Brak weryfikacji czyszczenia w przemyśle farmaceutycznym z powodu nieczystości powierzchni ze stali nierdzewnej

Czystość sprzętu niededykowanego powinna być sprawdzona przed jego późniejszym dopuszczeniem do użytku w produkcji półproduktów i aktywnych składników farmaceutycznych (API), przy zmianie produktu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Procedury czyszczenia powinny zawierać wystarczające szczegóły, aby umożliwić operatorom czyszczenie każdego rodzaju sprzętu w powtarzalny i skuteczny sposób, a procedury te powinny być zatwierdzone zgodnie z wymaganiami amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA)¹. FDA wydała liczne listy ostrzegawcze z powodu nieodpowiedniego czyszczenia^2,3,4, braku walidacji metody czyszczenia i nieprzestrzegania procedur czyszczenia⁵. 21 CFR §211.67 określa wymagania niezbędne do pomyślnej weryfikacji czyszczenia.

Jest standardem w przemyśle, że walidacja metod analitycznych do weryfikacji czyszczenia jest przeprowadzana na próbkach ze stali nierdzewnej o tej samej powierzchni/wykończeniu co sprzęt produkcyjny. Kupony ze stali nierdzewnej (np. 50 cm²) służą do przedstawiania powierzchni sprzętu do eksperymentów weryfikacyjnych w laboratorium. Podczas opracowywania i walidacji tych metod analitycznych próbka będąca przedmiotem zainteresowania (tj. pozostałości, które powinny zostać odzyskane z powierzchni urządzenia) jest dopytywana w docelowej pozostałości na kuponie ze stali nierdzewnej wyznaczonym przez maksymalny dopuszczalny limit przeniesienia (MACO). Poziom ten określa się na podstawie dopuszczalnego limitu narażenia, który jest zdefiniowany jako limit, przy którym pacjent może być narażony bez negatywnych skutków dla zdrowia (poziom bez obserwowanych szkodliwych skutków, NOAEL).

Analityk lub operator produkcyjny przeprowadzający pobieranie wymazów musi postępować zgodnie z ustrukturyzowaną procedurą, aby zapewnić, że odzysk jest powtarzalny, niezależnie od tego, kto wykonuje wymaz. Procedura powinna wyraźnie wyszczególniać rodzaj wymazówki, liczbę użytych wymazów, rozcieńczalnik, ilość użytego rozpuszczalnika, dokładny wzór zamiatania, liczbę pociągnięć nałożonych na powierzchnię próbki, ilość czasu poświęconego na pobieranie wymazów/ekstrakcję próbek, metodę wykrywania (ultrafiolet, fluorescencja, spektrometria mas, całkowity węgiel organiczny itp.), technikę ekstrakcji materiału z główki wacika, itd.

Oprócz wszystkich wyżej wymienionych czynników, które wpływają na odzysk próbki, powierzchnia kuponu, a co za tym idzie, powierzchnia sprzętu również odgrywają rolę. Powierzchnia kuponu może być modyfikowana w wyniku osadzania się cienkiej warstwy materiału na powierzchni lub w wyniku zmiany stopnia utlenienia jednego lub więcej pierwiastków w stali nierdzewnej (np. Fe, Cr i Ni)^6,7,8. Regeneracja powierzchni kuponów ze stali nierdzewnej z powrotem do jej pierwotnego stanu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia procesu wymiany ilościowej. Badania, w których kupony ze stali nierdzewnej nie zostały odpowiednio oczyszczone, wykazały zmienność w odzyskiwaniu, w tym analityka do innego, różnych leków lub różnych poziomów skoków^9,10,11. Odchylenie standardowe w odzyskiwaniu dziesięciu powtórzeń na jednym kuponie może wynosić do 14% i 26% na pięciu kuponach⁹. Ważne jest, aby zauważyć, że wartości względnego odchylenia standardowego (S_rel) rosły wraz ze wzrostem liczby powtórzeń lub wraz ze wzrostem liczby użytych kuponów (tj. pięć kuponów zamiast pięciokrotnego wzrostu na tym samym kuponie)¹¹. W takich przypadkach zmienność nie może być interpretowana jako fluktuacja losowa. Niemniej jednak ich wyniki można wytłumaczyć naszym odkryciem, że czystość powierzchni kuponu wpłynie na regenerację. Wyniki opisane w tym artykule ilustrują znaczny wzrost wyników odzysku i zmniejszenie zmienności po prawidłowym oczyszczeniu powierzchni próbek ze stali nierdzewnej.

Clean-in-place () to zautomatyzowany sposób czyszczenia powierzchni sprzętu, który polega na minimalnym lub żadnym demontażu sprzętu. Podczas procesu czyszczenia wykonywana jest zdefiniowana procedura kolejnego mycia zasadą, a następnie kwasem w celu usunięcia pozostałości organicznych i nieorganicznych. Środki powierzchniowo czynne, związki chelatujące lub czynniki kompleksujące są zwykle dodawane do roztworów w celu zwiększenia skuteczności czyszczenia dowolnego produktu z powierzchni urządzenia. Skuteczność czyszczenia zależy od kilku parametrów, w tym wyboru i stężenia roztworów (tj. rodzaju i składu zasady, kwasu i środka powierzchniowo czynnego), czasu czyszczenia, temperatury (zwykle 60 - 80 °C), rodzaju zanieczyszczenia oraz obecności trudnych do czyszczenia części¹². W zależności od rodzaju produktu leczniczego, roztwory 100 i 200 zostały wybrane do użycia do czyszczenia kuponów ze stali nierdzewnej używanych do weryfikacji czyszczenia, ponieważ symulują one proces stosowany do czyszczenia urządzeń produkcyjnych.

To badanie informuje o wpływie różnych czynników wpływających na odzysk pozostałości farmaceutycznych z powierzchni próbek ze stali nierdzewnej i zaleca najlepsze praktyki dla rozwoju analitycznych metod czyszczenia małych cząsteczek, białek terapeutycznych i przeciwciał. Brak dobrze zdefiniowanej procedury, która konsekwentnie czyściłaby powierzchnię kuponu, został zidentyfikowany jako główny czynnik przyczyniający się do niskich i zmiennych odzysków. Wysoki i powtarzalny odzysk uzyskano, gdy powierzchnia kuponu została odpowiednio oczyszczona¹³.

1. Przykładowe rozwiązanie

1. Obliczyć granicę czyszczenia (CL) dla leku w oparciu o maksymalne dopuszczalne przeniesienie (MACO) zgodnie z kryteriami dawki terapeutycznej.
   UWAGA: W tym przypadku granica czyszczenia (CL) dla leku A została obliczona na 2,4 μg na 50^cm2 w oparciu o maksymalne dopuszczalne przeniesienie (MACO) zgodnie z kryteriami dawki terapeutycznej. Weryfikacja czyszczenia jest wykonywana przy limicie czystości 50%, 100% i 150%. Weryfikacja czyszczenia została oceniona dla dwóch formulacji (2,5% i 60% w/w obciążenia leku).

2. Procedura czyszczenia kuponów

1. Podejście wstępne
   1. Wyczyść kupony, spłukując i wycierając powierzchnię przez 10 - 15 sekund dwukrotnie wodą i dwukrotnie metanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości osadu. Wykonaj ten proces w okapie, ponieważ metanol jest toksyczny i bardzo lotny.
2. Zaawansowane podejście
   1. Korzystanie z rozwiązań do czyszczenia na miejscu
      1. Ustaw sonikator na temperaturę pokojową. Sonikator nie posiada regulacji ustawień mocy, dlatego czas jest ustawiony tak, aby dać odpowiednie wyniki czyszczenia.
      2. Zanurz próbki w wodzie klasy wysokiej jakości do chromatografii cieczowej (HPLC) i poddaj sonikacji przez 2 minuty.
      3. Zanurz kupony w 0,1% alkalicznym roztworze detergentu w wodzie klasy HPLC i poddaj sonikacji przez 2 minuty.
      4. Zanurz kupony w wodzie HPLC i sonikuj przez 2 minuty.
      5. Zanurz kupony w 0,1% kwaśnym roztworze detergentu w wodzie HPLC i poddaj sonikacji przez 2 minuty.
      6. Zanurz kupony w wodzie HPLC i sonikuj przez 2 minuty.
   2. Za pomocą nadtlenku kwasowo-zasadowego
      UWAGA: Jest to alternatywna metoda polegająca na użyciu kwasów, zasad i nadtlenków, a nie detergentów alkalicznych i kwaśnych.
      1. Ustaw sonikator na temperaturę pokojową. Sonikator nie posiada regulacji ustawień mocy, dlatego czas jest ustawiony tak, aby dać odpowiednie wyniki czyszczenia.
      2. Zanurz kupony w wodzie i poddaj sonikacji na 2 minuty.
      3. Zanurz kupony w 0,1 M wodorotlenku sodu i poddaj sonikacji na 2 minuty.
      4. Zanurz kupony w wodzie i poddaj sonikacji na 2 minuty.
      5. Zanurz kupony w 0,1 M kwasie solnym i poddaj sonikacji przez 2 minuty.
      6. Zanurz kupony w wodzie i poddaj sonikacji na 2 minuty.
      7. Zanurz kupony w 0,1 mg/ml NaNo2 i poddaj sonikacji przez 2 minuty.
      8. Zanurz kupony w wodzie i poddaj sonikacji na 2 minuty.

3. Procedura pobierania wymazów

1. Zamontuj kupony ze stali nierdzewnej na dnie plastikowej zlewki o pojemności 250 ml (lub 500 ml) za pomocą taśmy dwustronnej.
2. Przytrzymaj zlewkę, aby ułatwić procesy nakłuwania i pobierania wymazów. Minimalizuje to również niektóre niepożądane wypadki, takie jak przestrzelenie zakrętu podczas wymazywania.
3. Nanieść określoną objętość o określonym stężeniu i postaci użytkowej (np. 200 μl z 12 μg/ml przy 2,5 % w/w obciążenia lekiem A) w wirowy wzór na powierzchni próbki za pomocą pipety wyporowej.
4. Poczekaj, aż powierzchnia kuponu wyschnie (~ 3 - 10 minut w zależności od lotności próbki).
5. Zanurz suchy wacik w fiolce z 2 ml rozcieńczalnika (metanol: kwas mrówkowy 100:0,2 objętości/objętość).
6. Usunąć nadmiar rozpuszczalnika, dociskając wacik do wnętrza fiolki.
7. Mocno przetrzyj powierzchnię kuponu równymi, nakładającymi się na siebie ruchami z boku na bok, aż całkowita powierzchnia testowa 50 cm² zostanie przetarta jedną stroną mokrego wacika.
8. Powtórz proces wycierania (krok 3.7) po tej samej stronie wacika.
9. Przetrzyj dwukrotnie cztery krawędzie kuponu.
10. Odwróć wacik na drugą stronę i obróć kupon o 90°, zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, obracając w ten sposób kierunek pobierania wymazówki o 90°.
11. Powtórz ruch wymazywania zgodnie z opisem w krokach 3.7 - 3.9. Po pobraniu próbek z powierzchni przeciąć główkę wacika za pomocą nożyczek do fiolki z rozpuszczalnikiem.
12. Powtórz proces pobierania wymazu za pomocą drugiego wacika, obracając kupon o 90° w tym samym kierunku, który został wcześniej wybrany.
13. Sondować sonikowanie fiolki zawierającej dwie główki wacika przez 5 minut, a następnie wirować przez 10 sekund.
14. Przenieść roztwór do fiolki HPLC i oznaczyć go jako roztwór roboczy.

4. Obliczanie odzysku

1. Odzyskiwanie próbek
   1. Przygotować roztwory kontrolne, mieszając po 200 μl każdego z roztworów do uzupełniania kuponów z 1 800 μl rozcieńczalnika.
   2. Uruchomić system chromatograficzny zgodnie z warunkami wymienionymi w tabeli 1.
   3. Obliczyć odzysk roztworu roboczego wacika na podstawie względnej powierzchni pod pikiem roztworów roboczych (A_{, W}) i roztworu kontrolnego (_AC).
   4. Powtórz proces na trzech kuponach i oblicz średni odzysk wraz ze względnym odchyleniem standardowym (S_rel).
      UWAGA: Wszystkie zastosowane tutaj metody analityczne zostały zwalidowane zgodnie z wytycznymi ICH Q2(R1). Warunki chromatografii są wymienione w rozdziale dotyczącym materiałów.

Reprezentatywne wyniki z początkowych prób weryfikacji czyszczenia dla leku A są podsumowane w Tabeli 2. Zanim kupony zostały oczyszczone zgodnie ze szczegółową procedurą w sekcji eksperymentalnej, uzyskano niespójne wyniki przy różnych poziomach skoków, dla różnych proporcji API/substancji pomocniczej, różnych analityków, a nawet dla tego samego analityka w różnych dniach. Należało zająć się zaobserwowaną zmiennością odzysku, ponieważ niektóre wyniki nie spełniły wymagań walidacyjnych (60% < odzysku < 150%), takich jak odzysk dla 60% ładunku leku przy wszystkich limitach czyszczenia.

Pierwszym typem zmienności zaobserwowanym w Tabeli 2 jest zmienność precyzji, co można zobaczyć na podstawie wysokiego S rel związanego z większością wyników odzyskiwania (liczby podane w nawiasach). Oprócz oczekiwanej zmienności między analitykami (dane pokazane w odniesieniu 13), zmienność z dnia na dzień jest również obserwowana dla jednego analityka, przy czym wszystkie inne warunki nie uległy zmianie, jak pokazano w pierwszych dwóch eksperymentach w tabeli 2 (przy obciążeniu lekiem na poziomie 2,5%). Niespójne odzyski zaobserwowano przy różnych poziomach skoków wynoszących 50%, 100% i 150% limitu czyszczenia (Srel do 16% dla 60% obciążenia lekiem przy 150% limicie czyszczenia), niezależnie od obciążenia lekiem lub analityka przeprowadzającego eksperyment. Ponadto stwierdzono zmienność nawet przy różnych proporcjach API/substancji pomocniczej, przy 2,5% i 60% obciążeniu lekiem (Tabela 2) oraz przy 50% obciążeniu lekiem zgłoszonym w odniesieniu 13). Niska formuła dawała średnio najwyższy odzysk, co sugeruje, że substancja pomocnicza zwiększała regenerację leku z kuponu. Całkiem możliwe, że 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC), środek powierzchniowo czynny, chroniła organiczny związek leczniczy przed interakcją chelatacji metali i ułatwiała usuwanie leku z powierzchni kuponu, gdy stosunek leku do substancji pomocniczej był niższy.

Na podstawie typów zmienności omówionych powyżej, początkowym podejściem do poprawy odzysku było ponowne opracowanie metody ekstrakcji i warunków eksperymentalnych w celu uzyskania stałych i wysokich odzysków. Dostosowane parametry obejmowały: technikę pobierania wymazów, rozcieńczalnik (różne rozpuszczalniki, różne proporcje organiczne/wodne, różne kwasy i stężenie kwasów), rozpuszczalnik do wstrzykiwania, pH kolca i rozcieńczalnika, technikę nacierania oraz technikę ekstrakcji leku z wacika. Średnie odzyski dla czterech różnych kuponów wraz ze względnym odchyleniem standardowym są pokazane w Rysunek 1 dla niektórych eksperymentów. Główny wniosek był taki, że żadna z powyższych zmian nie wyeliminowała obserwowanej wcześniej zmienności w tabeli 2. Niezależnie od czynnika eksperymentalnego, który został zmieniony, zmienność odzysku (Srel) z jednego kuponu na drugi była oczywista i w niektórych przypadkach wynosiła >20%. W ramach błędu eksperymentalnego prawie wszystkie te eksperymenty nie zostały uznane za statystycznie różne. Różnica między indywidualnym odzyskiem na każdej powierzchni kuponu a średnim odzyskiem (ΔRecovery) jest pokazana w Rysunek 2. Oczywiste jest, że średni odzysk różni się w zależności od powierzchni kuponu. W związku z tym oczekuje się, że powierzchnia kuponu będzie głównym czynnikiem przyczyniającym się do obserwowanej zmienności.

Istniało duże prawdopodobieństwo, że poprzednio obserwowana zmienność w odzyskiwaniu wynikała ze zmienności między kuponami. Eksperymenty weryfikacyjne czyszczenia dla 60% obciążenia lekiem powtórzono sześć razy, a każda formuła została wzbogacona o cztery kupony o identycznym materiale i wykończeniu powierzchni, wszystkie od tego samego dostawcy. Z wyników pokazanych w Rysunek 3 jasno wynikało, że odzysk dla preparatu 60% nie był zbyt powtarzalny z jednej próby na drugą, z ogólną tendencją do niższych odzysków w miarę postępu eksperymentów. Co więcej, zaobserwowano pewne różnice między kuponami w tej formule (Rysunek 2). Zaobserwowana zmienność sugerowała, że powierzchnia różnych kuponów nie była identyczna i w różny sposób oddziaływała z matrycą.

Pierwszym podejściem do zminimalizowania różnicy między kuponami było dokładne oczyszczenie powierzchni kuponów. Kupony używane do uzyskania odzysku w Rysunek 3 zostały oczyszczone zgodnie z procedurą przedstawioną w sekcji eksperymentalnej. Wyniki odzyskiwania po wyczyszczeniu kuponów są przedstawione w Rysunek 3. Oczywiste jest, że odzysk jest praktycznie powtarzalny z jednej próby na drugą, a różnica w odzysku między kuponami jest zminimalizowana.

Tabela 2 pokazuje porównanie wyników odzyskiwania przed i po oczyszczeniu kuponów w tych samych warunkach eksperymentalnych. Można wyciągnąć następujące wnioski: 1) wszystkie odzyski były wysokie (90 - 100%); 2) Wartości S rel na każdym poziomie skoku były akceptowalne i znacznie mniejsze niż wcześniej zgłaszane wyniki na nieoczyszczonych kuponach, 3) Zmienność w odzyskiwaniu od jednego poziomu skoku do drugiego została zminimalizowana, 4) Różnica w składzie nie wpłynęła na regenerację.

Kupony oczyszczone roztworami zostały następnie wykorzystane do weryfikacji czyszczenia związków B (inna mała cząsteczka), C i D (duże cząsteczki, tj. biologiki) o różnych formułach i poziomach skoków. Te same wnioski wyciągnięte z eksperymentów dla leku A miały zastosowanie do leku B, C i D (szczegółowe wyniki pokazano w odnośniku 13). Wysokie poziomy odzysku uzyskano w odniesieniu do wielkości cząsteczki i właściwości fizykochemicznych dzięki zastosowaniu systematycznego czyszczenia kuponów.

Rysunek 1. Średni odzysk uzyskany z czterech kuponów. Słupki błędów reprezentują względne odchylenie standardowe od czterech prób na czterech kuponach. Numer eksperymentu: 1) normalny nakłucie, 2) 10% kwas mrówkowy, 3) brak kwasu mrówkowego, 4) brak wody w roztworze kolca, 5) wysoki procent placebo (97%), 6) brak placebo, 7) wyciskanie wacika szpatułką, 8) dodanie etapu wirowania i 9) 0,1% HCL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Różnica w odzysku (ΔRecovery) uzyskana z czterech kuponów. ΔRecovery to różnica między odzyskiem na kuponie a średnim odzyskiem czterech kuponów. Numer eksperymentu: 1) normalny nakłucie, 2) 10% kwas mrówkowy, 3) brak kwasu mrówkowego, 4) brak wody w roztworze kolca, 5) wysoki procent placebo (97%), 6) brak placebo, 7) wyciskanie wacika szpatułką, 8) dodanie etapu wirowania i 9) 0,1% HCL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Zmienność odzysku leku A przy 2,5 % stosunku leku/substancji pomocniczej przed i po czyszczeniu. Solidne trójkąty odpowiadają wartościom odzysku przed czyszczeniem kuponów, podczas gdy otwarte symbole odpowiadają wartościom odzysku po wyczyszczeniu kuponów. Słupki błędów reprezentują względne odchylenie standardowe od czterech prób na czterech kuponach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Warunki chromatografii

Tabela 2. Wzbogacone poziomy odzysku dla różnych ładunków narkotyków przed i po oczyszczeniu kuponów zgodnie z procedurą opisaną w sekcji eksperymentalnej.

Nie istnieje żaden konflikt interesów finansowych ani konflikt interesów.