Artykuł metodologiczny

Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii

DOI:

10.3791/56197

⸱

19 września 2017

 , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Institute of Biology and Information Science, East China Normal University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa ocena wzrostu bakterii jest niezbędna do zrozumienia fizjologii drobnoustrojów jako zjawiska na poziomie systemu. Wprowadzono protokół manipulacji eksperymentalnej i podejście analityczne, pozwalające na precyzyjną, wysokoprzepustową analizę wzrostu bakterii, który jest kluczowym przedmiotem zainteresowania biologii systemów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzrost bakterii jest centralnym pojęciem w rozwoju nowoczesnej fizjologii mikrobiologicznej, jak również w badaniu dynamiki komórkowej na poziomie systemów. Ostatnie badania wykazały korelacje między wzrostem bakterii a zdarzeniami obejmującymi cały genom, takimi jak redukcja genomu i reorganizacja transkryptomu. Prawidłowa analiza wzrostu bakterii ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zależnej od wzrostu koordynacji funkcji genów i składników komórkowych. W związku z tym wymagana jest dokładna ocena ilościowa wzrostu bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Pojawiające się osiągnięcia technologiczne oferują nowe narzędzia eksperymentalne, które umożliwiają aktualizację metod stosowanych do badania wzrostu bakterii. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje czytnik mikropłytek z wysoce zoptymalizowaną procedurą eksperymentalną do powtarzalnej i precyzyjnej oceny wzrostu bakterii. Protokół ten został wykorzystany do oceny wzrostu kilku wcześniej opisanych szczepów Escherichia coli. Główne etapy protokołu są następujące: przygotowanie dużej liczby zapasów komórek w małych fiolkach do powtarzających się testów z powtarzalnymi wynikami, użycie 96-dołkowych płytek do wysokoprzepustowej oceny wzrostu oraz ręczne obliczenie dwóch głównych parametrów (tj. maksymalnego tempa wzrostu i gęstości zaludnienia) reprezentujących dynamikę wzrostu. W porównaniu z tradycyjnym testem jednostki tworzącej kolonię (CFU), który zlicza komórki hodowane w szklanych probówkach w czasie na płytkach agarowych, obecna metoda jest bardziej wydajna i zapewnia bardziej szczegółowe zapisy czasowe zmian wzrostu, ale ma bardziej rygorystyczną granicę wykrywalności przy niskiej gęstości populacji. Podsumowując, opisana metoda jest korzystna dla precyzyjnej i powtarzalnej wysokoprzepustowej analizy wzrostu bakterii, która może być wykorzystana do wyciągnięcia wniosków koncepcyjnych lub do poczynienia obserwacji teoretycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania mikrobiologiczne często rozpoczynają się od hodowli komórek bakteryjnych i oceny krzywych wzrostu bakterii, które stanowią fundamentalne zjawisko fizjologii bakteryjnej1,2,3. Podstawowe zasady hodowli są szeroko dostępne w opublikowanej literaturze naukowej i podręcznikach, ponieważ hodowla bakteryjna jest podstawową metodologią. Na poziomie ławki tradycyjnie znaczna uwaga skupiała się na optymalizacji pożywek wzrostowych i warunków hodowli, ale kontrolowanie tempa wzrostu, które prawdopodobnie zapewniłoby jeszcze lepsze zrozumienie fizjologii drobnoustrojów, nie było szeroko badane4. W przypadku bakterii rosnących wykładniczo kluczowym parametrem stanu komórkowego jest tempo wzrostu, które według doniesień jest skoordynowane z genomem, transkryptomem i proteomem5,6,7,8. W związku z tym ilościowa ocena wzrostu bakterii ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia fizjologii drobnoustrojów.

Aby ocenić wzrost bakterii, metody eksperymentalne używane do szacowania biomasy są dobrze znane9,10 i opierają się na wykrywaniu parametrów biochemicznych, fizycznych lub biologicznych, takich jak zmętnienie optyczne. Ponadto metody analityczne stosowane do uchwycenia dynamicznych właściwości zmian wzrostu są zwykle oparte na ustalonych modelach nieliniowych11,12,13, na przykład równania logistyczne. Dynamikę wzrostu uzyskuje się na ogół poprzez czasowe pobieranie próbek wzrostu komórek w hodowli poprzez pomiar zmętnienia optycznego lub wykonywanie testów jednostek tworzących kolonie (CFU). Ograniczeniem tych metod hodowli i wykrywania jest to, że punkty danych nie są prawdziwym odzwierciedleniem dynamiki populacji, ponieważ odstępy między pomiarami są często wyrażone w godzinach, a warunki hodowli (np. zmiany temperatury i napowietrzenia) są zaburzone w momencie pobierania próbek. Kultura i techniki analizy muszą być aktualizowane z wykorzystaniem najnowszych osiągnięć w technologii i zrozumieniu. Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie czytników mikropłytek pozwalają na obserwację rozwoju bakterii w czasie rzeczywistym i znacznie obniżają koszty pracy. Korzystając z tych zaawansowanych urządzeń, najnowsze badania nad wzrostem bakterii opisały metody analityczne do pomiarów o wysokiej przepustowości14,15.

Celem tego protokołu jest ocena precyzyjnej dynamiki wzrostu w sposób wysokoprzepustowy, co będzie cenne dla badań ilościowych, które ostatecznie odpowiedzą na pytania, jak określa się tempo wzrostu i jakie czynniki wpływają na tempo wzrostu. Protokół odnosi się do wszystkich czynników, które powinny być brane pod uwagę w celu powtarzalnego i precyzyjnego ilościowego oznaczania wzrostu bakterii. Metoda eksperymentalna i analiza zostały szczegółowo opisane w tekście głównym. Metoda ta pozwala na precyzyjną i powtarzalną analizę wzrostu bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Mikrobiolodzy mogą korzystać z tego protokołu, aby uzyskać dodatkowe wyniki ilościowe na podstawie dowodów eksperymentalnych. Protokół ten może być również wykorzystany do badań z zakresu biologii systemów, które próbują wyciągnąć wnioski koncepcyjne lub uzyskać teoretyczny przegląd wzrostu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża wzrostowego

UWAGA: Skład chemiczny minimalnej pożywki M63 jest następujący: 62 mM K2HPO4, 39 mM KH2PO4, 15 mM (NH4)2SO4, 1,8 μM FeSO4, 15 μM tiamino-HCl, 0,2 mMMgSO4 i 22 mM glukozy. M63 wytwarza się przez zmieszanie trzech roztworów podstawowych: roztworu Five X, 20% glukozy i roztworuMgSO4 tiaminy. Przechowywać wszystkie roztwory w temperaturze 4 °C.

  1. Przygotowanie roztworu Five X
    1. Aby przygotować roztwórFeSO4, użyj pipety elektrycznej i jednorazowej pipety serologicznej, aby dodać ddH2O do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj P-200, aby dodać 0,06 ml HCl, aby uzyskać 0,01 M HCl. Dodaj 36 mg FeSO4-7H 2O i dobrze wymieszaj.
    2. Odmierzyć 160 ml ddH2O w cylindrze miarowym i dodać do zlewki o pojemności 500 ml. Dodaj w następującej kolejności: 10,72 g K2HPO4, 5,24 g KH2PO4, 2,0 g (NH4)2SO4 i 0,5 ml roztworuFeSO4 (przygotowanego w kroku 1.1.1).
    3. Za pomocą precyzyjnego pH-metru dostosuj pH do 7,0, dodając 2 M KOH. Wlać roztwór do cylindra miarowego i dodać ddH2O do całkowitej objętości 200 ml. Wysterylizuj roztwór za pomocą jednostki filtrującej o pojemności 250 ml (PVDF, 0,22 μM).
  2. Przygotowanie 20% roztworu glukozy
    1. Odmierzyć 200 ml ddH2O w cylindrze miarowym i przelać do zlewki o pojemności 500 ml. Mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego, dodaj 50 g glukozy. Rozcieńczyć roztwór w cylindrze miarowym do całkowitej objętości 250 ml. Wysterylizować roztwór zgodnie z opisem w kroku 1.1.3.
  3. Przygotowanie roztworuMgSO4 tiaminy
    1. Dodać 150 ml ddH2O do zlewki o pojemności 500 ml. Mieszając mieszadłem magnetycznym, dodać 1,0 g tiamino-HCl i 10 g MgSO 4-7H2 O. Rozcieńczyć roztwórw cylindrze miarowym do całkowitej objętości 200 ml. Wysterylizować roztwór zgodnie z opisem w kroku 1.1.3.
  4. Przygotowanie minimalnej pożywki M63
    1. Umieść roztwór Five X, 20% roztwór glukozy, roztwór tiaminyMgSO4, pipetę elektroniczną, pipetę P-200 i końcówki do pipet o pojemności 200 μl na czystej stole.
    2. Odmierzyć 155,8 ml ddH2O w cylindrze miarowym i przelać do zlewki o pojemności 500 ml.
    3. Za pomocą pipety elektronicznej i jednorazowej pipety serologicznej dodać 40 ml roztworu Five X i 4 ml 20% roztworu glukozy do zmierzonego ddH2O. Następnie dodaj 0,2 ml roztworu tiaminyMgSO4 z P-200. Wysterylizować roztwór zgodnie z opisem w kroku 1.1.3.

2. Przygotowanie wywaru glicerolu

  1. Hodowla komórkowa
    UWAGA: Szczepy bakteryjne (np. W3110 i jego zredukowane genomy) są dostępne w organizacjach zajmujących się bankami szczepów. Szczepy są zwykle uzyskiwane w postaci kolonii na płytkach agarowych.
    1. Umieść pięć wysterylizowanych szklanych probówek z korkami z gumy silikonowej, pipetę elektroniczną, końcówki do pipet P-1 000, 1 000 μl, końcówki do pipet P-200, 200 μl, a docelowe szczepy (kolonie na płytkach) na czystej ławce.
    2. Wystaw wylot szklanej rurki na palnik Bunsena przed otwarciem korka z gumy silikonowej. Po otwarciu probówki wystawić korek z gumy silikonowej na działanie płomienia, a następnie delikatnie umieść nakrętkę z powrotem na szklanej rurce.
    3. Za pomocą pipety elektronicznej i jednorazowej pipety serologicznej dodaj 5 ml M63 do jednej ze szklanych probówek i 4,5 ml M63 do pozostałych czterech probówek.
    4. Użyj końcówki P-200, aby wybrać kolonię i zaszczepić ją w szklanej probówce zawierającej 5 ml M63.
    5. Zwiruj rurkę, aby uzyskać zawiesinę. Następnie rozcieńczyć roztwór 10-krotnie, przenosząc 0,5 ml tego roztworu do jednej z czterech probówek zawierających 4,5 ml M63.
    6. Powtórzyć proces opisany w kroku 2.1.5 dla pozostałych probówek. Seria rozcieńczeń o pięciu różnych stężeniach (rozcieńczenia 1, 10, 100, 1000 i 10 000) jest teraz gotowa.
    7. Wysterylizować wyloty szklanych probówek i korków z gumy silikonowej zgodnie z opisem w kroku 2.1.2. Zakryj probówki korkami. Unikaj zanieczyszczenia, nie marszcząc korków z gumy silikonowej.
    8. Umieścić pięć probówek we wstępnie ogrzanym inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 37 °C i wstrząsać z prędkością 200 obr./min. Inkubuj kulturę przez noc lub przez 10 do 30 godzin.
  2. Wybór kultury do zapasu glicerolu
    1. Umieść wstępnie podgrzane podłoże M63 o temperaturze pokojowej, P-1,000, końcówki do pipet 1,000 μl i jednorazową kuwetę na czystej stole.
    2. Dodaj 1000 μl M63 do jednorazowej kuwety z P-1,000. Umieść jednorazową kuwetę w spektrofotometrze, uruchom program na stałej długości fali 600 nm i zmierz ślepą próbę.
    3. Przenieś pięć szklanych probówek z inkubatora do wytrząsania na czystą ławkę.
    4. Wyrzuć M63 z jednorazowej kuwety i dodaj 1,000 μl kultury do tej samej jednorazowej kuwety z P-1,000. Zmierzyć zmętnienie optyczne hodowli komórkowej (OD600) zgodnie z opisem w kroku 2.2.2.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia i uzyskać precyzyjny pomiar, należy wystawić szklane probówki i korki na działanie płomienia zgodnie z opisem i przeprowadzić wirowanie kultury przed pobraniem próbki. Aby zapewnić wiarygodne wyniki, zaleca się powtarzanie pomiarów, szczególnie gdy gęstość komórek jest niska.
    5. Spośród pięciu kultur komórkowych wybierz jedną, która znajduje się we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego (OD600 = 0,01 - 0,05) dla zapasu glicerolu.
      UWAGA: Jeśli wiele kultur ma gęstość w optymalnym zakresie, zwykle wybiera się tę najbliższą 0,05.
  3. Przygotuj zapasy glicerolu do wielokrotnych testów.
    UWAGA: Jest to opisane dla przygotowania dziesięciu zapasów. Większe lub mniejsze ilości mogą być wykonane zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
    1. Na czystej ławie umieść wysterylizowany 60% roztwór glicerolu, dziesięć wysterylizowanych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml, końcówki do pipet P-1000 i P-200, 1000 i 200 μl oraz stojak na mikroprobówki.
    2. Dodać 250 μl wysterylizowanego 60% roztworu glicerolu i 750 μl wybranej kultury komórkowej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i wymieszać pipetując.
      UWAGA: Objętość zapasów jest zmienna, ale zawsze utrzymuj stosunek 1:3 60% glicerolu do hodowli komórkowej; W ten sposób uzyskuje się końcowe stężenie glicerolu wynoszące 15%.
    3. Umieścić pozostałe dziewięć mikroprobówek w stojaku na mikroprobówki i dozować 100 μl mieszaniny przygotowanej w kroku 2.3.2 do każdej probówki. Obecnie istnieje dziesięć identycznych zapasów glicerolu do wykorzystania w przyszłości.
    4. Przechowywać buliony w głębokiej zamrażarce w temperaturze -80 °C.

3. Zdobywanie krzywych wzrostu

  1. Konfiguracja czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Terminy umieszczone w cudzysłowie pokazują konkretne sformułowanie użyte w używanym tutaj czytniku płyt (patrz Spis materiałów).
    1. Otwórz oprogramowanie. Otwórz "Protokoły" w "Menedżerze zadań" i wybierz "Utwórz nowy". Wybierz "Protokół standardowy".
    2. Otwórz "Procedurę" i dostosuj ustawienia. Otwórz "Ustaw temperaturę" i wybierz "Inkubator włączony". Ustaw "Temperaturę" na 37 °C i "Gradient" na 0 °C. Sprawdź "Podgrzej" przed przejściem do następnego kroku. Otwórz "Start Kinetic", ustaw "Czas trwania" na 24:00:00 lub 48:00:00 i "Interwał" na 00:30:00 lub 01:00:00.
      UWAGA: Odczytanie całej płytki 96-dołkowej zajmuje około 1 minuty.
    3. Otwórz "Potrząśnij" i ustaw "Tryb potrząsania" jako "Liniowy". Zaznacz "Constitution Shake" i ustaw "Częstotliwość" na 567 cpm. Otwórz "Odczyt", zaznacz "Absorbancja", "Punkt końcowy/kinetyczny" i "Monochromatory". Ustaw "Długość fali" na 600.
    4. Kliknij "Zatwierdź", aby potwierdzić, że procedura jest poprawna. Kliknij "Zapisz", aby zapisać go jako nowy program do wykorzystania w przyszłości.
  2. Rejestrowanie wzrostu w czasie rzeczywistym
    1. Narysuj piktogram 96-dołkowej płytki (tabela 8 × 12), aby wskazać położenie inokulowanych próbek kultur na 96-dołkowej płytce. Wydrukuj tabelę i użyj jej jako odniesienia do eksperymentu.
      UWAGA: Studzienki znajdujące się na krawędziach mikropłytki powinny zawierać tylko ślepą pożywkę ze względu na parowanie.
    2. Umieść wysterylizowaną 96-dołkową mikropłytkę z płaskim dnem i pokrywką, P-1000, końcówki do pipet 1000 μl, końcówki do pipet P-200, końcówki do pipet 200 μl, kilka mikroprobówek 1,5 ml, pipetę wielokanałową 8, wysterylizowany zbiornik odczynnika, temperaturę pokojową M63 i zapasy glicerolu (przygotowane w kroku 2.3) na czystej ławce.
    3. Dodać około 25 ml M63 do zbiornika odczynnika. Użyj tego zapasu zbiornika do wszystkich poniższych kroków.
    4. Dodać 900 μl M63 do mikroprobówek, przygotowując się do wykonania seryjnych rozcieńczeń.
    5. Rozmrozić bulion glicerolu w temperaturze pokojowej. Dodaj 900 μl M63 do rozmrożonego bulionu glicerolowego i odwiruj. Powoduje to 10-krotne rozcieńczenie oryginalnego zapasu glicerolu.
    6. Przenieść 100 μl 10-krotnego rozcieńczenia do innej mikroprobówki zawierającej 900 μl M63 i wirować. Powoduje to 100-krotne rozcieńczenie.
    7. Powtarzać krok 3.2.6 aż do uzyskania żądanej liczby rozcieńczeń.
    8. Napełnij studzienki na krawędzi mikropłytki 200 μl M63 za pomocą 8-kanałowej pipety (P-200).
      UWAGA: Te studzienki mogą być używane jako półfabrykat.
    9. Załadować 200 μl każdej rozcieńczonej próbki przygotowanej w krokach 3.2.4 - 3.2.7 do studzienek mikropłytki zgodnie z tabelą odniesienia (krok 3.2.1). Rozcieńczone próbki należy swirować przed załadowaniem i załadować tę samą próbkę do wielu dołków w różnych miejscach na płytce.
    10. Umieścić 96-dołkową mikropłytkę na czytniku płytek.
    11. Otwórz "Czytaj teraz" w "Menedżerze zadań" i wybierz program (sekcja 3.1). Kliknij "OK", aby rozpocząć pomiar. Zapisz nagranie jako nowy plik eksperymentalny do analizy danych (sekcja 4).

4. Analiza danych

  1. Eksportuj wyniki danych o tempie wzrostu w czasie rzeczywistym (sekcja 3.2) do pamięci USB w postaci pliku tekstowego.
    UWAGA: Wyniki (krzywe) sformatowane w 96 dołkach będą wyświetlane na czytniku płytek w czasie rzeczywistym. Rekordy godzinowe (wartości OD) można eksportować jako tabelę; wiersze i kolumny reprezentują odpowiednio numery studzienek (np. A1, B1) i czas pomiaru (np. 00:00:59).
  2. Otwórz plik tekstowy za pomocą arkusza kalkulacyjnego.
  3. Skopiuj godzinowe odczyty OD600 z 96-dołkowej mikropłytki do nowego arkusza roboczego w celu dalszej analizy.
  4. Odejmij odczyty tła w czasie zerowym od godzinowych odczytów każdej próbki studzienki.
    UWAGA: Dla wygody jako wartość tła można użyć średniej wartości ślepych studzienek zawierających M63 (krok 3.2.8).
  5. Oblicz średnią z pięciu kolejnych odczytów OD600, aby oszacować maksymalną gęstość zaludnienia.
    UWAGA: Największą średnią wartość z pięciu kolejnych odczytów OD600 definiuje się jako maksymalną wartość OD600 odpowiedniej krzywej wzrostu.
  6. Obliczyć szybkość wzrostu, μ (h-1), stosując następujące równanie dla wszystkich par kolejnych wartości OD600:
    figure-protocol-1
    UWAGA: W tym równaniu Ci i C i+1 reprezentują wartości OD600 dowolnych dwóch kolejnych punktów czasowych (odpowiednio ti i t i+1). LN oznacza logarytm naturalny.
  7. Oblicz zmiany szybkości wzrostu w czasie na podstawie godzinowych odczytów OD600 zgodnie z krokiem 4.6. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe pięciu kolejnych szybkości wzrostu, aby oszacować maksymalną szybkość wzrostu.
    UWAGA: Największa średnia z najmniejszym odchyleniem standardowym jest definiowana jako maksymalna szybkość wzrostu odpowiedniej krzywej wzrostu.

5. Potwierdzanie globalnego odchylenia 96-dołkowych odczytów (opcjonalnie)

UWAGA: Zarówno czytnik płytek, jak i jednorazowa płytka 96-dołkowa mogą powodować stronnicze pomiary. Aby uzyskać wysoce precyzyjne i powtarzalne wyniki ilościowe, zdecydowanie zaleca się potwierdzenie globalnego odchylenia płytki 96-dołkowej.

  1. Przygotować płytkę 96-dołkową i czytnik płytek do badania odchylenia, jak opisano w ppkt 3.2.2.
  2. Dodaj 20 ml M63 do wysterylizowanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj bulion glicerolowy do tej samej probówki wirówkowej i odwiruj. Przenieść zawieszony roztwór do wysterylizowanego zbiornika odczynnika.
  3. Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieś 200 μl zawieszonego roztworu na płytkę 96-dołkową.
  4. Umieść 96-dołkową płytkę na czytniku płytek i rozpocznij pomiar.
  5. Zapisz godzinowe odczyty OD600 i przeanalizuj zgodnie z opisem w sekcji 4. Porównaj obliczoną maksymalną szybkość wzrostu i gęstość zaludnienia każdego odwiertu, aby określić odchylenie lokalizacyjne odczytów z 96 odwiertów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda umożliwia uchwycenie dynamicznego wzrostu bakterii w sposób ciągły, o wysokiej przepustowości, dzięki wykorzystaniu 96-dołkowego czytnika formatu, który wykonuje wiele pomiarów gęstości optycznej w różnych odstępach czasu (od minut przez godziny do dni). Krzywe wzrostu różnych szczepów E. coli wykazujących ekspresję różnych genomów można precyzyjnie uzyskać w jednym eksperymencie (Rysunek 1A). W porównaniu z opisaną metodą, metoda tradycyjna (te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki w protokole obejmują przygotowanie wspólnego zapasu komórek rosnących wykładniczo i replikację tych samych próbek w wielu studzienkach w różnych pozycjach na mikropłytce. Wcześniej mikrobiolodzy rozpoczynali hodowlę od nocnej hodowli wstępnej. Chociaż ta metoda może skrócić czas opóźnienia wzrostu bakterii, trudno jest uzyskać powtarzalne krzywe wzrostu. Jak pokazano na rysunku 2, niezależne pomiary z wykorzystaniem popularnych zapasów glicerolu dały prawie identyczne krzywe w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Kohei Tsuchiya za dostarczenie przykładu testu CFU. Prace te zostały częściowo wsparte finansowo przez Grant-in-Aid for Scientific Research (C) nr 26506003 (dla BWY) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
K2HPO4Wako164-04295
KH2PO4Wako166-04255
(NH4)2SO4Wako019-03435
MgSO4-7H2OWako138-00415
Tiamina-HClWako201-00852
glukozaWako049-31165
HClWako080-01066
Siarczan żelaza (II) siedmiowodny (FeSO4-7H2O)Wako094-01082
KOHWako168-21815
GlycerolWako075-00611
Probówka wirówkowa (50 mL, sterylizowana)WATSON1342-050S
Końcówki do pipet, 200 i mikro; LWATSON110-705Y Końcówki
do pipet, 1,000 &mikro; LWATSON110-8040
Mikroprobówka (1,5 ml)Pipeta wielokanałowa WATSON131-715C
WATSONNT-8200
PASORINAJAKO JEDNO2-4990-02
Szklany cylinder (200 ml)AS ONE1-8562-07
Precyzyjny miernik pHAS ONEAS800 / 1-054-01
Pipetman P-200GILSON1-6855-05
Pipetman P-1000GILSON1-6855-06
Jednorazowe pipety serolocywe (10 ml)Jednorazowe
(25 ml)
BM Bio801-02Y
VortexBM BioBM-V1
Corning Costar 96-dołkowa mikropłytka z pokrywką (płaska dno, przezroczysta)Sigma-AldrichCorning, 3370
Zbiornik na odczynniki Corning Costar (50 ml)Sigma-AldrichCorning, 4870
Stericup GV PVDF (250 mL, 0,22 µ M)Merck MilliporeSCGVU02RE
Pipet-Aid XPDRUMMOND4-000-101
Bioshaker (BR-23UM MR)TAITEC0053778-000
Komórka do utylizacji (1,5 ml)Kartell1938 / 2-478-02
DU 730 Life Science Spektrofotometr UV/VisBeckman CoulterA23616
EPOCH2BioTek2014- EP2-002 / EPOCH2T
Zlewka (500 mL)IWAKI82-0008
BIO czysta ławkaPanasonicMCV-B131F
Rurki szklaneNICHIDEN RIKA GLASSP-10M~P-30 /101019
Korki z gumy silikonowejShinEtsu PolymerT-19
Szczepy bakteryjneOrganizacja banku szczepów; Narodowy Projekt Zasobów Biologicznych (NBRP) w Japonii
8 MIESZADŁO pipety serolocywe SANPLATEC SAN27014 Statyw do mikroprobówek SANPLATEC SAN27015

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
  2. Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
  3. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  4. Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287(2015).
  5. Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
  6. Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808(2013).
  7. Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
  8. Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231(2016).
  9. Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
  10. Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
  11. Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
  12. Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
  13. Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
  14. Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172(2016).
  15. Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
  16. Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801(2015).
  17. Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza wzrostu bakteriiwysokoprzepustowa ocena wzrostuprotok z u yciem czytnika mikrop ytekmaksymalny szybko wzrostupomiar g sto ci populacjipomiar absorbancji OD600procedura rozcie cze seryjnychszczepy Escherichia coliprzygotowanie po ywki M63zastosowanie p ytek 96 do kowych

Powiązane artykuły