Artykuł metodologiczny

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56199

⸱

8 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

W tym artykule

Podsumowanie

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Streszczenie

Niewydolność naczyniowa i zmiany w prawidłowym ukrwieniu siatkówki są jednymi z głównych czynników patogenezy różnych zagrażających wzrokowi chorób oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa, retinopatia nadciśnieniowa i prawdopodobnie jaskra. Dlatego preparaty mikronaczyniowe siatkówki są kluczowymi narzędziami do badań fizjologicznych i farmakologicznych w celu określenia podstawowych mechanizmów patofizjologicznych i zaprojektowania terapii tych chorób. Pomimo szerokiego zastosowania modeli mysich w badaniach okulistycznych, badania nad reaktywnością naczyniową siatkówki są rzadkie u tego gatunku. Głównym powodem tej rozbieżności są trudne procedury izolacji ze względu na mały rozmiar tych naczyń krwionośnych siatkówki, który wynosi ~ ≤ 30 μm średnicy światła. Aby obejść problem bezpośredniej izolacji tych mikronaczyń siatkówki do badań funkcjonalnych, opracowaliśmy technikę izolacji i przygotowania, która umożliwia badania ex vivo wazoaktywności siatkówki myszy w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Chociaż obecne preparaty eksperymentalne będą odnosić się w szczególności do tętniczek siatkówki myszy, metodologia ta może być łatwo zastosowana do mikronaczyń krwionośnych szczurów.

Wprowadzenie

Zaburzenia w perfuzji siatkówki są związane z patogenezą różnych chorób oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa, retinopatia nadciśnieniowa i jaskra1,2,3. Dlatego badania mające na celu pomiar reaktywności naczyniowej w siatkówce są ważne dla zrozumienia patofizjologii tych chorób i opracowania nowych podejść do leczenia.

Ze względu na możliwość manipulacji genami w genomie myszy, mysz stała się powszechnie używanym modelem zwierzęcym do badań układu sercowo-naczyniowego4. Jednak ze względu na mały rozmiar naczyń krwionośnych siatkówki (≤ 30 μm) pomiar reaktywności naczyniowej w siatkówce myszy jest trudny. Na przykład, techniki stereomikroskopowe do pomiarów in vivo mają ograniczoną rozdzielczość optyczną i dlatego pozwalają na dokładne wykrycie zmian średnicy lub przepływu krwi w małej krwi o średnicy mniejszej niż ≤ 30 μm tylko wtedy, gdy są wyposażone w dodatkowe wyrafinowane urządzenia, takie jak mikroskop konfokalny wykorzystujący barwniki fluorescencyjne lub oftalmoskop skaningowy optyki adaptatywnej5, 6. Co więcej, interpretacja pomiarów in vivo mających na celu identyfikację lokalnych mechanizmów sygnalizacyjnych w naczyniach krwionośnych siatkówki może być zakłócona przez środki znieczulające, zmiany ogólnoustrojowego ciśnienia krwi i wpływ pozagałkowych naczyń krwionośnych.

Dlatego opracowaliśmy metodę pomiaru reakcji naczyń krwionośnych siatkówki myszy z wysoką rozdzielczością wzrokową ex vivo. Przedstawiona technika pozwala na wizualizację tętniczek siatkówki za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Ta metoda, która może być również stosowana u szczurów, zapewnia dostęp do zalet technologii celowania genowego w badaniach naczyń ocznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne tego badania zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Nadrenii-Palatynatu, Niemcy. Opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi i oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Zwierzęta były traktowane zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE w zakresie doświadczeń na zwierzętach. Do eksperymentów wykorzystano samce myszy C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, USA) w wieku 3-4 miesięcy. Zwierzęta trzymano w standardowych warunkach (temperatura 23 ± 2 °C, zakres wilgotności 55 ± 10% i 12 godzin cykli światło/ciemność) i miały dostęp do standardowej karmy dla myszy i wody ad libitum.

1. Izolacja siatkówki myszy

  1. Umieść narzędzia do preparowania na stole przygotowawczym i sprawdź, czy wszystkie narzędzia są kompletne, aby umożliwić szybkie przygotowanie.
  2. Poświęć mysz przez wdychanie CO2 .
  3. Odetnij głowę myszy stalowymi nożyczkami, przetnij czaszkę strzałkowo na dwie połówki za pomocą tej samej pary nożyczek i usuń skórę i mózg za pomocą nożyczek do oczu (Rysunek 1).
  4. Odetnij kość czaszki, aby pozostawić tylko kość oczodołu, używając nożyczek do oczu.
  5. Przenieść orbitę do naczynia preparacyjnego zawierającego lodowaty bufor Krebsa-Henseleita.
  6. Trzymaj naczynie preparacyjne na lodzie lub zmieniaj bufor co 10 minut.
  7. Przetnij kość oczodołu za pomocą nożyczek do oczu i delikatnie usuń gałkę oczną wraz z tkanką oczodołu za pomocą precyzyjnej pęsety typu 4 i nożyczek sprężynowych Student Vannas (Rysunek 2).
  8. Delikatnie usuń gruczoł Harderian, tkankę łączną i mięśnie zewnątrzgałkowe za pomocą precyzyjnej pęsety typu 5 i nożyczek do kapsulotomii Vannas, uważając, aby nie uszkodzić głównej gałęzi tętnicy ocznej.
  9. Podwiązywać gałęzie oczodołowe tętnicy ocznej i ostatecznie bliższy koniec głównej gałęzi tętnicy ocznej za pomocą szwów nylonowych 10-0 (Ryc. 3).
  10. Przenieś gałkę oczną na szalkę Petriego zawierającą 70% etanolu na 10 s za pomocą precyzyjnej pęsety typu 4. Umieścić gałkę oczną z powrotem w naczyniu separacyjnym i zastąpić bufor świeżym roztworem Krebsa. Rogówka będzie wyglądać na białawą po ekspozycji na etanol .
  11. Nakłuć obwodową rogówkę igłą o rozmiarze 30 i wyciąć rogówkę za pomocą nożyczek do kapsulotomii Vannas. Delikatnie odetnij tkankę tęczówki, umieść jeden ostry czubek nożyczek kapsulotomijnych Vannas między naczyniówką a siatkówką i odetnij naczyniówkę i twardówkę. Pozostaw trochę tkanki twardówki wokół nerwu wzrokowego (Ryc. 4).

2. Montaż siatkówki w komorze perfuzyjnej

UWAGA: Komora perfuzyjna używana do eksperymentów z tętniczkami siatkówki jest domowej roboty. Składa się z przezroczystego zbiornika z rurką wlotową i odpływową (Rysunek 5). Jeden koniec silikonowej rurki jest przyklejony do dna komory za pomocą kleju histoakrylowego, a drugi koniec przymocowany do trójdrożnego kranu. Podłączyć strzykawkę zawierającą świeży bufor Krebsa do trójdrogowego kranu i napełnić probówkę buforem.

  1. Weź szklaną mikropipetę z uchwytem na igłę i wepchnij ją do końca rurki na dnie komory perfuzyjnej. Następnie rozbij końcówkę mikropipety nożyczkami typu 4, aby uzyskać końcówkę o średnicy 100 μm.
  2. Skoncentruj się na końcówce mikropipety i przepłucz ją przez strzykawkę podłączoną do probówki. Uważaj, aby naczynia włosowate nie były zasłonięte przez zanieczyszczenia. W przypadku niedrożności należy ją wyjąć, przepłukać rurkę i włożyć kolejną mikropipetę.
  3. Napełnij komorę perfuzyjną zimnym buforem Krebsa i umieść komorę pod mikroskopem stereoskopowym.
  4. Umieść przezroczystą plastikową platformę w komorze perfuzyjnej. Platforma ta ma wgłębienie o szerokości 1,8 mm na nerw wzrokowy i tętnicę oczną i jest umieszczona na dwóch stalowych drutach o średnicy 1,6 mm. Następnie umieść na platformie pierścień ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 2.8 mm i średnicy zewnętrznej 4.0 mm.
  5. Przenieś siatkówkę z nerwem wzrokowym i przyczepioną tętnicą oczną z komory rozwarstwiającej do komory perfuzyjnej z najwyższą ostrożnością za pomocą łyżki. Ten krok jest ważny, aby zapobiec potencjalnemu rozciąganiu tkanek, ponieważ może to być szkodliwe dla eksperymentu.
  6. Odetnij zszytą część bliższego końca tętnicy ocznej, umieść dwie wstępnie uformowane pętle nylonowego szwu 10-0 na mikropipecie i kaniuluj tętnicę oczną za pomocą mikropipety. Przymocuj tętnicę do mikropipety (Rysunek 6) i umieść siatkówkę na przezroczystej platformie za pomocą cienkiej pęsety.
  7. Delikatnie rozerwij przednią torebkę soczewki za pomocą dwóch cienkich pęset, wyciągnij soczewkę i odetnij całą torebkę soczewki za pomocą mikronożyczek.
  8. Następnie wykonaj cztery promieniste nacięcia w siatkówce w połowie odległości od pars plana do nerwu wzrokowego i umieść pierścień ze stali nierdzewnej na siatkówce, aby przymocować go do dołu. Siatkówka jest teraz gotowa do eksperymentu (Rysunek 7).

3. Przygotowanie tętniczek siatkówki do eksperymentu

  1. Umieść komorę perfuzyjną pod mikroskopem świetlnym. Obiektyw jest soczewką obiektywową 100X zanurzoną w wodzie.
  2. Podłączyć dwa przewody do wlotu i odpływu do pompy perycyklicznej i wprowadzić cyrkulację w komorze z buforem Krebsa natlenionym 95%O2 i gazowanym 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Stosować natężenie przepływu od 100 do 120 ml/min.
  3. Podłącz silikonową rurkę, która jest podłączona do mikropipety, do silikonowego węża zbiornika za pomocą trójdrożnego kurka. Następnie należy napełnić zbiornik buforem Krebsa do wysokości odpowiadającej 50 mm Hg, ale nie otwierać jeszcze kranu trójdrogowego.
  4. Spójrz przez obiektywy mikroskopu i skup się na powierzchni siatkówki. Szukaj naczyń krwionośnych lub czerwonych krwinek. Możliwe, że naczynia krwionośne są całkowicie zapadnięte, więc czasami widoczne są tylko niektóre czerwone krwinki.
  5. Kiedy zostanie znalezione naczynie krwionośne, skup się na nim i otwórz trójdrożny kran odcinający. Średnica naczynia powinna natychmiast wzrosnąć, a czerwone krwinki poruszają się albo odśrodkowo, jeśli jest to tętniczka, albo dośrodkowo w przypadku żyłki. Tętniczki mają mniejszą średnicę w porównaniu z żyłkami tego samego rzędu.
  6. Po znalezieniu naczynia krwionośnego z dobrze widoczną ścianą, można je wykorzystać do eksperymentów po okresie równowagi wynoszącym 30 minut (Ryc. 8). W okresie równowagi tętniczki rozwijają tylko słaby ton wewnętrzny, co skutkuje zmniejszeniem średnicy światła o mniej niż 10%.

4. Przeprowadzanie eksperymentu

  1. Zbadać żywotność naczyń za pomocą mimetycznej tromboksanu 9,11-dideoksy-9α,11α-metanoepoksydowej prostaglandyny F2α (U46619), dodając ją do roztworu do kąpieli. Środek ten zwęża tętniczki siatkówki myszy o około 50% od średnicy spoczynkowej w stężeniach ≥ 10-6 M.
  2. Po potwierdzeniu, że naczynie jest zdolne do życia, wypłukać agonistę z kąpieli poprzez cyrkulację pompy i wprowadzić świeży bufor Krebsa do kąpieli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

U-46619 wywoływał zależne od stężenia reakcje skurczowe w tętniczkach siatkówki myszy typu dzikiego z linii C57Bl/6J. Przy stężeniu 10-6 M zmniejszenie średnicy światła naczynia wyniosło ≈50% w stosunku do średnicy spoczynkowej. Rysunek 9A przedstawia reprezentatywną krzywą zależność reakcji od stężenia dla jednej tętniczki siatkówki. W tętniczkach uprzednio skurczonych za pomocą U46619, kumulatywne podawanie acetylocholiny wywołało zależne od stęż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomiar odpowiedzi naczyniowych w siatkówce myszy jest trudny ze względu na mały rozmiar naczyń krwionośnych siatkówki. Dzięki prezentowanej technice tętniczki siatkówki są uwidocznione za pomocą mikroskopii światła przechodzącego. Jest to możliwe, ponieważ izolowana siatkówka jest półprzezroczysta. Zaletą tej techniki jest wysoka rozdzielczość optyczna. Obliczona rozdzielczość przestrzenna wynosi 11 px/μm. Jednak rzeczywista rozdzielczość tego układu optycznego wykorzystującego światło białe wynosi od 200 do 300 nm, co t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Ernst und Grimmke Stiftung i Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (DOG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nożyczki staloweCarl Roth GmbH3576.11x 140 mm
Nożyczki do oczuGeuderG-193901x proste, 10,5 cm
Pęseta precyzyjna, prosta z cienkimi końcówkamiCarl Roth GmbHLH68.12x typ 4
Pęseta precyzyjna, prosta z bardzo cienkimi końcówkamiCarl Roth GmbHLH53.12x typ 5
Nożyczki kapsulotomijneVannasGeuder197601x proste, 77 mm
Student Vannas Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki precyzyjnej91501-091x zakrzywione,
Barraquer Uchwyt igłyGeuderG-175001x zakrzywiony, igła 120 mm
Becton, Dickinson and Company3051281x 30 G
Kapilary szklane (do produkcji mikropipet)Drummond Scientific Company9-000-12111x (1,2 x 0,8 mm; średnica zewnętrzna/wewnętrzna)
Nylon ShatureAlcon1980011x 10-0
Naczynie do hodowli komórek nunclonThermo Fisher Scientific1530661x
naczynie do hodowli komórek nunclonThermo Fisher Scientific1729311x średnica 100 mm
Discofix CBraun16500C10 cm
Histoacryl klejB. Braun Surgical, S.A.1050052
NazwaFirmaNumer katalogowy>Komentarze
Equipment
Pompa perycykliczna  (CYKLO II)Carl Roth GmbHEP76.11x
Pionowy ściągacz do pipet Model 700CDavid Kopf Instrumenty1x
Mikroskop (Vanox-T AH-2)Olympus1x
Obiektyw do zanurzenia w wodzie LUMPlanFL, 1.0 NAOlympus1x
Aparat cyfrowy (TK-C1381)JVC1x
Komora perfuzyjnawłasnej produkcji1x
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Drugs and Solutions
EtanolCarl Roth GmbHK928.4
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2)Carl Roth GmbH5239.1
Chlorek kalium (KCl)Carl Roth GmbH6781.1
Diwodorofosforan kalium (KH2PO4)Carl Roth GmbH3904.2
Siarczan magnezu (MgSO4)Carl Roth GmbH261.2
Chlorek sodu (NaCl)Carl Roth GmbH9265.2
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Carl Roth GmbH0965.3
α-(D)-(+)- Glukoza monohydratCarl Roth GmbH6780.1
9,11-dideoksy-9&alfa;,11&alfa;-metanoepoksydowa prostaglandyna F2&alfa; (U-46619)Cayman Chemical16450
Chlorek acetylocholinySigma-AldrichA6625-25G
o średnicy 35 mm

Bibliografia

  1. Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
  2. Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
  3. Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
  4. Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
  5. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  6. Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
  7. Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
  8. Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
  9. Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
  10. Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie ex vivopomiar reaktywno ci naczyniowejtechnika wideomikroskopiiizolacja t tnicy ocznejperfuzja buforem Krebsaskurcz naczy wywo any U46619rozszerzenie naczy wywo ane acetylocholinmonta w szklanej mikropipecieobrazowanie stereomikroskopowe

Powiązane artykuły