Artykuł metodologiczny

Nowatorskie zastosowanie trójwymiarowej ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do charakteryzowania wczesnej ciąży u myszy

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56207

⸱

24 października 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Devision of Repreoductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine, 2Mouse Phenotyping Core, Baylor College of Medicine, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Myszy są powszechnie używane do badania biologii ciąży. W przypadku takich badań wymagane jest jednak przerwanie ciąży, co wyklucza badania podłużne i wymaga wykorzystania dużej liczby zwierząt. Dlatego opisujemy nieinwazyjną technikę ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do wczesnego wykrywania i monitorowania zdarzeń poimplantacyjnych u ciężarnej myszy.

Streszczenie

Ultrasonografia wysokiej częstotliwości (HFUS) jest powszechną metodą nieinwazyjnego monitorowania rozwoju ludzkiego płodu w czasie rzeczywistym w macicy. Mysz jest rutynowo wykorzystywana jako model in vivo do badania implantacji zarodka i progresji ciąży. Niestety, takie badania na myszach wymagają przerwania ciąży, aby umożliwić dalszą analizę fenotypową. Aby rozwiązać ten problem, zastosowaliśmy trójwymiarową (3-D) rekonstrukcję danych obrazowych HFUS w celu wczesnego wykrywania i charakteryzowania miejsc implantacji mysich zarodków oraz ich indywidualnej progresji rozwojowej w macicy. Łącząc obrazowanie HFUS z rekonstrukcją i modelowaniem 3D, byliśmy w stanie dokładnie określić ilościowo liczbę miejsc implantacji zarodków, a także monitorować postęp rozwoju u ciężarnych myszy C57BL6J/129S od 5,5 dnia po stosunku (d.p.c.) do 9,5 d.p.c. za pomocą przetwornika. Pomiary obejmowały: liczbę, lokalizację i objętość miejsc implantacji oraz odstępy między miejscami implantacji; Żywotność zarodków oceniano za pomocą monitorowania czynności serca. W bezpośrednim okresie po implantacji (od 5,5 do 8,5 d.p.c.) trójwymiarowa rekonstrukcja ciężarnej macicy zarówno w formacie siatki, jak i nakładki litej umożliwiła wizualne przedstawienie rozwijających się ciąż w obrębie każdego rogu macicy. Ponieważ genetycznie modyfikowane myszy są nadal wykorzystywane do charakteryzowania żeńskich fenotypów reprodukcyjnych pochodzących z dysfunkcji macicy, metoda ta oferuje nowe podejście do wykrywania, ilościowego określania i charakteryzowania wczesnych zdarzeń implantacji in vivo. To nowatorskie zastosowanie obrazowania 3D HFUS demonstruje zdolność do skutecznego wykrywania, wizualizacji i charakteryzowania miejsc implantacji zarodków we wczesnej ciąży mysiej w sposób nieinwazyjny. Technologia ta oferuje znaczną poprawę w porównaniu z obecnymi metodami, które opierają się na przerywaniu ciąży w celu uzyskania dużej tkanki i charakterystyki histopatologicznej. Tutaj używamy formatu wideo i tekstowego, aby opisać, jak skutecznie wykonać ultradźwięki wczesnej ciąży mysiej w celu wygenerowania wiarygodnych i powtarzalnych danych z rekonstrukcją formy macicy na siatkowych i solidnych obrazach 3D.

Wprowadzenie

Nawracające wczesne utrata ciąży jest jednym z najczęstszych powikłań po poczęciu i dotyka około 1% par starających się o dziecko1,2. Mechanizmy leżące u podstaw wczesnej utraty ciąży są zróżnicowane: od wewnętrznych nieprawidłowości zarodkowych i chorób współistniejących u matki po wady receptywności endometrium1,3,4. Ze względu na ich podatność genetyczną, modele mysie są szeroko wykorzystywane do badań nad wczesną implantacją zarodka i ciążą. Co więcej, krótki czas ciąży myszy i możliwość przeprowadzania badań na dużą skalę zapewniły rosnącą użyteczność myszy w rozwiązywaniu kluczowych pytań klinicznych w medycynie reprodukcyjnej człowieka5. To powiedziawszy, zdecydowana większość mysich projektów eksperymentalnych nadal wymaga eutanazji wielu matek w kolejnych dniach ciąży w celu ilościowego określenia i analizy lokalizacji, liczby, rozmiaru i wzorców odstępów między miejscami implantacji podczas ciąży6,7,8, co wyklucza badania podłużne na tym samym zwierzęciu.

W klinice ultrasonografia jest niezawodnym i nieocenionym narzędziem do monitorowania żywotności i rozwoju ludzkiego płodu w sposób nieinwazyjny9,10,11. Ostatnio ultrasonografia o wysokiej częstotliwości (HFUS) zaczęła znajdować ograniczone zastosowanie u myszy jako metoda monitorowania żywotności i wzrostu płodu podczas ciąży12,13,14. Najnowsze osiągnięcia technologiczne w obrazowaniu ultrasonograficznym pozwoliły na zastosowanie danych trójwymiarowych (3D) do wizualnej rekonstrukcji narządów zwierzęcych i późniejszego monitorowania patologii15,16,17. Zastosowanie tej zaawansowanej technologii obrazowania znacznie poprawiło zdolność wykrywania mniejszych fluktuacji objętości, zmniejszania zmienności między zwierzętami oraz monitorowania postępu patologii lub skuteczności interwencji terapeutycznej17. Podczas gdy głównym zastosowaniem tej technologii było monitorowanie progresji nowotworu złośliwego w modelach onkomysów15,16, obrazowanie 3D HFUS dopiero od niedawna jest wykorzystywane do ilościowego i monitorowania aktywnego wzrostu implantacji zarodka i rozwoju płodu w macicy myszy18.

Tutaj pokazujemy, jak wykonać obrazowanie HFUS w celu uzyskania danych 2D i 3D w celu wygenerowania rekonstrukcji macicy myszy we wczesnej ciąży. Pokazujemy przydatność tej nowatorskiej metody do wykrywania tych wczesnych przypadków implantacji zarodka bez konieczności przerywania ciąży, umożliwiając naukowcom gromadzenie danych w sposób nieinwazyjny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Te badania zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez National Institutes of Health oraz protokołami dla zwierząt zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Baylor College of Medicine pod numerem protokołu AN-4203.

1. Przygotowanie ciężarnej myszy do badania ultrasonograficznego

  1. Krycie czasowe
    1. Umieść tamę ze sprawdzonym płodnym samcem myszy na noc, zaczynając po 1700 roku. Oddziel matkę i samca o godzinie 0700 (h), niezależnie od tego, czy obecny jest czop dopochwowy, aby zapewnić dokładne datowanie ciąży.
      UWAGA: Za dzień po kryciu uważa się 0,5 dnia po stosunku (d.p.c.).
  2. Przygotowanie do badania ultrasonograficznego
    1. Umieść ciężarną mysz w szczelnie zamkniętym pojemniku do indukcji znieczulenia.
    2. Uspokoić izofluranem (2%), wziewnym środkiem znieczulającym i tlenem (1 l/min), aż zwierzę straci odruch prostowania (około 1-2 minuty w zależności od wielkości myszy) i nie obserwuje się spontanicznych ruchów (poza oddychaniem).
    3. Umieść uspokojoną mysz w pozycji leżącej na plecach w stożku nosowym z izofluranem (2%) wziewnym środkiem znieczulającym i tlenem (1 l/min). Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia.
    4. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż krem do depilacji na cały brzuch, mostek do pochwy i bocznie na boki.
    5. Pozostaw krem na maksymalnie 3 minuty, a następnie usuń krem i włosy chusteczką. Upewnij się, że wszystkie włosy zostały usunięte, ponieważ wszelkie pozostałe włosy obniżą jakość obrazu.

2. Przygotowanie sceny ultrasonograficznej

  1. Włącz przetwornik.
  2. Podłącz stopień silnika 3-D stopień silnika do przetwornika.
    1. Podłącz do silnika 3D, podłączając silnika 3D do złącza silnika 3D na tylnym panelu. Przymocuj system silnika 3D do systemu montażowego za pomocą szybkozłączki na górze, aby połączyć się ze stacją obrazowania, oraz szybkozłączki na dole, aby przymocować przetwornik clamp.
  3. Przymocuj sondę do przetwornika clamp.

3. Rozpocznij obrazowanie ciężarnej myszy

  1. Umieść mysz na wznak na platformie monitorującej. Mysz w sposób ciągły otrzymuje znieczulenie izofluranem (między 1,5-2,5%) i tlen (1 l/min) przez stożek nosowy. Delikatnie przyklej wszystkie łapy do podkładek monitorujących tętno na platformie.
    1. Nałóż 1-2 ml żelu do transmisji ultradźwięków na brzuch.
  2. Korzystając z manualnego stopnia motorycznego, umieść sondę ultradźwiękową na dolnej części brzucha.
    1. Zlokalizuj pęcherz, który powinien wyglądać jak wypełnione płynem ciemne koło tuż po głowach do otworu pochwy.
    2. Po zlokalizowaniu pęcherza moczowego bardzo powoli przesuwaj sondę w głowowie, aby uwidocznić macicę w ciąży, która powinna wyglądać jak cylindryczny kształt z okrągłymi obszarami w miejscach ciąży. Można to opisać jako wyglądające jak perły na łańcuszku.
    3. Po zidentyfikowaniu macicy w ciąży rozpocznij obrazowanie 2D.

4. Obrazowanie ultrasonograficzne 2D (Rysunek 1)

  1. Po zidentyfikowaniu macicy w ciąży zacznij od miejsca ciąży znajdującego się najbliżej pęcherza moczowego i powoli i sekwencyjnie przesuwaj głow, aby określić liczbę i lokalizację miejsc ciąży.
  2. Jeśli nerka, śledziona lub wątroba są uwidocznione, przestaw sondę bliżej ogona (bliżej pęcherza), ponieważ użytkownik posunął się za daleko w głowo.
  3. Wyobraź sobie przeciwległy róg macicy w ten sam sposób.
  4. Zamrożenie obrazu, gdy ramka ultrasonograficzna znajduje się w środku miejsca implantacji/ciąży, aby zapisać go do późniejszej analizy i pomiarów.
    UWAGA: Zatrzymanie obrazu i zapisanie go do późniejszej analizy zajmuje mniej niż jedną sekundę.
  5. Zmierz odległość implantacji za pomocą hiperechogenicznej reakcji decydualizacji jako markera, klikając najpierw ręcznie narzędzie "zmierz", a następnie klikając lokalizację jednego miejsca implantacji. Następnie przeciągnij kursor do następnego miejsca implantacji i kliknij, aby narysować linię, której odległość komputer automatycznie poinformuje o swojej odległości. Oprogramowanie następnie podaje, jaki jest pomiar ręczny. Ten krok nie jest skomputeryzowany, ale polega na tym, że użytkownik zaznacza odległość między miejscami dziesiętnymi, rysując linię między miejscami dziesiętnymi, dla której program zapewni pomiar.
  6. Zmierz rozmiar implantacji, rozmiar worka ciążowego i rozmiar słupa płodu.

5. Tętno płodu

UWAGA: Przy 9,5 d.p.c. bicie serca płodu powinno być wyraźnie widoczne.

  1. Trzymając sondę bardzo nieruchomo, włącz Dopplera fali tętna i ustaw ją nad widzialnym biciem serca.
  2. Rejestruj pulsacje bicia serca serca.
    UWAGA: Oprócz serca, procedura ta może również rejestrować pulsacje w pępowinie.

6. Akwizycja ultrasonograficzna 3D

  1. Po uwidocznieniu macicy w ciąży na obrazowaniu 2D, umieść sondę w obszarze, który znajduje się w przybliżeniu w środku pożądanego obrazu 3D. Na przykład, jeśli ktoś obrazuje jabłko w 3D, sonda powinna być początkowo umieszczona w miejscu, w którym przewiduje się lokalizację rdzenia jabłka (tj. w środku obiektu).
  2. Gdy sonda znajduje się w pozycji pośrodku żądanego obrazu, uzyskaj akwizycję 3D. Etap motoryczny 3D pokona tę odległość przez macicę w serii kroków lub klatek, z zamiarem uchwycenia w całości tego, czego pragnie badacz.
  3. Upewnij się, że zamierzone struktury są całkowicie uchwycone w skanowaniu 3D przed zakończeniem części ultrasonograficznej w czasie rzeczywistym. Zapisz te informacje 3-W do późniejszego przetworzenia. Całkowity czas akwizycji ultrasonograficznej 2D i 3D wynosi około 10-20 minut, gdy jest wykonywany przez doświadczonego użytkownika.

7. Przetwarzanie końcowe 3-D Rekonstrukcji (Rysunek 2)

  1. Załaduj żądane dane do przetwarzania obrazu 3D.
  2. Wybierz "metody równoległe i obrotowe", które załadują wszystkie klatki obrazu 3D do jednego "pola" 3D, w którym użytkownik będzie następnie śledził żądany obiekt, klatka po klatce. Wybierz rozmiar kroku 0,08 ml. Zacznij od jednego końca bloku obrazu i przewiń, aby zapoznać się z obrazami, które zostały przechwycone w przestrzeni.
    1. Zacznij od jednego końca obrazu i ręcznie obrysuj kontur obiektu.
    2. Przewiń do następnego wycinka obrazu 2D lub "ramki" i ręcznie obrysuj kontur obiektu.
    3. Kontynuuj ten proces, dopóki wszystkie klatki nie zostaną ręcznie oznaczone/obśledzone przez użytkownika.
    4. Kliknij "zakończ", aby uzyskać obraz 3D i obliczenia całkowitej objętości.
  3. Wybierz między siatką a solidną nakładką, która jest strzałką w lewym górnym rogu.
  4. Wybierz, czy chcesz zachować lub usunąć otaczające informacje o obrazie ultrasonograficznym, aby uzyskać przejrzystość. Każda rekonstrukcja 3D może trwać od 10 do 20 minut.

8. Opieka pozabiegowa

  1. Po zakończeniu badania ultrasonograficznego wyłącz gaz znieczulający, zdejmij mysz z platformy i delikatnie wytrzyj i zmyj żel ultradźwiękowy ze zwierzęcia.
  2. Umieść mysz z powrotem w klatce w pozycji leżącej w wyściełanym obszarze. Monitoruj, aż zwierzę się obudzi i zacznie się spontanicznie poruszać.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 1, ultradźwięki o wysokiej częstotliwości umożliwiają wykrycie rozwoju miejsc implantacji już od 5,5 d.p.c. Wykorzystanie jaśniejszego, hiperechogenicznego zdecidualizowanego endometrium jako markera miejsc implantacji w 6,5 d.p.c. pozwala na ilościowe określenie liczby i rozmieszczenia tych miejsc. W miarę postępu ciąży do 7,5 d.p.c., łatwo można również zidentyfikować ciemniejszy, hipoechogeniczny worek ciążowy oraz biegun zarodkowy....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

To nowatorskie zastosowanie obrazowania 3D HFUS demonstruje zdolność do skutecznego wykrywania, wizualizacji i charakteryzowania miejsc implantacji zarodków we wczesnej ciąży mysiej w sposób nieinwazyjny. Technologia ta oferuje znaczną poprawę w porównaniu z obecnymi metodami, które opierają się na przerywaniu ciąży w celu uzyskania dużej tkanki i charakterystyki histopatologicznej. Należy jednak zauważyć, że metody histologiczne byłyby nadal uważane za bardziej optymalne, gdy pożądana jest charakterystyka na bardziej ro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Bardzo doceniamy pomoc Rong Zhao, Jie Li i Yan Ying.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
VisualSonics Vevo 2100 Platforma/maszyna do obrazowania ultrasonograficznegoVisualSonics, inc.VS-11945
Stacja obrazowania VevoVisualSonics, inc.SA-11982
Aquasonic 100 Żel do transmisji ultradźwiękówParker#SKU PLI 01-08
Butelka 100 ml izofluranu (IsoThesia)Henry Shein#29404
PuraLubenMaść okulistyczna dla zwierzątDechra#12920060

Bibliografia

  1. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  2. Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
  3. Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
  4. Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
  5. Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
  6. Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897(2015).
  7. Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364(2012).
  8. Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
  9. Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
  10. Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
  11. Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
  12. Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205(2013).
  13. Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38(2014).
  14. Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
  15. Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97(2015).
  16. Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
  17. Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
  18. Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312(2017).
  19. Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
  20. Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500(2012).
  21. Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171(2016).
  22. Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
  23. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
  24. Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
  25. Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
  26. Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
  27. Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstrukcja tr jwymiarowaci a u myszyimplantacja zarodkaobrazowanie in vivopomiar p cherzyka p odowegomonitorowanie aktywno ci sercanak adka siatki bry owejpozycjonowanie g owicy przetwornikael do bada ultrasonograficznych

Powiązane artykuły