Artykuł metodologiczny

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

DOI:

10.3791/56195

⸱

25 sierpnia 2017

 , 
1Gene Editing Institute, Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute, Christiana Care Health Services, 2Department of Medical Sciences, University of Delaware

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombinatoryczna edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 i jednoniciowych oligonukleotydów jest skuteczną strategią korygowania mutacji jednopunktowych, które często są odpowiedzialne za różne choroby dziedziczne u ludzi. Korzystając z dobrze ugruntowanego systemu modelowego opartego na komórkach, mutacja punktowa zmutowanego genu eGFP z pojedynczą kopią zintegrowanego z komórkami HCT116 została naprawiona przy użyciu tego podejścia kombinatorycznego. Analiza komórek skorygowanych i nieskorygowanych ujawnia zarówno precyzję edycji genów, jak i rozwój zmian genetycznych, gdy w nieskorygowanych komórkach w sekwencji DNA otaczającej miejsce docelowe powstają indele. W tym miejscu przedstawiono konkretną metodologię zastosowaną do analizy tego kombinatorycznego podejścia do edycji genów mutacji punktowej, w połączeniu ze szczegółową strategią eksperymentalną pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym. Protokół ten nakreśla podstawowe podejście i przepływ pracy dla badań mających na celu opracowanie edycji genów opartej na CRISPR/Cas9 do terapii u ludzi. Wnioskiem z tej pracy jest to, że mutageneza na miejscu zachodzi w wyniku aktywności CRISPR/Cas9 podczas procesu naprawy mutacji punktowej. Prace te wprowadzają ustandaryzowaną metodologię identyfikacji stopnia mutagenezy, która powinna być ważnym i krytycznym aspektem każdego podejścia przeznaczonego do wdrożenia klinicznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pionierskie badania Mandeckiego (1986) wykazały trwałe zmiany w plazmidowym DNA za pomocą oligonukleotydów przekształconych w bakterie1, podczas gdy Walder i Walder (1986) przeprowadzili podobne badania na drożdżach2. Wkrótce potem Sherman i jego koledzy opublikowali serię artykułów, w których jednoniciowe oligonukleotydy zostały wprowadzone do komórek drożdży, aby dokonać dziedzicznych zmian w genach3. Opierając się na przełomowych pracach w komórkach mikrobiologicznych, Kmieć i współpracownicy zaczęli opracowywać unikalne oligonukleotydy z pojedynczym czynnikiem, które kierowały naprawą pojedynczej zasady w komórkach ssaków4. Koncepcja ta opierała się na danych biochemicznych, które wykazały, że cząsteczki zawierające RNA wiążą się ściślej z miejscem docelowym niż te złożone wyłącznie z zasad DNA. Chociaż pojawiły się liczne doniesienia o sukcesie edycji genów przy użyciu chimerycznych oligonukleotydów5,6,7, poziomy edycji pozostały bardzo zróżnicowane między eksperymentami i w różnych kombinacjach cel/komórka.

Jednoniciowe DNA dawcy jest preferowane niż dwuniciowe DNA dawcy, ponieważ jest mniej prawdopodobne, że zostanie zintegrowane w losowych miejscach w genomie8. Jednak egzogennie wprowadzone jednoniciowe oligonukleotydy są podatne na szybką degradację przez nukleazy komórkowe. Zastosowano kilka strategii ochrony końców oligonukleotydów przed degradacją. Chroniony egzonukleazą, jednoniciowy DNA zawierający pożądaną sekwencję był wystarczający do uzyskania wydajności edycji w zakresie 0,1-1%6. Ulepszone i bardziej spójne techniki transfekcji, w połączeniu z odczytami fenotypowymi, pozwoliły na bardziej spójną edycję przez wiele grup badawczych8,9,10,11,12,13.

W ciągu ostatnich 10 lat podjęto znaczne wysiłki, aby komórki docelowe były bardziej podatne na edycję genów. Jedna ze strategii wykorzystuje modulację cyklu komórkowego14,15,16. Podczas gdy częstość edycji w normalnych warunkach reakcji z jednoniciowymi oligonukleotydami (ssODN) wprowadzonymi do hodowanych komórek ssaków wahała się między 0,1% a 1%, częstość edycji genów wzrosła od 3 do 5 razy, gdy oligonukleotydy zostały wprowadzone do komórek podczas ich przejścia przez fazę S. W osobnej serii eksperymentów Brachman i Kmiec (2005) wykazali, że stosunkowo wysoki poziom precyzyjnej edycji genów (3-5%) uzyskano, gdy 2'3'dideoksycytozyna (ddC) była inkubowana w komórkach przez 24 godziny przed dodaniem oligonukleotydu17. ddC zmniejsza szybkość ruchu widełek replikacyjnych DNA, co sugeruje, że edycja genów przez ssODN w replikujących się komórkach prawdopodobnie wiąże się z włączeniem ODN do regionów aktywnej replikacji11,18. Podsumowując, badania te doprowadziły do koncepcji, że DNA dawcy zostaje włączone do rosnących widełek replikacyjnych jako część prawdziwego mechanizmu działania edycji genów, niezależnie od tego, czy występuje dwuniciowe pęknięcie, czy nie19. W ten sposób korekta mutacji punktowej lub zastąpienie segmentu DNA w chromosomie następuje poprzez parowanie DNA i szlak asymilacji jednoniciowej.

Wywoływanie losowych pęknięć dwuniciowego DNA w rosnących komórkach za pomocą czynników małocząsteczkowych tworzy środowisko, w którym procesy replikacji DNA są wstrzymywane, gdy komórka próbuje naprawić uszkodzenie20,21. To przejściowe spowolnienie widełek replikacyjnych umożliwia bardziej efektywną penetrację struktury chromatyny przez jednoniciowe oligonukleotydy edycyjne, poprawiając dostępność celu15. Wykazano, że tworzenie dwuniciowych pęknięć DNA przez leki takie jak VP16, bleomycyna lub camptothecin22,23, stymuluje poziom edycji genów prawie 10-krotnie, do 6-8%. Jednak losowe dwuniciowe pęknięcia DNA są niepożądane w warunkach terapeutycznych.

Edycja genów za pomocą programowalnych nukleaz i oligonukleotydów jest również stymulowana podczas podziału komórki24,25. Kiedy dostarczanie oparte na kwasach nukleinowych zostało wykorzystane do przeprowadzenia naprawy ukierunkowanej na homologię w zsynchronizowanych komórkach HCT 116, Rivera-Torres i współpracownicy wykazali ten sam wzrost aktywności celowania, gdy nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) zastosowano z jednoniciowymi oligonukleotydami, wprowadzonymi do replikującej się populacji komórek26,27 . Niedawno Bialk i współpracownicy wykazali, że naprawa mutacji pojedynczej zasady z jednoniciowymi oligonukleotydami i szeregiem zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych, krótkich powtórzeń palindromicznych cząsteczek Cas9 (CRISPR/Cas9) odbywa się z większą skutecznością, gdy populacja komórek przechodzi przez fazę S28. Cząsteczka CRISPR składa się z RNA i służy do identyfikacji regionu w docelowej sekwencji DNA, który jest przeznaczony do rozszczepienia. Cas9 jest enzymem bakteryjnym, którego funkcją jest rozszczepianie dwuniciowego DNA w reakcji wymiany nukleolitycznej. W ten sposób CRISPR umieszcza kompleks na celu genomowym, a nukleaza Cas9 wykonuje dwuniciowe pęknięcie. Lin i in. (2014) wykazali również znaczenie cyklu komórkowego dla osiągania wysokich częstotliwości edycji genów, przy użyciu zmodyfikowanego systemu dostarczania za pośrednictwem kompleksu CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) w pierwotnych fibroblastach noworodków, ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i innych liniach komórkowych24. Tak więc związek ustalony między edycją genów a progresją cyklu komórkowego dla edycji genów pojedynczego czynnika ma zastosowanie do kombinatorycznej edycji genów przy użyciu programowalnych nukleaz i matryc DNA dawcy. Podczas gdy kombinatoryczne podejście do edycji genów połączyło wielu partnerów z matrycą DNA dawcy, większość pracowników w tej dziedzinie używa CRISPR/Cas9 do zapewnienia dwuniciowej funkcji przerwania. Wybór ten opiera się na łatwości użycia tego konkretnego narzędzia genetycznego i elastyczności, z jaką można je wykorzystać do wyłączenia funkcji genu lub wprowadzenia obcego fragmentu DNA do określonego miejsca. Generowanie nokautu jest technicznie łatwiejsze w porównaniu z wymianą genu, gdzie włączenie "prawidłowych" lub normalnych kopii genu do miejsca choroby musi być przeprowadzone z precyzją. Wielu badaczy identyfikuje i bada zastosowanie określonych leków i odczynników, które umożliwiają korektę zmutowanych zasad i wstawienie normalnych sekwencji genetycznych we właściwej pozycji przy podwyższonych częstotliwościach29.

Ostatnio, Rivera-Torres et al.30 wykorzystał kombinatoryczną edycję genów, wykorzystując dwuniciową aktywność przerwania specjalnie zaprojektowanego systemu CRISPR/Cas9 oraz informację genetyczną dostarczaną przez jednoniciową matrycę DNA donora oligonukleotydowego, aby naprawić mutację punktową w pojedynczej kopii genu wzmocnionego białka zielonego fluorescencji (eGFP) zintegrowanego z komórkami HCT116. Autorzy wykorzystali tę dobrze scharakteryzowaną modelową linię komórkową do oceny specyficzności rozszczepienia otaczającego miejsce docelowe. Dane ujawniają, że istnieje heterogeniczność w miejscu docelowym, szczególnie w komórkach, które nie zawierają skorygowanej mutacji punktowej. W tym manuskrypcie szczegółowo opisujemy i skupiamy się na metodologii stosowanej przez tych pracowników do badania heterogeniczności mutacji na miejscu utworzonej przez edycję genów CRISPR/Cas9.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół obejmuje pracę z komórkami ssaków; oczekuje się znajomości techniki sterylnej/hodowli komórek.

1. Warunki linii komórkowej i hodowli

  1. Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli komórek HCT 116: zmodyfikowana pożywka McCoy's 5A uzupełniona 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny (jest to kompletna pożywka).
    UWAGA: Przed posiewem hoduj komórki HCT 116-19 w kolbie T-75 lub T-175. Gdy 90% zlewa się, każda kolba T-75 da 8,4 x 106 komórek, około pięciu 10-centymetrowych płytek, a każda T-175 da 18,4 x 106 komórek, około piętnaście 10-centymetrowych płytek.

2. Pobieranie komórek z kolby

  1. Odessać pożywkę, przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami bez wapnia i magniesium (PBS) firmy Dulbecco (10 ml dla T-75 lub 25 ml dla T-175) i aspirować.
  2. Dodawać trypsynę kroplami do kolby za pomocą pipety o pojemności 2 ml (2 ml dla T-175 lub 1 ml dla T-75). Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 5 minut, aby umożliwić odłączenie komórek.
  3. Postukać w kolbę, aby upewnić się, że wszystkie komórki są usunięte, a następnie ugasić kompletnym podłożem, rozpraszając je na całej powierzchni kolby (8 ml dla T-175 lub 4 ml T-75).
  4. Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml
  5. Przed odwirowaniem komórek należy pobrać 10 μl ze stożkowego 15 ml i połączyć je z 10 μl błękitu trypanowego, aby policzyć komórki. Granulować komórki, wirując przez 5 minut w temperaturze 125 x g i temperaturze 16 °C.

3. Liczenie komórek

  1. Przenieść 10 μl komórek zmieszanych z błękitem trypanowym do hemocytometru. Policz 4 siatki na zewnątrz (każda siatka zawiera 16 kwadratów).
    1. Weź średnią liczbę komórek z każdego zestawu szesnastu kwadratów narożnych.
    2. Pomnóż przez 10 000 (104).
    3. Pomnożyć przez całkowitą objętość pożywki użytej do zebrania komórek, aby skorygować rozcieńczenie z dodatku błękitu trypanowego.
      UWAGA: Format równania do obliczenia objętości do ponownego zawieszenia komórek jest następujący:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2

4. Powlekanie komórek

  1. Na każdą 10-centymetrową płytkę komórek, która ma być zsynchronizowana, dodaj 5 ml kompletnej pożywki i 6 μM afidicholiny (12 μl z 2,5 mM zapasu w 200-procentowym etanolu).
  2. Przenieś 100 μl ponownie zawieszonych osadów komórkowych, 2,5 x 106 komórek, na każdą 10-centymetrową płytkę i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.
  3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16-24 godziny w celu zsynchronizowania komórek na granicy G1/S.

5. Uwalnianie komórek od synchronizacji afidikoliny

  1. Na 4 godziny przed celowaniem odessać pożywkę, przemyć PBS, odessać PBS i dodać 5 ml kompletnej pożywki
  2. Umieścić go z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny

6. Kompleksowanie RNA

  1. Wprowadź sekwencję zmutowanego genu eGFP do internetowego generatora 25 (http:// crispr.mit.edu/) i wybierz sekwencje prowadzące CRISPR, które wiążą się w bliskiej odległości od miejsca docelowego. Uzyskaj sekwencje przewodnika CRISPR ze źródła komercyjnego.
  2. Przechowuj CRISPR RNA (crRNA), trans-aktywujące crRNA (tracrRNA) i białko Cas9 w temperaturze 20 °C i stosuj zgodnie z sugestiami producenta.
    1. Wymieszać RNA w stężeniach równomolowych do 45 μM. Dodać 6,75 μl 200 μM zapasu crRNA i 6,75 μl 200 μM zapasu tracrRNA do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 16,50 μl buforu TE, aby uzyskać końcową objętość 30 μl.
  3. Podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut w bloku grzewczym lub maszynie do PCR.
    Uwaga: gorąco!
  4. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    UWAGA: Jeśli używasz maszyny do PCR, ustaw chłodzenie na 0.2 °C/s.
  5. Wykonaj następujące czynności dla każdej próbki.
    1. Rozcieńczyć 2,22 μl kompleksu crRNA:tracrRNA w 2,78 μl buforu TE (10 mM Tris, pH 8,0 i 0,1 mM EDTA; pH 8,0) do końcowej objętości 5 μL.
    2. Rozcieńczyć 1,67 μl białka Cas9 z 60 μM w 3,33 μl pożywki o niskiej surowicy do końcowej objętości 5 μl.
  6. Wymieszaj 5 μl białka Cas9 z 5 μl skompleksowanego RNA

7. Zbieranie komórek w celu targetowania

  1. Odessać pożywkę, przemyć 5 ml PBS, odessać PBS i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej trypsyny do każdej 10-centymetrowej płytki. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 5 minut.
  2. Postukaj w 10-centymetrową płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte, a następnie zapełnij 4 ml kompletnego podłoża, rozpraszając je na całej powierzchni płytki.
  3. Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Przed odwirowaniem komórek należy pobrać 10 μl ze stożkowej probówki o pojemności 15 ml i połączyć je z 10 μl błękitu trypanowego, aby policzyć komórki. Granulować komórki, wirując przez 5 minut w temperaturze 125 x g i temperaturze pokojowej.
  5. Odessać pożywkę i przemyć 5 ml PBS. Granulować komórki, wirując w tempie 125 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

8. Liczenie komórek

  1. Przenieść 10 μl komórek zmieszanych z błękitem trypanowym do hemocytometru. Policz 4 siatki na zewnątrz (każda siatka zawiera szesnaście kwadratów).
    1. Weź średnią liczbę komórek z każdego zestawu szesnastu kwadratów narożnych.
    2. Pomnóż przez 10 000 (104).
    3. Pomnożyć przez całkowitą objętość pożywki użytej do zebrania komórek, aby skorygować rozcieńczenie z dodatku błękitu trypanowego.
      UWAGA: Poniżej znajduje się format równania do obliczenia objętości do ponownego zawieszenia komórek. Ponownie zawiesić wymaganą liczbę komórek w zmodyfikowanym pożywce McCoy's 5A bez surowicy.
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4

9. Kierowanie na próbki

  1. Przenieś 100 μl zawiesiny ogniw (5 x 105 ogniw) z kroku 8.1 do każdej kuwety elektroporacyjnej o odstępie 4 mm. Dodać 10 μl kompleksu RNP z kroku 6,7 do 100 μl komórek o gęstości 5 x 105 komórek. Dodać ODN (2 μM) do każdej próbki.
    UWAGA: W celu kontroli dodatniej dodać 1 μl eGFP przy stężeniu 1 μg/μl plazmidu wykazującego ekspresję
    1. Zabierz stojak do maszyny do elektroporacji, delikatnie strzepnij każdą próbkę i umieść ją w komorze. Elektroporacja przy 250 V, LV; 2 impulsy, 1 s; 13 ms; Impuls jednobiegunowy.
  2. Przenieś stojak z powrotem do okapu. Przenieść każdą próbkę do studzienki zawierającej 2 ml kompletnego podłoża na płytce 6-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny przed sprawdzeniem poziomów korygujących.

10. Analiza komórek z edytowanymi genami i wydajność transfekcji

  1. Odessać pożywkę i przemyć komórki 2 ml PBS. Odessać PBS i dodać 500 μl wstępnie podgrzanej trypsyny do każdego dołka 6-dołkowej płytki. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 5 minut.
  2. Postukaj w płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki są usunięte, a następnie zalać 1 ml kompletnego podłoża, rozpraszając je na całej powierzchni studzienki.
  3. Przełóż komórki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i osad o masie 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zassać pożywkę. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu FACS (0,5% BSA, 2 mM EDTA i 2 μg/ml jodku propidyny w PBS).
  5. Zmierz fluorescencję komórek (eGFP+) za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. Oblicz skuteczność korekcji jako procent całkowitej liczby żywych komórek eGFP-dodatnich w stosunku do całkowitej liczby żywych komórek w każdej próbce, zgodnie z opisem w Rivera Torres i wsp30.

11. Analiza sekwencji DNA

  1. Elektroporować zsynchronizowane i uwolnione komórki HCT 116-19 w stężeniu 5 x 105 komórek/100 μL, z kompleksem RNP przy 100 pmols i 72NT ODN przy 2,0 μM.
  2. Przenieś komórki na płytki 6-dołkowe i pozwól im dojść do siebie przez 72 godziny.
  3. Posortuj komórki pojedynczo na płytki 96-dołkowe za pomocą sortera FACS z laserem 488 nm (100 mw) dla eGFP+/-, zgodnie z opisem w Rivera-Torres et al30.
    UWAGA: Nie wszystkie studnie będą z powodzeniem rosły.
  4. Roznów komórki w ciągu 6 tygodni i zbieraj zgodnie z opisem w kroku 7.
  5. Z dołków, w których nastąpił wzrost, wyizoluj komórkowy gDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA (patrz Tabela materiałów) i amplifikuj region otaczający docelową zasadę za pomocą PCR (718 pz; starter do przodu 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3' i starter odwrotny 5'-ACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3').
  6. Wykonaj analizę sekwencjonowania DNA na próbkach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy systemu modelowego do badania edycji genów w komórkach ssaków, który opiera się na korekcie mutacji punktowej osadzonej w genie eGFP zintegrowanej jako pojedyncza kopia w komórkach HCT116. Ważne jest, aby pamiętać, że jest to gen z pojedynczą kopią; w ten sposób można uzyskać mniej skomplikowany pogląd na zmiany DNA lub mutagenezę. Rysunek 1A przedstawia sekwencję zmutowanego genu eGFP z docelową bazą, trzecią zasadą TAG kodonu stop, podświetloną na czerwono. Zilustrowano również oligonukleotyd 72-zasadowy, który jest częściowo komplementarny do nietranskrybowanej nici genu eGFP (72NT) i ma za zadanie indukować wymianę zasad z G na C. Ponadto, CRISPR, oznaczony jako 2C, ze wskazaną sekwencją protospacer w orientacji od 5' do 3', jest również przedstawiony w Rysunek 1A. Aby przeprowadzić tę reakcję edycji genów, użyliśmy rybonukleoproteiny (RNP) składającej się z RNA CRISPR (cr) i RNA tracr (tr) sprzężonego z oczyszczonym białkiem Cas9 (Figura 1B), zamiast używać wektora ekspresji ssaków składającego się z genu Cas9 i odpowiedniej specyficznej sekwencji przewodnika RNA.

Gdy specjalnie zaprojektowana cząstka RNP jest dostarczana z jednoniciowym oligonukleotydem do komórek HCT116 za pomocą elektroporacji, edycja genów, potwierdzona naprawą mutacji pojedynczej zasady w eGFP, jest obserwowana po 72 godzinach inkubacji za pomocą cytometru przepływowego. Naprawę funkcjonalną można zaobserwować poprzez pojawienie się zielonej fluorescencji w docelowych komórkach, komórkach, które można również oddzielić od całej populacji poprzez sortowanie z powodu tej fluorescencji. Jak pokazano na Rysunek 2, stopniowa reakcja na dawkę może być widoczna jako wzrost skoordynowanych poziomów RNP i 72NT. Stosunek molekularny, pikomole RNP i stężenie mikromolowe 72NT, jak pokazano na rysunku, są oparte na optymalnych dawkach stosowanych w reakcjach edycji genów, które są zależne od wprowadzenia Cas9 i specyficznego przewodnika RNA z transfekowanych wektorów ekspresyjnych. Wstawka w Rysunek 2 przedstawia reakcję edycji genów przeprowadzoną pod nieobecność cząstki RNP. W tym przypadku około 1% docelowych komórek jest korygowanych, gdy w reakcji edycji genów z pojedynczym czynnikiem stosuje się 10-krotnie wyższe stężenie oligonukleotydu 72NT.

Aby ustalić, czy w miejscu docelowym występuje heterogeniczność genetyczna - tzw. efekt mutagenezy na miejscu - postanowiliśmy zbadać wynik edycji genów w poszczególnych komórkach. Chociaż jest to o wiele bardziej pracochłonne niż badanie całej populacji, prawdziwy pomiar śladów genetycznych lub zmian chorobowych można ustalić, gdy bada się genom komórek rozszerzonych klonalnie. Powtórzyliśmy eksperyment opisany w Rysunek 2, tym razem używając tylko 100 pmol kompleksu RNP i 2,0 μmol oligonukleotydu 72NT. Jak wyżej, komórki HCT 116 synchronizowano przez 24 godziny z afidicholiną i zatrzymano na granicy G1/S. Po 4 godzinach komórki zostały uwolnione, a narzędzia do edycji genów zostały wprowadzone za pomocą elektroporacji. 72 godziny później komórki przeanalizowano za pomocą FACS i posortowano indywidualnie na 96-dołkowe płytki (proces eksperymentalny jest zilustrowany na Rysunek 3). Komórki wykazujące zieloną fluorescencję posortowano za pomocą cytometrii przepływowej do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki w celu ekspansji klonalnej. Co ważne, komórki pozbawione ekspresji eGFP zostały również wyizolowane i posortowane w podobny sposób w celu ekspansji w tych samych warunkach.

Po 14 dniach wzrostu, większość indywidualnych klonów rozrosła się na tyle, że możliwa była izolacja DNA. W związku z tym wybrano 16 klonów próbek z dodatnim wynikiem eGFP, a integralność genetyczna otaczająca miejsce docelowe została przeanalizowana za pomocą sekwencjonowania DNA. Informacje dotyczące sekwencji DNA alleli w populacji zostały wygenerowane przy użyciu sekwencjonowania Sangera, zmontowane przy użyciu oprogramowania do wizualizacji sekwencji w celu porównania sekwencji allelu typu dzikiego (Figura 4A). Miejsce cięcia kompleksu RNP jest oznaczone czarną strzałką, umieszczoną na zielonym pasku (2C crRNA). Jak pokazano również w Rysunek 4A, wszystkie 16 komórek eGFP-dodatnich zawiera przewidywaną wymianę nukleotydów w miejscu docelowym. Przekształcona reszta C jest podświetlona na czerwono, a profil piku odzwierciedlający tę dokładną zmianę znajduje się pod sekwencją eGFP-dodatnią. W podobny sposób 15 niezielonych izolatów klonalnych, wystarczająco rozszerzonych, aby umożliwić ekstrakcję i sekwencjonowanie DNA, przeanalizowano pod kątem niejednorodności w miejscu docelowym. Zgodnie z przewidywaniami, w około połowie próbek nie zaobserwowano wymiany zasad DNA. Znajduje to odzwierciedlenie w utrzymaniu reszty G w miejscu docelowym, jak pokazano na Rysunek 4B. Pozostałe ekspansje klonalne badane w tych eksperymentach wykazywały niejednorodną populację mutacji delecyjnych, co odpowiada za brak zielonej fluorescencji. Rozmiar usuwania wahał się od jednej bazy do 19 zasad. Ważne jest, aby pamiętać, że zbadaliśmy tylko 15 próbek komórek eGFP-dodatnich i chociaż uważamy, że jest to dość reprezentatywne dla rodzaju zmian genetycznych pozostawionych przez aktywność CRISPR/Cas9, istnieje możliwość, że inne typy lub formy indeli mogą być obecne w docelowej populacji.

Razem wzięte, wyniki wyświetlane w Rysunek 4 potwierdzają odczyt fenotypowy w systemie celowania eGFP. Konwersja nukleotydu G do C umożliwia pojawienie się zielonej fluorescencji w skorygowanych komórkach HCT116. Nie zaobserwowano podstawiania zasad otaczających miejsce docelowe w klonach wyizolowanych w tym eksperymencie lub w poprzednich eksperymentach27,28. Dane pokazują również, że komórki, które nie przechodzą edycji genów poprzez naprawę mutacji punktowej, pozostają nieskorygowane, ale w niektórych przypadkach nie niezmienione, z szeregiem heterogeniczności genetycznej otaczającej miejsce docelowe.

figure-results-1
Rysunek 1. (A) Modelowy system do edycji genów zmutowanego genu eGFP. Odpowiednie segmenty dzikiego i zmutowanego genu eGFP z docelowym kodonem, znajdującym się w środku sekwencji, są wyświetlane odpowiednio na zielono i czerwono. Nukleotyd przeznaczony do wymiany jest pogrubiony i podkreślony. Podświetlone na niebiesko zasady reprezentują sekwencję protospacerową 2C CRISPR, a pomarańczowe zasady podkreślają miejsce PAM. Oligonukleotyd użyty w tych eksperymentach ma długość 72 zasad, z wiązaniami zmodyfikowanymi fosforanotaniami na trzech końcowych zasadach; 72-mer jest ukierunkowany na nić nietranskrybowaną (NT) (72BA). (B) Reakcja składania rybonukleoprotein CRISPR/Cas9. crRNA zapewnia swoistość docelową (20 zasad, sekcja czerwona) odpowiadającą sekwencji protospacerowej 2C oraz domenę interakcji (kolor niebieski) z tracrRNA (kolor zielony). crRNA i tracrRNA są wyżarzane w stężeniach równomolowych. Białko Cas9 (szare) jest dodawane w celu zakończenia składania RNP. Przewodnie RNA (gRNA) kierują i aktywują endonukleazę Cas9, która następnie rozszczepia docelowe DNA. Dolna część rysunku przedstawia sekwencję zarodkową 2C i sekwencję tracrRNA. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Rivera-Torres, N. i in. (2017). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Edycja genów jest zależna od dawki, gdy jest kierowana przez RNP i ssODN. Zsynchronizowane i uwolnione ogniwa HCT 116-19 poddano elektroporacji 24-120 pmol CRISPR/Cas9 RNP i 0,6-3,0 μM 72mer. Po 72-godzinnym okresie rekonwalescencji aktywność edycji genów mierzono za pomocą cytometru przepływowego. Edycja genów jest przedstawiana jako skuteczność korekcji (%), określona przez liczbę żywotnych komórek eGFP-dodatnich podzieloną przez całkowitą liczbę żywotnych komórek w populacji. Słupki błędów są tworzone z trzech zestawów punktów danych wygenerowanych w trzech oddzielnych eksperymentach przy użyciu podstawowych obliczeń błędu standardowego. Wstawka: Edycja genów za pomocą jednego agenta. Aktywność edycji genów kierowana przez jednoniciowy oligonukleotyd (72NT) przy braku kompleksu RNP w identycznych warunkach jest przedstawiona jako funkcja rosnącego stężenia. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Rivera-Torres, N. i in. (2017). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Eksperymentalna strategia izolacji klonów jednokomórkowych. Komórki wykazujące ekspresję eGFP oceniono jako dodatnie i posortowano za pomocą cytometru przepływowego jako pojedyncze komórki do indywidualnych studzienek w celu ekspansji klonalnej. Komórki pozbawione ekspresji eGFP wyizolowano i posortowano w podobny sposób oraz namnażano w tych samych warunkach. DNA zostało następnie wyizolowane, a gen eGFP amplifikowany i poddany sekwencjonowaniu Sangera w celu przeanalizowania aktywności edycji genów otaczających miejsce docelowe. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Rivera-Torres, N. i in. (2017). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. (A) Analiza alleliczna komórek eGFP-dodatnich rozmnożonych jako populacja klonalna. Klonalnie izolowane i ekspandowane próbki eGFP (szesnaście klonów) analizowano w miejscu otaczającym docelową zasadę i DNA z każdej z nich, zebrano, oczyszczono, amplifikowano i zsekwencjonowano. Analizę alleli przeprowadzono przy użyciu sekwencjonowania Sangera, zmontowano za pomocą oprogramowania do wizualizacji sekwencji i porównano z sekwencją allelu typu dzikiego, która jest zilustrowana na górze rysunku. Miejsce przecięcia kompleksu RNP jest oznaczone małą czarną strzałką umieszczoną na zielonym pasku (2C crRNA). (B) Analiza alleliczna komórek eGFP-ujemnych rozmnożonych jako populacja klonalna. Piętnaście pojedynczych próbek, rozszerzonych z klonów pochodzących z nieskorygowanej populacji, zostało losowo wybranych i przeanalizowanych pod kątem tworzenia indelu w miejscu otaczającym docelowy nukleotyd. Jak wyżej, analizę alleli przeprowadzono przy użyciu sekwencjonowania Sangera i zmontowano za pomocą oprogramowania do wizualizacji sekwencji. Po raz kolejny przedstawiono sekwencję allelu typu dzikiego w górnej części rysunku, wraz z miejscem cięcia RNP. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Rivera-Torres, N. i in. (2017). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Edycja genów stała się głównym nurtem dyscypliny naukowej, głównie ze względu na pojawienie się systemu CRISPR/Cas9. Ten niezwykły szlak, który ułatwia odporność adoptywną w komórkach bakteryjnych, został ponownie wykorzystany jako narzędzie molekularne umożliwiające zmiany genomowe w ludzkich chromosomach. Naturalną funkcją CRISPR/Cas9 jest wyłączenie wirusowego DNA poprzez wprowadzenie dwuniciowych pęknięć DNA prowadzących do fragmentacji30,31. Aktywność ta powoduje zniszczenie inwazyjnego egzogennego DNA i prowadzi do odporności prokariotycznej, która hamuje późniejsze zakażenie tą samą cząsteczką wirusa. O dziwo, system ten wykazuje zachowanie płucneumoniczne, w tym sensie, że może reaktywować określone gRNA CRISPR utworzone przez poprzednie zdarzenia infekcji.

Skuteczność i dokładność rozerwania genów katalizowanego przez CRISPR/Cas9 została wykorzystana w wielu eukariotycznych systemach genetycznych, w których celem było wyłączenie działającego genu 32,33. Po zredukowaniu do poziomu podstawowego proces składa się z dwóch podstawowych etapów. Pierwszym z nich jest przerwanie dwuniciowe, podczas gdy drugie opiera się na nieodłącznym procesie łączenia się niehomologicznego końca (NHEJ) w celu zakończenia nokautu. W większości przypadków pęknięcie dwuniciowe powoduje powstanie tępo zakończonych, niesprzężonych segmentów chromosomów, a enzymy zaangażowane w NHEJ reagują na pęknięcie chromosomu i działają w celu połączenia złamanych końców. Proces ten może czasami wiązać się z utratą pojedynczych nukleotydów w odciętym miejscu. Utrata nawet kilku baz może spowodować przesunięcie ramki i ustanie ekspresji funkcjonalnej. Zastosowanie CRISPR/Cas9 do tworzenia genetycznego nokautu poprzez zaangażowanie naturalnego procesu NHEJ zrewolucjonizowało genetykę eukariotyczną; utrata DNA w miejscu docelowym jest zarówno przewidywalna, jak i oczekiwana.

W przeciwieństwie do nokautu genów, wielu badaczy było zaangażowanych w próby przekierowania i ponownego wykorzystania aktywności CRISPR/Cas9 w kierunku procesu naprawy kierowanej przez homologię. Celem badań jest korekcja genów. W tej strategii CRISPR/Cas9 jest łączony z matrycą DNA dawcy, która dostarcza informacji genetycznej w celu naprawy wrodzonego błędu lub wprowadzenia mutacji do zdrowych genów. Wczesne doniesienia podkreślające niezwykłą zdolność CRISPR/Cas9 do katalizowania naprawy kierowanej przez homologię wskazywały (bezpośrednio lub pośrednio), że proces ten zachodził w bardzo precyzyjny sposób 24,34. Nasze laboratorium badało naprawę lub korektę genów kierowaną homologią przy użyciu jednoniciowych oligonukleotydów w celu zdefiniowania otaczającego go mechanizmu i obwodów regulacyjnych 15,17,18,23. Skupiliśmy się przede wszystkim na mutacjach jednopunktowych edycji genów, ponieważ jest to najbardziej podstawowa mutacja genetyczna, o której wiadomo, że jest odpowiedzialna za wiele zaburzeń dziedzicznych. Nasza podstawowa wiedza na temat edycji genów skłoniła nas do zakwestionowania precyzji aktywności CRISPR/Cas9 w tych reakcjach, ponieważ funkcja CRISPR/Cas9 w nokaucie genów powoduje powstawanie indeli. Użyliśmy dobrze zdefiniowanego systemu modelowego, a nie nieselektywnego, ale klinicznie istotnego genu, do zbadania mutagenezy na miejscu w zdecydowanie redukcjonistyczny sposób. Wykorzystując prosty gen docelowy, na podstawie którego można zmierzyć korektę genów zarówno na poziomie genotypowym, jak i fenotypowym, doszliśmy do wniosku, że heterogeniczność występująca w miejscu docelowym może być zidentyfikowana w wiarygodny i solidny sposób.

Nasze dane potwierdzają, że dobrze znany system edycji genów, składający się ze zmutowanego genu eGFP zintegrowanego z komórkami HCT116, może dostarczyć podstawowych informacji w odniesieniu do powstawania zmian genetycznych i procesu mutagenezy na miejscu. CRISPR/Cas9 i jednoniciowe cząsteczki donorowego donora oligonukleotydów działające w tandemie mogą prowadzić do precyzyjnej naprawy mutacji punktowej w genie eGFP. Proponujemy nowy model naprawy mutacji punktowych, szlaku molekularnego, w którym DNA dawcy działa jako szablon replikacyjny do naprawy zmutowanej zasady, procesu, który nazwaliśmy ExACT30. Populacja docelowa, nie wykazująca skorygowanego fenotypu, wykazuje różnorodne komórki zawierające niejednorodne i szeroko zakrojone indele DNA otaczające miejsce docelowe. U około połowy klonów wyizolowanych z nieskorygowanej populacji zaobserwowano mutagenezę delecji w miejscu docelowym. Ponieważ żaden wcześniejszy raport nie wykazał, że jednoniciowe oligonukleotydy działające jako narzędzia do edycji genów pojedynczego czynnika mogą indukować indele w miejscu docelowym, wnioskujemy, że aktywność CRISPR/Cas9 jest odpowiedzialna za te mutacje.

W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółową metodologię, dzięki której heterogeniczność genetyczna w miejscu docelowym może być mierzona w wiarygodny i solidny sposób. Chociaż ogromną uwagę poświęcono analizie i mapowaniu mutagenezy poza ośrodkiem, jest prawdopodobne, że heterogeniczna mutacja utworzona w miejscu docelowym będzie miała większy wpływ na sukces lub porażkę edycji genów na arenie klinicznej. Dodatkowe technologie lub zmodyfikowane białka Cas9 mogą być wymagane w celu poprawy precyzji ukierunkowanej na homologię naprawy wrodzonych błędów w komórkach ssaków35. Niektóre z tych technologii obejmują wykorzystanie pomocniczych oligonukleotydów, które działają jako most, utrzymując końce chromosomów razem i unikając destrukcyjnego działania NHEJ. Określenie stopnia heterogeniczności w miejscu docelowym w wyniku aktywności edycji genów jest i musi być ważną częścią każdego protokołu zaprojektowanego dla interwencji terapeutycznej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
McCoy' s 5A Zmodyfikowana pożywkaATCC30-2007
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ATCC30-2020
L-glutaminaATCC30-2214
Roztwór penicyliny-streptomycynyATCC30-2300
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoATCC30-2200trypsyny wapniowej lub magnezowej
ATCC30-2101
Aphidicolin 1mgThermo FisherAC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmolIDTBrak numeru katalogowego, ponieważ jest wykonany dla konkretnego celu genu.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmolIDT1072533
S.p. Cas9 Nukleaza 3NLS, 500 i mikro; gIDT1074182
IDTE BuforIDT11-01-03-01
Kuwety do elektroporacji Zeus 0,4 cmVWR10497-474
Gene Pulser Xcell Systemy elektroporacjiBioRad1652660
Albumina surowicy bydlęcej
liofilizowany proszek, skrystalizowany, ≥ 98,0% (GE)		Sigma05470-1G
EDTA (0,5 M), pH 8,0ThermoFisher ScientificAM9260G
Jodek Propidium - 1,0 mg/ml roztwór w wodzieThermoFisher ScientificP3566
DNeasy Blood & Zestaw tkanek (250)Qiagen69581
6-dołkowe wielodołkowe płytki do hodowli komórkowych Standard LineVWR10062-892
Szalki PetriegoFisher12-565-90
Probówki stożkowe (15 ml) (w stojakach)Thermo FisherAM12500
roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher15250061
Zredukowane podłożew surowicyThermo Fisher31985062
Bez roztworu EDTA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).">Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  2. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).">Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
  3. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).">Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
  4. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).">Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
  5. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).">Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
  6. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).">Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
  7. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).">Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
  8. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).">Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
  9. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).">Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
  10. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).">Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
  11. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).">Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
  12. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).">Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
  13. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).">Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
  14. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).">Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
  15. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).">Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
  16. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).">Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
  17. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).">Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
  18. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).">Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
  19. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).">Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
  20. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).">Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
  21. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).">Wang, Z., Zhou, Z. -J., Liu, D. -P., Huang, J. -D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
  22. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).">Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
  23. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).">Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
  24. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).">Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).
  25. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).">Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  26. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).">Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791(2014).">Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a, Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791(2014).
  28. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308(2015).">Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308(2015).
  29. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).">Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
  30. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350(2017).">Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350(2017).
  31. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).">Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
  32. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).">Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  33. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).">Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  34. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).">Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
  35. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).">Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Edycja gen wcytometria przep ywowasekwencjonowanie DNAelektroporacjakom rki HCT116gen EGFPjednoniciowy oligonukleotyd

Powiązane artykuły