura w celu dysocjacji grudek komórek.
  11. Zneutralizować roztwór enzymatyczny, dodając 4 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS i zawiesić.
  12. Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórek i rozcieńczyć w HBSS w stosunku 1:100. Aby określić liczbę komórek, należy załadować 10 μl rozcieńczenia do komory Neubauera. Policz komórki znajdujące się w jednym z dużych kwadratów komory pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 20x z 0,45 NA).
    1. Powtórz liczenie w sumie w czterech dużych kwadratach. Oblicz całkowitą liczbę komórek (N) jako N = średnia liczba policzonych komórek x całkowita objętość x rozcieńczenie x 104.
  13. Resztę próbki odwirować przez 5 minut przy sile 200 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad roztworem zamrażającym o stężeniu10-6 komórek na ml.
  14. Podwielokrotność zawiesiny umieścić w fiolkach kriogenicznych po 10 6 komórek (1 ml) każda. Umieścić fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania i zamrażać w temperaturze -80 °C.
  15. Następnego dnia przechowuj fiolki kriogeniczne w ciekłym azocie.

2. Hodowla komórek karmiących

  1. Od jednego do czterech dni przed rozpoczęciem procesu wyprowadzania rozmrozić fiolkę kriogeniczną zawierającą 1 x 106 inaktywowanych komórek HFF-1 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  2. Rozcieńczyć rozmrożony HFF-1 w podgrzanym DMEM uzupełnionym 10% FBS i utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C.
  3. Napełnij każdą studzienkę 4-dołkowej płytki 500 μl wstępnie podgrzanej 0,2% żelatyny ze skóry świń i utrzymuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  4. Usunąć 500 μl żelatyny ze studzienek i dodać 500 μl rozcieńczenia HFF. Delikatnie kołysz płytą, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie HFF na dnie studzienek. Unikaj ruchów okrężnych, w przeciwnym razie komórki skoncentrują się w środku studni.
  5. Inkubować płytkę przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy inaktywowanych HFF w każdym dołku.
  6. Następnego dnia obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem (obiektyw 10X z 0,3 NA) i sprawdź, czy są przyczepione i równomiernie rozmieszczone. Zmień podłoże, aby wyeliminować resztki DMSO. Usuń pożywkę i dodaj 500 μl wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS.

3. Pobieranie i hodowla zarodków

  1. Cztery dni przed pobraniem zarodka należy podać 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy we wstrzyknięciu dootrzewnowym 6-12 tygodniowym samicom myszy.
    UWAGA: Użyliśmy samic ze szczepów 129S2 lub B6CFAF1, chociaż można użyć samic z innych szczepów myszy. Niemniej jednak, podczas pracy z samicami ze szczepów niepermisywnych (np. CBA), pożywkę należy uzupełnić o 2i, jak wspomniano w kroku 4.2.
  2. Po 48 godzinach podać 5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej we wstrzyknięciu dootrzewnowym i kojarzyć samice z samcami w wieku co najmniej 8 tygodni w stosunku 1:1. Następnego dnia oddziel samice od samców.
  3. Dzień przed pobraniem zarodków przygotuj szalkę Petriego o średnicy 35 mm z kilkoma 40 μl kropli pożywki KSOMaag uzupełnionej 4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i napełnij płytkę olejem mineralnym, aby całkowicie pokryć krople. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zrównoważenia pożywki.
  4. Aby przygotować pipety do manipulacji zarodkami, podgrzej cieńszą część szklanej pipety Pasteura z długą końcówką za pomocą palnika Bunsena. Gdy zmięknie, wyjmij go z płomienia i rozsuń oba końce. Przełam go na żądaną długość. Średnica wewnętrzna końcówki powinna wynosić 100-150 μm.
  5. Eutanazja samic myszy przez zwichnięcie szyjki macicy 45-48 godzin po stosunku (p.c.).
  6. Wypreparuj myszy, aby odsłonić jamę brzuszną, przecinając skórę zakrzywionymi, gładkimi, ostrymi nożyczkami, a otrzewną prostymi, ostrymi nożyczkami. Chwyć jedną macicę kleszczami, odetnij jajowód za pomocą prostych, ostrych nożyczek i umieść go w pożywce CZB buforowanej przez Hepes (HCZB)13 w temperaturze 37 °C. Powtórz proces, aby usunąć drugi jajowód.
  7. Przepłucz jajowody strzykawką o pojemności 1 ml wypełnioną HCZB, przytrzymywaną przez kleszcze zegarmistrzowskie, aby zebrać 2-komórkowe zarodki.
    UWAGA: Aby przygotować igłę do płukania, weź igłę podskórną o sile 30 G, odetnij koniec i zmielić na końcówkę na kamieniu ściernym.
  8. Za pomocą pipety doustnej pobrać zarodki, umyć je w HCZB i wyhodować w przygotowanym wcześniej naczyniu do hodowli zarodków w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do stadium blastocysty. W każdej kropli o pojemności 40 μl można wyhodować do 50 zarodków. Monitoruj rozwój zarodka co 24 godziny pod mikroskopem stereoskopowym.
    UWAGA: Alternatywnie zarodki można pobrać w stadium blastocysty w celu skrócenia hodowli zarodków in vitro. W takim przypadku należy poddać samice eutanazji w 3,5 - 4,5 p.c., wyciąć macicę. i przepłukać go HCZB.

4. Pochodzenie komórek macierzystych

  1. Przygotowanie płytek wyprowadzających
    1. W dniu wysiewu zarodków przygotuj pożywkę pochodną, uzupełniając pożywkę DMEM o 100 μM 2-β merkaptoetanolu, 1x aminokwasy endogenne, 20% zamiennika surowicy i 103 U/ml LIF.
    2. W razie potrzeby dodać również 1 μM inhibitora MEK PD0325901 i 3 μM inhibitora GSK3 CHIR99021 uzyskać pożywkę 2i.
    3. Pobrać z inkubatora płytkę 4-dołkową z monowarstwą inaktywowanych HFF (krok 2.6). Usunąć pożywkę i dodać 800 μl wstępnie podgrzanej pożywki pochodnej do każdej studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
  2. Usuwanie osłony przejrzystej i wysiew zarodków
    1. Przygotować szalkę Petriego o średnicy 35 mm z trzema 30 μl kropli kwaśnego roztworu Tyrode'a14 i trzema kroplami po 30 μl pożywki pochodnej. Przykryj krople olejem mineralnym i utrzymuj naczynie w temperaturze 37 °C.
    2. Wyjmij naczynie do hodowli zarodków z inkubatora. Jedna po drugiej, przenieś blastocysty z kropli hodowlanych do kropli kwaśnego roztworu Tyrode'a za pomocą pipety do manipulacji zarodkami. Jeśli to możliwe, wybierz tylko rozszerzone blastocysty, aby rozpocząć proces wyprowadzania.
    3. Monitorować trawienie osłonki przejrzystej pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy tylko osłonka przejrzysta zniknie, przenieś blastocystę do kropli pożywki pochodnej, aby wypłukać kwaśny roztwór Tyrode.
    4. Weź 4-dołkową płytkę wyprowadzającą z inkubatora i wysiewaj jedną blastocystę wolną od zony na komórkach zasilających w każdym dołku.
    5. Umieścić 4-dołkową płytkę wyprowadzającą z powrotem w inkubatorze i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Monitorowanie wzrostu komórek macierzystych i zmian pożywki
    1. Monitoruj kultury co 24 godziny pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 20X z 0,45 NA). Ważne jest, aby zwrócić uwagę, czy występują oznaki różnicowania komórek macierzystych, takie jak obrzęk komórek refrakcyjnych otaczających wyrostek lub nawet odsuwanie komórek żywicielskich na bok.
    2. Co drugi dzień zmieniaj medium kultury. Wyjąć płytkę 4-dołkową z inkubatora, usunąć pożywkę z każdej studzienki i dodać 800 μl wstępnie podgrzanej pożywki pochodnej uzupełnionej LIF i 2i, jeśli jest używane. Utrzymuj kulturę, aż zaobserwuje się wyrostki (6-8 dni).

5. Hodowla i utrzymanie komórek macierzystych

  1. Przygotuj uchwyty podobne do Kollegego i pipety do manipulacji komórkami macierzystymi. Wykonaj krok 3.4, aby przygotować pipety do manipulacji komórkami macierzystymi o średnicy wewnętrznej na końcówce 250-300 μm. Użyj drugiej części ciągniętej pipety Pasteura, aby przygotować uchwyt podobny do Kollegego. Podgrzej i uformuj do uzyskania haczyka.
  2. Wyjmij 4-dołkową płytkę hodowlaną z inkubatora i zlokalizuj wyrostek pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj uchwytu, aby odepchnąć zróżnicowane komórki i karmniki otaczające odrost.
    UWAGA: Aby uniknąć ewentualnego różnicowania wyrostka, ważne jest, aby usunąć wszystkie zróżnicowane komórki z krawędzi wyrostka.
  3. Odessać wyrostek za pomocą pipety do manipulacji komórkami macierzystymi i umieścić go w nowym naczyniu w kropli 50 μl trypsyny-EDTA.
  4. Użyj skalpela, aby przeciąć odrost na kilka części, aby zdezagregować go zarówno mechanicznie, jak i enzymatycznie.
  5. Od razu przenieś fragmenty wyrostka do świeżej kropli pożywki pochodnej, aby zneutralizować działanie trypsyny.
  6. Przenieś fragmenty wyrostka na nową 4-dołkową płytkę z monowarstwą podajników. Przenieść do 10 fragmentów na studzienkę i wyhodować je za pomocą pożywki pochodnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Utrzymuj hodowle podobne do komórek macierzystych przez co najmniej sześć tygodni, zanim rozważysz ustalenie linii mESC. Zmieniaj podłoże co drugi dzień i subkulturuj je raz w tygodniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Postępując zgodnie z tym protokołem, po pierwszym tygodniu hodowli powinno dojść do powstania przerostów w ponad 95% przypadków (Rysunek 1A). Ustanowienie linii mESC po sześciu pasażach jest zmienne pomiędzy powtórzeniami doświadczalnymi, przy średniej skuteczności na poziomie 60-80%. Dodatek 2i nie poprawia znacząco wyników w przypadku pracy z permissywnymi szczepami myszy, takimi jak te o tle 129S2, jest on jednak niezbędny przy pracy ze szczepami niepermis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż wyprowadzanie linii mESC jest dobrze znaną procedurą rutynowo stosowaną w wielu laboratoriach, jej skuteczność nie zawsze jest tak wysoka, jak oczekiwano, ze względu na wiele czynników, które mogą zakłócać utrzymanie pluripotencji. W niniejszym artykule pokazujemy krok po kroku, jak ustanowić linie mESC o wysokiej wydajności za pomocą prostego i niezawodnego protokołu. Sprawności te są podobne do tych podawanych w literaturze.

Aby zapewnić maksymalną wydajność, ważne jest, aby kontrol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Jonatanowi Lucasowi za pomoc techniczną przy hodowli komórek karmiących, Servei Estabulari de la UAB za opiekę nad zwierzętami i Domènec Martín za nagranie filmu. Prace te były wspierane przez Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R oraz Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC jest stypendystą PIF-UAB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml sryringeBD 
2-β-merkaptoetanolLife Technologies31350-010
Płytka 4-dołkowaThermo Scientific Nunc176740
Kwaśny roztwór tyrody Domowej robotyZobacz przepis w Nagy i in., 2003. W przypadku krótkotrwałego przechowywania (do 1 miesiąca) należy przechowywać w temperaturze 4ºC. Alternatywnie, w przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać go w temperaturze -20ºC. Jeśli wydajność roztworu maleje, należy go zakwasić przez dodanie niewielkiej kropli HCl 1M.
BSASigmaA3311
Kurczak anty-mysie IgG,sondy molekularne Alexa Fluor 488 - InvitrogenA-21200rozcieńczenie 1:500. Przeciwciało drugorzędowe dla mysich przeciwciał Oct4, Tuj1, αSMA i AFP. 
CHIR990212Axon Medchem 1386Rozpuścić w 2,15 ml DMSO na każdy mg proszku, aby otrzymać 1 mM roztwór podstawowy. Porcjować w żądanej objętości i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania. 
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810Dezaktywuj go przed użyciem przez ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 56&00C. Porcję i przechowuj w temperaturze -20º C
Igła do płukaniaBD 304000Odetnij koniec igły i zmielić na koniec na kamieniu ściernym
Żelatyna ze skóry wieprzowejFluka48724Rozcieńczyć 0,2% w wodzie destylowanej i autoklawować. Każde rozcieńczenie można stosować przez miesiąc.
Kozia anty-królicza IgG, sondy molekularne Alexa Fluor 594- InvitrogenA-11037rozcieńczenie 1:500. Przeciwciało drugorzędowe dla przeciwciała królika Sox2.
HBSSBioWestL0611
CZB  buforowany hepes;Domowej robotyZobacz kompozycję w Chatot i wsp., 1989
Ludzka gonadotropina kosmówkowaDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIRozcieńczyć w NaCl 0,9% przy 50 j.m./ml. Podwielokrotność podsycić w 1 ml i przechowywać w temperaturze -20º C przez okres do dwóch miesięcy. Po rozmrożeniu nie zamrażaj ponownie. 
Ludzkie fibroblasty napletkaATCCATCCSCRC-1041Do długotrwałego przechowywania zaleca się przechowywanie ich w ciekłym azocie.
Technologie zastępowania życia w surowicy KnockOut  10828-028Światłoczuły. Zaleca się porcjowanie go w małych objętościach, takich jak 10 ml, i przechowywanie w temperaturze -20º C (sprawdź datę ważności). Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.     
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050Suplement o działaniu 4 mg/ml BSA. Równowaga przy 37º C i 5% CO2 dziennie przed użyciem.
Czynnik hamujący białaczkęMerk MilliporeESG1106
myszy Charles River/HarlanZaleca się stosowanie myszy ze szczepu permisywnego pod względem pochodnego mESC (takiego jak 129S2 lub C57BL). Jednak szczepy wsobne są mniej wydajne w produkcji zarodków. Dlatego zaleca się stosowanie odmiany hybrydowej, takiej jak 129S2 x C57BL lub B6CBAF1, aby wykorzystać wigor hybrydy.
Olej mineralnySigmaM8410Testowany na zarodkach. Światłoczuły. 
Mitomycyna CServa2980501Rozpuść proszek w wodzie MilliQ w stężeniu 0,5 mg/ml. Przechowywać w 4º C chroniony przed światłem. Uwaga, jest szkodliwy i podejrzewa się, że powoduje raka.
Mysia antytubulina β III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500 rozcieńczenie
Mysz monoklonalna anty-&alfa;SMASigmaA52281:200 rozcieńczenie
Mysz monoklonalna anty-AFPR& D SystemsMAB1368rozcieńczenie 1:50
Mysz monoklonalna anty Oct3/4 Santa cruzSc-5279Rozcieńczenie 1:50
Aminokwasy endogenneLife Technologies11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408Rozpuścić w 2,08 ml DMSO na każdy mg proszku, aby otrzymać 1 mM roztwór podstawowy. Podwielokrotność porcjować w żądanej objętości i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
szalka Petriego (35mm)Thermo Scientific Nunc153066
szalka Petriego (60mm)Thermo Scientific Nunc150288
Gonadotropina surowicy ciężarnej klaczyFoligonFoligon-1000 UIRozcieńczyć w NaCl 0,9% przy 50 j.m./ml. Podajcie w 1 ml i przechowywać w temperaturze -20º C przez okres do dwóch miesięcy. Po rozmrożeniu nie zamrażaj ponownie. 
Królik poliklonalny anty-Sox2Merck MilliporeAB56031:200 rozcieńczenie
T75 falconThermo Scientific130190
Trypsyna-EDTA 10xBioWestX0930Rozcieńczyć 1:10 w HBSS w celu uzyskania 1x roztworu
309628

Bibliografia

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mysie embrionalne komórki macierzystehodowla zarodkówprzygotowanie komórek feederizolacja blastocystyczynnik hamujący białaczkęmedium 2iusuwanie błony przejrzystejsubkultura komórek macierzystychmarkery pluripotencjiróżnicowanie warstw zarodkowych
Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.