Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Podsumowanie

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Streszczenie

Chemotaksja to migracja wzdłuż określonego gradientu chemicznego¹. Chemokiny to cytokiny chemotaktyczne, które promują transport komórkowy ze specyficznością anatomiczną i czasową². Chemotaksja jest krytyczną funkcją limfocytów i innych komórek odpornościowych, którą można ocenić ilościowo in vitro. W manuskrypcie opisano metody, które pozwalają na ocenę chemotaksji, zarówno in vitro, jak i in vivo, dla różnych typów komórek, w tym linii komórkowych i komórek natywnych. Format in vitro oparty na płytce pozwala na jednoczesne porównywanie kilku stanów w czasie rzeczywistym i może być zakończony w ciągu 1-4 godzin. Warunkami testu in vitro można manipulować w celu wprowadzenia agonistów i antagonistów, a także odróżnienia chemotaksji od chemokinezy, która jest ruchem losowym. W przypadku oceny transportu in vivo komórki odpornościowe można znakować wieloma barwnikami fluorescencyjnymi i wykorzystywać do transferu adoptywnego. Zróżnicowane znakowanie komórek pozwala na wprowadzenie mieszanych populacji komórek do tego samego zwierzęcia, zmniejszając w ten sposób wariancję i zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu o odpowiedniej mocy. Migracja do tkanki limfatycznej następuje w ciągu zaledwie 1 godziny i można pobrać próbki z wielu przedziałów tkankowych. Cytometria przepływowa po pobraniu tkanek pozwala na szybką i ilościową analizę wzorców migracji wielu typów komórek.

Wprowadzenie

Solidna odporność wymaga złożonej czasowej i przestrzennej koordynacji niezliczonych typów komórek, aby odpowiednio reagować na urazy, infekcje i generować samotolerancję. Odkryto i scharakteryzowano kilkadziesiąt receptorów chemokinowych i odpowiadających im ligandów, które zapewniają mechanizmy molekularne, dzięki którym określone komórki mogą być kierowane do określonej tkanki w określonym czasie. Tak więc badanie chemotaksji i migracji jest nieodzownym elementem badań immunologicznych. Rzeczywiście, opisany test in vitro został niedawno wykorzystany jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji kofaktora chemotaktycznego, który przyspiesza chemotaksję komórek T w kierunku chemokin C-C 19 i 21³. Celem opisanych tu metod jest umożliwienie ilościowej oceny chemotaksji komórek odpornościowych in vitro i in vivo.

Test komorowy Boydena (migracja i inwazja komórek) jest niedrogą, powtarzalną i szybką metodą oceny migracji komórek^4,5. W standardowym teście górna komora jest wysiewana komórkami i jest oddzielona porowatą wkładką od dolnej komory, do której migrują komórki. W pożądanym czasie komórki, które przeniosły się na spód wkładki, można utrwalić i wybarwić w celu ilościowego określenia za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak takie pomiary ograniczają gromadzenie danych do jednego punktu końcowego, co wyklucza dynamiczne gromadzenie danych i może wymagać rozległej optymalizacji w celu określenia optymalnego punktu czasowego do analizy. W tym miejscu opisano kilka adaptacji, które umożliwiają ilościowe i multipleksowane pomiary chemotaksji in vitro w czasie rzeczywistym.

Do badań in vivo stosuje się funkcjonalny punkt końcowy, a mianowicie specyficzne nagromadzenie komórek w danym przedziale tkankowym. Wstępnie oznakowane komórki dawcy są wprowadzane do zwierząt biorców w drodze transferu adopcyjnego. Te komórki dawcy można następnie zidentyfikować za pomocą cytometrii przepływowej po pobraniu tkanki biorcy. Przedstawiono również strategię wspólnego znakowania, która pozwala na określenie transportu różnych typów komórek w obrębie jednego zwierzęcia biorcy. Metoda ta eliminuje zmienność między zwierzętami wynikającą z wstrzyknięcia komórek i uwzględnia fizjologiczną zmienność między zwierzętami.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rockefellera. Wszystkie zwierzęta były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów.

1. Chemotaksja in vitro

1. Hodowla komórek THP-1⁶ w Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES; 25 mM) (kompletna pożywka), utrzymując gęstość między 0,5-1,0 x 10⁶ komórek/ml.
2. W naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm oznaczyć 3,5 x 10⁵ komórek THP-1 na warunki acetoksymetylem kalceiny (kalceina AM; 2,5 μM) lub innym odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym w kompletnych pożywkach w temperaturze 37 °C przez 30 min.
   UWAGA: Barwniki muszą być przepuszczalne dla błony komórkowej i kompatybilne z etykietowaniem żywych komórek.
3. Rozgrzej czytnik płytek do temperatury 37 °C.
   UWAGA: Oprócz kontroli temperatury wymagana jest również funkcja odczytu od dołu. Zobacz krok 1.10.2, aby zapoznać się z alternatywą dla czytnika płytek do ilościowego oznaczania migrujących komórek.
4. Podczas etykietowania komórek przygotuj płytkę testową i dolną komorę.
   1. Użyj 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, z jednym warunkiem na studzienkę. Wykonaj każdy warunek w trzech egzemplarzach.
   2. Do płytki 24-dołkowej dodać 750 μl buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS) buforowanego 25 mM HEPES i 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Służy to jako podstawowy warunek kontrolny.
      1. Do warunków komparacyjnych należy używać innych studzienek, zawsze utrzymując całkowitą objętość w dolnej komorze na poziomie 750 μl.
         UWAGA: W tym przykładzie ludzkie białko chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1) służy jako kontrola pozytywna dla chemotaksji⁷.
         1. Zmontuj mieszaninę odczynników, łącząc HBSS z 25 mM HEPES, BSA (0,1%) i MCP-1 (75 ng/ml). Stosować surowicę dorosłego bydła (2,7 % v / v) z MCP-1 jako dodatkową kontrolę dodatnią.
            UWAGA: Stężenie chemokin i chemokin będzie zależeć od badanej osi chemotaktycznej. Liofilizowany MCP-1 jest ponownie zawieszany w wodzie destylowanej z BSA (0,1%) w celu uzyskania roztworu podstawowego o końcowym stężeniu 50 μg/ml. Można go rozcieńczyć w wodzie do roztworu roboczego o stężeniu 10 μg/ml. Dodać 5,6 μl tego roztworu do dolnej komory.
   3. Po zakończeniu kompozycji dolnych komór umieść porowatą wkładkę w każdej studzience, upewniając się, że wypustki wkładki są wyrównane z nacięciami płytki.
      UWAGA: Wybierz odpowiednią wielkość porów dla wkładek. W przypadku monocytów i limfocytów dobrze sprawdza się wielkość porów 3 μm. Niektóre typy komórek i/lub systemy chemokinowe mogą wymagać powierzchni pokrytej matrycą w celu optymalnej migracji. Na przykład do pomiaru chemotaksji monocytów THP-1 w kierunku MCP-1 zaleca się stosowanie wkładek pokrytych fibronektyną lub kolagenem. W przypadku czytnika płytek do oznaczania ilościowego, wkładka musi mieć powłokę nieprzepuszczalną dla światła, taką jak politereftalan etylenu, aby zapobiec wykryciu komórek niemigrujących w górnej komorze⁸.
5. Po inkubacji komórek przez 30 minut z kalceiną-AM, przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 2 min. Obejrzyj wzrokowo komórki, aby potwierdzić wychwyt kalceiny-AM (Rysunek 1).
6. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego. Umyj znakowane komórki w bezsurowicy RPMI 1640 uzupełnionym o HEPES 25 mM. Odwirować komórki o masie 1 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
7. Zawieś komórki w bezsurowicowym RPMI 1640 uzupełnionym o HEPES 25 mM. Policz komórki i dostosuj objętość tak, aby komórki miały końcowe stężenie 1,0-1,5 x 10⁶ komórek/ml.
8. Dozować 250 μl zawiesiny komórek do wkładu (górnej komory).
9. Po napełnieniu wszystkich górnych komór delikatnie podnieś płytkę i sprawdź spód pod kątem obecności pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócać migrację i wykrywanie. Aby usunąć pęcherzyk, najpierw spróbuj wyjąć, a następnie ponownie ustawić wkładkę. Jeśli to się nie powiedzie, użyj igły 27 G, aby przebić pęcherzyk, a następnie ponownie umieść wkładkę.
10. Umieścić płytkę w wstępnie podgrzanym czytniku płytek o temperaturze 37 °C.
    1. Pobieraj odczyty fluorescencji od dołu w odstępach 1-3 minut. W przypadku stosowania kalceiny-AM należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji fluorescencji odpowiednio na 485 nm i 520 nm. W zależności od typu komórki i układu chemokin, chemotaksja zwykle występuje w ciągu 1-4 godzin (Rysunek 2A).
    2. Jako alternatywę dla ciągłych pomiarów za pomocą czytnika płytek, zobrazuj studnie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 2B) zdolnego do wzbudzania i wykrywania światła odpowiednio przy 485 nm i 520 nm. Użyj małego powiększenia, aby uchwycić większość spodniej strony wkładki. Określ ilościowo komórki, przetwarzając obrazy za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania⁹.

2. Adoptywny transfer mysich limfocytów

1. Przygotowanie komórek dawcy
   1. Znieczulić 8-12-tygodniowe myszy dawcy C57BL/6J znieczuleniem izofluranowym (1-3%) za pomocą waporyzatora. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi.
   2. Umieść mysz w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą skalpela i zlokalizuj śledzionę w lewej górnej przestrzeni otrzewnej. Wyciąć całą śledzionę i umieścić w kompletnych pożywkach (RPMI uzupełnionych o 10% FBS i 25 mM HEPES; 1 ml/śledzionę) na lodzie. Eutanazja znieczulonych zwierząt dawców przez dekapitację.
   3. Delikatnie zmielić tkankę śledziony przez siatkę nylonową 40 μm na kompletne podłoże (1 ml / śledziona) za pomocą końcówki tłoka strzykawki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   4. Dodać 4 objętości buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy erytrocytów.
   5. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Jeśli erytrocyty pozostaną w osadzie, należy je ponownie zawiesić w buforze do lizy ACK, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odwirować komórki przy 1 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
   6. Ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce w stężeniu 2-5x10⁷ komórek/ml, a następnie przecedzić zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 40 μm, aby usunąć resztki komórek.
   7. Oznacz 1 x 10⁷ komórek/biorcę mysz barwnikiem fluorescencyjnym kompatybilnym z żywymi komórkami, który zostanie zachowany po późniejszym utrwaleniu, takim jak dioctan 5-chlorometylofluoresceiny (stężenie końcowe 2 μM)¹⁰. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Aby śledzić więcej niż jedną populację komórek, użyj innych barwników fluorescencyjnych z dodatkowymi populacjami komórek. Na przykład część komórek dawcy może być oznaczona 5-(i-6)-((((4-chlorometylo)benzoilo)amino) tetrametylorodaminą (końcowe stężenie 2 μM)¹¹.
   8. Dodać 4 objętości HBSS uzupełnione 25 mM HEPES, następnie odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w HBSS uzupełnionym HEPES 25 mM do końcowego stężenia 1 x 10⁸ komórek/ml.
      1. W przypadku stosowania więcej niż jednego barwnika fluorescencyjnego należy zachować populacje komórek oddzielnie aż do momentu bezpośrednio przed wstrzyknięciem.
      2. Przenieść małą podwielokrotność (10 μl) komórek każdego koloru do roztworu utrwalającego (1 ml) w celu późniejszej kompensacji cytometrii przepływowej.
2. Transfer limfocytów
   1. Znieczulić 8-12-tygodniowe myszy płci męskiej C57BL/6J izofluranem (1-3%) za pomocą waporyzatora; potwierdzić głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi. Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu.
   2. Krótko odwirować komórki dawcy (1 s) i przenieść do 1 ml strzykawki iniekcyjnej z igłą 27 G, 0,5 cala, łącząc różnicowo znakowane populacje komórek, jeśli ma to zastosowanie.
      1. Przenieść małą podwielokrotność (10 μl) zmieszanych komórek do roztworu utrwalającego (1 ml) w celu przeprowadzenia kolejnych analiz cytometrii przepływowej.
   3. Umieść zwierzęta dawcy w pozycji leżącej. Zastosuj łagodny nacisk doogonowy na skórę, grzbietowo do oka, powodując lekkie wysunięcie gałki ocznej.
   4. Skierować igłę przyśrodkowo i wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek dawcy zadoczoczopalnie każdej myszy biorcy. Komórki można również wstrzykiwać przez żyłę ogonową.
   5. Stopniowo wyjmować igłę do wstrzykiwań i umieszczać samą mysz w klatce ratunkowej. Monitorować zwierzę do momentu odzyskania przez nie przytomności; Po całkowitym wyzdrowieniu zwierzę należy zwrócić do mieszkania socjalnego.
3. Gromadzenie i analiza
   1. Po 1 godzinie znieczulić myszy biorcy znieczuleniem izofluranem (1-3%) za pomocą waporyzatora; potwierdzić głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca. Pobrać śledzionę (lub inną tkankę będącą przedmiotem zainteresowania) (krok 2.1.2.) od każdej myszy biorcy i umieścić w pełnej pożywce (1 ml/biorcę). Eutanazja znieczulonych zwierząt przez dekapitację.
      UWAGA: Dłuższe odstępy czasu przed pobraniem tkanek zwiększą akumulację tkanek przez co najmniej 24 godziny.
   2. Delikatnie zmielić tkankę śledziony przez siatkę nylonową o grubości 40 μm na kompletne podłoże za pomocą końcówki tłoka strzykawki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   3. Dodać 4 objętości buforu do lizy ACK i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   4. Ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym (sól fizjologiczna buforowana fosforanami uzupełniona 1% FBS). Policz komórki i dostosuj do końcowego stężenia 3 x 10 ⁷ komórek/ml. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek na 96-dołkową okrągłą płytkę denną.
   5. Wybarwić komórki pod kątem pożądanych markerów (patrz tabela materiałów) do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem (patrz Tabela Materiałów) przeciwko pożądanym markerom i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. Dodać 100 μl buforu barwiącego, odwirować komórki o stężeniu 1 000 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
   6. Zawiesić osad w 200 μl buforu barwiącego, odwirować komórki o stężeniu 1 000 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
   7. Zawiesić osad w buforze barwiącym o pojemności 125 μl i pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego zgodnie ze standardowymi procedurami.
      UWAGA: Zielony barwnik jest wzbudzany przez laser o długości fali 488 nm, a emisja jest wykrywana za pomocą filtrów dichroicznych 505 i 530/30. Pomarańczowy barwnik jest wzbudzany przez 561 nm, a emisja jest wykrywana przez filtr dichroiczny 582/15.
      1. Użyj zapisanych komórek z 2.1.8.2, aby skompensować każdy barwnik fluorescencyjny.
         UWAGA: Zastosowanie kompensacji opartej na perełkach z fluoroforami dopasowanymi do widm wzbudzenia i emisji barwników etykietujących spowoduje nieoptymalną kompensację.
      2. Użyj zapisanych komórek wejściowych z kroku 2.2.2.1, aby dokładnie określić stosunek różnie oznaczonych komórek wejściowych w przypadku korzystania z więcej niż jednej oznaczonej populacji (Rysunek 3). Oblicz migrację specyficzną dla tkanki na podstawie stosunku komórek znakowanych do nieznakowanych (Rysunek 4).

Wyniki

Podczas stosowania barwnika calcein-AM, oględziny komórek potwierdzą absorpcję etykiety (Rysunek 1). Automatyczne odczyty fluorescencyjne będą śledzić migrację, gdy komórki przechodzą na spód wkładki w czasie. Dane te wyraźnie pokazują indukcję migracji komórek w kierunku MCP-1, a także zwiększenie tej odpowiedzi przez surowicę (Figura 2A). W zależności od siły bodźca migracyjnego, przed nasileniem sygnału występuje opóźnienie wynoszące co najmniej ...

Dyskusja

Kwantyfikacja migracji komórek odpornościowych może być przeprowadzona za pomocą prostych i szybkich testów zarówno in vitro , jak i in vivo. Pokazujemy chemotaksję ludzkich monocytów in vitro w odpowiedzi na gradient MCP-1 i augmentację przez surowicę. In vivo mysie splenocyty dawcy zostały zróżnicowane i po przeniesieniu adopcyjnym odzyskane od zwierząt biorców.

Korzystanie z czytnika płytek ma tę zaletę, że pobiera próbki z kilku punktów czasowych (nawet ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Płodowa surowica bydlęca	ATCC	30-2020
Kolba do hodowli komórkowych	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Wzbudzenie: 485nm, Emisja: 520nm
Komórka naczynie	hodowlane Corning	1007
24-dołkowa płytka	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 ml stożkowa rurka	Corning	352097
Surowica bydlęca Albumina	Technologia sygnalizacji komórkowej	9998S
Ludzki rekombinowany MCP-1	Peprotech	300-04
Surowica dorosłego bydła	Sigma	B9433
HBSS z wapniem i magnezem; bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Czytnik płytek SpectraMax M2e	Urządzenia molekularne
Mikroskop odwróconej fluorescencji Olympus IX71	Olympus
Isothesia	Henry Schein zdrowie zwierząt	11695-6776-2	Znieczulenie izofluoranowe
Sitko komórkowe 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK bufor lizujący	Jakość Biologiczna	118-156-101
CellTracker Pomarańczowy CMTMR Barwnik	Thermo Fisher Scientific	C2927	Wzbudzenie: 541nm, Emisja: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Wzbudzenie: 485nm, Emisja: 520nm
Strzykawka 5ml	Strzykawka BD	309646
1ml Strzykawka	TB Strzykawka BD	309625
linii komórkowej THP-1	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 przeciwciało anty-mysie CD3	Biolegend	100228	Wzbudzenie: 405nm, Emisja: 421nm
Brilliant Violet 605 anty-mysie przeciwciało CD19	Biolegend	115540	Wzbudzenie: 405nm, Emisja: 603nm
96-dołkowa okrągła płyta dolna	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences	Cytometr przepływowy