Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wrodzone anomalie oczu i twarzoczaszki odzwierciedlają zakłócenia w grzebieniu nerwowym, przejściowej populacji migrujących komórek macierzystych, które dają początek licznym typom komórek w całym ciele. Zrozumienie biologii grzebienia nerwowego jest ograniczone, co odzwierciedla brak genetycznie wykonalnych modeli, które można badać in vivo i w czasie rzeczywistym. Danio pręgowany jest szczególnie ważnym modelem rozwojowym do badania populacji komórek wędrownych, takich jak grzebień nerwowy. Aby zbadać migrację grzebienia nerwowego do rozwijającego się oka, zastosowano połączenie zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o dużej długości fali, aby uchwycić wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowe filmy w czasie rzeczywistym rozwijającego się oka w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego, a mianowicie Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP), jako sox10 i foxd3 wykazano w wielu modelach zwierzęcych, że regulują wczesne różnicowanie grzebieni nerwowych i prawdopodobnie reprezentują markery komórek grzebienia nerwowego. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe wykorzystano do rozpoznania zachowania i wzorców migracji dwóch populacji komórek grzebienia nerwowego, które przyczyniają się do wczesnego rozwoju oka. Protokół ten dostarcza informacji do generowania filmów poklatkowych podczas migracji grzebienia neuronalnego danio pręgowanego, na przykład, i może być dalej stosowany do wizualizacji wczesnego rozwoju wielu struktur u danio pręgowanego i innych organizmów modelowych.
Wprowadzenie
Wrodzone choroby oczu mogą powodować ślepotę u dzieci i często są spowodowane nieprawidłowościami grzebienia nerwowego czaszki. Komórki grzebienia nerwowego to przejściowe komórki macierzyste, które powstają z cewy nerwowej i tworzą liczne tkanki w całym ciele. 1,2,3,4,5 Komórki grzebienia nerwowego, wywodzące się z prosencephalonu i śródmózgowia, dają początek kości i chrząstki w środkowej części twarzy i okolicy czołowej, a także tęczówce, rogówce, siatku beleczkowemu i twardówce w przednim segmencie oka.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisany tutaj protokół został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi dotyczącymi humanitarnego traktowania zwierząt laboratoryjnych, ustanowionymi przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan (UCUCA).
1. Pobieranie zarodków do obrazowania poklatkowego
- Między godziną 15 a 21 umieść samce i samice dorosłego zerosłego Tg (sox10: EGFP) lub Tg (foxd3: GFP) transgenicznego danio pręgowanego w podzielonym zbiorniku hodowlanym do krycia parami.
UWAGA: Ryby Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP), miłe prezenty od Thomasa Schillinga i Mary Halloran, odpowiednio, zostały skrzy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wielofotonowa obrazowanie fluorescencyjne w trybie time-lapse pozwoliło na stworzenie serii filmów, które ujawniły wzorce migracji komórek grzebienia nerwowego czaszki, dających początek strukturom kraniofacjalnym oraz przedniemu odcinkowi oka w liniach zebrafish Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP). Przykładowo, komórki grzebienia nerwowego wykazujące ekspresję sox10 między 12 a 30 hpf migrują z krawędzi rurki neuralnej do obszaru kraniofacjalnego (Video 1, <.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe umożliwia śledzenie in vivo przejściowych i migrujących populacji komórek. Ta potężna technika może być wykorzystana do badania procesów embrionalnych w czasie rzeczywistym, a w niniejszym badaniu wyniki tej metody poszerzyły obecną wiedzę na temat migracji i rozwoju komórek grzebienia nerwowego. Wcześniejsze badania obrazowania poklatkowego zazwyczaj wykorzystują konfokalną laserową mikroskopię skaningową. 29,30,31,32 W tym miejscu przedstawiamy zast.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Prace te były wspierane finansowo przez granty z National Eye Institute of the National Institutes of Health (K08EY022912-01) i Vision Research Core (P30 EY007003).
Podziękowania
Autorzy dziękują Thomasowi Schillingowi za uprzejme podarowanie ryby Tg(sox10:eGFP) oraz Mary Halloran za uprzejme podarowanie ryby Tg(foxd3:GFP).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zbiorniki hodowlane z przegrodami | Zestaw | ZHCT100 | krzyżujących (1,0 litra) Przezroczysty poliwęglan z pokrywką i wkładką |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Mikroskop stereofluorescencyjny - FusionOptics i TripleBeam | |
| Millipore chlorku sodu | (EMD) | 7760-5KG | Podwójny worek PE. Nr CAS 7647-14-5, numer WE 231-598-3 |
| Milipor chlorku potasu | (EMD) | 1049380500 | Chlorek potasu 99.999 Suprapur. Numer CAS 7447-40-7, numer WE 231-211-8. |
| Chlorek wapnia dwuwodny | Fisher Scientific | C79-500 | Butelka foliowa; 500 g. Nr CAS 10035-04-8 |
| Siarczan magnezu (bezwodny) | Milipor (EMD) | MX0075-1 | Butelka polietylenowa; 500 g. Numer CAS 7487-88-9, numer WE 231-298-2 |
| Milipor błękitu metylenowego | (EMD) | 284-12 | Butelka szklana; 25 g. Proszek, certyfikowana plama biologiczna |
| Wodorowęglan sodu | Milipore (EMD) | SX0320-1 | Butelka polietylenowa; 500 g. Proszek, GR ACS. Numer CAS 144-55-8, numer WE 205-633-8 |
| N-Phenylthiocea | Sigma | P7629-25G | >98%. Numer CAS 103-85-5, numer WE 203-151-2 |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma | D8418-500ML | Klasa biologii molekularnej. Numer CAS 67-68-5, numer WE 200-664-3 |
| Metanosulfonian trikainy | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Agaroza niskotopliwa | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sito GQA Agaroza niskotopliwa, 25 g |
| Otwarta komora kąpielowa | Warner Instruments | RC-40HP | Wysokoprofilowe |
| szklane szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-545-102 | Okrągłe szkło nakrywkowe. |
| Smar wysokopróżniowy | Fisher Scientific | 14-635-5C | Rura o wadze 2,0 funta. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Platforma szybkiej wymiany | Warner Instruments | QE-1 | Adapter |
| stolika | 35 mm Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16,5 x 10 cm |
| Mikroskop wielofotonowy TC SP5 MP | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laserowy | sejfLeica Microsystems CMS GmbH | ||
| Pakiet aplikacji Leica X (LAS X) Oprogramowanie | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Wersja 13.0 x64 Oprogramowanie | Adobe | ||
| iMovie Wersja 10.1.4 Oprogramowanie | Apple |
Bibliografia
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
