Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56213

⸱

31 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Streszczenie

Uszkodzenie DNA indukuje specyficzne reakcje sygnalizacyjne i naprawcze w komórce, co jest kluczowe dla ochrony integralności genomu. Mikronapromienianie laserowe stało się cennym narzędziem eksperymentalnym do badania odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) in vivo. Umożliwia analizę dynamiki makromolekularnej pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości w odpowiedzi na uszkodzenia wywołane laserem ograniczone do submikrometrowego obszaru w jądrze komórkowym. Stosowano jednak różne warunki laserowe bez uwzględniania różnic w rodzajach wywoływanych uszkodzeń. W rezultacie, charakter szkody często nie jest dobrze scharakteryzowany lub kontrolowany, co powoduje pozorne niespójności w profilach rekrutacji lub modyfikacji. Wykazaliśmy, że różne warunki napromieniowania (tj. różne długości fal, a także różne moce wejściowe (napromieniowanie) lasera femtosekundowego (fs) bliskiej podczerwieni (NIR)) indukowały różne zespoły białek DDR i naprawczych. Odzwierciedla to rodzaj powstałych uszkodzeń DNA. Protokół ten opisuje, w jaki sposób miareczkowanie mocy wejściowej lasera umożliwia indukcję różnych ilości i złożoności uszkodzeń DNA, które można łatwo monitorować poprzez wykrywanie uszkodzeń zasad i sieciowania, różnicowej sygnalizacji poli (ADP-rybozy) (PAR) oraz specyficznych dla szlaku zespołów czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia. Po określeniu warunków uszkodzenia możliwe jest zbadanie wpływu różnej złożoności uszkodzeń i zróżnicowanej sygnalizacji uszkodzeń, a także wyczerpania czynników poprzedzających na dowolny czynnik będący przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Sygnalizacja uszkodzeń DNA in vivo nie jest dobrze poznana
In vivo DNA jest skompleksowane z histonami i innymi czynnikami, tworząc włókna chromatyny. Regulacja struktury chromatyny ma ogromne znaczenie dla metabolizmu DNA. Na przykład wariant histonu H2AX jest fosforylowany przez mutację ataksji-teleangiektazji (ATM) i inne kinazy po indukcji pęknięć dwuniciowych (DSB) i jest ważny dla wzmocnienia sygnału uszkodzenia DSB, a także zapewnia miejsce dokowania dla innych czynników. Wydaje się, że na rozprzestrzenianie się sygnalizacji uszkodzeń i wybór ścieżki naprawy krytyczny wpływ ma lokalna struktura chromatyny w miejscach uszkodzenia1. Wiele czynników przebudowujących chromatynę, opiekuńczych histonów i enzymów modyfikujących histony jest rzeczywiście rekrutowanych do uszkadzania miejsc i jest ważnych dla skutecznej naprawy DNA, podkreślając znaczenie regulacji chromatyny w DDR i naprawie2,3,4. Ponadto u drożdży i drosophila5,6,7,8, co przypomina relokalizację loci genów w przedziale subjądrowym związanym z regulacją genów9,10. Ostatnie badania na komórkach mysich i ludzkich wykazały również mobilizację miejsc DSB, co wpływa na wierność naprawy i wybór ścieżki11,12. Stwarza to możliwość, że DDR/naprawa może być również ściśle związana z architekturą jądrową, organizacją chromatyny wyższego rzędu i dynamiką chromosomów w jądrze komórkowym. W związku z tym tak ważne jest opracowanie metod o wysokiej rozdzielczości do badania DDR i procesów naprawczych w kontekście endogennego środowiska jądrowego w żywej komórce, aby zrozumieć krótko- i długoterminowe konsekwencje uszkodzenia DNA.

Krytyczna rola polimerazy PAR (PARP) w ocenie zakresu i rodzaju uszkodzenia oraz regulacji składania białek w miejscu uszkodzenia
PARP1 to czujnik nacięć DNA szybko aktywowany przez uszkodzenie DNA, który odgrywa kluczową rolę w naprawie DNA13. Pierwotnie sądzono, że PARP1 działa razem z X-Ray Repair Cross Complementing 1 (XRCC1) w celu ułatwienia naprawy przez wycinanie zasady (BER), ale ostatnie badania ujawniają jego rolę w innych szlakach naprawy DNA, w tym DSB repair14. Aktywowany PARP1 wykorzystuje dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+) jako substrat do ADP-rybozylanu wielu białek docelowych, w tym siebie. Ten enzym i inni członkowie rodziny przyciągnęli wiele uwagi w ostatnich latach, ponieważ inhibitory PARP okazały się obiecującymi lekami terapeutycznymi na nowotwory. Chociaż początkowo stwierdzono, że inhibitory PARP są skuteczne w komórkach raka piersi z mutacją genu raka piersi (BRCA), obecnie istnieje mnóstwo dowodów na ich działanie w terapiach mono- i skojarzonych wraz z czynnikami uszkadzającymi/napromienianiem DNA przeciwko szerokiemu spektrum nowotworów z mutacjami nie ograniczającymi się do BRCA15,16,17,18,19,20.

Na poziomie molekularnym wykazano, że aktywacja PARP odgrywa kluczową rolę w organizowaniu lokalnej struktury chromatyny w miejscach uszkodzenia. Zależna od PAR rekrutacja enzymów modyfikujących chromatynę ułatwia naprawę DSB i dyktuje wybór szlaku naprawy, co sugeruje ważną rolę modyfikacji PAR w miejscach uszkodzenia. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 Niedawno wykazaliśmy wykluczenie białka wiążącego p53 1 (53BP1) z miejsc uszkodzenia przez PAR 32, dostarczając alternatywnego wyjaśnienia zależnej od 53BP1 hiperaktywacji niehomologicznego łączenia końcówek (NHEJ) przez inhibitor PARP i podkreślając znaczenie PARP w wyborze ścieżki naprawy DSB33,34. PARP1 również bezpośrednio PARyluje i wpływa na aktywność wielu czynników naprawy DNA14.

Wykorzystanie mikronapromieniowania laserowego jako narzędzia do badania DDR/naprawy In Vivo
Mikronapromienianie laserowe w celu wywołania submikronowych zmian na poszczególnych chromosomach zostało po raz pierwszy opisane w 1969 roku35 i szczegółowo omówione w 1981 roku36. Kilkadziesiąt lat później wykazano, że mikronapromienianie laserowe indukuje uszkodzenia DNA w określonym regionie submikrometrowym w jądrze komórkowym i udowodniono, że jest cenną techniką badania rekrutacji lub modyfikacji różnych czynników do zmian w DNA in vivo13,37,38,39,40,41. Metoda ta pozwala na wykrycie tych czynników, które nie tworzą wyraźnych ognisk wywołanych promieniowaniem (IRIF) w miejscach uszkodzenia39,42. Możliwe jest również zbadanie czasoprzestrzennej dynamiki zmian strukturalnych chromatyny zarówno w miejscach uszkodzenia, jak i w pozostałej części jądra. Dokładnie porównaliśmy DDR indukowane przez różne systemy laserowe i moce wejściowe, aby ocenić związek między rodzajem uszkodzenia DNA a warunkami mikronapromieniowania32,43,44,45. Nieprawidłowe wzorce rekrutacji 53BP1 i telomerowego czynnika wiązania powtórzeń 2 (TRF2) zaobserwowano w poprzednich badaniach uszkodzeń laserowych, które stanowiły podstawę do powtarzających się obaw o "niefizjologiczny" charakter uszkodzeń wywołanych laserem46,47,48,49. Odkryliśmy, że te pozorne rozbieżności można teraz wyjaśnić za pomocą różnicowej sygnalizacji PARP, która mierzy ilość i złożoność wywołanych uszkodzeń32. Potwierdziliśmy, że: 1) ogniwa napromieniowane laserowo (nawet po napromieniowaniu o dużej mocy wejściowej) są zatrzymywane w interfazie w sposób zależny od kontroli punktu kontroli uszkodzenia i zachowują żywotność (co najmniej do 48 godzin)32,50; oraz 2) rekrutacja/modyfikacje czynników naprawczych wiernie odwzorowują te zaobserwowane podczas leczenia konwencjonalnymi czynnikami uszkadzającymi DNA i indukcji DSB przez endonukleazy32,39,42,44,50,51,52. Wyniki te silnie potwierdzają fizjologiczne znaczenie badania odpowiedzi komórkowych wywołanych uszkodzeniem laserowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Podstawowe przygotowanie komórek

Uwaga: Ten krok służy do standardowego wykrywania immunofluorescencji endogennego białka lub modyfikacji, oraz do użycia linii komórkowej stabilnie wyrażającej fluorescencyjnie znakowane białko rekombinowane. Na przykład komórki nabłonka nerki torbacza (PtK2) stabilnie eksprymujące EGFP-53BP11220-1711 lub TRF2-YFP zostały użyte w naszym poprzednim badaniu (Rysunek 1)32. W pierwszym przypadku region tworzący ognisko 53BP1 (aminokwas 1220-1711), który zawiera domenę oligomeryzacji, domenę Tudora i motyw rekrutacji zależnej od ubikwitylacji (UDR), został połączony ze wzmocnionym GFP (EGFP-53BP11220-1711). To białko fuzyjne podsumowuje rekrutację miejsca uszkodzenia pełnowymiarowego 53BP153,54,55. W komórkach HeLa fluorescencyjnie oznaczone podjednostki kohezyny (np. hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52 i GFP-SA2 51) muszą być stabilnie wyrażone, aby zapewnić skuteczne włączenie do kompleksu i podsumować specyficzną dla fazy rekrutację miejsca uszkodzenia cyklu komórkowego S / G2 endogennej kohezyny51.

  1. Umieścić dowolny przylegający typ komórek na naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm z siatkowym szkiełkiem nakrywkowym, aby umożliwić indywidualną identyfikację komórek. Dostosuj początkową liczbę komórek, aby osiągnąć 60% konfluencji w ciągu 36-48 godzin w oparciu o szybkość proliferacji danej linii komórkowej. Na przykład:
    1. W przypadku komórek nabłonka nerki torbacza PtK2 (typu dzikiego lub stabilnie wykazujących ekspresję EGFP-53BP11220-1711 lub TRF2-YFP): płytka 2,0 x 104 komórki w 2 ml zaawansowanej minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) uzupełnionej 2 mM L-glutaminą, 4% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) i inkubować w temperaturze 37 °C z 7% CO2.
    2. W przypadku komórek HeLa ze stabilną ekspresją fluorescencyjnie znakowanych rekombinowanych białek GFP-SA2: nasiona 1,0 x 105 komórek w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Można również wykorzystać inne komórki HeLa, w tym komórki niezmodyfikowane lub komórki wykazujące ekspresję hSMC1-GFP.
  2. Pozwól komórkom przylegać i namnażać się przez 36-48 godzin przed indukcją uszkodzenia DNA przy zbieganiu 30-60% (aby umożliwić wizualizację liczby siatki). Przejdź do sekcji 4.

2. Transfekcja przejściowa

Uwaga: Czasami nie ma dobrych przeciwciał do wykrywania białek endogennych. Jeśli linie komórkowe o stabilnej ekspresji białek markerowych nie są dostępne, należy przeprowadzić transfekcje przejściowe w celu monitorowania białek znakowanych fluorescencyjnie do analiz żywych komórek.

  1. W przypadku komórek HeLa, w dniu 1, wysiewać 6-8 x 104 komórek w 0,5 ml pożywki hodowlanej w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i inkubować w 100% wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 . Patrz krok 1.1, aby zapoznać się z warunkami pożywek hodowlanych.
  2. Dzień 2, użyj plazmidu ekspresji ssaków kodującego fluorescencyjnie znakowany czynnik naprawy DNA (np. GFP-NTH1 lub GFP-OGG1 dla uszkodzenia zasady32,44,56, GFP-Ku dla dużych dawek DSB57, GFP-53BP132 dla stosunkowo prostych DSB lub innych interesujących białek połączonych ze znacznikiem fluorescencyjnym), aby przeprowadzić transfekcję DNA za pośrednictwem liposomów. Rozcieńczyć 0,3 μg plazmidowego DNA w 25 μl pożywki hodowlanej bez surowicy w probówce o pojemności 1,5 ml.
  3. W innej probówce o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 1 μl odczynnika do transfekcji DNA na bazie liposomów w 25 μl pożywki hodowlanej bez surowicy i delikatnie wymieszać.
  4. Delikatnie wymieszać rozcieńczone DNA i środek transfekcyjny i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) do utworzenia kompleksów DNA-lipidów.
  5. Raz przepłukać komórki 0,5 ml pożywki hodowlanej, usunąć pożywkę i dodać 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej do komórek (jak w kroku 1.1).
  6. Dodaj kompleksy DNA-lipid do komórek. Delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie kołysząc talerzem. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze, jak w kroku 2.1.
  7. Po 4-6 godzinach usuń pożywkę hodowlaną z komórek i dodaj 300 μl 0,05% Trypsyny-EDTA. Wyjąć go, dodać 200 μl trypsyny-EDTA i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 3-4 minuty.
  8. Po potwierdzeniu, że komórki są odłączone, dodać 800 μl pożywki hodowlanej i ponownie zawiesić komórki poprzez delikatne pipetowanie w celu rozbicia grudek komórek. Przenieść zawiesinę komórek do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm ze szkiełkiem nakrywkowym w kratkę i dodać pożywkę hodowlaną do końcowej objętości 2 ml.
  9. Inkubować komórki w inkubatorze jak w kroku 2.1 przez 48 godzin, a następnie przejść do sekcji 4.
    Uwaga: Jeśli ekspresja rekombinowanego białka jest toksyczna (transfekowane komórki wykazują okrągłą lub nieregularną morfologię po inkubacji w kroku 2.8), skróć czas ekspresji i przeprowadzić mikronaświetlanie laserowe (sekcja 4) po 16-20 godzinach od transfekcji, o ile można potwierdzić ekspresję białka (w celu wykrycia fluorescencji, patrz krok 4.3). W takim przypadku należy wykonać transfekcję bezpośrednio w naczyniu 35 mm. Wysiewaj 3,0 x 105 komórek HeLa w naczyniu o średnicy 35 mm z siatkowanym szkiełkiem nakrywkowym, aby osiągnąć około 50-70% zbieżności po 30 godzinach. Transfekcja plazmidów DNA i zmiana pożywki 2-6 godzin po transfekcji. Kontynuuj mikronaświetlanie laserowe 12-20 godzin później, jeśli ekspresja białka jest rozsądna, a komórki wydają się zdrowe.

3. Synchronizacja cyklu komórkowego

Uwaga: Dla białek naprawy homologicznej rekombinacji (HR), takich jak Rad51 i kohezyna, rekrutacja jest bardziej widoczna w fazie S/G2 cyklu komórkowego, w której następuje naprawa HR51. W związku z tym, aby monitorować rekrutację tych białek, konieczna jest synchronizacja komórek z fazą S / G2.

  1. Synchronizacja faz S/G2
    1. Użyj protokołu podwójnego bloku tymidyny do synchronizacji komórek z fazą S/G250,51. Po wysianiu komórek w naczyniu nakrywkowym z kratką o średnicy 35 mm (patrz krok 1.1), inkubować komórki z tymidyną (do końcowego stężenia 2,5 mM) w pożywkach hodowlanych (jak w kroku 1.1) przez 17 godzin w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .
    2. Przepłukać komórki 1 ml pożywki hodowlanej wolnej od tymidyny (jak w kroku 1.1) dwukrotnie i inkubować komórki w 2 ml pożywki hodowlanej wolnej od tymidyny przez 9 godzin, jak w kroku 1.1.
    3. Dodać 200 μl 27,5 mM roztworu podstawowego tymidyny (rozpuszczonego w pożywce hodowlanej) do pożywki hodowlanej z komórkami do końcowego stężenia 2,5 mM tymidyny. Inkubować komórki jak w kroku 3.1.1 przez kolejne 15 godzin. Przepłukać i inkubować komórki w pożywkach hodowlanych bez tymidyny przez 4-6 godzin i wywołać uszkodzenie DNA (sekcja 4).
    4. Potwierdź wydajność synchronizacji, używając markerów cyklu komórkowego (cyklina A2 i B1 odpowiednio dla S/G2 i G2), specyficznych dla fazy S/G2 czynników naprawy uszkodzeń DNA (np. Rad51 lub kohezyna) lub poprzez inkorporację IdU/EdU (dla komórek fazy S)51.
  2. Synchronizacja faz G1
    1. Wysiew 6-8 x 104 komórek HeLa w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm z siatkowanym szkiełkiem nakrywkowym (krok 2.1).
    2. Po 2 dniach zidentyfikuj komórki metafazy, które są lekko uniesione i okrągłe, pod odwróconym mikroskopem przy użyciu obiektywu 10X i soczewek okularowych 10X. Zdobądź obrazy, aby zarejestrować położenie komórek metafazy na szkiełku nakrywkowym z siatką.
    3. Po 3-4 godzinach należy potwierdzić podział komórki na dwie komórki potomne (w fazie G1) i wywołać uszkodzenie DNA (punkt 4).

4. Miareczkowanie mocy wejściowej lasera

Uwaga: W tym protokole indukujemy uszkodzenia DNA za pomocą impulsowego systemu laserowego fs NIR o długości fali 780 nm podłączonego do mikroskopu konfokalnego, lub impulsowego lasera nir o długości fali 800 nm sprzężonego z odwróconym mikroskopem epi-fluorescencyjnym. Chociaż moc wejściowa (rzeczywiste natężenie promieniowania w ognisku lasera w próbce) potrzebna do wywołania porównywalnego DDR jest inna w tych systemach, podstawowa zasada miareczkowania mocy wejściowej ma zastosowanie do obu lub dowolnych systemów NIR32,57. Energia in situ na impuls laserowy i szczytowe natężenie promieniowania w ognisku dla dwóch systemów laserowych mieściły się w zakresie odpowiednio 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ i 7 × 10 10-5,24 × 1011 W/cm 232.

  1. Włącz laser NIR i pozwól systemowi laserowemu rozgrzać się przez 1 godzinę przed użyciem.
  2. Umieść naczynie z komórkami na podgrzewanym (37 °C) stoliku w komorze, która umożliwia kontrolę CO2 (5%) i wilgotności (100%).
    Uwaga: Jeśli komora CO2 nie jest dostępna, należy używać pożywek hodowlanych niezależnych od CO2 przez okres do 5-6 godzin. Jeśli etap ogrzewania nie jest dostępny, trzymaj komórki pod mikroskopem przez < 20 minut i natychmiast umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych z odpowiednią kontrolą temperatury, CO2 i wilgotności. Te warunki hodowli mogą się różnić w zależności od konkretnego typu użytej komórki, a także organizmu, z którego pochodzą (np. ssaki i).
  3. Do analizy żywych komórek białek znakowanych fluorescencyjnie wybierz filtr GFP (wzbudzenie 450-490 nm, emisja 515-586 nm) lub filtr Cy3 (wzbudzenie 540-552 nm, emisja > 590 nm) odpowiednio dla GFP lub białka skondensowanego mCherry, używając obiektywu zanurzeniowego 100X lub 63X.
  4. Szukaj komórek, które mają porównywalne sygnały fluorescencyjne, odzwierciedlające porównywalne poziomy ekspresji białek. Unikaj komórek, które mają zbyt słabą lub zbyt silną ekspresję, aby zmniejszyć zmienność między komórkami w pomiarach fluorescencji.
  5. Miareczkować moc wejściową lasera.
    1. Laser NIR 780 nm podłączony do mikroskopu konfokalnego
      1. Użyj programowej funkcji wybielania, aby celować w ścieżki liniowe wewnątrz jądra komórkowego w celu wystawienia na pojedyncze skany laserowe (rozdzielczość 512 x 512 pikseli, powiększenie X1, wybielony obszar 50 x 4 piksele, czas przebywania pikseli 12,8 μs, iteracja x1) przez obiektyw olejowy (100X/1,3 NA).
      2. Dostosuj procent transmisji laserowej (za pomocą oprogramowania/sprzętu wbudowanego w system mikroskopu laserowego przez producenta) na 5% bez zmiany żadnych innych ustawień.
      3. Umieść komórkę na środku pola. Kliknij narzędzie obszaru zainteresowania (ROI) i narysuj linię lub ramkę (około 50 x 4 piksele) w jądrze za pomocą myszy, a następnie kliknij przycisk "Wybielacz", aby wywołać uszkodzenie DNA.
        Uwaga: W kolejnych etapach napromieniania "wybielanie" należy zwiększać w krokach co 5% do 40% lub do 100%, jeśli to konieczne.
      4. Laser NIR 800 nm podłączony do mikroskopu epifluorescencyjnego
      5. Kontroluj moc wejściową za pomocą obiektywu zanurzeniowego z kontrastem fazowym (63X/1,4 NA) poprzez zmotoryzowany obrót filtra polaryzacyjnego wprowadzonego na ścieżkę wiązki i zamontowanego na sterowanym komputerowo zmotoryzowanym stoliku obrotowym32,39,58.
      6. Wyreguluj kąt polaryzatora (°) i zmierz moc wejściową (mW) wchodzącą do mikroskopu za pomocą miernika mocy lasera. Określ kąty polaryzatora, które zapewniają moc wejściową w zakresie od 20 mW do 155 mW w krokach co 5-10 mW.
      7. Ustaw kąt polaryzatora odpowiadający mocy wejściowej 20 mW.
        Uwaga: W przypadku naszego systemu laserowego, jeśli kąt polaryzatora wynosi 40 °, moc wejściowa wynosi 65 mW. Zwiększ moc wejściową w krokach co 5-10 mW.
  6. Aby przeprowadzić analizę dynamicznych komórek, przejdź do kroków 6.1 i 6.3. W celu immunofluorescencyjnego wykrywania białek endogennych lub modyfikacji należy przejść do sekcji 5. Po zakończeniu analizy przejdź do kroku 4.7 w celu dalszego miareczkowania mocy lasera. Aby przeanalizować wymóg dotyczący współczynnika upstream, przejdź do sekcji 7.
    Uwaga: Rekrutacja czynników BER i NHEJ jest szybka (w ciągu kilku minut) i przejściowa (odpowiednio < ~ 30 min-1 h w zależności od czynnika i < ~4 godziny po indukcji uszkodzenia). W przeciwieństwie do tego, rekrutacja czynników HR Rad51 i kohezyny jest wykrywalna po ~30 min-1 h i mają tendencję do utrzymywania się dłużej niż 8 godzin przy nienaprawionych uszkodzeniach DNA44,50,51. W związku z tym konieczne jest zbadanie różnych punktów czasowych po napromieniowaniu pod kątem różnych czynników naprawczych.
  7. Zwiększ moc wejściową o żądane przyrosty (tj. 5% dla lasera 780 NIR i 5-10 mW dla 800 NIR), jak w kroku 4.4, i powtórz kroki 4.5-4.7 na nowym zestawie komórek, aby określić próg (50% uszkodzonych komórek wykazuje rekrutację) i szczyt (100% komórek wykazuje rekrutację) dla każdego białka.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

Uwaga: Do wykrywania modyfikacji białek kowalencyjnych, takich jak PAR (marker uszkodzenia kompleksu) i fosforylacja H2AX (marker DSB), a także dimerów pirymidyny cyklobutanu (CPD)/(6-4) fotoproduktów (6-4PP) i 8-oksoguaniny (8-oxoG) (odpowiednio markery sieciowania i uszkodzenia zasady), komórki muszą być utrwalone i wybarwione specyficznymi przeciwciałami. Ponadto najlepiej jest potwierdzić wyniki uzyskane za pomocą znakowanych fluorescencyjnie białek rekombinowanych poprzez detekcję przeciwciał białek endogennych, w celu rozróżnienia artefaktów wywołanych nadekspresją rekombinowanych białek fuzyjnych.

  1. Utrwal komórki w różnych punktach czasowych po indukcji uszkodzenia (krok 4.5) w zależności od czynników, zastępując pożywkę hodowlaną (patrz krok 1.1) 1,5 ml 4% paraformaldehydu/1X PBS przez 10 minut w RT.
    Uwaga: Opary paraformaldehydu są toksyczne i wszystkie prace należy wykonywać w wentylowanym okapie.
  2. Usuń 4% paraformaldehydu/PBS i dodaj 1 ml 0,5% detergentu/PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć 0,5% detergentu/PBS i płukać komórki 2 ml PBS przez 5 minut dwa razy, a następnie inkubować komórki w 2 ml roztworu blokującego (10% surowicy cielęcej, 1% BSA/PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć roztwór blokujący i dodać 2 ml PBS do komórek, a następnie zastąpić PBS 250 μl roztworem przeciwciała pierwszorzędowego o stężeniu 3% BSA/PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Stosować rozcieńczenie 1:200-1:500 (typowe stężenie około 1 μg/ml, oznaczone empirycznie) dla przeciwciał specyficznych dla różnych markerów uszkodzenia DNA (np. γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/kohezyna (DSB, HR); CPD/6-4PP (uszkodzenia sieciujące); Glikozylazy 8-oxoG/DNA (np. NTH1) (uszkodzenie zasady); PAR (wysokie dawki złożonego uszkodzenia)).
  5. Usunąć roztwór przeciwciała i dwukrotnie przepłukać 2 ml PBS przez 5 minut, usunąć PBS i inkubować z 250 μl 0,1% przeciwciała drugorzędowego w 3% BSA/PBS przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała i dodać 2 ml PBS przez 5 minut dwa razy i utrzymywać komórki w 1,5-2 ml PBS w temperaturze 4 °C do obrazowania w krokach 6.1 i 6.2.

6. Ilościowa analiza fluorescencyjna komórek wybarwionych immunologicznie lub żywych

  1. Uchwyć obrazy barwionych lub żywych komórek (n >10) za pomocą mikroskopu używanego do napromieniania. W przypadku systemu mikroskopu epi-fluorescencyjnego należy użyć rozdzielczości 1 344 x 1 024 pikseli i zapisać obrazy jako pliki TIFF 16-bitowe. W przypadku mikroskopu konfokalnego użyj powiększenia 1X; Laser argonowy do GFP/FITC, laser HeNe 594 do Cy3/mCherry; 512 x 512 lub 1 024 x 1 024 pikseli dla rozdzielczości obrazu; Szybkość skanowania 5, liczba: 1 dla szybkiego skanowania lub 2+ dla uśredniania na podstawie wielu skanów w celu poprawy stosunku sygnału do szumu.
  2. Korzystaj z programów do analizy obrazu przeznaczonych do pomiaru intensywności pikseli.
    1. Użyj narzędzia Prostokąt woluminu, aby narysować obszar zwrotu wokół miejsca uszkodzenia na obrazie pojedynczej komórki. Użyj tego samego rozmiaru ROI, aby zmierzyć sygnał fluorescencji tła w nukleoplazmie przylegającej do miejsc uszkodzenia, ale nie nakładających się na nie. Jest to ważne dla normalizacji fotowybielania związanego z systemem mikroskopu niekonfokalnego.
    2. Aby zmierzyć sygnały fluorescencji za pomocą programu do analizy obrazu, kliknij "Raport z analizy objętości" znajdujący się w przyborniku. Pojawi się nowe okno. W sekcji "Dane do wyświetlenia" zaznacz tylko pola "Nazwa" i "Gęstość". Następnie kliknij "Gotowe", aby wyświetlić pomiary.
    3. Wyeksportuj wartości do programu arkusza kalkulacyjnego, klikając ikonę tabeli znajdującą się u dołu okna Raport objętości i wybierz "Karty (format Excel)" dla Separatorów pól i "Plik" dla miejsca docelowego eksportu.
    4. Aby uzyskać sygnały względne, użyj programu arkusza kalkulacyjnego, aby podzielić intensywność fluorescencji w miejscu uszkodzenia (kolumna 1) przez intensywność w kontrolnym regionie tła (kolumna 2) w nukleoplazmie i odejmij przez 1 w celu normalizacji.
  3. Ilościowa analiza przebiegu fluorescencji w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopu konfokalnego
    1. Zidentyfikuj fluorescencyjnie znakowane komórki białko-dodatnie za pomocą mikroskopu, jak w kroku 4.3.
    2. Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne poklatkowe przed uszkodzeniem i w różnych punktach czasowych po indukcji uszkodzenia w sekcji 4. Najpierw narysuj ROI wybielacza (dla indukcji uszkodzeń), a następnie wybierz podmenu "Acquire>Time Series", ustaw "Liczba" na 20, a "opóźnienie cyklu" na 30 s, wybierz "wybielaj raz po pierwszym skanowaniu", a następnie kliknij "start B". W tym przypadku pierwszy obraz jest uzyskiwany bezpośrednio przed indukcją uszkodzenia, a następnie 19 akwizycji obrazu w odstępie 30 sekund. Interwały ("opóźnienie cyklu") mogą być zmieniane w zależności od celu badania.
    3. Po zakończeniu akwizycji obrazu kliknij "Średnia" i narysuj ROI w obszarze uszkodzenia. Kliknij "Pokaż tabelę", aby wyświetlić tabelę z listą intensywności w ramach wybranych ROI. Znormalizuj dane, dzieląc intensywność fluorescencji miejsca uszkodzenia w różnych punktach czasowych przez intensywność tego samego regionu przed uszkodzeniem i odejmij przez 1.

7. Transfekcja małego interferującego RNA (siRNA)

Uwaga: Wyczerpanie docelowego białka jest skutecznym sposobem na określenie wymagań dotyczących czynnika poprzedzającego obserwowaną rekrutację białka do miejsc uszkodzenia (Sekcja 4). Ponadto strategia ta jest najlepszym sposobem na określenie swoistości przeciwciała stosowanego do wykrywania immunofluorescencji (patrz punkt 5).

  1. Dzień 1: Przygotuj 2 dołki komórek HeLa na 24-dołkowej płytce, wysiewając 6-8 x 104 komórek HeLa w 0,5 ml pożywki hodowlanej w każdym dołku, jedną do transfekcji kontrolnej siRNA i jedną do siRNA PARP1 (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
  2. Dzień 2: Upewnij się, że komórki są w około 40-50% zlewające się. Wykonaj pierwszą rundę transfekcji siRNA: Rozcieńczyć 5 pmol siRNA w 25 μl pożywki hodowlanej bez surowicy, dodać 3 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów do probówki, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przepłukać komórki 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej raz i przechowywać komórki w 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej (patrz krok 1.1).
  4. Dodaj kompleksy RNA-lipidowe do komórek i delikatnie wymieszaj, przechylając naczynie w przód iw tył. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze, jak w kroku 2.1.
  5. Odessać mieszaninę do transfekcji i po 6 godzinach dodać 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej (krok 1.1).
  6. Dzień 3: Wykonaj drugą rundę transfekcji siRNA (patrz krok 7.2). Następnie wysiew 60-100% komórek do naczynia nakrywkowego o średnicy 35 mm, jak opisano w kroku 2.3.
  7. Dzień 5: Kontynuuj mikronaświetlanie laserowe przy użyciu optymalnych warunków mocy lasera w celu maksymalnej rekrutacji czynnika zainteresowania, jak określono w sekcji 4. Zazwyczaj efektywne zubożenie można zaobserwować w około 60-90% komórek HeLa.
    Uwaga: Jako alternatywne i uzupełniające podejście, inhibitory, jeśli są dostępne, mogą być stosowane do hamowania funkcji czynnika będącego przedmiotem zainteresowania32,44. W celu analizy wpływu hamowania sygnalizacji DDR dodaj 20 μM inhibitora PARP, inhibitora glikohydrolazy 1 μM PAR (PARG) lub 10 μM zależnej od DNA kinazy białkowej z inhibitorem podjednostki katalitycznej (DNA-PKcs) i 10 μM inhibitora ATM w dimetylosulfotlenku (DMSO) do szalek na 1 godzinę przed indukcją uszkodzenia. Dodaj DMSO tylko do komórek kontrolnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przy użyciu komórek PtK2 stabilnie ekspresujących EGFP-53BP1120-171 lub TRF2-YFP przeprowadzono miareczkowanie mocy wejściowej lasera w celu ustalenia optymalnych warunków dla ich rekrutacji (Rysunek 1)32.

W miejscach uszkodzeń wywołanych laserem o wysokiej mocy wejściowej zaobserwowano znaczne skupianie się CPD (uszkodzeń sieciujących typowo generowanych przez promieniowanie ultrafioletowe (UV)) oraz glikozylazy DNA GFP-NTH1, kt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zalety stosowania mikronapromieniowania laserowego do badań DDR to:

1. Możliwe jest wywołanie różnych typów i ilości uszkodzeń DNA od prostych pęknięć nici do złożonych uszkodzeń DNA oraz wykrycie różnych czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia DNA poprzez dostosowanie parametrów napromieniania laserowego. Możliwe jest również wielokrotne uszkodzenie tego samego jądra komórkowego w celu oceny efektów trans (jak na rycinie 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Akirze Yasui z Uniwersytetu Tohoku, Japonia za plazmid ekspresji GFP-NTH1, oraz dr Eros Lazzerini Denchi z Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornia za plazmidy ekspresji TRF2-YFP i EGFP-53BP11220-1711. Prace te były wspierane przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych (FA9550-04-1-0101) i Fundację Beckman Laser Institute Inc. (do M.W.B.), stypendium Fundacji Forda z Narodowej Akademii Nauk (do B.A.S) oraz NSF MCB-1615701 i CRCC CRR-17-426665 (do KL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ti:Szafirowy impulsowy laser femtosekundowy NIR Mira-900Coherent Inc.Mikroskop odwrócony Mira 900
 Obiektyw Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 NAZeissAPOCHROMAT Ph3 
Kompaktowy stolik obrotowy Regulator temperatury Newport CorpPR50PP
SystemWarnerTC-344B
Ibidi 10918
System inkubacji gazówIbidi 11920
Laserowy miernik mocy i energii (RoHS)Pole koherentneMaxII-TOP 
Cyfrowa kamera CCD ORCA-R2HamamatsuC10600
LSM 510 META Laserowe mikroskopy skaningoweCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm Naczynia z kratką MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 komórki nabłonka nerekATCCCCL 56 
Ogniwa HeLaATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
Medium niezależne od CO2 Life Technologies18045-088
Zaawansowany MEM Life Technologies12492-013uzupełniony o L-glutaminę, 4% penicyliny
/streptomycynyFBS Fisher Scientific15140122
L-GlutaminaFisher Scientific25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Tymidyna   SIGMAT9250
pożywka bez surowicy        (Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy)Fisher Scientific11058021
Anty-Cyklobutancyjny dimer pirymidyny (CPD) (mysz)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (mysz)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (królik)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (królik)Abcamab70163
Polimery anty-PAR (mysz)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (królik)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mysz)Novus Biological NB100-56506
Anti 6-4PP (mysz)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Królik)                                        (do wykrywania kohezyny)Yokomori (KY)
Anti-Rad51 (Królik)Santa Cruz BiotechnologySC-8349
Anti-Ku70 (mysz)  Novus BiologicalsNB100-102
8-oksyguanina Trevigen, Inc.
Anty-PARP1  (Królik)                                       wygenerowane w KY labref 43
  Anty-hCAPG (Królik)                                      (do wykrywania kondensyny)wytworzony w laboratoriumref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
Odczynnik do transfekcji HiPerFect siRNAQiagen301705
Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher Scientific11668019
Stabilna linia komórkowa GFP-SMC1       wygenerowane w laboratorium KYref 49 
Stabilna linia komórkowa GFP-NEIL2wytworzona w laboratorium KYnr ref. 54
Stabilna linia komórkowa GFP-NTH1wytworzona w laboratoriumnr ref. 32
Plazmid GFP-SMC1wytworzony w laboratorium
Plazmid GFP-Kuwytworzony w laboratorium
Anty-MDC1 (królik)  Novus BiologicalsNB100– 395
Anty-gH2AX (królik)  Milipor07– 164
EGFP-53BP1(1220-1711) Stabilna linia komórkowa PtK2wytworzona w laboratoriumnr ref. 32
TRF2-YFP PtK2 stabilna linia komórkowawytworzona w laboratoriumnr ref. 32
DMSOSigmaD2650-100ML
inhibitor PARGTrevigen4680-096-03
DNA– Inhibitor PKcs  NU7026 SigmaN1537
KU55933  Calbiochem118500
Olaparib Apexbio TechnologyA4154
Paraformaldehyd MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENC MS100503-916 (EA)
Ilość Jedno oprogramowanie do analizy 1-D Wersja 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC Program do analizy obrazu
ExcelMicrosoftarkusz kalkulacyjny
Triton X100Fisher ScientificBP151-500detergent
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco 10X bez wapnia i magnezuFisher Scientific14200166rozcieńczyć do 1X 
grzewczy wygenerowane w laboratorium KY KY KYKY Berns Berns Inhibitor ATM

Bibliografia

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27(2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135(2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68(2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548(2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219(2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460(2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

odpowied na uszkodzenia DNAp kni cie dwunicioweuszkodzenie zasadpoli ADP rybozylowaniemikroskopia konfokalnaznakowanie bia ek fluorescencyjnychsynchronizacja cyklu kom rkowegoinhibicja PARPobrazowanie ywych kom rek
Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.