Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56174

⸱

6 listopada 2017

 ,  , 
1Program in Neuroscience, The College of Wooster, 2Department of Biology, The College of Wooster, 3Program in Biochemistry, Cellular, and Molecular Biology, The College of Wooster

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Streszczenie

Rozwój układu nerwowego obejmuje sekwencyjną serię zdarzeń, które są koordynowane przez kilka ścieżek sygnałowych i sieci regulacyjnych. Wiele białek zaangażowanych w te szlaki jest ewolucyjnie zachowanych między ssakami a innymi eukariontami, takimi jak muszka owocowa Drosophila melanogaster, co sugeruje, że podobne zasady organizacji istnieją podczas rozwoju tych organizmów. Co ważne, Drosophila jest szeroko wykorzystywana do identyfikacji mechanizmów komórkowych i molekularnych regulujących procesy wymagane u ssaków, w tym neurogenezę, różnicowanie, przewodnictwo aksonalne i synaptogenezę. Muchy były również z powodzeniem wykorzystywane do modelowania różnych chorób neurorozwojowych człowieka. Tutaj opisujemy protokół krok po kroku mikrodysekcji, utrwalenia i immunofluorescencyjnej lokalizacji białek w mózgu dorosłego Drosophila. Protokół ten koncentruje się na dwóch przykładowych populacjach neuronów, neuronach ciała grzyba i fotoreceptorach siatkówki, i obejmuje opcjonalne kroki do śledzenia pojedynczych neuronów ciała grzyba za pomocą analizy mozaikowej z techniką represyjnych markerów komórkowych (MARCM). Przykładowe dane zarówno z mózgów typu dzikiego, jak i zmutowanego są pokazane wraz z krótkim opisem kryteriów punktacji dla wad kierowania aksonami. Podczas gdy protokół ten podkreśla dwa dobrze ugruntowane przeciwciała do badania morfologii ciała grzyba i neuronów fotoreceptorowych, inne regiony mózgu Drosophila i lokalizacja białek w innych regionach mózgu mogą być również badane za pomocą tego protokołu.

Wprowadzenie

Chociaż układ nerwowy Drosophila jest mniejszy niż u ludzi i gryzoni, jego złożoność stanowi potężny, przystępny model do lepszego zrozumienia jego kręgowych odpowiedników. W wielu przypadkach genomy kręgowców i much kodują bardzo podobne białka, które dyktują mechanizmy rozwoju układu nerwowego. W rzeczywistości wiele genów wymaganych do rozwoju neuronów u kręgowców ma ortologi u much, w tym te zaangażowane w szlaki sygnałowe, które kontrolują wzorce, neurogenezę i przewodnictwo aksonalne1,2,3,4,5. Na przykład netryna jest ligandem wymaganym do prowadzenia aksonów u ssaków, a D. melanogaster6,7,8. Podczas gdy netyna została pierwotnie wyizolowana z embrionalnej tkanki mózgowej pisklęcia6, późniejsze badania wykazały, że netryna odgrywa zachowawczą rolę podczas rozwoju embrionalnego ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u Drosophila8. W innych badaniach wykorzystano genetyczne badania przesiewowe w embrionalnym ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila w celu zidentyfikowania konserwatywnych ligandów i receptorów wymaganych do znalezienia ścieżki zarówno u Drosophila, jak i kręgowców9.

Podczas gdy embrionalny ośrodkowy układ nerwowy muchy był szeroko stosowany w przeszłości do identyfikacji ligandów, receptorów i wewnątrzkomórkowych białek sygnalizacyjnych wymaganych do prowadzenia aksonów8,9, ostatnie prace zbadały sposoby, w jakie wiele z tych białek kontroluje również decyzje dotyczące odnajdywania ścieżki w późniejszych etapach rozwoju. W szczególności badania nad rozwojem neuronów fotoreceptorów grzyba (MB) i siatkówki (Rysunek 1) dostarczyły wglądu w mechanizmy kontrolujące odnajdywanie ścieżek, tworzenie synaps, przycinanie aksonów i kilka innych aspektów rozwoju neuronów10,11,12,13,14,15,16,17. Neurony fotoreceptorowe łączą siatkówkę muchy z obszarami mózgu dorosłego zwanymi blaszką i rdzeniem i mają kluczowe znaczenie dla przekazywania informacji wizualnych do mózgu (przejrzane przez18,19), podczas gdy neurony ciała grzyba są centralnie zlokalizowane w mózgu muchy i są niezbędne do uczenia się i pamięci20,21. Zarówno neurony fotoreceptorowe, jak i wewnętrzne neurony ciał grzybów, zwane komórkami Kenyona, wykorzystują ewolucyjnie zachowane rozproszone i zależne od kontaktu mechanizmy naprowadzania aksonów, aby znaleźć swoje postsynaptyczne cele. Oprócz tego, że są widoczne u dorosłych muszek, fotoreceptory i neurony MB mogą być również bezpośrednio wizualizowane u larw i poczwarek z przeciwciałami lub genami reporterowymi22,23,24,25. Możliwość łatwej wizualizacji tych dwóch zestawów neuronów w różnych punktach czasowych rozwoju promowała ich wykorzystanie jako doskonałych modeli dla wielu aspektów rozwoju neuronów.

Oprócz tego, że są używane jako model do zrozumienia mechanizmów prawidłowego rozwoju układu nerwowego, ostatnie badania wykazały, że muchy mogą również służyć jako dokładne modele wielu różnych chorób ludzkich, w tym Zespołu Łamliwego X (FXS)26, Niepełnosprawność intelektualna (ID)27,28,29,30,31, i inni32. Na przykład, aby zbadać funkcję molekularną genu ZC3H14, genu niedawno powiązanego z ludzką niepełnosprawnością intelektualną, stworzyliśmy model identyfikacji muchy przy użyciu allelu zerowego ortologu muchy ZC3H14, o nazwie Nab230. Muchy pozbawione Nab2 mają poważne zaburzenia pamięci i wydłużone ogony poli(A), podsumowując to, co obserwuje się u pacjentów lub linii komórkowych pochodzących od pacjentów33,34. Co ważne, muszki pozbawione Nab2 wykazują również poważne defekty morfologii mózgu w swoich dorosłych ciałach grzybów34, podobnie jak u muszek pozbawionych genu zespołu FXS, FMR135. W ten sposób muchy mogą służyć jako ważny organizm modelowy do badania zarówno normalnego rozwoju mózgu, jak i chorób, które go zakłócają.

Wreszcie, dostępność metod monitorowania zachowania o wysokiej przepustowości, w połączeniu z szerokim wachlarzem dostępnych narzędzi genetycznych, sprawiają, że Drosophila jest modelowym organizmem z wyboru do identyfikacji obszarów mózgu, które kontrolują złożone zachowania, takie jak uczenie się i pamięć, sen, zaloty, pragnienie i inne36,37,38,39. Jednym ze szczególnie przydatnych narzędzi, które znajduje się w centrum "skrzynki narzędzi" genetyka much, jest system GAL4/UAS (Rysunek 2). Ten system40,41 wykorzystuje specyficzną tkankowo ekspresję aktywatora transkrypcji Gal4 w celu zwiększenia ekspresji genów lub transgenów poniżej sekwencji aktywującej (UAS). Modyfikacje tego systemu pozwoliły naukowcom na przykład precyzyjnie kontrolować pobudliwość określonych neuronów42,43, nadekspresję lub powalenie określonych genów będących przedmiotem zainteresowania44,45, analizować dynamikę wapnia w czasie rzeczywistym in vivo46 i wyrażać geny reporterowe w celu oznaczenia linii neuronalnych41. Połączenie systemu GAL4/UAS z rekombinacją mitotyczną pozwoliło również na stworzenie systemu Analizy Mozaiki z Systemem Repressible Cell Marker (MARCM)12,47. MARCM jest szeroko stosowany w śledzeniu pojedynczych neuronów w celu identyfikacji komponentów sygnalizacji komórkowej wymaganych do prowadzenia aksonów12,47. Chociaż te i inne techniki dostarczyły wielu cennych informacji na temat mechanizmów komórkowych wymaganych do funkcjonowania układu nerwowego, większość z nich wymaga najpierw przeprowadzenia sekcji mózgu Drosophila; Konieczne jest staranne usunięcie mózgu, aby zachować prawidłową morfologię mózgu i wzorce połączeń między obszarami mózgu. Poniższy protokół wykorzystuje ciało grzyba i neurony fotoreceptorowe jako przykładowe populacje neuronów, prowadząc Cię przez sekcję i barwienie immunofluorescencyjne mózgów dorosłych Drosophila.

Protokół

1. Genetyka Drosophila melanogaster i opcjonalne procedury szoku cieplnego

  1. Po skrzyżowaniu much i wykluciu się potomstwa F1 należy uzyskać samice i/lub samce o odpowiednim genotypie. W zależności od badanego obszaru mózgu, muchy powinny być zbierane codziennie i rozdzielane według płci, aby łatwiej było odróżnić zależne od wieku i/lub dymorficzne płciowo wzorce połączeń mózgowych.
    UWAGA: Opcjonalnie: Jeśli muchy są wykorzystywane do analizy mozaiki z analizą represyjnych markerów komórkowych (MARCM)12,47, zarodki, larwy lub poczwarki powinny być poddawane szokowi termicznemu w temperaturze 37 °C przez 30 - 45 minut w celu wywołania rekombinacji mitotycznej. W celu ukierunkowania określonych regionów ciał grzybów do analizy MARCM, szok cieplny powinien być mierzony zgodnie z harmonogramem określonym przez12 i opisanym w Rysunek 5B. W przypadku stosowania MARCM do badania obszarów mózgu innych niż ciała grzybów, należy przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu określenia optymalnego etapu szoku cieplnego. Podczas gdy poniższe kroki są napisane w odniesieniu do zamkniętych much, dorosłe osobniki pharate można również wypreparować za pomocą tych kroków po usunięciu koperty poczwarki.

2. Przygotowanie stacji prosektoryjnej

  1. Umieść mikroskop stereoskopowy i źródło światła z dołączonymi światłowodami na gęsiej szyi na dużym blacie. Aby promować pewne ruchy dłoni i zmniejszyć "drgania" dłoni podczas sekcji, konieczne jest zapewnienie odpowiedniej przestrzeni do odpoczynku dłoni i podłokietników wokół mikroskopu. Upewnij się, że po obu stronach mikroskopu jest około 8 - 10 cali i 4 - 6 cali między podstawą mikroskopu a krawędzią stołu.
  2. Napełnij 2 lub 3 dołki szklanego naczynia 9- lub 3-dołkowego 1,0 ml buforu PTN (0,1 M bufor fosforanu sodu o pH 7,2, 0,1% niejonowy środek powierzchniowo czynny, patrz Tabela materiałów dla kompletnych składników buforowych) i umieść obok stacji preparacyjnej na lodzie. Nowo wypreparowane mózgi zostaną przeniesione do tego naczynia i przechowywane do etapu fiksacji.
    1. Uwaga: Jeśli wymagane jest obrazowanie na żywo, buforem do rozwarstwiania powinien być 1x bufor soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS) lub bufor HL348. Jeśli wymagana jest wewnątrzkomórkowa lokalizacja białka, PBS może być również stosowany jako alternatywny bufor do preparacji i utrwalania. Po utrwaleniu należy przeprowadzić przepuszczalność błon komórkowych za pomocą płukanek PTN zawierających 0,1% lub 0,3% detergentu niejonowego.
    2. Jeśli PBS jest używany do preparowania i utrwalania, końcówki pipet należy przepłukać co najmniej jeden raz buforem zawierającym detergent (takim jak PTN), aby zapobiec przywieraniu mózgu do plastikowych końcówek pipet podczas przenoszenia do probówek do mikrowirówek.
  3. Używając pustej szklanej lub plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm, zbuduj naczynie do rozwarstwiania zawierające elastomer silikonowy. Krótko wymieszaj składniki elastomeru zgodnie ze wskazówkami producenta, przelej do naczyń o średnicy 35 mm i pozostaw na noc do polimeryzacji na płaskiej powierzchni. Naczynia do preparowania zawierające elastomer powinny być używane do ochrony cienkich końcówek kleszczy preparacyjnych, które mogą łatwo ulec uszkodzeniu, jeśli dojdzie do kontaktu kleszczyków z twardszą powierzchnią, taką jak szklane naczynie. Regularnie kupujemy również dostępne na rynku naczynia pokryte silikonem w sklepach internetowych. Aby zwiększyć kontrast podczas sekcji, szczególnie przydatne są naczynia do rozwarstwiania z elastomeru silikonowego zawierające inaktywowany węgiel drzewny (a tym samym zabarwione na czarno).

3. Procedura sekcji mózgu dorosłego

  1. Znieczulić 3 - 5-dniowego dorosłego D. melanogaster za pomocą CO2 lub za pomocą lodu. Jeśli używasz lodu, umieść fiolkę zawierającą muchy do góry nogami (korkiem do dołu) w wiaderku z lodem na ~5 minut. Umieszczenie fiolki w lodzie do góry nogami zapobiega zagnieżdżaniu się much w żywności. Po znieczuleniu much umieść je na zimnej metalowej podkładce lub szalce Petriego, siedząc w lodzie lub na podkładce na muchy emitujące CO2. W przypadku preparacji mózgów w celu analizy neurodegeneracji można również użyć starszych much.
  2. Umieść niewielką ilość (150 - 200 μl) PTN na środku naczynia rozwarstwiającego za pomocą pipety transferowej lub pipety p200, aby utworzyć "pęcherzyk" PTN. Umieść naczynie preparacyjne pod mikroskopem stereoskopowym i wyreguluj oświetlenie i ostrość tak, aby pęcherzyk PTN wypełniał pole widzenia i był równomiernie oświetlony.
  3. Manipuluj muchami tak, aby były "brzuchem do góry" (tj. brzuszną stroną do góry) podczas leżenia na metalowej podkładce lub CO2 .
  4. Używając jednej pary kleszczy #5, chwyć odwłok muchy, która ma być wycięta i, trzymając muchę, całkowicie zanurz ją w PTN na naczyniu preparacyjnym.
    UWAGA: W pozostałej części protokołu wszystkie kroki należy wykonać, gdy głowica jest zanurzona w PTN.
  5. Używając drugiej pary kleszczy #5, chwyć podstawę trąbki muchowej i rozsuń dwie pary kleszczy, aby odłączyć głowę muchy od ciała. Odrzuć brzuch i klatkę piersiową. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby głowica nie została zwolniona i mogła unosić się na powierzchni PTN. Gdy głowa unosi się na wodzie, może być bardzo trudno ją ponownie chwycić bez zmiażdżenia mózgu.
    UWAGA: Za pomocą tej metody przerywane są połączenia między mózgiem a brzusznym rdzeniem nerwowym. Jeśli wymagane są nienaruszone połączenia między tymi regionami OUN, należy postępować zgodnie z alternatywnym protokołem sekcji, takim jak49,50. Jeśli trąba odczepi się od głowy muchy przed usunięciem głowy, w miejscu, w którym znajdowała się trąbka, pojawi się otwór. W takim przypadku chwyć głowę muchy na krawędzi otworu w pobliżu jednego oka. Następnie zdejmij głowę z umiarkowaną siłą, jednocześnie odciągając od siebie dwie pary kleszczy. Czasami, gdy głowa jest usuwana z ciała, jelito i/lub brzuszny rdzeń nerwowy pozostaje przyczepiony do głowy i powinien zostać usunięty przed kontynuowaniem sekcji.
  6. Podczas gdy jedna para kleszczy chwyta trąbkę, druga para powinna chwycić przyśrodkową krawędź prawego oka muchy. Powoli odsuń kleszcze od siebie. Ten krok powinien być wykonywany z niewielką ilością stałej siły bocznej. Gdy kleszcze powoli oddalają się od siebie, trąbka powinna odsunąć się od głowy i utworzyć centralny otwór w naskórku głowy. Wyrzuć trąbkę za pomocą pierwszej pary kleszczy, nie zwalniając przyśrodkowej części prawego oka z drugiej pary.
    Uwaga: Mózg dorosłego D. melanogaster znajduje się w ogonowym (tj. tylnym/tylnym) obszarze głowy muchy. Dlatego należy unikać chwytania tego obszaru głowy. Idealnie byłoby, gdyby kleszcze bezpośrednio chwytały tylko rostralną (tj. przednią) część głowy w pobliżu siatkówki przyśrodkowej. Mózg i związana z nim tchawica powinny być teraz widoczne przez centralny otwór w naskórku. W tym czasie wszelkie białe, żylaste nitki tchawicy wystające z otworu można usunąć i wyrzucić.
  7. Drugą parą kleszczy chwyć przyśrodkową krawędź lewej siatkówki (na krawędzi środkowego otworu w naskórku głowy). Aby usunąć siatkówki i związane z nimi naskórka, powoli odciągnij kleszcze od siebie pod kątem 180°. Gdy siatkówka oddziela się od leżącego poniżej płata wzrokowego, powinieneś odczuwać lekki spadek napięcia. Postępuj powoli, aby zapobiec rozerwaniu płata optycznego.
    UWAGA: Zbyt szybkie oddzielenie kleszczyków na tym etapie może spowodować rozerwanie płata wzrokowego lub rozerwanie struktur ciała grzyba. Czasami naskórek zostanie usunięty, ale kawałki siatkówki pozostaną przyczepione do płata wzrokowego. W przypadku obrazowania ciał grzybów nie jest całkowicie konieczne usunięcie całej siatkówki. Jednak analiza innych obszarów mózgu (takich jak unerwienie nerwów wzrokowych płatów mózgowych siatkówki) może wymagać całkowitego usunięcia siatkówki, zgodnie z opisem przez48,51.
    UWAGA: Ponieważ siatkówka jest powoli oddzielana od leżącego poniżej płata wzrokowego mózgu, płat wzrokowy powinien być widoczny jako nieprzezroczysta biała struktura pokryta białą, żylastą tchawicą. Po usunięciu jednej siatkówki można ją wyrzucić. Analizując odnajdywanie ścieżki neuronów siatkówki, należy zachować szczególną ostrożność na tym etapie, aby zapobiec uszkodzeniu płata wzrokowego. Dostępny jest również dodatkowy protokół skupiający się na preparowaniu i obrazowaniu na żywo neuronów fotoreceptorowych48.
  8. Teraz ostrożnie usuń jak najwięcej widocznej tchawicy. Tchawica może już zawierać lub później wypełnić się powietrzem, powodując unoszenie się mózgu i potencjalnie utratę podczas późniejszych etapów barwienia immunologicznego. Aby usunąć tchawicę, usuń ją z mózgu za pomocą bardzo ostrej pary kleszczy #5.
  9. Usuń pozostałą siatkówkę i otaczający naskórek, używając obu par kleszczy, aby chwycić przyśrodkowy obszar lewej siatkówki muchy. Ostrożnie rozerwij siatkówkę na pół, aby usunąć kawałki siatkówki i naskórka. W niektórych przypadkach usunięcie pozostałego naskórka bez zmiażdżenia mózgu okazuje się szczególnie trudne. W tych przypadkach stwierdziliśmy, że pozostałe pasma brzusznego rdzenia nerwowego można zamiast tego chwycić jedną parą kleszczy, podczas gdy druga para kleszczy służy do ostrożnego usunięcia ostatniej części naskórka.
  10. Za pomocą pipety p200 przenieś wypreparowane mózgi do jednego dołka 9- lub 3-dołkowego naczynia zawierającego PTN. Mózgi o tym samym genotypie powinny być zebrane razem w tej samej studni i trzymane na lodzie. Tkanka mózgowa powinna zostać utrwalona w ciągu godziny od sekcji. Mózgi mogą być ustalane w małych partiach i łączone, jeśli wymagana jest większa liczba mózgów. W większości przypadków doświadczony badacz może zwykle przeprowadzić sekcję mózgu i przenieść go do szklanego naczynia zbiorczego w ciągu około 3 - 5 minut.

4. Procedura utrwalania i barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Za pomocą pipety p200 przenieś wypreparowane mózgi z naczynia 9-dołkowego do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml wypełnionej 0,5 ml 4% paraformaldehydu rozcieńczonego w PTN. Co najmniej 10 - 15 mózgów o tym samym genotypie można połączyć w jednej probówce do mikrowirówki. Wszystkie pozostałe etapy (aż do zamontowania mózgów na szkiełkach) są zakończone w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
    UWAGA: Z paraformaldehydem (PFA) należy obchodzić się pod wyciągiem. Odpady PFA należy oszczędzać i odpowiednio utylizować. 20% paraformaldehydu zakupionego w szklanych ampułkach można rozdzielić do probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.
  2. Wewnątrz dygestorium inkubuj mózgi w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut, kołysząc się z wolną prędkością w temperaturze pokojowej.
  3. Po utrwaleniu pozwól mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówki pod wpływem grawitacji.
    Uwaga: Czasami mózgi mogą przykleić się do boku probówki do mikrowirówki. Jeśli tak się stanie, zwykle pomocne jest boczne obrócenie rurki między palcem wskazującym a kciukiem lub bardzo delikatne stuknięcie rurką o ławkę, aby ułatwić zapadanie się mózgu.
  4. Usunąć utrwalacz za pomocą pipety p1000 i wykonać dwa "szybkie" płukania 500 μl PTN, pozwalając mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówki między płukaniami. Podczas tych szybkich myć, gdy wszystkie mózgi osiądą grawitacyjnie na dnie probówki mikrowirówki, PTN można natychmiast wymienić na świeży bufor; Nie jest wymagany dodatkowy czas prania.
    UWAGA: Zazwyczaj pozostawienie dodatkowego bufora w probówce jest lepsze niż ryzyko usunięcia mózgu. Często wymagane jest dokładne zbadanie końcówki pipety, aby upewnić się, że żaden mózg nie został omyłkowo usunięty z rurki. Jeśli mózg został przypadkowo odpipetowany do końcówki, wlej je z powrotem do probówki mikrowirówki, poczekaj, aż mózgi się uspokoją, a następnie kontynuuj usuwanie pozostałego PTN.
  5. Po ostatnim szybkim myciu za pomocą pipety p1000 wykonaj trzy "długie" płukania: dodaj 500 μL PTN i myj przez 20 min w temperaturze pokojowej na kołysce/nutatorze. Wszystkie przyszłe "długie" prania powinny trwać 20 minut.
    UWAGA: Po tych praniach nieruchome mózgi można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w PTN.
  6. Usunąć ostatnie płukanie za pomocą pipety p1000 i inkubować mózgi na kołysce lub nutatorze w temperaturze pokojowej w 0,5 ml roztworu blokującego [PTN + 5% normalna surowica kozia (NGS)] przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Przeciwciała drugorzędowe kozy będą stosowane w kolejnych krokach protokołu. Jeśli zostaną użyte przeciwciała drugorzędowe innego gatunku, w roztworach blokujących i przeciwciał należy użyć normalnej surowicy tego gatunku (a nie NGS).
  7. Za pomocą pipety p1000 usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PTN (PTN + 5% NGS + rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe). W przypadku stosowania przeciwciała pierwszorzędowego po raz pierwszy, optymalne rozcieńczenie tego przeciwciała powinno być określone empirycznie.
    Uwaga: Do wizualizacji neuronów ciała grzyba zwykle stosuje się przeciwciała rozpoznające Fas2. Przeciwciała te są dostępne w Banku Hybrydoma Badań Rozwojowych (DSHB) jako przeciwciało 1D4 i należy je rozcieńczyć w stosunku 1:20 w PTN + 5% NGS.
    UWAGA: Do wizualizacji neuronów fotoreceptorowych zwykle stosuje się przeciwciała rozpoznające chaoptynę. Przeciwciała Chaoptin są dostępne w DSHB jako przeciwciało 24B10 i należy je rozcieńczyć w stosunku 1:20 w PTN + 5% NGS.
    UWAGA: Proces utrwalania zazwyczaj eliminuje fluorescencję z białka fluorescencyjnego, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP). Dlatego podczas stosowania MARCM do analizy przewodnictwa aksonalnego poszczególnych neuronów MB należy użyć przeciwciała rozpoznającego GFP.
  8. Inkubować mózgi w roztworze przeciwciał pierwotnych na rockerze/nutatorze przez 2 - 3 noce w temperaturze 4 °C.
  9. Po inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi pozwól mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówkowej, a następnie usuń roztwór przeciwciała pierwotnego.
  10. Za pomocą pipety p1000 wykonaj 2 "szybkie" płukania i 3 "długie" 20-minutowe płukania 0,5 ml PTN, jak opisano powyżej w krokach 4.4 i 4.5, ostrożnie pozwalając mózgom osiąść grawitacyjnie na dnie probówki mikrowirówki między każdym płukaniem.
  11. Inkubować mózgi przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z odpowiednimi fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi. Przeciwciała drugorzędowe rozcieńcza się zwykle w 0,5 ml PTN + 5% NGS w stężeniu 1:200,
    UWAGA: Po dodaniu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych, mózgi powinny być trzymane w ciemności do końca eksperymentu.
    UWAGA: W przypadku utrzymania resztkowej fluorescencji GFP, podczas wykonywania analizy MARCM zaleca się użycie przeciwciała drugorzędowego znakowanego fluoroforem o podobnych długościach fal wzbudzenia/emisji jak GFP (np. izotyocyjanian fluorosceiny (FITC) lub Alexa488).
  12. Po wtórnej inkubacji przeciwciał pozwól mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówki i usuń wtórny roztwór przeciwciała.
  13. Wykonaj 2 "szybkie" płukania i 3 "długie" 20-minutowe płukania 0,5 ml PTN, jak opisano powyżej w krokach 4.4 i 4.5, ostrożnie pozwalając mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówki między każdym myciem.
  14. Po trzecim "długim" 20-minutowym płukaniu użyj pipety p200, aby usunąć jak najwięcej buforu.
  15. Dodaj 75 μl fluorescencyjnego podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu do mózgu. Odpipetuj mózgi i umieść podłoże w końcówce pipety raz, aby wymieszać. Nie odwracaj probówki, ponieważ mózg może utknąć na nasadce lub bokach probówki do mikrowirówki.
    UWAGA: Po zawieszeniu mózgów w pożywce montażowej, probówki można zawinąć w folię aluminiową w celu spowolnienia schładzania fluoroforu i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. W razie potrzeby mózgi można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale najlepiej jak najszybciej zamontować je na szkiełkach.

5. Montaż mózgów dorosłych D. melanogaster na szkiełkach mikroskopowych i obrazowaniu

  1. Zbuduj zjeżdżalnię "mostową". Umieść dwa "podstawowe" szkiełka nakrywkowe w odległości około 1 cm od siebie na dodatnio naładowanym szkiełku. Upewnij się, że dodatnio naładowana strona zjeżdżalni jest skierowana do góry. Przyklej szkiełka nakrywkowe do szkiełka za pomocą lakieru do paznokci, jak pokazano na Rysunek 3A. Zwykle pomocne jest uszczelnienie trzech zewnętrznych krawędzi każdej szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby upewnić się, że nośniki montażowe nie przesiąkają pod tymi szkiełkami nakrywkowymi. Pozostaw lakier do paznokci do całkowitego wyschnięcia (10 - 15 min) przed kontynuacją.
  2. Umieścić szkiełko podstawowe pod mikroskopem stereoskopowym i odpipetować roztwór podłoża mocującego zawierający wypreparowane mózgi do przestrzeni między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Aby zapewnić większy kontrast, warto manewrować światłami na gęsiej szyi tak, aby były równoległe do blatu.
  3. Usuń dodatkowe media mocujące ze szkiełka za pomocą pipety, uważając, aby nie odpipetować mózgów z szkiełka.
  4. Odsuń dodatkowe nośniki montażowe. Pozwoli to na dokładniejsze ułożenie mózgów podczas następnego kroku.
  5. Używając kleszczy i mikroskopu stereoskopowego, ustaw mózgi na szkiełku w siatce z płatami czułków skierowanymi do góry.
  6. Umieść szkiełko nakrywkowe ("most") na mózgach (Rysunek 3A). Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka nakrywkowego mostka w miejscu, w którym stykają się z "podstawowymi" szkiełkami nakrywkowymi.
  7. Za pomocą pipety p200 powoli napełnij środkową wnękę pod mostkiem świeżymi mediami montażowymi (Rysunek 3B). Umieszczaj po jednej kropli na otwartej krawędzi środkowego szkiełka nakrywkowego i pozwól, aby nośnik montażowy przesunął się pod środkową szkiełko nakrywkowe. Kontynuuj, aż cała wnęka zostanie wypełniona nośnikiem montażowym, a następnie uszczelnij górę i dół przezroczystym lakierem do paznokci
    8. .
  8. Po wyschnięciu lakieru do paznokci natychmiast zobrazuj szkiełka lub przechowuj je w światłoszczelnym, szczelnym pudełku na szkiełka w temperaturze -20 °C.
  9. W ciągu tygodnia zobrazuj mózgi za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego z laserami wzbudzającymi i kostkami filtrującymi odpowiednimi dla wybranych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych. Obrazy Z-stack neuronów ciała grzyba są zwykle uzyskiwane przy użyciu obiektywów 20X lub 40X. Obrazowanie neuronów fotoreceptorowych siatkówki może wymagać większego powiększenia.

Wyniki

Opisana powyżej metoda umożliwia niezawodną i powtarzalną wizualizację niemal każdego obszaru mózgu dorosłej Drosophila . W niniejszej pracy skupiono się na ciałach grzybowych oraz neuronach fotoreceptorowych, jednak w innych badaniach wykorzystano podobne metody do wizualizacji obszarów mózgu takich jak pars intercerebralis52, neurony zegara biologicznego53,54 oraz neurony projekcyjne płata antenalnego5, spośród wielu innych. Co ważne, technikę tę można wykorzystać do wizualizacji zarówno całych struktur mózgu, jak i poszczególnych neuronów w obrębie tych struktur, stosując techniki takie jak MARCM12,47. Rysunek 4, Rysunek 5 oraz Rysunek 6 przedstawiają kilka różnych typów danych z ciał grzybowych i neuronów fotoreceptorowych w mózgach dorosłych osobników, które można uzyskać za pomocą tej techniki preparatyki i immunobarwienia.

W pierwszej kolejności opisaną powyżej metodę można wykorzystać do bezpośredniej wizualizacji morfologii ciała grzyboidalego, stosując przeciwciała rozpoznające fascykulinę 2 (Fas2) lub geny reporterowe eksprymowane w neuronach ciała grzyboidalnego34. Jak pokazano na Ryc. 4A oraz Ryc. 4B, przeciwciała Fas2 mogą służyć do wizualizacji płatów α, β oraz (w mniejszym stopniu) γ ciał grzyboidalnych w mózgach dorosłych osobników Drosophila . Fas2 jest białkiem adhezji komórkowej niezbędnym do wiązkowania neuronów i jest wysoce eksprymowane w płatach α i β23,56,57, co czyni go wiarygodnym i uznanym markerem tych neuronów ciała grzyboidalnego. Warto zauważyć, że za pomocą tego przeciwciała można również zwizualizować okrągłe ciało elipsoidalne zlokalizowane w centralnej części mózgu dorosłego owada (Ryc. 4A).

Defekty białek prowadzenia aksonów często powodują niepełną penetrację fenotypów mutantów ciał grzybowych15,34,35. Dlatego w większości przypadków należy obrazować i analizować kilkadziesiąt mózgów. Na przykład aksony płatów β ciał grzybowych u much z mutacją null Nab2 nieprawidłowo przekraczają linię środkową mózgu. Ten fenotyp „przekrzyżowania” lub „fuzji” płatów β jest zazwyczaj obserwowany u ~80% dorosłych much Nab2 null, natomiast występuje głównie w kontrolach typu dzikiego i może być klasyfikowany jako fuzja lekka, umiarkowana lub całkowita34. „Fuzja” płatów β w obrębie linii środkowej wynika z nieprawidłowej projekcji aksonów po stronie przeciwbieżnej do przeciwległej półkuli mózgu. Jak pokazano na Rysunku 4C i szczegółowo opisano w34,35, fuzja lekka odnosi się do płatów β połączonych „cienką wiązką włókien Fas2-dodatnich”, natomiast fuzja umiarkowana dotyczy płatów β połączonych w stopniu znacznym, wykazujących lekko zmniejszoną grubość płata w linii środkowej. Fuzja całkowita (lub „skrajna”) odnosi się do płatów β całkowicie połączonych, które nie wykazują zmniejszenia grubości płata ani barwienia Fas2 w linii środkowej. Zakres fuzji płatów β ciał grzybowych może być ilościowo określony i przedstawiony zgodnie z opisem w 34,35 lub w formie tabeli przedstawiającej odsetek mózgów z każdym typem defektu morfologicznego.

Oprócz barwienia przeciwciałami przeciwko Fas2, technikę MARCM12,47,48 można również wykorzystać do wizualizacji decyzji dotyczących prowadzenia aksonów pojedynczych neuronów GFP+ w obrębie płatów ciała grzybnowatego. MARCM wykorzystuje rekombinację mitotyczną podczas rozwoju w celu stworzenia pojedynczych neuronów lub klonalnie spokrewnionych grup neuronów znakowanych GFP (Rycina 5A). MARCM umożliwia wygenerowanie niewielkiej liczby neuronów, w których całkowicie brakuje danego białka, w organizmie muchy będącym w innym zakresie heterozygotycznym. Dzięki temu technika ta okazała się szczególnie użyteczna w analizie funkcji białek w prowadzeniu aksonów, które są jednocześnie niezbędne dla ogólnego przeżycia organizmu12,47. Homozygotyczne neurony null znakowane GFP można bezpośrednio porównać z neuronami kontrolnymi znakowanymi GFP w genetycznym tle typu dzikiego. Ponadto, w zależności od momentu poddania rozwijających się larw lub poczek ulegających szokowi termicznemu, można celować w różne klasy neuronów ciała grzybnowatego (Rycina 5B).

Przykład danych generowanych za pomocą tej techniki przedstawiono na Rysunku 5C, gdzie jako przykład wygenerowano klony MARCM typu dzikiego (tj. kontrolne). Aby wygenerować poszczególne neurony ciał grzybowych GFP+ pokazane na Rysunku 5C, rozwijające się larwy F1 początkowo przetrzymywano w temperaturze 25 °C. Około 5–6 dni po wykluciu larw (ALH), poczwarki poddano szokowi termicznemu przez 30 min w temperaturze 37 °C, a następnie przeniesiono z powrotem do 25 °C aż do eklozji. Po wykluciu osobników dorosłych mózgi wypreparowano w PTN, utrwalono i jednocześnie inkubowano z przeciwciałami rozpoznającymi Fas2 (1D4, rozcieńczonym 1:20 w PTN) oraz GFP (rozcieńczonym 1:50 w PTN). Następnie mózgi inkubowano z przeciwciałami wtórnymi i montowano na szkiełkach zgodnie z powyższym opisem. Komórki GFP+ zidentyfikowano i obrazowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego, a projekcje maksymalnej intensywności utworzono za pomocą programu ImageJ. Jak pokazano na Rysunku 5C, kontrolne neurony GFP+ wygenerowane w płatach α i β kolokalizują z Fas2 i kończą się przed kontaktem z linią środkową oddzielającą obie półkule mózgu Drosophila. Pojedynczy akson biegnie w kierunku przednim, rozwidla się, a następnie biegnie grzbietowo i przyśrodkowo, tworząc płaty α i β. W kilku poprzednich badaniach zastosowano tę technikę, aby sprawdzić, czy określone białka są wymagane do autonomicznego badania podziału komórek w wielu aspektach aksonogenezy, w tym w zakresie wydłużania, wyznaczania drogi, rozgałęziania i/lub przycinania10,1,12,13,14,15,16,17,34.

Oprócz ciał grzybowatych, decyzje dotyczące prowadzenia aksonów neuronów fotoreceptorowych siatkówki (komórki R) można również zwizualizować za pomocą opisanej powyżej metody sekcji (podobnie jak za pomocą metody sekcji opisanej w odniesieniu48). Każdy ommatidium w oku muchy zawiera 8 neuronów fotoreceptorowych, które można podzielić na trzy grupy (Rysunek 1): komórki R1-R6, których aksony kierują się do powierzchownej warstwy lamina płata optycznego mózgu; komórki R7, których aksony kierują się do głębszej warstwy M6 meduli; oraz komórki R8, których aksony kierują się do pośredniej warstwy M3 meduli19,58. Wzór projekcji każdej klasy fotoreceptorów był intensywnie badany, a neurony te wspólnie z sukcesem wykorzystano jako model do zrozumienia szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w prowadzenie aksonów19,59. Co ważne, wszystkie aksony fotoreceptorów można łatwo zwizualizować w preparatach mózgów Drosophila poprzez immunostaining tkanek dorosłych, poczwarek lub larw przy użyciu przeciwciała rozpoznającego chaoptynę, glikoproteinę powierzchni komórkowej24,60,61. Skonstruowano również geny reporterowe wykazujące ekspresję GFP lub β-galaktozydazy w każdym typie komórki R (komórki R1-R6, R7 i R8), które mogą być użyte do wizualizacji każdej klasy fotoreceptorów62. Ponieważ każdy typ komórki R kończy się w innej warstwie rozwijającego się płata optycznego, reportery te pozwoliły na szczegółowe porównanie szlaków sygnalizacyjnych niezbędnych, aby każdy typ komórki poprawnie odnalazł swój cel. Przykład wzorców ekspresji wytworzonych przez dwa z tych genów reporterowych w połączeniu z lokalizacją chaoptyny (która może służyć jako marker wszystkich neuronów fotoreceptorowych) pokazano na Rysunku 6. Aby zwizualizować fotoreceptory R7, wypreparowano mózgi zawierające specyficzny dla R7 gen reporterowy Rhodopsin4-LacZ i zabarwiono je przeciwciałami przeciwko chaoptynie i β-galaktozydazie. Rhodopsin 4 (Rh4) jest specyficznie wyrażany w podgrupie komórek R763; zatem promotor Rh4 może być użyty do sterowania ekspresją genu reporterowego tylko w tych komórkach. Jak oczekiwano, komórki R7 kończą się w głębszej warstwie M6 meduli (oznaczonej żółtą przerywaną linią na Rysunku 6). Podobnie, mózgi wykazujące ekspresję β-galaktozydazy z promotora Rhodopsin 6 (Rh6), który jest specyficznie wyrażany w fotoreceptorach R863, zostały wypreparowane i poddane immunostainingu przy użyciu przeciwciał rozpoznających chaoptynę i β-galaktozydazę. Jak pokazano na Rysunku 6, fotoreceptory R8 kończyły się w warstwie R3 meduli. Choć tutaj nie pokazano, Rh1-LacZ może być również użyty do wizualizacji zakończeń fotoreceptorów R1-R6 w lamina.

Schemat neuroanatomiczny z zaznaczeniem płata wzrokowego, neuronów siatkówkowych i ciała grzybowego; skupienie na drogach wzrokowych.
Rysunek 1: Osobnik dorosły Drosophila melanogaster mózg składa się z funkcjonalnie odrębnych, lecz wzajemnie połączonych obszarów. (A) Schemat dorosłego osobnika D. melanogaster przedstawiono mózg, z zaznaczonymi centralnie ciałami grzybowymi oraz obwodowymi neuronami fotoreceptorami siatkówki. (B) Powiększony schemat wiązek aksonów ciał grzybowych (nazywanych również płatami) u dorosłego osobnika, rozpoznawanych przez przeciwciała Fas2. Neurony wewnętrzne ciał grzybowych, zwane komórkami Kenyon, wysyłają aksony w kierunku przednim z położonych grzbietowo ciał komórkowych (ciała komórkowe pominięte na tym schemacie) i tworzą wyraźne struktury płatów. W mózgu dorosłego osobnika płaty γ (zaznaczone na czerwono) powstają z pojedynczej przyśrodkowej wiązki aksonów, natomiast grzbietowe płaty α i przyśrodkowe płaty β (zaznaczone na niebiesko) powstają z pojedynczego aksonu, który ulega bifurkacji podczas procesu wyznaczania drogi wzrostu. Neurony α'/β' rozwijają płaty aksonalne, które częściowo pokrywają się z płatami neuronów α/β, lecz nie są one rozpoznawane przez przeciwciała Fas2 i zostały pominięte na tym schemacie. (CNeurony siatkówki odgrywają kluczową rolę w przekazywaniu informacji wizualnych z siatkówki do płata optycznego. Aksony odchodzą od ciał komórkowych zlokalizowanych w siatkówce (kolor beżowy) i tworzą połączenia z postsynaptycznymi komórkami docelowymi w lamina lub medulla. Fotoreceptory R1-R6 (zaznaczone na czerwono) tworzą specyficzne połączenia z komórkami w zewnętrznej warstwie płata optycznego, zwanej lamina. Fotoreceptory R7 (kolor żółty) synapsują z komórkami docelowymi w warstwie M6 medulla, natomiast komórki R8 (zaznaczone na zielono) kierują aksony do nieco bardziej powierzchownej warstwy M3 medulla. Część C zaadaptowano za zgodą Macmillan Publishers Ltd: Nature Neuroscience (referencja64, prawa autorskie (201)). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ekspresja genów u muszek; system GAL4/UAS; schemat genetyczny; interakcja enhancera i UAS.
Rysunek 2: System GAL4/UAS może być wykorzystywany do ukierunkowanej ekspresji genów. Aby uzyskać muchy wykazujące ekspresję interesującego genu („Gen X”) w specyficznym wzorcu tkankowym, muchy muszą posiadać zarówno transgen wykazujący ekspresję białka aktywatora transkrypcji Gal4 pod kontrolą specyficznego dla danej tkanki enhancera, jak i transgen zawierający sekwencję wiążącą Gal4 (zwaną sekwencją aktywującą upstream lub UAS) sąsiadującą z Genem X. Zazwyczaj taką kombinację uzyskuje się poprzez krzyżowanie much rodzicielskich, z których każda posiada jeden transgen, a następnie selekcjonując potomstwo F11 potomstwo zawierające oba te elementy. W powstałej generacji F1 generacji, Gal4 zostanie wyekspresowany i zwiąże się z UAS, aby aktywować transkrypcję genu X w sposób tkankowo specyficzny. Co istotne, różne transgeny zawierające UAS można stosować w kombinacji z tym samym GAL4 „driver”. Na przykład transgen wykazujący ekspresję Gal4 w ciałach grzybowych (MBs) może zostać połączony z transgenem zawierającym sekwencję UAS w celu ekspresji GFP, transgenem wyciszającym ekspresję interesującego genu za pomocą interferencji RNA lub transgenem UAS kodującym reporter. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przygotowania preparatu na szkiełku przedmiotowym, szkiełka zakrywające typu „mostek” i „podstawa”, aplikacja Vectashield.
Rysunek 3: Montaż mózgów w przygotowaniu do obrazowania immunofluorescencyjnego. (AMózgi montuje się na szkiełkach SuperFrost Plus z wykorzystaniem przykrywki mostkowej, aby zapobiec ich spłaszczeniu. Dwie „bazowe” szkiełka nakrywkowe przytwierdza się do naładowanego dodatnio szkiełka SuperFrost Plus za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci, a następnie między nie umieszcza się wypreparowane mózgi. Nad mózgami kładzie się bezbarwną przykrywkę „mostkową” i przytwierdza ją do szkiełek nakrywkowych bazy.BPo wyschnięciu lakieru do paznokci, pod mostek powoli nanosi się pipetą preparat Vectashield w celu zachowania fluorescencji przeciwciała wtórnego. Następnie za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci uszczelnia się górną i dolną krawędź szkiełka nakrywki tworzącego „mostek”. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy projekcyjne struktury mózgu przedstawiające etapy fuzji płatów; mikroskopia, analiza anatomii neuronalnej.
Rycina 4: Aksony ciał grzybowych można wyraźnie zwizualizować przy użyciu przeciwciał rozpoznających Fas2. (A) Osoba dorosła Muszka owocówka Mózgi zostały wypreparowane, utrwalone i inkubowane z przeciwciałami rozpoznającymi Fas2. Przeciwciała pierwotne wyznakowano za pomocą wtórnych przeciwciał kozich anty-mysich sprzężonych z Alexa48, a następnie mózgi zamontowano na szkiełkach dodatnio naładowanych i obrazowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego. Symetrycznie rozmieszczone ciała komórek ciał grzybowych wysyłają aksony w kierunku przednim, gdzie ulegają one rozwidleniu i tworzą pęki aksonalne (zwane również płatami). Aksony tworzące skierowane grzbietowo płaty α oraz skierowane przyśrodkowo płaty β wykazują ekspresję Fas2. Co istotne, płaty β u much dzikich kończą się przed linią środkową mózgu. Centralnie położone ciało elipsoidalne można również zwizualizować przy użyciu przeciwciała 1D4.B) wewnątrzstronnie skierowane aksony płata γ u osobników dorosłych Muszka owocówka ciała grzybczaste również wykazują ekspresję Fas2 i mogą być wizualizowane przy użyciu przeciwciała 1D4. Zazwyczaj ekspresja Fas2 w aksonach płata $\gamma$ jest mniejsza niż w płatach $\alpha$ i $\beta$.C) Aksony ciał grzybowych w mózgach mutantów Nab2-null (genotyp: Nab2ćwiczenie 3/Nab2ex3) błędnie rzutują się przeciwstronnie i często nie wykazują obecności płatów. Mózgi osobników z wyłączonym genem Nab2 (Nab2-null) poddano dysekcji, utrwaleniu i barwieniu przeciwciałem 1D4 w celu wizualizacji płatów $\alpha, \beta$ i $\gamma$ ciała grzybowatego. Przedstawiono projekcje Z-stack o maksymalnej intensywności, a także pojedyncze przekroje optyczne skupione na obszarze linii środkowej. Podczas gdy aksony płata $\beta$ ciała grzybowatego u osobników typu dzikiego rzadko przekraczają linię środkową mózgu, w mózgach osobników Nab2-null występuje zróżnicowany stopień błędnego rzutowania przez linię środkową do przeciwległej półkuli mózgu, co prowadzi do powstania „zlewonych” płatów $\beta$. Zgodnie z definicjami w literaturze przedmiotu34,35, łagodne zlanie odnosi się do 34za zgodą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces edycji genów w neuronach; schemat i tabela okresów szoku termicznego; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 5Metoda MARCM może być wykorzystana do wizualizacji aksonów pojedynczych neuronów. (A) Analiza mozaikowa z represyjnym markerem komórkowym (MARCM) wykorzystuje rekombinację mitotyczną zapośredniczoną przez rekombinazę FLP w miejscach FRT w celu stworzenia dwóch odrębnych komórek potomnych. W tym przykładzie wszystkie komórki zawierają białko GAL4 specyficzne dla ciał grzybowych na oddzielnym chromosomie. W wyniku rekombinacji mitotycznej podczas podziału komórki jedna komórka potomna (górna) wykazuje ekspresję GFP (lub związanej z błoną białka CD8-GFP) i zawiera dwa allele mutanta badanego genu, podczas gdy druga komórka potomna (dolna) dziedziczy dwa allele typu dzikiego (WT) oraz transgen wykazujący ekspresję białka Gal80 przy użyciu promotora tubuliny. Gal80 hamuje Gal4, zatem wszystkie komórki produkujące Gal80 będą niefluorescencyjne i powinny być albo heterozygotyczne, albo homozygotyczne pod względem typu dzikiego. Tylko te komórki, które są GFP+ będzie zawierać dwie kopie allelu zmutowanego. Należy zauważyć, że jest to tylko jedna z kilku metod generowania GFP+ przedstawiono komórki, które zawierają również dwa allele mutanty genu będącego przedmiotem zainteresowania; prosimy przejrzeć12,45,56 dla innych przykładów. (BPonieważ rozwój neuronów ciał grzybkowatych rozpoczyna się od neuronów $\gamma$, następnie $\alpha'/\beta'$, a kończy na neuronach $\alpha/\beta$, każdą klasę neuronów można selektywnie celować i wizualizować poprzez szok termiczny w różnych punktach czasowych rozwoju. Jak opisano w 12, 40-minutowy szok termiczny w temperaturze 37 °C który następuje ≤2,5 dnia po wykluciu się larw (ALH), będzie celować specyficznie w neurony γ, podczas gdy szok termiczny występujący 3,5–4,5 dnia ALH (w późnym stadium larwalnym L3) będzie celować w neurony α'/β', a szok termiczny występujący między 5. a 7. dniem ALH (podczas rozwoju poczwarki) będzie celować w neurony α/β.C) Pojedyncze aksony typu dzikiego wizualizowano za pomocą metody MARCM. Poczwarki typu dzikiego w wieku ok. 5–6 dni (genotyp: hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT82B, UAS-CD8-GFP/FRT82B, tub>Gal80; OK107-GAL4/+) poddano szokowi termicznemu w temperaturze 37 °C przez 40 min w celu indukcji rekombinacji mitotycznej. Mózgi wypreparowano, utrwalono i barwiono przeciwciałami rozpoznającymi GFP (1:50) oraz Fas2 (1:20). Następnie mózgi inkubowano z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi i wizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. W tym przykładzie dane z genotypu „kontrolnego” wskazują, że komórki GFP-dodatnie wygenerowane przy użyciu MARCM są typu dzikiego i zamiast zawierać dwa genymut allele, zawierają dwa genyWT allele. Płaty β ciała grzyb狀owatego (zobrazowane przy użyciu przeciwciał rozpoznających Fas2) kończą się przed osią środkową mózgu; obecne są również neurony płata α. Aby przedstawić szczegóły, w dolnym rzędzie obrazów pokazano powiększony widok pojedynczej półkuli mózgu. Część C została opracowana za zgodą z literatury.34. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza porównawcza aktywacji fotoreceptorów komórek R7 i R8, β-galaktozydaza, chaoptyna, schemat.
Rysunek 6Można również zwizualizować aksony fotoreceptorów. Mózgi osobników dorosłych wykazujące ekspresję β-galaktozydazy w fotoreceptorach R7 (po lewej, przy użyciu Rh4-LacZ) lub fotoreceptory R8 (po prawej, używając Rh6-LacZ) zostały wypreparowane, utrwalone i inkubowane z przeciwciałami rozpoznającymi β-galaktozydazę lub chaoptinę. Mózgi poddano następnie inkubacji z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi i wizualizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Przedstawiono pojedyncze przekroje optyczne z każdego mózgu. Po lewej stronie widoczne są aksony kilku fotoreceptorów R7 (strzałki), które kończą się w głębszej warstwie M6 meduli (oznaczonej żółtą linią przerywaną). Po prawej stronie aksony fotoreceptorów R8 (strzałki) kończą się w zewnętrznej warstwie M3 meduli (oznaczonej zieloną linią przerywaną). Ponieważ fotoreceptory R7 wykazują ekspresję albo Rh3, albo Rh4, a fotoreceptory R8 wykazują ekspresję albo Rh5, albo Rh663, wszystkie fotoreceptory R7 lub R8 nie mogą być uwidocznione przy użyciu pojedynczego LacZ gen reporterowy. Paski skali = 10 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisana powyżej metoda preparacji i wizualizacji może być stosowana w szerokiej gamie zastosowań związanych z barwieniem immunologicznym i obrazowaniem na żywo. Nakreśliliśmy ogólny protokół barwienia immunologicznego i podkreśliliśmy jeden ze sposobów, w jaki MARCM może być wykorzystany do wizualizacji morfologii aksonalnej poszczególnych neuronów ciała grzyba. Ponadto te ogólne procedury mogą być również stosowane do obrazowania innych obszarów mózgu w stałych lub świeżo wypreparowanych mózgach dorosłych48,65. Obrazowanie na żywo może zapewnić bardziej efektywne podejście podczas analizy wzorców ekspresji pułapek wzmacniających, genów reporterowych lub linii MiMIC66, na przykład. Aby zapobiec wychwytywaniu artefaktów wynikających ze śmierci komórki podczas obrazowania na żywo GFP w nieutrwalonej tkance, mózgi należy wypreparować w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub pożywce HL348, zamontować na szkiełkach podstawowych w 1x PBS (lub HL3) i zobrazować w mniej niż 15 - 20 minut. Należy również zadbać o to, aby usunąć jak najwięcej tchawicy z wypreparowanego mózgu przed obrazowaniem, ponieważ może to zakłócać wizualizację fluorescencji GFP.

Podczas gdy warunki barwienia do oceny morfologii ciała grzyba i neuronów fotoreceptorowych są stosunkowo dobrze ustalone 24,61,67, lokalizacja określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania w tych typach komórek może wymagać rozległego rozwiązywania problemów i optymalizacji. W szczególności należy zoptymalizować kilka krytycznych etapów, w tym rozcieńczanie przeciwciał, blokowanie stężenia składnika buforowego i utrwalanie, aby uzyskać najbardziej powtarzalne i wiarygodne wyniki. W pierwszej kolejności należy określić optymalne stężenie przeciwciała pierwszorzędowego. Chociaż dostępne na rynku przeciwciała często mają sugerowane rozcieńczenie (i często początkowo zaczynamy od tego stężenia), wartości te rzadko są określane empirycznie na tkankach Drosophila. W związku z tym testowanie serii rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych, które wahają się powyżej i poniżej początkowej sugestii producenta, często skutkuje bardziej specyficznym barwieniem. Podczas gdy rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych może mieć znaczący wpływ na dokładność barwienia i powinno być precyzyjnie określone, czas inkubacji mózgów w roztworach zawierających przeciwciała pierwszorzędowe może się znacznie różnić przy niewielkim wpływie na ogólny wynik. Na przykład, zaobserwowaliśmy podobne wyniki podczas inkubacji wypreparowanych mózgów z pierwotnym przeciwciałem Fas2 przez dwa, trzy, a nawet cztery dni w temperaturze 4 °C. Chociaż zalecamy co najmniej dwie noce, inkubowaliśmy również mózgi w roztworze przeciwciał pierwotnych przez jedną noc i uzyskaliśmy powtarzalne barwienie. Co ważne, ograniczenie czasu inkubacji mózgu w przeciwciałie drugorzędowym do 3 godzin w temperaturze pokojowej (lub jednej nocy w temperaturze 4 °C) pomaga ograniczyć nieswoiste wiązanie przeciwciał drugorzędowych z tkanką mózgową.

Po drugie, może być konieczne użycie dodatkowych odczynników "blokujących" w celu wyeliminowania niepożądanego sygnału tła. Opcje obejmują zwiększenie stężenia NGS do ~10%, dodanie 1 - 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do roztworów przeciwciał blokujących i pierwszorzędowych/drugorzędowych lub wstępną adsorpcję przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C z zarodkami Drosophila (patrz odniesienie68, sekcja 2.9, krok 3).

Chociaż napisaliśmy powyższy protokół, używając PTN jako sugerowanego bufora dla wszystkich etapów fiksacji, płukania i inkubacji przeciwciał, utrwalenie tkanek w innych (takich jak PLP i PEM, wymienione w tabeli materiałów) może skutkować głębokimi różnicami w sile sygnału. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że cyklina E jest niewykrywalna w krążkach wyobrażonych larw, gdy tkanki są utrwalone w tradycyjnym 4% paraformaldehydzie rozcieńczonym w PBS, ale jest wyraźnie widoczna, gdy tkanki są utrwalone w buforze PLP (Ken Moberg, komunikacja osobista i odniesienie69). Oprócz zmian w składnikach buforowych, zmiana czasu i temperatury utrwalenia tkanki może również znacząco wpłynąć na barwienie immunofluorescencyjne i w razie potrzeby można je określić empirycznie. Ogólnie rzecz biorąc, czas wiązania powinien być wystarczająco długi, aby umożliwić wystarczające usieciowanie składników komórkowych i długotrwałe utrzymanie ogólnej morfologii komórek, a jednocześnie być wystarczająco ograniczony, aby zapobiec nadmiernemu sieciowaniu i "zakopywaniu" epitopów białkowych. Dlatego, początkowo optymalizując warunki barwienia dla nowo nabytego przeciwciała pierwotnego, zwykle ograniczamy czas wiązania do około 20 minut i często utrwalamy tkanki w niższych temperaturach.

W każdym eksperymencie immunofluorescencyjnym należy uwzględnić kilka kontroli w celu zbadania swoistości przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, a także wpływu transgenów/tła genetycznego na obserwowany fenotyp. Aby upewnić się, czy stosowane przeciwciało pierwszorzędowe specyficznie rozpoznaje białko będące przedmiotem zainteresowania, tkanki pochodzące od much pozbawionych tego białka i/lub tkanki z nadekspresją białka powinny zostać włączone jako kontrole. Dodanie nadmiaru oczyszczonego białka antygenowego może być również uwzględnione w celu określenia, czy pierwotne przeciwciało rozpoznaje inne epitopy w mózgu muchy. Wreszcie, każdy sygnał fluorescencyjny obecny, gdy pominięte przeciwciała pierwszorzędowe są pominięte, reprezentuje poziom niespecyficznego wiązania przez wybrane przeciwciała drugorzędowe.

Należy również uwzględnić kilka ważnych kontroli w celu oceny wpływu tła genetycznego lub obecności transgenów na intensywność barwienia lub morfologię neuronów. Na przykład, muchy użyte w eksperymencie MARCM na rysunku 5 zawierają wiele transgenów (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Tub>GAL80 i OK107-GAL4), z których każdy powinien być analizowany oddzielnie pod kątem wpływu na morfologię ciała grzyba. Jako bardzo ważne jest, aby przeanalizować morfologię ciała grzyba muszek zawierających zarówno OK107-GAL4, jak i UAS-CD8-GFP. Konieczna może być również ocena wpływu szoku cieplnego i produkcji rekombinazy Flp na rozwój ciała grzyba poprzez analizę much zawierających zarówno hsFLP, jak i FRT82B. Chociaż MARCM może dostarczyć istotnych informacji na temat tego, czy dane białko autonomicznie kontroluje prowadzenie aksonów, liczba kontroli wymaganych do dokładnego wyciągnięcia tego wniosku może być niewielkim ograniczeniem tej techniki. W mniej skomplikowanych eksperymentach stosuje się również podobne kontrole. Weźmy na przykład eksperyment, w którym system GAL4/UAS jest używany w połączeniu z transgenem RNAi w celu obniżenia ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania we wszystkich neuronach. W tym eksperymencie obecne będą co najmniej dwa transgeny: panneuronalny sterownik GAL4, taki jak elav-GAL4, oraz transgen UAS-RNAi . Morfologia neuronów ciała grzyba u muszek zawierających każdy z tych transgenów osobno powinna być badana jako dodatek do warunków doświadczalnych, w których muchy są nosicielami obu transgenów w tej samej muszce.

Wreszcie, aby ustalić, czy białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji w neuronach ciała grzyba, zwykle konieczne jest współbarwienie mózgów przeciwciałami przeciwko Fas2. Alternatywnie, białka fluorescencyjne, takie jak GFP, RFP lub CD8-GFP związane z błoną, mogą być również wyrażane za pomocą systemu GAL4/UAS i stosowane w połączeniu z przeciwciałami rozpoznającymi białko będące przedmiotem zainteresowania. Ponieważ Fas2 rozpoznaje tylko fascykulowane aksony, które tworzą α ciała grzyba i β płaty, zastosowanie napędzanego przez GAL4, związanego z błoną CD8-GFP było szczególnie przydatne do oznaczania neuronów ciała grzyba.

Wady w prowadzeniu aksonów często nie są w 100% przenikliwe i nawet mózgi o tym samym genotypie mogą wykazywać pewną zmienność. Dlatego, analizując nowo wygenerowane zmutowane allele pod kątem defektów w ciele grzyba lub znajdowania ścieżki fotoreceptorów, należy zastosować kombinację różnych alleli i podejść. W większości badań w literaturze stosuje się kilka różnych podejść w celu zbadania, czy białko odgrywa autonomiczną rolę komórki w kontrolowaniu przewodnictwa aksonalnego: i) analiza wad odnajdywania ścieżki u homozygotycznych muszek zerowych (najlepiej przy użyciu różnych alleli zerowych), ii) analiza wad odnajdywania ścieżki u muszek, w których brakuje białka będącego przedmiotem zainteresowania tylko w neuronach (zwykle za pośrednictwem RNAi), iii) analiza MARCM wad odnajdywania ścieżki, oraz iv) eksperymenty ratunkowe, w których gen ulega reekspresji w neuronach homozygotycznych muszek zerowych. Idealnie byłoby, gdyby kilkadziesiąt mózgów na genotyp zostało przeanalizowanych pod kątem wad w morfologii neuronów.

Chociaż opisany tutaj protokół koncentruje się przede wszystkim na immunofluorescencyjnej lokalizacji białek w utrwalonej tkance, opracowywanych jest kilka przyszłych zastosowań tej techniki do obrazowania żywej tkanki mózgowej. Po wypreparowaniu mózgów (zwykle w pożywkach do hodowli komórkowych) można je hodować przez kilka dni w temperaturze 25 °C. Te metody hodowli ex vivo są opracowywane w celu zbadania szerokiej gamy procesów biologicznych, takich jak aktywność białek, które promują regenerację aksonów po urazie70,71, dynamika sygnalizacji wewnątrzkomórkowej72 i rozwój neuronów73.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Changhui Pak i Alysii Vrailas Mortimer za początkowe nauczenie SMK techniki preparacji mózgu. Dziękujemy również członkom grupy laboratoryjnej Kena Moberga, szczególnie Chrisowi Roundsowi, za krytyczną lekturę manuskryptu. Przeciwciała rozpoznające Fas2 (1D4) i chaoptynę (24B10) uzyskano z Banku Hybrydoma Badań Rozwojowych. Przeciwciało 24B10 zostało zdeponowane w DSHB przez Seymoura Benzera i Nansi Colley24,60,61, przeciwciało 1D4 zostało zdeponowane w DSHB przez Corey Goodman 22,23,56. Zapasy much zostały pozyskane z Bloomington Stock Center. Pragniemy również podziękować Centrum Obrazowania MCIC Ohio Agricultural Research and Development Center (OARDC) za użycie mikroskopu konfokalnego do obrazowania mózgów na rycinach 4A i B. SMK jest wspierany przez grant z NICHD (1 R15 HD084241-01A1). M. Kahl otrzymał wsparcie z grantu NSF (NSF REU #1560061).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze/pęseta do mikrodysekcjiTed Pella505-NM
Naczynia SylgardOprzyrządowanie do systemów żywychDD-50-S-BLKDostępne w amazon.com
Fas2 Badania rozwojowe przeciwciałHybridoma Bank1D4
Chaoptinrozwojowe Hybridoma Bank24B10
GFPPrzeciwciało Aves LabGFP-1010
Alexa488 kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszomThermoFisherA-11001
Alexa488 kozie przeciwciało wtórne przeciwko kurczakomThermoFisherA-11039
Alexa647 kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszomThermoFisherA-21236
20% paraformaldehydMikroskop elektronowy UsługiRT15713
VectaShieldVector LabsH-1000
SuperFrost Plus SzkiełkaThermoFisher99-910-01
Szkiełka nakrywkoweThermoFisher12-553-454
Na Bufor fosforanowy jednozasadowySigmaS3139
Na Bufor fosforanowy dwuzasadowySigmaS3264
Triton X 100SigmaX100-100ml
lakier do paznokciUsługi mikroskopu elektronowego (EMS)72180
stereomikroskopLeica S6D ze źródłem
Czasza 9-dołkowa (płytka punktowa)VWR89090-482
nutator/rockerFisher22-363-152 lub 88-861-041
Czasza 35mmGenesee Scientific32-103
SylgardFisher50-366-794
KimwipeFisher06-666
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Potencjalne fiksacyjne
PTN Buffer0,1 M NaPhosphate, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, zwykle składa się z 0,5 l 0,1 M buforu NaPhosphate i porcji 50 ml na raz w razie potrzeby w razie potrzeby
bufor2% paraformaldehydu, 0,01 M NaI04, 0,075 M lizyna, 0,037 M NaPO4, pH 7,2, rozpuścić 0,36 g lizyny w 10 ml H2O + 7,5 ml 0,1 M NaH2PO4 pH 7,2 + 2,5 ml 0,1 M Na2HPO4 na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem wymieszać 15 ml tego buforowanego roztworu lizyny z 50 mg NaIO4 (periodynian sodu) + 2 ml 20% wysokiej jakości paraformaldehydu (EMS) + 3 ml
buforu0,1 M RURY pH 7,0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, Ten bufor można wygodnie przygotować jako 2x zapas i rozcieńczyć 8% paraformaldehydem (PFA), aby uzyskać końcowe stężenie 4% PFA
strong>NameCompanyNumer katalogowyKomentarze
Fly Kolby dostępne w Bloomington
elav (c155)-GAL4BL458Pan-neuronalny sterownik GAL4
w*;;; Sterownik OK107-GAL4BL 854GAL4 dla wszystkich neuronów ciała grzyba (INSERCJA OK107-GAL4 odbywa się na 4. chromosomie)
y(1), w(67c23); sterownik c739-GAL4BL 7362GAL4 dla płatów alfa i beta (na 2. chromosomie)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFPBL 64305sterownik GAL4 dla płatów alfa i beta, zawiera również UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4BL 4440Sterownik GAL4 przede wszystkim dla płatów gamma ciała grzyba (na 2. chromosomie)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFPBL 64296Sterownik GAL4 dla płatów gamma ciała grzyba, zawiera również UAS-CD8-GFP
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, stado Tub>Gal80/CyOBL 5145MARCM, zawiera miejsce FRT i GAL80 na 2. chromosomie
w*, stado elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFPBL5146MARCM, zawiera hsFLP, panneuronalny GAL4 i CD8-GFP na chromosomie X
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Tuba>GAL80/TM3, Sb(1); Kolba OK107-GAL4BL 44408MARCM do przerzucania 3. chromosomu
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT40A, Wanna>GAL80; Kolba OK107-GAL4BL44406MARCM do przerzucania 2. chromosomu
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO; Kolba OK107-GAL4BL 44407MARCM do odwracania chromosomu X
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyOBL 5137GFP znakuje powierzchnię komórki (CD8 jest białkiem transbłonowym)
y(1), w*; FRTG13, stado UAS-CD8-GFPBL 5139MARCM, zawiera miejsce FRT i CD8-GFP na 2. chromosomie
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Stado Pin(1)/CyOBL 28832MARCM, zawiera hsFLP i CD8-GFP na chromosomie X
w*; FRTG13, Tub>GAL80BL 5140MARCM, zawiera miejsce FRT i GAL80 na 2. chromosomie
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80BL 5135MARCM, zawiera miejsce FRT i GAL80 na 3. chromosomie
Badania światła LED KL300 PLP H2O PEM <

Bibliografia

  1. Reichert, H. Evolutionary conservation of mechanisms for neural regionalization, proliferation and interconnection in brain development. Biol Lett. 5 (1), 112-116 (2009).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  4. Oortveld, M. A., et al. Human intellectual disability genes form conserved functional modules in Drosophila. PLoS Genet. 9 (10), 1003911(2013).
  5. Sanchez-Soriano, N., Tear, G., Whitington, P., Prokop, A. Drosophila as a genetic and cellular model for studies on axonal growth. Neural Dev. 2, 9(2007).
  6. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  7. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  8. Harris, R., Sabatelli, L. M., Seeger, M. A. Guidance cues at the Drosophila CNS midline: identification and characterization of two Drosophila Netrin/UNC-6 homologs. Neuron. 17 (2), 217-228 (1996).
  9. Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
  10. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (3), 001743(2010).
  11. Hattori, D., et al. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition. Nature. 449 (7159), 223-227 (2007).
  12. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  13. Reynaud, E., et al. Guidance of Drosophila Mushroom Body Axons Depends upon DRL-Wnt Receptor Cleavage in the Brain Dorsomedial Lineage Precursors. Cell Rep. 11 (8), 1293-1304 (2015).
  14. Reuter, J. E., et al. A mosaic genetic screen for genes necessary for Drosophila mushroom body neuronal morphogenesis. Development. 130 (6), 1203-1213 (2003).
  15. Ng, J. Wnt/PCP proteins regulate stereotyped axon branch extension in Drosophila. Development. 139 (1), 165-177 (2012).
  16. Lai, Y. W., et al. Drosophila microRNA-34 Impairs Axon Pruning of Mushroom Body gamma Neurons by Downregulating the Expression of Ecdysone Receptor. Sci Rep. 6, 39141(2016).
  17. Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
  18. Borst, A., Helmstaedter, M. Common circuit design in fly and mammalian motion vision. Nat Neurosci. 18 (8), 1067-1076 (2015).
  19. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35 (5), 827-841 (2002).
  20. Schurmann, F. W. Fine structure of synaptic sites and circuits in mushroom bodies of insect brains. Arthropod Struct Dev. 45 (5), 399-421 (2016).
  21. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  22. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  23. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
  24. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7929-7933 (1982).
  25. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36 (1), 15-26 (1984).
  26. Wan, L., Dockendorff, T. C., Jongens, T. A., Dreyfuss, G. Characterization of dFMR1, a Drosophila melanogaster homolog of the fragile X mental retardation protein. Mol Cell Biol. 20 (22), 8536-8547 (2000).
  27. Androschuk, A., Al-Jabri, B., Bolduc, F. V. From Learning to Memory: What Flies Can Tell Us about Intellectual Disability Treatment. Front Psychiatry. 6, 85(2015).
  28. Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3 (1), 91-104 (2009).
  29. van der Voet, M., Nijhof, B., Oortveld, M. A., Schenck, A. Drosophila models of early onset cognitive disorders and their clinical applications. Neurosci Biobehav Rev. 46, Pt 2 326-342 (2014).
  30. Pak, C., et al. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12390-12395 (2011).
  31. Gatto, C. L., Broadie, K. Drosophila modeling of heritable neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 21 (6), 834-841 (2011).
  32. van Alphen, B., van Swinderen, B. Drosophila strategies to study psychiatric disorders. Brain Res Bull. 92, 1-11 (2013).
  33. Kelly, S. M., et al. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA. 20 (5), 681-688 (2014).
  34. Kelly, S. M., et al. The Drosophila ortholog of the Zc3h14 RNA binding protein acts within neurons to pattern axon projection in the developing brain. Dev Neurobiol. 76 (1), 93-106 (2016).
  35. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  36. Yamamoto, D., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat Rev Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  37. Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology (Bethesda). 25 (6), 338-346 (2010).
  38. Ueno, T., et al. Identification of a dopamine pathway that regulates sleep and arousal in Drosophila. Nat Neurosci. 15 (11), 1516-1523 (2012).
  39. Vogelstein, J. T., et al. Discovery of brainwide neural-behavioral maps via multiscale unsupervised structure learning. Science. 344 (6182), 386-392 (2014).
  40. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  41. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  42. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  43. Hodge, J. J. Ion channels to inactivate neurons in Drosophila. Front Mol Neurosci. 2, 13(2009).
  44. Neumuller, R. A., Perrimon, N. Where gene discovery turns into systems biology: genome-scale RNAi screens in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 471-478 (2011).
  45. Ni, J. Q., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  46. Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).
  47. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  48. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  49. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), (2011).
  50. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (12), 1472-1474 (2011).
  51. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  52. Liu, Y., Liao, S., Veenstra, J. A., Nassel, D. R. Drosophila insulin-like peptide 1 (DILP1) is transiently expressed during non-feeding stages and reproductive dormancy. Sci Rep. 6, 26620(2016).
  53. Shafer, O. T., Helfrich-Forster, C., Renn, S. C., Taghert, P. H. Reevaluation of Drosophila melanogaster's neuronal circadian pacemakers reveals new neuronal classes. J Comp Neurol. 498 (2), 180-193 (2006).
  54. Rieger, D., Shafer, O. T., Tomioka, K., Helfrich-Forster, C. Functional analysis of circadian pacemaker neurons in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 26 (9), 2531-2543 (2006).
  55. Hillebrand, J., et al. The Me31B DEAD-Box Helicase Localizes to Postsynaptic Foci and Regulates Expression of a CaMKII Reporter mRNA in Dendrites of Drosophila Olfactory Projection Neurons. Front Neural Circuits. 4, 121(2010).
  56. Goodman, C. S., Davis, G. W., Zito, K. The many faces of fasciclin II: Genetic analysis reveals multiple roles for a cell adhesion molecule during the generation of neuronal specificity. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 479-491 (1997).
  57. Fushima, K., Tsujimura, H. Precise control of fasciclin II expression is required for adult mushroom body development in Drosophila. Dev Growth Differ. 49 (3), 215-227 (2007).
  58. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  59. Hadjieconomou, D., Timofeev, K., Salecker, I. A step-by-step guide to visual circuit assembly in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 76-84 (2011).
  60. Van Vactor, D. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr Opin Neurobiol. 8 (1), 80-86 (1998).
  61. Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
  62. Tahayato, A., et al. Otd/Crx, a dual regulator for the specification of ommatidia subtypes in the Drosophila retina. Dev Cell. 5 (3), 391-402 (2003).
  63. Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
  64. Hakeda-Suzuki, S., et al. Goal collaborates with Flamingo in conferring synaptic-layer specificity in the visual system. Nat Neurosci. 14 (3), 314-323 (2011).
  65. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  66. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  67. Crittenden, J. R., Skoulakis, E. M., Han, K. A., Kalderon, D., Davis, R. L. Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem. 5 (1-2), 38-51 (1998).
  68. Muller, H. A. Immunolabeling of embryos. Methods Mol Biol. 420, 207-218 (2008).
  69. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  70. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  71. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 575-597 (2012).
  72. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  73. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja m zgu Drosophilaneurony cia grzybowychmedium do disekcji PTNutrwalanie paraformaldehydeminkubacja w roztworze blokuj cymaplikacja przeciwcia a pierwszorz dowegobarwienie przeciwcia em drugorz dowymfluorescencyjne medium monta owe
Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.