Artykuł metodologiczny

Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii

24.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56197

⸱

19 września 2017

 , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Institute of Biology and Information Science, East China Normal University

W tym artykule

Podsumowanie

Ilościowa ocena wzrostu bakterii jest niezbędna do zrozumienia fizjologii drobnoustrojów jako zjawiska na poziomie systemu. Wprowadzono protokół manipulacji eksperymentalnej i podejście analityczne, pozwalające na precyzyjną, wysokoprzepustową analizę wzrostu bakterii, który jest kluczowym przedmiotem zainteresowania biologii systemów.

Streszczenie

Wzrost bakterii jest centralnym pojęciem w rozwoju nowoczesnej fizjologii mikrobiologicznej, jak również w badaniu dynamiki komórkowej na poziomie systemów. Ostatnie badania wykazały korelacje między wzrostem bakterii a zdarzeniami obejmującymi cały genom, takimi jak redukcja genomu i reorganizacja transkryptomu. Prawidłowa analiza wzrostu bakterii ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zależnej od wzrostu koordynacji funkcji genów i składników komórkowych. W związku z tym wymagana jest dokładna ocena ilościowa wzrostu bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Pojawiające się osiągnięcia technologiczne oferują nowe narzędzia eksperymentalne, które umożliwiają aktualizację metod stosowanych do badania wzrostu bakterii. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje czytnik mikropłytek z wysoce zoptymalizowaną procedurą eksperymentalną do powtarzalnej i precyzyjnej oceny wzrostu bakterii. Protokół ten został wykorzystany do oceny wzrostu kilku wcześniej opisanych szczepów Escherichia coli. Główne etapy protokołu są następujące: przygotowanie dużej liczby zapasów komórek w małych fiolkach do powtarzających się testów z powtarzalnymi wynikami, użycie 96-dołkowych płytek do wysokoprzepustowej oceny wzrostu oraz ręczne obliczenie dwóch głównych parametrów (tj. maksymalnego tempa wzrostu i gęstości zaludnienia) reprezentujących dynamikę wzrostu. W porównaniu z tradycyjnym testem jednostki tworzącej kolonię (CFU), który zlicza komórki hodowane w szklanych probówkach w czasie na płytkach agarowych, obecna metoda jest bardziej wydajna i zapewnia bardziej szczegółowe zapisy czasowe zmian wzrostu, ale ma bardziej rygorystyczną granicę wykrywalności przy niskiej gęstości populacji. Podsumowując, opisana metoda jest korzystna dla precyzyjnej i powtarzalnej wysokoprzepustowej analizy wzrostu bakterii, która może być wykorzystana do wyciągnięcia wniosków koncepcyjnych lub do poczynienia obserwacji teoretycznych.

Wprowadzenie

Badania mikrobiologiczne często rozpoczynają się od hodowli komórek bakteryjnych i oceny krzywych wzrostu bakterii, które stanowią fundamentalne zjawisko fizjologii bakteryjnej1,2,3. Podstawowe zasady hodowli są szeroko dostępne w opublikowanej literaturze naukowej i podręcznikach, ponieważ hodowla bakteryjna jest podstawową metodologią. Na poziomie ławki tradycyjnie znaczna uwaga skupiała się na optymalizacji pożywek wzrostowych i warunków hodowli, ale kontrolowanie tempa wzrostu, które prawdopodobnie zapewniłoby jeszcze lepsze zrozumienie fizjologii drobnoustrojów, nie było szeroko badane4. W przypadku bakterii rosnących wykładniczo kluczowym parametrem stanu komórkowego jest tempo wzrostu, które według doniesień jest skoordynowane z genomem, transkryptomem i proteomem5,6,7,8. W związku z tym ilościowa ocena wzrostu bakterii ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia fizjologii drobnoustrojów.

Aby ocenić wzrost bakterii, metody eksperymentalne używane do szacowania biomasy są dobrze znane9,10 i opierają się na wykrywaniu parametrów biochemicznych, fizycznych lub biologicznych, takich jak zmętnienie optyczne. Ponadto metody analityczne stosowane do uchwycenia dynamicznych właściwości zmian wzrostu są zwykle oparte na ustalonych modelach nieliniowych11,12,13, na przykład równania logistyczne. Dynamikę wzrostu uzyskuje się na ogół poprzez czasowe pobieranie próbek wzrostu komórek w hodowli poprzez pomiar zmętnienia optycznego lub wykonywanie testów jednostek tworzących kolonie (CFU). Ograniczeniem tych metod hodowli i wykrywania jest to, że punkty danych nie są prawdziwym odzwierciedleniem dynamiki populacji, ponieważ odstępy między pomiarami są często wyrażone w godzinach, a warunki hodowli (np. zmiany temperatury i napowietrzenia) są zaburzone w momencie pobierania próbek. Kultura i techniki analizy muszą być aktualizowane z wykorzystaniem najnowszych osiągnięć w technologii i zrozumieniu. Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie czytników mikropłytek pozwalają na obserwację rozwoju bakterii w czasie rzeczywistym i znacznie obniżają koszty pracy. Korzystając z tych zaawansowanych urządzeń, najnowsze badania nad wzrostem bakterii opisały metody analityczne do pomiarów o wysokiej przepustowości14,15.

Celem tego protokołu jest ocena precyzyjnej dynamiki wzrostu w sposób wysokoprzepustowy, co będzie cenne dla badań ilościowych, które ostatecznie odpowiedzą na pytania, jak określa się tempo wzrostu i jakie czynniki wpływają na tempo wzrostu. Protokół odnosi się do wszystkich czynników, które powinny być brane pod uwagę w celu powtarzalnego i precyzyjnego ilościowego oznaczania wzrostu bakterii. Metoda eksperymentalna i analiza zostały szczegółowo opisane w tekście głównym. Metoda ta pozwala na precyzyjną i powtarzalną analizę wzrostu bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Mikrobiolodzy mogą korzystać z tego protokołu, aby uzyskać dodatkowe wyniki ilościowe na podstawie dowodów eksperymentalnych. Protokół ten może być również wykorzystany do badań z zakresu biologii systemów, które próbują wyciągnąć wnioski koncepcyjne lub uzyskać teoretyczny przegląd wzrostu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki wzrostowej

UWAGA: Skład chemiczny minimalnego podłoża M63 jest następujący: 62 mM K2HPO4, 39 mM KH2PO4, 15 mM (NH4)2SO4, 1,8 µM FeSO4, 15 µM tiaminy-HCl, 0,2 mM MgSO4 oraz 22 mM glukozy. Podłoże M63 przygotowuje się poprzez zmieszanie trzech roztworów zapasowych: roztworu Five X, 20% glukozy oraz roztworu MgSO4 i tiaminy. Wszystkie roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

  1. Przygotowanie roztworu Five X
    1. Aby przygotować roztwór FeSO4, należy użyć pipety elektrycznej i jednorazowej pipety serologicznej, aby dodać ddH2O do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL. Za pomocą pipety P-200 należy dodać 0,06 mL HCl w celu uzyskania stężenia 0,01 M HCl. Następnie dodać 36 mg FeSO4-7H2O i dokładnie wymieszać.
    2. Odmierzyć 160 mL ddH2O w cylindrze miarowym i przelać do zlewki o pojemności 500 mL. Dodać kolejno następujące składniki: 10,72 g K2HPO4, 5,24 g KH2PO4, 2,0 g (NH4)2SO4 oraz 0,5 mL roztworu FeSO4 (przygotowanego w kroku 1.1.1).
    3. Za pomocą precyzyjnego pH-metru dostosować pH do wartości 7,0, dodając 2 M KOH. Przenieść roztwór do cylindra miarowego i uzupełnić ddH2O do całkowitej objętości 200 mL. Sterylizować roztwór za pomocą jednostki filtracyjnej 250 mL (PVDF, 0,22 µM).
  2. Przygotowanie 20% roztworu glukozy
    1. Odmierzyć 200 mL ddH2O w cylindrze miarowym i przelać do zlewki o pojemności 500 mL. Podczas mieszania za pomocą mieszadła magnetycznego dodać 50 g glukozy. Rozcieńczyć roztwór w cylindrze miarowym do całkowitej objętości 250 mL. Sterylizować roztwór zgodnie z opisem w kroku 1.1.3.
  3. Przygotowanie roztworu MgSO4 i tiaminy
    1. Do zlewki o pojemności 500 mL dodać 150 mL ddH2O. Podczas mieszania mieszadłem magnetycznym dodać 1,0 g tiaminy-HCl i 10 g MgSO4-7H2O. Rozcieńczyć roztwór w cylindrze miarowym do całkowitej objętości 200 mL. Sterylizować roztwór zgodnie z opisem w kroku 1.1.3.
  4. Przygotowanie minimalnej pożywki M63
    1. Umieścić roztwór Five X, 20% roztwór glukozy, roztwór MgSO4 i tiaminy, pipetę elektryczną, pipetę P-200 oraz końcówki do pipety 200 µL na czystym blacie roboczym.
    2. Odmierzyć 155,8 mL ddH2O w cylindrze miarowym i przelać do zlewki o pojemności 500 mL.
    3. Za pomocą pipety elektrycznej i jednorazowej pipety serologicznej dodać 40 mL roztworu Five X oraz 4 mL 20% roztworu glukozy do odmierzonej ilości ddH2O. Następnie, za pomocą pipety P-200, dodać 0,2 mL roztworu MgSO4 i tiaminy. Sterylizować roztwór zgodnie z opisem w kroku 1.1.3.

2. Przygotowanie zapasu w glicerolu

  1. Hodowla komórkowa
    UWAGA: Szczepy bakteryjne (np. W3110 oraz jego szczepy o zredukowanym genomie) są dostępne w bankach szczepów. Szczepy te są zazwyczaj otrzymywane w formie kolonii na płytkach z agarem.
    1. Umieść na czystej dygestorze pięć sterylnych probówek szklanych z silikonowymi korkami, pipetę elektroniczną P-1,000, końcówki do pipety 1,000-µL, pipetę P-200, końcówki do pipety 200-µL oraz docelowe szczepy (kolonie na płytkach).
    2. Przed otwarciem silikonowego korka wystaw wlot probówki szklanej na płomień palnika Bunsena. Po otwarciu probówki wystaw silikonowy korek na płomień, a następnie lekko załóż go z powrotem na probówkę.
    3. Używając pipety elektronicznej i jednorazowej pipety serologicznej, dodaj 5 mL M63 do jednej z probówek szklanych i 4,5 mL M63 do pozostałych czterech probówek.
    4. Za pomocą końcówki P-200 pobierz kolonię i zaszczep ją w probówce szklanej zawierającej 5 mL M63.
    5. Wymieszaj zawartość probówki na wstrząsarze Vortex, aby przygotować zawiesinę. Następnie wykonaj 10-krotne rozcieńczenie roztworu, przenosząc 0,5 mL tej zawiesiny do jednej z czterech probówek zawierających 4,5 mL M63.
    6. Powtórz proces opisany w kroku 2.1.5 dla pozostałych probówek. Seria rozcieńczeń z pięcioma różnymi stężeniami (rozcieńczenia 1, 10, 100, 1000 i 10 000) jest teraz gotowa.
    7. Zsterylizuj wloty probówek szklanych oraz silikonowe korki zgodnie z opisem w kroku 2.1.2. Zamknij probówki korkami. Aby uniknąć kontaminacji, nie zginaj silikonowych korków.
    8. Umieść pięć probówek w uprzednio ogrzanym inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i wytrząsaj z prędkością 200 rpm. Inkubuj hodowlę przez noc lub od 10 do 30 h.
  2. Wybór hodowli do przygotowania banku glicerolu
    1. Umieść na czystej dygestorze podgrzane do temperatury pokojowej medium M63, pipetę P-1,000, końcówki do pipety 1,000-µL oraz jednorazową kuwetę.
    2. Dodaj 1,000 µL M63 do jednorazowej kuwety za pomocą pipety P-1,000. Umieść kuwetę w spektrofotometrze, uruchom program przy stałej długości fali 600 nm i zmierz próbę ślepą.
    3. Przenieś pięć probówek szklanych z inkubatora z wytrząsaniem na czystą dygestorze.
    4. Wylej M63 z jednorazowej kuwety i dodaj do niej 1,000 µL hodowli za pomocą pipety P-1,000. Zmierz mętność optyczną hodowli komórkowej (OD600) zgodnie z opisem w kroku 2.2.2.
      UWAGA: Aby uniknąć kontaminacji i uzyskać precyzyjny pomiar, wystaw probówki szklane i korki na płomień zgodnie z opisem i wymieszaj hodowlę na Vortexie przed pobraniem próbki. Aby zapewnić wiarygodność wyników, zaleca się powtórne pomiary, szczególnie gdy gęstość komórek jest niska.
    5. Z pięciu hodowli komórkowych wybierz tę, która znajduje się we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego (OD600= 0,01 - 0,05), aby przygotować bank glicerolu.
      UWAGA: Jeśli kilka hodowli ma gęstość w optymalnym zakresie, zazwyczaj wybiera się tę najbliższą wartości 0,05.
  3. Przygotowanie banków glicerolu do powtarzalnych testów.
    UWAGA: Opis dotyczy przygotowania dziesięciu próbek. Można przygotować większą lub mniejszą liczbę próbek zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
    1. Umieść na czystej dygestorze sterylny 60% roztwór glicerolu, dziesięć sterylnych mikroprobówek 1,5-mL, pipety P-1,000 i P-200, końcówki do pipet 1,000- i 200-µL oraz statyw na mikroprobówki.
    2. Dodaj 250 µL sterylnego 60% roztworu glicerolu i 750 µL wybranej hodowli komórkowej do mikroprobówki 1,5-mL i wymieszaj poprzez pipetowanie.
      UWAGA: Objętość banku jest zmienna, ale zawsze należy zachować stosunek 60% glicerolu do hodowli komórkowej w proporcji 1:3; daje to końcowe stężenie 15% glicerolu.
    3. Umieść pozostałe dziewięć mikroprobówek w statywie i do każdej z nich dozuj 100 µL mieszaniny przygotowanej w kroku 2.3.2. Otrzymano dziesięć identycznych banków glicerolu do przyszłego wykorzystania.
    4. Przechowuj próbki w zamrażarce niskotemperaturowej w -80 °C.

3. Pozyskiwanie krzywych wzrostu

  1. Konfiguracja czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Terminy ujęte w cudzysłowie odpowiadają konkretnemu sformułowaniom użytym w czytniku płytek zastosowanym w tej procedurze (patrz Tabela Materiałów).
    1. Uruchom oprogramowanie. Otwórz sekcję "Protocols" w "Task Manager" i wybierz opcję "Create New". Wybierz "Standard Protocol".
    2. Otwórz sekcję "Procedure" i dostosuj ustawienia. Otwórz "Set Temperature" i zaznacz "Incubator On". Ustaw wartość "Temperature" na 37 °C oraz "Gradient" na 0 °C. Zaznacz opcję "Preheat" przed przejściem do następnego kroku. Otwórz "Start Kinetic", ustaw czas trwania pomiaru ("Run time") na 24:00:00 lub 48:00:00 oraz interwał ("Interval") na 00:30:00 lub 01:00:00.
      UWAGA: Odczyt całej płytki 96-dołkowej trwa około 1 min.
    3. Otwórz sekcję "Shake" i ustaw tryb wstrząsania ("Shake Mode") na "Linear". Zaznacz opcję "Constitution Shake" i ustaw częstotliwość ("Frequency") na 567 cpm. Otwórz sekcję "Read", zaznacz opcje "Absorbance", "Endpoint/Kinetic" oraz "Monochromators". Ustaw długość fali ("Wavelength") na 600.
    4. Kliknij "Validate", aby potwierdzić poprawność procedury. Kliknij "Save", aby zapisać ją jako nowy program do przyszłego użytku.
  2. Rejestracja wzrostu w czasie rzeczywistym
    1. Narysuj piktogram płytki 96-dołkowej (tabela 8 × 12), aby zaznaczyć położenie zaszczepionych próbek kultur na płytce. Wydrukuj tabelę i używaj jej jako punktu odniesienia podczas eksperymentu.
      UWAGA: Dołki znajdujące się na brzegach mikropłytki powinny zawierać wyłącznie czyste pożywkę ze względu na parowanie.
    2. Umieść w komorze z laminarnym przepływem powietrza sterylną mikropłytkę 96-dołkową z płaskim dnem i pokrywką, końcówki do pipety P-1000 (1000 µL), końcówki do pipety P-200 (200 µL), kilka mikropróbek 1,5 mL, pipetę 8-kanałową, sterylizowany rezerwuar na odczynniki, pożywkę M63 w temperaturze pokojowej oraz mrożone banki z glicerolem (przygotowane w kroku 2.3).
    3. Wlej około 25 mL pożywki M63 do rezerwuaru na odczynniki. Używaj tego zapasu do wszystkich następnych etapów.
    4. Dodaj 900 µL M63 do mikropróbek w celu przygotowania do wykonania rozcieńczeń seryjnych.
    5. Rozmroź bankę z glicerolem w temperaturze pokojowej. Dodaj 900 µL M63 do rozmrożonej banki i wymieszaj w wirówce vortex. Pozwoli to uzyskać 10-krotne rozcieńczenie oryginalnego stoku w glicerolu.
    6. Przenieś 100 µL 10-krotnego rozcieńczenia do kolejnej mikroprobówki zawierającej 900 µL M63 i wymieszaj w wirówce vortex. Pozwoli to uzyskać 100-krotne rozcieńczenie.
    7. Powtarzaj krok 3.2.6 aż do uzyskania pożądanej liczby rozcieńczeń.
    8. Wypełnij dołki na brzegu mikropłytki 200 µL M63 za pomocą pipety 8-kanałowej (P-200).
      UWAGA: Dołki te mogą służyć jako próba ślepa.
    9. Nanieś 200 µL każdej z rozcieńczonych próbek przygotowanych w krokach 3.2.4 – 3.2.7 do dołków mikropłytki zgodnie z tabelą odniesienia (krok 3.2.1). Przed naniesieniem wymieszaj rozcieńczone próbki w wirówce vortex i nanieś tę samą próbkę do kilku dołków w różnych miejscach na płytce.
    10. Umieść mikropłytkę 96-dołkową w czytniku płytek.
    11. Wybierz opcję "Read Now" w "Task Manager" i wybierz odpowiedni program (sekcja 3.1). Kliknij "OK", aby rozpocząć pomiar. Zapisz rejestrację jako nowy plik eksperymentalny do analizy danych (sekcja 4).

4. Analiza danych

  1. Wyeksportuj wyniki danych o tempie wzrostu w czasie rzeczywistym (sekcja 3.2) do pliku tekstowego na pamięci USB.
    UWAGA: Wyniki w formacie 96-dołkowym (krzywe) będą wyświetlane na czytniku płytek w czasie rzeczywistym. Godzinowe zapisy (wartości OD) można wyeksportować jako tabelę; wiersze i kolumny reprezentują odpowiednio numery dołków (np. A1, B1) oraz czas pomiaru (np. 00:00:59).
  2. Otwórz plik tekstowy w programie do arkuszy kalkulacyjnych.
  3. Skopiuj godzinowe odczyty OD600 z mikropłytki 96-dołkowej do nowego arkusza w celu dalszej analizy.
  4. Odejmij odczyty tła w czasie zero od godzinowych odczytów każdego dołka z próbką.
    UWAGA: Dla ułatwienia jako wartość tła można zastosować średnią wartość dołków ślepych zawierających M63 (krok 3.2.8).
  5. Oblicz średnią z pięciu kolejnych odczytów OD600, aby oszacować maksymalną gęstość populacji.
    UWAGA: Najwyższą wartość średnią z pięciu kolejnych odczytów OD600 definiuje się jako maksymalną wartość OD600 odpowiadającej krzywej wzrostu.
  6. Oblicz tempo wzrostu, µ (h-1), stosując poniższe równanie dla wszystkich par kolejnych wartości OD600:
    figure-protocol-1
    UWAGA: W tym równaniu Ci i Ci+1 reprezentują wartości OD600 w dowolnych dwóch kolejnych punktach czasowych (odpowiednio ti i ti+1). LN oznacza logarytm naturalny.
  7. Oblicz zmiany tempa wzrostu w czasie na podstawie godzinowych odczytów OD600 zgodnie z krokiem 4.6. Oblicz średnią i odchylenie standardowe z pięciu kolejnych wartości tempa wzrostu, aby oszacować maksymalne tempo wzrostu.
    UWAGA: Najwyższą średnią przy najniższym odchyleniu standardowym definiuje się jako maksymalne tempo wzrostu odpowiadającej krzywej wzrostu.

5. Potwierdzenie globalnego obciążenia odczytów z płytki 96-dołkowej (opcjonalnie)

UWAGA: Zarówno czytnik płytek, jak i jednorazowa płytka 96-dołkowa mogą powodować błędy pomiarowe. Aby uzyskać wysoce precyzyjne i powtarzalne wyniki ilościowe, zdecydowanie zaleca się potwierdzenie globalnego błędu systematycznego płytki 96-dołkowej.

  1. Przygotować płytkę 96-dołkową oraz czytnik płytek do testu błędu systematycznego zgodnie z opisem w sekcji 3.2.2.
  2. Do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL dodać 20 mL medium M63. Do tej samej probówki dodać stok glicerolowy i wymieszać na wortexie. Przenieść zawiesinę do sterylnego zbiornika na odczynniki.
  3. Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieść 200 µL zawiesiny na płytkę 96-dołkową.
  4. Umieścić płytkę 96-dołkową w czytniku płytek i rozpocząć pomiar.
  5. Rejestrować godzinowe odczyty OD600 i przeanalizować je zgodnie z opisem w sekcji 4. Porównać obliczoną maksymalną szybkość wzrostu oraz gęstość populacji dla każdego dołka, aby określić błąd lokalizacyjny odczytów z płytki 96-dołkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana metoda umożliwia rejestrację dynamicznego wzrostu bakterii w sposób ciągły i wysokoprzepustowy dzięki zastosowaniu czytnika w formacie 96-dołkowym, który wykonuje wielokrotne pomiary gęstości optycznej w różnych odstępach czasu (od minut, przez godziny, aż po dni). Krzywe wzrostu zestawu szczepów E. coli wykazujących ekspresję różnych genomów mogą zostać precyzyjnie uzyskane w ramach jednego eksperymentu (Rycina 1A). W porównaniu z opisaną me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki w protokole obejmują przygotowanie wspólnego zapasu komórek rosnących wykładniczo i replikację tych samych próbek w wielu studzienkach w różnych pozycjach na mikropłytce. Wcześniej mikrobiolodzy rozpoczynali hodowlę od nocnej hodowli wstępnej. Chociaż ta metoda może skrócić czas opóźnienia wzrostu bakterii, trudno jest uzyskać powtarzalne krzywe wzrostu. Jak pokazano na rysunku 2, niezależne pomiary z wykorzystaniem popularnych zapasów glicerolu dały prawie identyczne krzywe w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dziękujemy Kohei Tsuchiya za dostarczenie przykładu testu CFU. Prace te zostały częściowo wsparte finansowo przez Grant-in-Aid for Scientific Research (C) nr 26506003 (dla BWY) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.

Podziękowania

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
K2HPO4Wako164-04295
KH2PO4Wako166-04255
(NH4)2SO4Wako019-03435
MgSO4-7H2OWako138-00415
Tiamina-HClWako201-00852
glukozaWako049-31165
HClWako080-01066
Siarczan żelaza (II) siedmiowodny (FeSO4-7H2O)Wako094-01082
KOHWako168-21815
GlycerolWako075-00611
Probówka wirówkowa (50 mL, sterylizowana)WATSON1342-050S
Końcówki do pipet, 200 i mikro; LWATSON110-705Y Końcówki
do pipet, 1,000 &mikro; LWATSON110-8040
Mikroprobówka (1,5 ml)Pipeta wielokanałowa WATSON131-715C
WATSONNT-8200
PASORINAJAKO JEDNO2-4990-02
Szklany cylinder (200 ml)AS ONE1-8562-07
Precyzyjny miernik pHAS ONEAS800 / 1-054-01
Pipetman P-200GILSON1-6855-05
Pipetman P-1000GILSON1-6855-06
Jednorazowe pipety serolocywe (10 ml)Jednorazowe
(25 ml)
BM Bio801-02Y
VortexBM BioBM-V1
Corning Costar 96-dołkowa mikropłytka z pokrywką (płaska dno, przezroczysta)Sigma-AldrichCorning, 3370
Zbiornik na odczynniki Corning Costar (50 ml)Sigma-AldrichCorning, 4870
Stericup GV PVDF (250 mL, 0,22 µ M)Merck MilliporeSCGVU02RE
Pipet-Aid XPDRUMMOND4-000-101
Bioshaker (BR-23UM MR)TAITEC0053778-000
Komórka do utylizacji (1,5 ml)Kartell1938 / 2-478-02
DU 730 Life Science Spektrofotometr UV/VisBeckman CoulterA23616
EPOCH2BioTek2014- EP2-002 / EPOCH2T
Zlewka (500 mL)IWAKI82-0008
BIO czysta ławkaPanasonicMCV-B131F
Rurki szklaneNICHIDEN RIKA GLASSP-10M~P-30 /101019
Korki z gumy silikonowejShinEtsu PolymerT-19
Szczepy bakteryjneOrganizacja banku szczepów; Narodowy Projekt Zasobów Biologicznych (NBRP) w Japonii
8 MIESZADŁO pipety serolocywe SANPLATEC SAN27014 Statyw do mikroprobówek SANPLATEC SAN27015

Bibliografia

  1. Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
  2. Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
  3. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  4. Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287(2015).
  5. Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
  6. Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808(2013).
  7. Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
  8. Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231(2016).
  9. Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
  10. Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
  11. Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
  12. Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
  13. Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
  14. Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172(2016).
  15. Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
  16. Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801(2015).
  17. Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza wzrostu bakteriiwysokoprzepustowa ocena wzrostuprotok z u yciem czytnika mikrop ytekmaksymalny szybko wzrostupomiar g sto ci populacjipomiar absorbancji OD600procedura rozcie cze seryjnychszczepy Escherichia coliprzygotowanie po ywki M63zastosowanie p ytek 96 do kowych

Powiązane artykuły