Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Summary

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Abstract

Komórki wykazują różne morfologie i skomplikowane relacje anatomiczne. Jak komórki oddziałują ze swoimi sąsiadami? Czy interakcje różnią się między typami komórek, czy nawet w obrębie danego typu? Jakimi regułami przestrzennymi się kierują? Odpowiedzi na tak fundamentalne pytania in vivo były do tej pory utrudnione ze względu na brak narzędzi do znakowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości. Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół celowania w pojedyncze komórki za pomocą techniki MultiColor FlpOut (MCFO). Ta metoda opiera się na trzech różnie oznaczonych reporterach (HA, FLAG i V5) pod kontrolą UAS, które są milczące przez terminator transkrypcji otoczony przez dwa miejsca FRT (FRT-stop-FRT). Impuls szoku cieplnego indukuje ekspresję rekombinazy Flp wywołanej szokiem cieplnym, która losowo usuwa kasety FRT-stop-FRT w poszczególnych komórkach: ekspresja występuje tylko w komórkach, które również wyrażają sterownik GAL4. Prowadzi to do powstania tablicy różnokolorowych komórek danego typu komórki, która umożliwia wizualizację morfologii poszczególnych komórek w wysokiej rozdzielczości. Na przykład technikę MCFO można połączyć ze specyficznymi czynnikami glejowymi GAL4 w celu wizualizacji morfologii różnych podtypów glejowych w mózgu dorosłego Drosophila.

Introduction

Gleja, nieneuronalna populacja komórek układu nerwowego (NS), długo uważano, że stanowi statyczną strukturę dla neuronów i dlatego nie była szczegółowo badana. Jednak u ludzi glej stanowi zdecydowaną większość komórek w NS (~90%) i dzieli się na kilka różnych kategorii, w tym astrocyty, oligodendrocyty, mikroglej i komórki Schwanna. U Drosophila komórki glejowe stanowią około 10% komórek NS. Co ciekawe, ich morfologie i funkcje są niezwykle podobne do tych występujących u kręgowców^1,2. Ich morfologia obejmuje barierę krew-mózg (BBB) tworzącą nabłonek, osłonę i komórki podobne do astrocytów.

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) Drosophila składa się z następujących głównych struktur: regionów kory zawierających ciała komórek nerwowych; neuropils, które zawierają połączenia synaptyczne; małych i dużych aksonów, które łączą różne neuropile; nerwów obwodowych, które łączą narządy zmysłów i mięśnie z OUN (Rysunek 1). Glej jest związany ze wszystkimi tymi strukturami anatomicznymi: glej kory mózgowej (CG) w regionach korowych, glej podobny do astrocytów (ALG) i glej pochewkowy (EG) w regionach neuropile, glej poszywający jest również związany z centralnymi drogami aksonowymi i nerwami obwodowymi (EGN), a na koniec dwa gleje przypominające arkusze, glej okołonerwowy (PG) i pachwinowy (SPG), które razem tworzą ciągłą warstwę pokrywającą cały NS (Ryc. 2).

Poprzednie badania wykazały, że glej odgrywa ważną rolę w rozwoju NS; monitorują liczbę komórek neuronalnych poprzez reakcję na krążące systemowo peptydy insulinopodobne, zapewniają troficzne wsparcie neuronom, takim jak astrocyta-neuron mleczan wahadłowy, i eliminują umierające neurony przez fagocytozę^3,4,5,6. W dojrzałym NS glej utrzymuje barierę krew-mózg, pobiera neuroprzekaźniki i utrzymuje homeostazę jonową, działa jako główne komórki odpornościowe w NS, ponieważ makrofagi nie mogą naruszyć bariery krew-mózg i modulują aktywność synaptyczną, a także zachowanie zwierząt^{6,7,8,9,10,11}.

Czy różne podtypy gleju pełnią wyspecjalizowane funkcje, pozostaje ważnym otwartym pytaniem. Jednak systematyczna analiza całego genomu gleju, zwłaszcza u osób dorosłych, jest utrudniona przez brak odpowiednich narzędzi genetycznych do manipulacji nimi. W tym artykule przedstawiono metodę, która pozwala na wydajną i łatwą charakterystykę kształtów komórek w celu badania złożonych interakcji komórka-komórka. Technika ta została zastosowana do scharakteryzowania morfologii różnych podtypów glejowych w mózgu dorosłego Drosophila, ale w zależności od konkretnego zastosowanego sterownika GAL4 można ją dostosować do badania neuronów^12,13, dowolnego rodzaju mieszających się komórek i w zasadzie dowolnej tkanki w dowolnym stadium rozwoju.

Protocol

1. Przygotowanie much do eksperymentów MultiColor FlpOut (MCFO)

UWAGA: Technika MCFO odnosi się do zmodyfikowanej wersji tak zwanego wycięcia kasety zatrzymania za pośrednictwem Flp (FlpOut). Transgeniczne muchy MCFO przenoszą promotor szoku cieplnego (hsp)-rekombinazę Flp i różne reportery pod kontrolą UAS. Każdy reporter składa się ze wspólnego szkieletu mirystoylowanego (myr) super folderowego białka zielonej fluorescencji (sfGFP), do którego wstawiono 10 kopii znacznika epitopu (np. HA, FLAG lub V5). Powstałe w ten sposób niefluorescencyjne białka noszą nazwę "spaghetti monster GFPs" (smGFPs)¹⁴ i mogą być wykryte za pomocą specyficznych przeciwciał przeciwko różnym znacznikom epitopów.

1. Przelatuje krzyżowo z kasetą MCFO i hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) do odpowiednich linii sterujących glejowych GAL4 (patrz Tabela materiałów).
   1. Ponieważ hsp jest już aktywny w temperaturze 25 °C i niewiele komórek może ulegać rekombinacji prowadzącej do niespecyficznego znakowania, należy ustawić krzyżówki w temperaturze 18 °C, aby uniknąć nieszczelności systemu. Odczekać około 20 dni w temperaturze 18 °C, aby uzyskać generację F1. Po szoku cieplnym (patrz krok 2) utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C (Rysunek 3).

2. Szok cieplny

UWAGA: W zależności od miejsca wprowadzenia, wydajność hsp-Flp może się różnić; dlatego optymalny czas szoku cieplnego musi być zoptymalizowany. Do tego protokołu wykorzystano stado muchowe MCFO, w którym hsp-Flp został wprowadzony na chromosomie X (patrz tabela materiałów).

1. Przenieść potomstwo krzyżówki w kroku 1.1 (muchy pokolenia F1, w wieku 3-4 dni) do nowych fiolek zawierających pokarm i poddać je szokowi termicznemu w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
   UWAGA: Młode muchy (1-2 dniowe) są bardzo wrażliwe na szok cieplny. Odczekaj jeszcze 1 lub 2 dni przed wykonaniem szoku cieplnego, aby zmniejszyć śmiertelność spowodowaną leczeniem. Użyj niektórych much generacji F1 jako kontroli, bez szoku cieplnego.
2. Podczas szoku cieplnego utrzymuj muchy w normalnych fiolkach z jedzeniem, aby zmniejszyć śmiertelność wywołaną stresem. Umieścić samice i samce w oddzielnych fiolkach.
3. Upewnij się, że zanurzyłeś całą fiolkę w wodzie, aby zapewnić jednorodny szok cieplny. Użyj 5-8-minutowego wstrząsu jako odpowiedniego punktu wyjścia do rzadkiego znakowania komórek glejowych wieloma liniami sterownika GAL4; Czas trwania wstrząsu musi być zoptymalizowany dla każdego kierowcy i eksperymentu (może być konieczne krótsze lub dłuższe czasy szoku cieplnego).
4. Po szoku cieplnym połóż fiolki poziomo na ławce na kilka minut, aby muchy mogły dojść do siebie po szoku cieplnym.
   UWAGA: Nie ma potrzeby wymiany fiolek.
5. Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C i poddaj je sekcji (patrz krok 3 i 4) 2 lub więcej dni po szoku cieplnym, aby uzyskać optymalną ekspresję reportera.

3. Przygotowanie i roztwory do rozbioru

1. W dniu sekcji należy przygotować świeży roztwór utrwalający w probówkach PCR o pojemności 200 μl, mieszając 180 μl pożywki do hodowli komórek S2 z 20 μl 20% paraformaldehydu (PFA) w celu uzyskania 2% roztworu PFA. Roztwór utrwalający należy utrzymywać na lodzie przed i w trakcie preparacji.
   Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
   UWAGA: Wymieszaj 160 μl pożywki do hodowli komórkowych S2 z 40 μl 20% paraformaldehydu (PFA) w probówce PCR o pojemności 200 μl, aby przygotować 4% roztwór PFA zamiast 2% roztworu.
2. Użyj jednej probówki PCR na genotyp z maksymalnie 8-10 mózgami na probówkę, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia.
3. Przygotuj roztwór do płukania mózgu dla dorosłych: 0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,5% Triton X-100 w PBS.
   UWAGA: W zależności od barwienia może być potrzebny roztwór zawierający 1% Triton X-100. Wyższe stężenie Triton X-100 zwiększa przenikanie przeciwciała do tkanki i konieczne jest barwienie obszarów leżących głęboko w tkance (np. regionów synaptycznych w mózgu dorosłego Drosophila).
4. Przygotuj roztwór blokujący: 3% normalnej surowicy koziej, 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w PBS.
5. Roztwór do przemywania mózgu dla dorosłych i roztwór blokujący mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
6. Umieść szklaną płytkę studni głębinowej na lodzie i napełnij każdą studzienkę następującymi roztworami: jedną z 70% etanolem, jedną z PBS i jedną z pożywką do hodowli komórek S2.

4. Sekcja mózgu dorosłego

1. Umieść 3-centymetrową naczynie preparacyjne na stoliku mikroskopu stereoskopowego i napełnij je zimnym podłożem do hodowli komórek S2. Przeprowadzić wszystkie sekcje w tym podłożu, aby upewnić się, że tkanka pozostaje zdrowa podczas procedury preparacji.
   UWAGA: Użyj naczynia preparacyjnego wyłożonego kilkoma milimetrami czarnego silikonu, który zapewnia dobry kontrast tła (na zdjęciach) i zachowaj kleszcze podczas sekcji.
2. Znieczulić muchy o pożądanym genotypie za pomocą CO₂.
3. Za pomocą kleszczy chwyć muchę za skrzydła i umyj ją w zimnym 70% etanolu przez 30 s, a następnie zimnym PBS przez dodatkowe 30 sekund.
4. Przenieś muchę do głębokiego zagłębienia, które jest wypełnione pożywką do hodowli komórek S2.
5. Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich much o tym samym genotypie i utrzymuj je w zimnej pożywce do hodowli komórek S2 aż do rozwarstwienia, co pozwoli zachować tkankę.
   UWAGA: Znieczulaj tylko taką liczbę much, jaką można wyciąć w czasie około 30 minut. Długi czas inkubacji w pożywce do hodowli komórek S2 może uszkodzić tkankę.
6. Chwyć muchę kleszczami i pod mikroskopem stereoskopowym zanurz muchę w pożywce do hodowli komórek S2.
7. Odłącz głowę od reszty ciała. Wyrzuć ciało i trzymaj głowę zanurzoną w pożywce do hodowli komórek S2. Niezwykle ważne jest, aby przez cały czas trwania sekcji trzymać głowę kleszczami. Jeśli głowa zacznie unosić się na wodzie, trudno będzie ją odzyskać bez uszkodzenia tkanki.
8. Rozpocznij sekcję od wyciągnięcia jednego oka, cały czas trzymając głowę co najmniej jednym kleszczem. Upewnij się, że końcówka kleszczyków znajduje się tuż pod siatkówką, aby uniknąć uszkodzenia tkanki pod spodem. Wyciągnij drugie oko i zacznij usuwać naskórek, aż pojawi się mózg.
9. Usuń całą tkankę tchawicy i naskórek wokół mózgu, aż tkanka będzie wyglądać na czystą. Upewnij się, że usunąłeś całą tkankę tchawicy wokół mózgu, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia; Tkanki są teraz gotowe do utrwalenia i wybarwienia.
10. Utrzymuj wszystkie wypreparowane mózgi w zimnej pożywce do hodowli komórek S2 przed przeniesieniem ich do roztworu PFA, aby określić czas etapu utrwalania.

5. Barwienie mózgu u dorosłych

1. Przenieś izolowany mózg za pomocą pipety P10 do roztworu PFA w temperaturze pokojowej (RT). Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, nigdy nie używaj kleszczy do przenoszenia mózgu po sekcji. Wykonaj wszystkie kroki w probówkach PCR o pojemności 200 μl na nutatorze.
2. Na wszystkich etapach, przed wyrzuceniem starego roztworu za pomocą pipety P200, pozwól mózgom osiąść na dnie probówki. Spróbuj usunąć supernatant bez zasysania tkanki. Chroń tkankę przed ekspozycją na światło.
3. Utrwal mózgi w 200 μl 2% PFA w pożywce do hodowli komórek S2 przez 1 godzinę lub w 4% PFA przez 30 minut. Utrzymuj identyczne czasy utrwalania między próbkami w celu zwiększenia odtwarzalności.
4. Po 3 (lub więcej) płukaniach po 15 minut każde w 200 μl roztworu do przemywania mózgu osoby dorosłej, zablokuj tkanki 200 μl roztworu blokującego na 30 minut. Możliwe są dłuższe czasy inkubacji w roztworze blokującym.
5. Inkubować mózgi przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze do przemywania mózgu dla dorosłych w całkowitej objętości 200 μl.
   UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od rodzaju użytego przeciwciała. Mogą być konieczne dłuższe inkubacje.
   1. W celu znakowania trzech markerów MCFO należy inkubować mózgi z przeciwciałami pierwszorzędowymi anty-HA (1:500), anty-FLAG (epitop DYKDDDDK) (1:100) i anty-V5.
   2. Pierwszorzędowe przeciwciała bezpośrednio sprzężone mogą być stosowane zamiast normalnej kombinacji pierwszorzędowej + drugorzędowej (np. anty-V5:DyLight 549 (1:200)). W takim przypadku należy traktować przeciwciała bezpośrednio sprzężone jako przeciwciała drugorzędowe.
      UWAGA: Dla każdego genotypu zachowaj kilka mózgów jako kontrolę, aby zweryfikować specyficzność barwienia. Pomiń inkubację przeciwciał pierwotnych i przejdź bezpośrednio do następnego kroku.
6. Przemyć tkanki 3 razy przez 1 godzinę w 200 μl roztworu do przemywania mózgu dla dorosłych (krok 3.3) i inkubować je z drugorzędowymi koniugatami fluoroforowymi/pierwotnymi przeciwciałami bezpośrednio sprzężonymi, rozcieńczonymi w roztworze do przemywania mózgu dla dorosłych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, w całkowitej objętości 200 μl
   UWAGA: Przykłady odpowiednich przeciwciał: AlexaFluor 488 (1:250), przeciwciała sprzężone anty-V5:DyLight 549 (1:200) i DyLight 647 (1:100).
7. Umyć mózgi 3 razy przez 1 godzinę w 200 μl roztworu do przemywania mózgu dla dorosłych, a następnie przepłukać końcowe w 200 μl PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej; ostatni etap płukania w PBS usuwa wszelkie ślady Triton X-100 i jest niezbędny do uzyskania optymalnych wyników barwienia. Zamontuj mózgi w podłożu montażowym za pomocą środka zapobiegającego blaknięciu na szklanych szkiełkach nakrywkowych.

6. Montaż mózgów do obrazowania

1. Przytnij przekładkę obrazową do odpowiedniego rozmiaru za pomocą nożyczek. W przypadku mikroskopii o wysokiej rozdzielczości umieść próbkę i przekładkę obrazową między dwoma szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.
   UWAGA: Przekładki obrazowe to cienkie (0,12 mm grubości) samoprzylepne przekładki, które odklejają się i przyklejają do szklanych szkiełek nakrywkowych lub szkiełek mikroskopowych, umożliwiając mocowanie próbek bez kompresji.
2. Za pomocą kleszczyków usuń samoprzylepną wyściółkę z jednej powierzchni i nałóż przekładkę klejem do dołu na powierzchnię szklanego szkiełka nakrywkowego (22 mm x 60 mm). Nanieść 10 μl podłoża mocującego na nowe szklane szkiełko nakrywkowe.
3. Za pomocą pipety P10 przenieś mózgi z probówki o pojemności 200 μl do szkiełka nakrywkowego, obok kropli podłoża mocującego. Wraz z tkankami przenieś trochę PBS, aby utrzymać mózg w roztworze.
4. Za pomocą pipety P10 przenieś mózgi z PBS do kropli podłoża mocującego, próbując ograniczyć ilość PBS. Przenieść próbki w podłożu montażowym na szkiełko nakrywkowe za pomocą przekładki obrazowej. Użyj wystarczającej ilości nośnika montażowego, aby przykryć próbkę.
5. Usuń drugą wkładkę samoprzylepną z górnej strony przekładki i dodaj szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbek. Końcówką kleszczy delikatnie dociśnij obszar kleju, aby uszczelnić. Natychmiast zobrazuj zamontowane tkanki lub przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.

7. Akwizycja obrazu

1. Uzyskaj stosy konfokalnych obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X (NA = 1,2, zanurzenie w wodzie) lub obiektywem 63X (NA = 1,4, zanurzenie w oleju) (rozmiary pikseli = 1,024 x 1,024 w płaszczyźnie xy; Odległość między dwoma sekcjami konfokalnymi = 0,5 μm). Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie detektora w każdym kanale w taki sposób, aby na obrazach nie było nasyconych pikseli i zerowych wartości pikseli; Pozwala to uniknąć utraty informacji i zapewnia wykorzystanie pełnego zakresu dynamiki detektora.
   UWAGA: Ponieważ obrazowanie 3D jest czasochłonne, pomiary można zautomatyzować, skanując wiele próbek równolegle w różnych lokalizacjach. Aby uniknąć parowania z obiektywem zanurzeniowym w wodzie, należy użyć specjalnego medium immersyjnego z olejem o współczynniku załamania światła n = 1,33.
2. Przetwarzaj stosy konfokalne w celu uzyskania projekcji o maksymalnej gęstości, zmian odcienia kanału oraz regulacji jasności i kontrastu za pomocą dowolnego standardowego oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów).

Results

Ta sekcja ilustruje przykłady wyników, które można uzyskać za pomocą techniki MCFO w mózgu dorosłego Drosophila. Rysunek 3 pokazuje schemat metody. Trzy różnie znakowane błonowo reportery (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG i myr-smGFP-V5) pod kontrolą UAS są utrzymywane w milczeniu przez terminator transkrypcji otoczony dwoma miejscami FRT (FRT-stop-FRT). Impuls szoku cieplnego indukuje ekspresję rekombinazy Flp, która losowo usuwa kaset...

Discussion

Protokół ten opisuje łatwą i skuteczną metodę badania morfologii różnych typów komórek w tkance będącej przedmiotem zainteresowania w wysokiej rozdzielczości. W technice MCFO wiele reporterów z różnymi znacznikami epitopów jest używanych w połączeniu do wielokolorowego etykietowania stochastycznego (ryc. 2). Podobnie jak w przypadku innych metod, takich jak Brainbow/Flybow 15,16,17, MCFO zwiększa różnorodność etykiet poprzez koekspresję markerów, umożliwiając wizualizację granic komórkowych ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kąpiel wodna	Grant	GD100
Probówki do PCR	Sarstedt	72.737.002
Kleszcze	Dumont	11251-20
Naczynie preparacyjne 30 mm x 12 mmm	Mikroskopia elektronowa Nauki	70543-30	Szklana naczynie preparacyjne
Pyrex 3 Szklana płyta punktowa z depresją	Corning	7223-34	Szklane płytki preparacyjne
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	domowej roboty z węgla drzewnego
Pożywka do hodowli komórkowych ExpressFive S2	Invitrogen	10486-025
20%	Mikroskopia elektronowa PFA Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normalna surowica kozia	Jackson Laboratories	005-000-121
Normalna surowica osła	Jackson Laboratories	017-000-121
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647
Królik HA-tag	Sygnalizacja komórkowa	C29F4	Przeciwciało pierwotne, rozcieńczenie 1:500
Flaga szczura - tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:100
Mysz V5-tag: DyLight 549	AdSerotec	0411	Sprzężony przeciwciało, rozcieńczenie 1:200
anty-królik AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:250
anty-szczur DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Skontaktuj się z firmą w celu zamówienia
Szkło nasadkowe mikroskopu 22 X 60 mm	mikroskopu Marienfeld	101152
Roth	H874		22 x 22 mm
konfokalny laserowy mikroskop skaningowy
			Olejek immersyjny do mikroskopii fluorescencyjnej, bezhalogenowy
Immersol	Zeiss	W 2010	Płyn zanurzeniowy do obiektywów zanurzeniowych w wodzie, bezhalogenowy
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	Sterownik GAL4
R86E01-GAL4 (ALG)	Sterownik
Bloomington Stock Center 45914 GAL4hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAGA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	Reporter UAS (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fidżi (Zdjęcie J)			Oprogramowanie do analizy obrazu
Multi Time Macro	Zeiss		Oprogramowanie do automatycznego skanowania