Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chemotaksja to migracja wzdłuż określonego gradientu chemicznego1. Chemokiny to cytokiny chemotaktyczne, które promują transport komórkowy ze specyficznością anatomiczną i czasową2. Chemotaksja jest krytyczną funkcją limfocytów i innych komórek odpornościowych, którą można ocenić ilościowo in vitro. W manuskrypcie opisano metody, które pozwalają na ocenę chemotaksji, zarówno in vitro, jak i in vivo, dla różnych typów komórek, w tym linii komórkowych i komórek natywnych. Format in vitro oparty na płytce pozwala na jednoczesne porównywanie kilku stanów w czasie rzeczywistym i może być zakończony w ciągu 1-4 godzin. Warunkami testu in vitro można manipulować w celu wprowadzenia agonistów i antagonistów, a także odróżnienia chemotaksji od chemokinezy, która jest ruchem losowym. W przypadku oceny transportu in vivo komórki odpornościowe można znakować wieloma barwnikami fluorescencyjnymi i wykorzystywać do transferu adoptywnego. Zróżnicowane znakowanie komórek pozwala na wprowadzenie mieszanych populacji komórek do tego samego zwierzęcia, zmniejszając w ten sposób wariancję i zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu o odpowiedniej mocy. Migracja do tkanki limfatycznej następuje w ciągu zaledwie 1 godziny i można pobrać próbki z wielu przedziałów tkankowych. Cytometria przepływowa po pobraniu tkanek pozwala na szybką i ilościową analizę wzorców migracji wielu typów komórek.
Wprowadzenie
Solidna odporność wymaga złożonej czasowej i przestrzennej koordynacji niezliczonych typów komórek, aby odpowiednio reagować na urazy, infekcje i generować samotolerancję. Odkryto i scharakteryzowano kilkadziesiąt receptorów chemokinowych i odpowiadających im ligandów, które zapewniają mechanizmy molekularne, dzięki którym określone komórki mogą być kierowane do określonej tkanki w określonym czasie. Tak więc badanie chemotaksji i migracji jest nieodzownym elementem badań immunologicznych. Rzeczywiście, opisany test in vitro został niedawno wykorzystany jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji kofaktora chemotaktycznego, który przyspiesza chemotaksję komór....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rockefellera. Wszystkie zwierzęta były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów.
1. Chemotaksja in vitro
- Hodowla komórek THP-16 w Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES; 25 mM) (kompletna pożywka), utrzymując gęstość między 0,5-1,0 x 106 komórek/ml.
- W naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm oznaczyć 3,5 x 105 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przy użyciu barwnika calcein-AM kontrola wizualna komórek pozwoli potwierdzić pobranie znacznika (Rycina 1). Zautomatyzowane odczyty fluorescencji będą śledzić migrację komórek w miarę ich przemieszczania się na spodnią stronę wkładki w czasie. Dane te wyraźnie wykazują indukcję migracji komórek w kierunku MCP-1, a także nasilenie tej odpowiedzi przez surowicę (Rycina 2A). W zależności od siły bodźca migracyjnego występuje opóźni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kwantyfikacja migracji komórek odpornościowych może być przeprowadzona za pomocą prostych i szybkich testów zarówno in vitro , jak i in vivo. Pokazujemy chemotaksję ludzkich monocytów in vitro w odpowiedzi na gradient MCP-1 i augmentację przez surowicę. In vivo mysie splenocyty dawcy zostały zróżnicowane i po przeniesieniu adopcyjnym odzyskane od zwierząt biorców.
Korzystanie z czytnika płytek ma tę zaletę, że pobiera próbki z kilku punktów czasowych (nawet .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Program Bernarda L. Schwartza dla Lekarzy Naukowców na Uniwersytecie Rockefellera, Robertson Therapeutic Development Fund na Uniwersytecie Rockefellera oraz Sackler Center for Biomedicine and Nutrition Research na Uniwersytecie Rockefellera.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Płodowa surowica bydlęca | ATCC | 30-2020 | |
| Kolba do hodowli komórkowych | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Wzbudzenie: 485nm, Emisja: 520nm |
| Komórka naczynie | hodowlane Corning | 1007 | |
| 24-dołkowa płytka | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 ml stożkowa rurka | Corning | 352097 | |
| Surowica bydlęca Albumina | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9998S | |
| Ludzki rekombinowany MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Surowica dorosłego bydła | Sigma | B9433 | |
| HBSS z wapniem i magnezem; bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Czytnik płytek SpectraMax M2e | Urządzenia molekularne | ||
| Mikroskop odwróconej fluorescencji Olympus IX71 | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein zdrowie zwierząt | 11695-6776-2 | Znieczulenie izofluoranowe |
| Sitko komórkowe 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK bufor lizujący | Jakość Biologiczna | 118-156-101 | |
| CellTracker Pomarańczowy CMTMR Barwnik | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Wzbudzenie: 541nm, Emisja: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Wzbudzenie: 485nm, Emisja: 520nm |
| Strzykawka 5ml | Strzykawka BD | 309646 | |
| 1ml Strzykawka | TB Strzykawka BD | 309625 | |
| linii komórkowej THP-1 | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 przeciwciało anty-mysie CD3 | Biolegend | 100228 | Wzbudzenie: 405nm, Emisja: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anty-mysie przeciwciało CD19 | Biolegend | 115540 | Wzbudzenie: 405nm, Emisja: 603nm |
| 96-dołkowa okrągła płyta dolna | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Cytometr przepływowy |
Bibliografia
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
