Prosta eliminacja fluorescencji tła w ludzkiej tkance mózgowej utrwalonej formaliną do mikroskopii immunofluorescencyjnej

Podsumowanie

Autofluorescencja tła próbek biologicznych często komplikuje techniki obrazowania oparte na fluorescencji, szczególnie w starszych ludzkich tkankach postmitotycznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób autofluorescencja z tych próbek może być skutecznie usunięta za pomocą dostępnego na rynku źródła światła z diodą elektroluminescencyjną do fotowybielania próbki przed barwieniem immunologicznym.

Streszczenie

Immunofluorescencja to powszechna metoda używana do wizualizacji subkomórkowych kompartmentów i określania lokalizacji określonych białek w próbce tkanki. Dużą przeszkodą w uzyskaniu wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych jest endogenna autofluorescencja tkanki spowodowana starzeniem pigmentów, takich jak lipofuscyna, lub powszechnymi procesami przygotowania próbek, takimi jak utrwalanie aldehydu. Protokół ten opisuje, w jaki sposób fluorescencja tła może zostać znacznie zmniejszona poprzez fotowybielanie przy użyciu matryc diod elektroluminescencyjnych (LED) z białym luminoforem przed leczeniem za pomocą sond fluorescencyjnych. Szerokie spektrum emisji diod LED z białym luminoforem pozwala na wybielanie fluoroforów w szerokim zakresie pików emisji. Aparat do fotowybielania może być zbudowany z gotowych komponentów przy bardzo niskich kosztach i stanowi dostępną alternatywę dla dostępnych na rynku gaszących chemikaliów. Wstępna obróbka fotowybielania tkanki, a następnie konwencjonalne barwienie immunofluorescencyjne generuje obrazy wolne od autofluorescencji tła. W porównaniu z uznanymi chemicznymi środkami wygaszającymi, które zmniejszały sygnały sondy i tła, zabieg fotowybielania nie miał wpływu na intensywność fluorescencji sondy, podczas gdy skutecznie zmniejszał fluorescencję tła i lipofuscyny. Chociaż fotowybielanie wymaga więcej czasu na wstępną obróbkę, w celu skrócenia czasu fotowybielania można zastosować matryce LED o wyższej intensywności. Ta prosta metoda może być potencjalnie zastosowana do różnych tkanek, w szczególności tkanek postmitotycznych, które gromadzą lipofuscynę, takich jak mózg i mięśnie sercowe lub szkieletowe.

Wprowadzenie

Mikroskopia fluorescencyjna z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko określonym białkom jest rutynowo używana do wizualizacji interesujących białek w hodowli komórkowej i tkankach. Główną komplikacją w uzyskiwaniu wyraźnych i ostatecznych obrazów w immunofluorescencji jest autofluorescencja, która może być wywoływana endogennie w tkance ssaków przez barwnik wieku lipofuscynę oraz przez białka, takie jak elastyna i kolagen^1,2. Inne źródła autofluorescencji można wprowadzić poprzez etapy przygotowania próbki, takie jak wiązanie aldehydu³. Granulki lipofuscyny, składające się głównie z oksydacyjnie modyfikowanych reszt degradacji białek i lipidów, gromadzą się w długowiecznych komórkach o zwiększonym wieku². Powoduje to trudności w obrazowaniu tkanek postmitotycznych, takich jak mózg i mięśnie sercowe lub szkieletowe, ponieważ spektrum emisji fluorescencji lipofuscyny jest szerokie i zmienne, często pokrywając się z długością fali emisji popularnych fluoroforów używanych do znakowania⁴. Czynniki te sprawiają, że obrazowanie ludzkiej tkanki mózgowej w przypadkach chorób neurodegeneracyjnych o późnym początku, takich jak zwyrodnienie płata czołowo-skroniowego (FTLD), jest szczególnie trudne.

Aby zredukować autofluorescencję, opracowaliśmy technikę, w której naświetlamy fragmenty tkanek zamontowane na szkiełku za pomocą układu białych diod elektroluminescencyjnych (LED) za pomocą domowej lampy biurkowej⁵. Ta prosta technika stanowi alternatywę dla technik wykorzystujących chemiczne środki hartownicze, takie jak CuSO₄ w octanie amonu lub dostępne na rynku barwniki hartownicze, takie jak Sudan Black B i Eriochrome Black T⁶. Zapewnia również znaczne oszczędności kosztów w porównaniu z wielospektralnymi technikami fotowybielania lamp LED i pozwala uniknąć komplikacji i artefaktów generowanych przez cyfrowe metody usuwania autofluorescencji, takie jak spektralne odmieszanie^7,8. Diody LED z białym luminoforem mają szerokie spektrum emisji, wysoką jasność i niskie koszty produkcji, dzięki czemu idealnie nadają się jako gotowy komponent do fotowybielania różnych chromoforów^5,9.

W tym protokole demonstrujemy konstrukcję aparatu do fotowybielania przy użyciu dostępnych komponentów i stosujemy fotowybielanie do przypadku tkanki FTLD zawierającej inkluzje tau-dodatnie (FTLD-T) przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosforylowanego tau. Pokazujemy wpływ fotowybielania na obrazowanie przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu dwóch powszechnie stosowanych chromoforów: Alexa 488 i Texas Red. Wpływ fotowybielania na skrawki nieleczone lub poddane działaniu komercyjnego środka wygaszającego chemicznego jest określany ilościowo i porównywany. Ta wstępna obróbka fotowybielania może być włączona do dowolnego standardowego protokołu barwienia immunofluorescencyjnego w celu usunięcia autofluorescencji w próbce biologicznej.

Protokół

Uwaga: Prezentowana praca została wykonana zgodnie z uznanymi międzynarodowymi standardami, w tym z Międzynarodową Konferencją Harmonizacji (ICH), Radą Międzynarodowych Organizacji Nauk Medycznych (CIOMS) oraz zasadami Deklaracji Helsińskiej. Wykorzystanie tkanek ludzkich odbyło się za zgodą Rady ds. Etyki Badań Naukowych Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia. Próbki ludzkiego mózgu zostały pobrane w ramach Morskiego Banku Tkanki Mózgowej. W momencie pobierania pobrania uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.

1. Budowa aparatury i roztworów do fotowybielania

1. Przygotować roztwory podstawowe.
   1. Przygotować 1 l 1x podstawowego roztworu soli fizjologicznej buforowanej Tris (1x TBS) (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) rozpuszczając 8,77 g NaCl i 6,06 g zasady Tris w 800 ml ddH₂O i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Zwiększyć objętość do 1 l i autoklawować.
   2. Przygotuj 10% (200x zapasowy) azydek sodu, rozpuszczając 1 g azydku sodu w 10 ml ddH₂O (10%, 200x bulion).
2. W przypadku 1-3 szkiełek o standardowych rozmiarach użyj pojedynczej, przezroczystej, kwadratowej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 100 mm jako komory szkiełka. W przypadku pojedynczej komory szkiełkowej dodaj 0,25 ml 200x azydku sodu do 50 ml 1x TBS, aby uzyskać 0,05% roztwór azydku-TBS. Ułóż 2-3 komory szkiełkowe pionowo, aby przetworzyć dodatkowe szkiełka. Przygotować dodatkowe 50 ml roztworu azydku TBS do każdej komory.
3. Utwórz rusztowanie, aby podnieść komorę (komory) przesuwu tak, aby głowica lampy mogła zmieścić się pod spodem.
   1. W przypadku studzienki przesuwnej o wymiarach 100 mm x 100 mm należy wyciąć otwory w dnie i bokach plastikowego pojemnika na żywność o wymiarach 100 mm x 100 mm x 30 mm i odwrócić pojemnik. Upewnij się, że boczne otwory są wystarczająco duże, aby zmieścić źródło światła LED i upewnij się, że dolny otwór jest wystarczająco duży, aby światło ze źródła światła docierało do komory próbki bez przeszkód.
   2. Przyłóż taśmę izolacyjną do rusztowania, aby zwiększyć przyczepność między rusztowaniem a komorą na próbki/blatem stołu. Do budowy rusztowania należy użyć wszelkich alternatywnych materiałów, o ile bezpiecznie podnosi ono komorę szkiełka, nie utrudniając docierania światła do próbki.
4. Usuń wszelkie dyfuzory lub nieprzezroczyste tworzywa sztuczne z lampy biurkowej, które mogą utrudniać bezpośrednie dotarcie światła LED do sample (jeśli to możliwe) i skieruj matrycę LED do góry. Umieść rusztowanie i komorę przesuwną (komory) przesuwne nad matrycą LED. Użyj lampy z elastyczną szyjką, aby ułatwić manipulację.
5. Skonstruuj odblaskową osłonę kopuły dla aparatu, wykładając wnętrze pudełka wystarczająco dużego, aby przykryć komorę szkiełka i rusztowanie folią aluminiową. Użyj pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1 ml do pojedynczej komory lub pudełka kartonowego o wymiarach 150 mm x 150 mm x 150 mm do wielu pionowo ułożonych komór.

2. Wstępna obróbka fotowybielacza skrawków tkanek

UWAGA: Przygotowanie sekcji tkanki może się różnić w zależności od źródła tkanki oraz zastosowanych metod utrwalania i osadzania. W tym przypadku tkanka mózgowa (zakręt oczodołowo-czołowy) z przypadku FTLD-T została utrwalona na ~ 2 dni w formalinie, przepuszczona przez gradient sacharozy, osadzona w OCT i pocięta na odcinki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu.

1. W chłodni o temperaturze 4 ºC, chłodni lub lodówce ustawić lampę pod rusztowaniem i umieścić komorę na próbki na rusztowaniu. Wlać 50 ml roztworu azydku TBS do komory na próbkę.
2. Zanurz skrawki tkanek zamontowane na standardowych szkiełkach mikroskopowych w komorze szkiełka zawierającej azydek-TBS za pomocą czystych kleszczy. W przypadku wielu szkiełek należy upewnić się, że szkiełka są umieszczone w komorze na jednej warstwie.
3. Przykryj aparat kopułą odblaskową, włącz lampę LED i inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.

3. Immunofluorescencja

1. Aby wybarwić tkankę pod kątem fosforylowanego tau za pomocą barwnika przeciwbarwiącego DAPI i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexa 488 i Texas Red, najpierw przygotuj roztwory do pobierania antygenu, przepuszczalności, blokowania i wiązania przeciwciał pierwotnych.
   1. Przygotować 500 ml buforu do odzyskiwania antygenu (10 mM kwasu cytrynowego, 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, 0,05% Tween 20; pH 6,2) przez rozpuszczenie 0,92 g kwasu cytrynowego i 0,37 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 500 ml ddH₂O. Dostosuj pH do 6,2 za pomocą NaOH i dodaj 0,25 ml Tween 20.
   2. Przygotuj 500 ml 0,025% Triton X-100 w roztworze TBS (TBS-Triton), dodając 0,125 ml Triton X-100 do 500 ml 1x TBS.
   3. Przygotować 1% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w TBS (bufor BSA-TBS), rozpuszczając 0,1 g BSA w 10 ml TBS.
   4. Przygotuj roztwór blokujący, dodając 0,2 ml normalnej surowicy koziej do 1,8 ml 1% BSA/TBS.
   5. Na każde szkiełko należy przygotować 150 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:100), pipetując 1,5 μl przeciwciała anty-fosfo-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) do 148,5 μl 1% buforu BSA-TBS i pozostawić na lodzie.
2. Aby pobrać antygen, zanurz fotowybielane szkiełka pionowo w kolektorze szkiełek zawierającym 25 ml buforu do odzyskiwania antygenu. Zabezpiecz kolektor taśmą i/lub sznurkami tak, aby kolektor nie wpadł do łaźni wodnej. Podgrzewać kolektor w łaźni wodnej o temperaturze 90 ºC przez 30 minut i pozostawić kolektor do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 30 minut przed wyjęciem szkiełek. Nie usuwaj szkiełek od razu, ponieważ spowoduje to wyschnięcie sekcji.
3. Przenieś szkiełka z kolektora do pobierania antygenu do słoika barwiącego wypełnionego 30 ml TBS-Triton i myj skrawki przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej, delikatnie wstrząsając. Powtórz pranie raz ze świeżym TBS-Triton. Usuń nadmiar buforu niestrzępiącą się chusteczką i obrysuj tkankę hydrofobowym pisakiem. Uważaj, aby szkiełka nie wyschły.
   1. Dla każdego szkiełka należy zablokować tkankę, pipetując 200 μl roztworu blokującego na tkankę i umieścić szkiełko w wilgotnej komorze. Zbuduj komorę, umieszczając stojak na suwaki w pudełku z końcówkami do pipet zawierającym mokry ręcznik papierowy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na równej powierzchni. Upewnij się, że roztwór blokujący całkowicie pokrywa tkankę.
4. Usunąć roztwór blokujący przez aspirację i odpipetować 100-150 μl roztworu przeciwciała pierwotnego na tkankę. Upewnij się, że obecna jest wystarczająca objętość przeciwciała i że sekcja znajduje się na równej powierzchni, aby uniknąć gromadzenia się roztworu przeciwciała na jednej stronie. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze.
5. Przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych i przeciwbarwienie jądrowe DAPI.
   1. Na każde szkiełko należy przygotować 150 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenia 1:100), dodając 1,5 μl koziej anty-mysiej Alexa 488 i 1,5 μl koziej anty-mysiej czerwieni Texas do 147 μl BSA-TBS i pozostawić na lodzie.
   2. Przygotować 0,1 μg/ml barwnika przeciwstawnego DAPI przez seryjne rozcieńczanie. Dokładnie wymieszać roztwór podstawowy i rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego 5 mg/ml DAPI w 999 TBS, aby uzyskać 1 ml roztworu o stężeniu 5 μg/ml. Na każdym szkiełku rozcieńczyć 3 μl roztworu o stężeniu 5 μg/ml ze 147 μl TBS do końcowego stężenia 0,1 μg/ml.
      UWAGA: DAPI jest znanym mutagenem i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
6. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe przez aspirację. Zanurz szkiełka w szklanym słoiku do barwienia zawierającym 30 ml TBS-Triton i myj przez 5 minut z delikatnym mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej. Powtórz etap mycia ze świeżym TBS-Triton. Usunąć nadmiar TBS-Triton i odpipetować od 100 do 150 μl mieszaniny przeciwciał wtórnych do każdego szkiełka.
   1. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie pokryta mieszaniną przeciwciał. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze w ciemności.
7. Usunąć mieszaninę przeciwciał drugorzędowych przez aspirację i przenieść szkiełko do szklanego słoika do barwienia zawierającego 30 ml TBS (bez Tritonu). Myć przez 5 minut z delikatnym mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej. Powtórz etap mycia ze świeżymi TBS. Nałóż od 100 do 150 μl 0,1 μg/ml barwnika przeciwstawnego DAPI na każde szkiełko i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
8. Przenieś szkiełka do szklanego słoika do barwienia zawierającego TBS i umyj 3 razy z delikatnym mieszaniem przez 5 minut każde, używając świeżych TBS do każdego prania. Usuń nadmiar bufora.
9. Nałóż 3 krople wodnego podłoża montażowego na tkankę. Za pomocą kleszczy delikatnie opuść czyste szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczkę, zaczynając od jednej krawędzi i powoli opuszczając drugą krawędź, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Należy uważać, aby nie usunąć szkiełka nakrywkowego w przypadku natychmiastowego obrazowania. W przeciwnym razie poczekaj, aż podłoże montażowe wyschnie przed przechowywaniem w temperaturze 4 ºC w ciemności.

4. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Włącz lampę fluorescencyjną, mikroskop i komputer i pozwól lampie rozgrzać się przez 15 minut. Umieść wybarwione szkiełka tkankowe w stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj obrazu w jasnym polu, aby zlokalizować tkankę w 10-krotnym powiększeniu.
2. Nałóż kroplę ddH₂O na powierzchnię szkiełka nakrywkowego i użyj soczewki obiektywowej 20x zanurzonej w wodzie (NA=1,0). Wybierz ustawienie 4-liniowego skanowania płaszczyzny średniej. Ustaw rozmiar otworka na 1 jednostkę Airy, która daje wycinek optyczny o wielkości ~3 mikronów. Wybierz długości fal wzbudzenia i emisji lasera dla każdego fluoroforu w oddzielnych ścieżkach, aby uzyskać najlepszy sygnał.
   UWAGA: Alexa 488: λ_ex = 488 nm (laser argonowy) λ_em = 493-570 nm; Czerwień teksacka: λ_ex = 561 nm (laser DPSS 561 nm), λ_em = 601-635 nm; DAPI: λ_ex = 405 nm (laser diodowy 405), λ_em = 410-507 nm.
   1. Dostosuj ustawienia mocy lasera i wzmocnienia, aby zoptymalizować intensywność sygnału dla każdej ścieżki. Zbierz obraz kompozytowy i zapisz. Użyj tych samych ustawień lasera, aby porównać intensywność fluorescencji na innym szkiełku.
3. Aby zobrazować intensywność fluorescencji w każdym kanale, zainstaluj makro narzędzi profilu RGB dla ImageJ¹⁰. Zapisz makro ze strony internetowej jako plik tekstowy (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Z menu ImageJ wybierz Plugins -> Macros -> Install; wybierz plik tekstowy, aby zainstalować narzędzie Profile RGB.
   1. Otwórz plik obrazu konfokalnego w ImageJ i przekonwertuj obrazy kompozytowe z 3 stosów na RGB, wykonując następujące czynności: Narzędzie Obraz -> Kolor -> Kanał. Wybierz "Kompozyt" z menu rozwijanego i zaznacz wszystkie trzy kanały. Następnie wybierz Obraz -> Typ -> Kolor RGB.
   2. Wybierz ikonę narzędzi profilu RGB i narysuj linię w poprzek przekroju obrazu, który ma zostać profilowany. Zapisz dane intensywności jako arkusz kalkulacyjny do kreślenia.

Wyniki

Etap wstępnego leczenia fotowybielaniem może być dodany do standardowego protokołu immunofluorescencji bezpośrednio przed pobraniem antygenu i barwieniem immunologicznym (Rysunek 1A). Montaż aparatu do fotowybielania może być również wykonany przy użyciu różnych, niedrogich, gotowych komponentów (Rysunek 1B). Widmo emisji diod LED z białym luminoforem obejmuje szeroki zakres długości fal, co sprawia, że nadają się one do fotowybielania w s...

Dyskusja

Opisana w tym manuskrypcji wstępna obróbka fotowybielania tkanek pozwala na skuteczną eliminację autofluorescencji przy użyciu gotowych składników. Protokół opisuje obrazowanie immunofluorescencyjne fosforylowanych agregatów tau w ludzkiej tkance mózgowej utrwalonej w formalinie przy użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexa 488 i Texas Red, z DAPI jako przeciwbarwieniem jądrowym. Aby zastosować metodę do innych tkanek, zalecamy wykonanie 48-godzinnej obróbki wstępnej fotowybielania próbki jako punktu wyjścia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Cholorek sodu	Sigma-Aldrich	S7653
Kwas solny	Caledon Chemikalia laboratoryjne	1506656
Azydek sodu	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Naczynie Pitri	Sarstedt	82.9923.422	Wszystkie elementy fotowybielacza można zastąpić w zależności od dostępności
Lampa biurkowa ściemnialna LED o mocy 6 W	DBPower	DS501	Wszystkie elementy fotowybielacza można zastąpić w zależności od dostępności
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	C-2404
Kwas etylenodiaminotetraoctowy ( EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Wodorotlenek sodu	BioShop Canada	SHY700.1
Łaźnia wodna	Haake Fisons	K15
Kolektor do slajdów	FisherScientific	12-587-17B
Słoik do barwienia	FisherScientific	E94
Wytrząsarka orbitalna	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Albumina surowicy bydlęcej	FisherScientific	BP1600-1
Normalna surowica kozia	Aurion	905.002
Długopis hydrofobowy	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Przeciwciało monoklonalne (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszy, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszy, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Podłoże montażowe	ThermoScientific	28-600-42
Szklany szkiełko
konfokalne Mikroskop	Zeiss	LSM710
ZEN 2012 Black Edition 11.0	Oprogramowanie Zeiss	LSM710	dołącza do mikroskopu konfokalnego
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Komercyjny hartownik chemiczny	Biotum	23007