Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56226

⸱

10 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Streszczenie

Złożone zmiany w ekspresji genów zazwyczaj pośredniczą w dużej części odpowiedzi komórkowej. Każdy gen może zmieniać ekspresję z unikalną kinetyką, ponieważ gen jest regulowany przez określony czas jednego z wielu bodźców, szlaków sygnałowych lub efektów wtórnych. W celu uchwycenia całej odpowiedzi ekspresji genów na niedotlenienie u drożdży S. cerevisiae, zastosowano analizę sekwencyjną RNA w celu monitorowania poziomów mRNA wszystkich genów w określonych momentach po ekspozycji na niedotlenienie. Niedotlenienie ustalono przez hodowlę komórek w ~100% gazieN2. Co ważne, w przeciwieństwie do innych badań hipoksyjnych, ergosterol i nienasycone kwasy tłuszczowe nie zostały dodane do pożywki, ponieważ metabolity te wpływają na ekspresję genów. Punkty czasowe zostały wybrane w zakresie 0 - 4 godzin po niedotlenieniu, ponieważ okres ten ujmuje główne zmiany w ekspresji genów. W każdym punkcie czasowym niedotlenione komórki środkowego logarytmu były szybko filtrowane i zamrażane, ograniczając ekspozycję naO2 i towarzyszące zmiany w ekspresji genów. Całkowite RNA wyekstrahowano z komórek i wykorzystano do wzbogacenia w mRNA, które następnie zostało przekształcone w cDNA. Z tego cDNA stworzono biblioteki multipleksowe i zsekwencjonowano osiem lub więcej próbek w jednym pasie sekwencera nowej generacji. Opisano proces po sekwencjonowaniu, który obejmuje wysokiej jakości przycinanie bazy, mapowanie odczytu i określanie liczby odczytów na gen. DESeq2 w środowisku statystycznym R wykorzystano do identyfikacji genów, które zmieniają się znacząco w dowolnym punkcie czasowym hipoksji. Analiza trzech powtórzeń biologicznych wykazała wysoką odtwarzalność, geny o różnej kinetyce i dużą liczbę oczekiwanych genów regulowanychO2. Metody te mogą być wykorzystywane do badania, w jaki sposób komórki różnych organizmów reagują na niedotlenienie w czasie i przystosowane do badania ekspresji genów podczas innych odpowiedzi komórkowych.

Wprowadzenie

Wiele organizmów reaguje na niedotlenienie, czyli niski poziom O2, zmieniając ekspresję genów 1,2,3. Ta odpowiedź pomaga komórkom radzić sobie z brakiem substratu krytycznego dla oddychania tlenowego i dla kilku reakcji biosyntezy, ale także ze zmieniającym się stanem redoks 4. Kilka badań mikromacierzy przeprowadzonych na S. cerevisiae pokazuje, że poziomy mRNA setek genów zmieniają się w odpowiedzi na niedotlenienie 5,6,7,8,9,10,11,12. Ostatnio sekwencja RNA została wykorzystana do scharakteryzowania zmian ekspresji genów w czasie podczas niedotlenienia 13. W tym miejscu przedstawiono i omówiono szczegóły eksperymentu.

Niedotlenienie może być osiągnięte na różne sposoby, z których każdy wytwarza inny poziom O2. W tym przypadku hipoksja została ustanowiona przez ciągły przepływ N2 o ultra wysokiej czystości do kolb, które obniżają [O2] natychmiast rozpuszczone z odtwarzalną kinetyką 10. Możliwe, że obecne są cząsteczki O2, które przyczyniają się do metabolizmu i ekspresji genów, ale to środowisko jest uważane za bardzo zbliżone do beztlenowego. W przypadku brakuO2 komórki drożdży nie mogą biosyntetyzować hemu, ergosterolu i nienasyconych kwasów tłuszczowych 4,12,14. Tak więc poprzednie badania obejmowały te metabolity podczas uprawy drożdży bez tlenu 5,10,15. Jednak w wielu reakcjach hipoksyjnych pośredniczy wyczerpanie tych metabolitów, a zatem ich uzupełnienie odwraca reakcje ekspresji genów niedotlenienia 12,16. Aby naśladować naturalne niedotlenienie, metabolity te nie były dodawane do pożywki. W krótkim czasie, w którym komórki były wystawione na niedotlenienie bez obecności tych niezbędnych metabolitów, nie było zauważalnego wzrostu śmierci komórki (dane nie pokazane) ani przedłużonej reakcji na stres 13.

Odpowiedź jest również zależna od szczepu i jego genotypu. Szczególnie ważne są allele znanych regulatorów reakcji hipoksyjnych 2. Tło szczepu S288C jest wysoce pożądane, aby wyniki można było porównać z innymi badaniami genomicznymi przeprowadzonymi na tym szczepie. Jednak S288C zawiera allel częściowej utraty funkcji genu HAP1 17, regulatora transkrypcji krytycznego dla odpowiedzi niedotlenienia. Ten allel został naprawiony w S288C przy użyciu kopii typu dzikiego z tła szczepu Σ1278b 11.

Ekspresja genów jest wysoce zależna od środowiska komórkowego. Dlatego podczas przeprowadzania analizy mRNA całego genomu ważne jest utrzymanie stałego środowiska przy jednoczesnej zmianie innego parametru, takiego jak czas, bodziec lub genotyp. Aby osiągnąć wysoce powtarzalne wyniki, należy wziąć pod uwagę te trzy praktyki dla badania i wszystkich jego biologicznych lub technicznych powtórzeń. Po pierwsze, ten sam eksperymentator (eksperymentatorzy) powinien przeprowadzić badanie, ponieważ praktyki techniczne mogą się różnić w zależności od eksperymentatora. Po drugie, w pożywce wzrostowej należy użyć tej samej partii składników, ponieważ każda partia ma nieco inny skład, który może wpływać na ekspresję genów. Po trzecie, aby zminimalizować efekty cyklu komórkowego, każdy punkt czasowy powinien składać się z komórek asynchronicznych w środkowej fazie wzrostu (1 - 2 x 107 komórek / ml).

Podczas charakteryzowania złożonej odpowiedzi, takiej jak reakcja ekspresji genu na niedotlenienie, korzystny jest przebieg czasowy dla określenia kinetyki różnych zdarzeń. Należy wybrać konkretne punkty czasowe, które uchwycą główne zmiany w odpowiedzi. W tym badaniu zaobserwowano punkty czasowe między 0 a 4 godzinami, ponieważ wcześniejsze eksperymenty ujawniły rozległe zmiany w ekspresji genów w tym okresie 13.

Do pomiaru globalnej ekspresji genów użyto sekwencji RNA-seq 18,19. Metoda ta wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji w celu określenia względnej obfitości transkryptu każdego genu. W porównaniu z analizą mikromacierzy DNA, sekwencja RNA wykazuje wyższą czułość (w celu wykrycia mniej obfitych transkryptów), większy zakres dynamiczny (w celu pomiaru większych zmian fałdowania) i lepszą odtwarzalność (w celu dokładnego śledzenia ekspresji genów w czasie). Zazwyczaj większość komórkowego RNA to rybosomalne RNA, więc opracowano wiele metod wzbogacania dla określonych gatunków RNA 20. W tym przypadku kulki poli-T zostały użyte do oczyszczenia transkryptów mRNA zawierających poli-A, chociaż różne dostępne na rynku zestawy do dezubożenia rRNA mogą być również skuteczne we wzbogacaniu mRNA.

Tutaj scharakteryzowano reakcję ekspresji genu S. cerevisiae na niedotlenienie. Komórki poddano działaniu hipoksji, a następnie pobrano próbki w ośmiu punktach czasowych (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 i 240 min). Aby potwierdzić odtwarzalność i zidentyfikować statystycznie zmienione transkrypty, przeprowadzono trzy powtórzenia biologiczne. RNA wyekstrahowano przez mechaniczne rozerwanie i oczyszczenie kolumny, a następnie przetworzono do analizy sekwencyjnej RNA. Opisano proces po sekwencjonowaniu oraz udostępniono skrypty programistyczne, które pozwalają na dokładne odwzorowanie wykonanych analiz. W szczególności do przetwarzania danych RNA-seq i identyfikacji 607 genów, które zmieniają się znacząco podczas niedotlenienia, wykorzystano Trimmomatic 21, TopHat2 23, środowisko statystyczne R 24 oraz pakiet DESeq2 25, HTseq oraz pakiet DESeq2 sup class="xref"25. Analiza głównych składowych (PCA) i ekspresja genów w kontrpróbach wykazały odtwarzalność tej techniki. Grupowanie i mapy cieplne ujawniły szeroką kinetykę ekspresji, podczas gdy analiza ontologii genów (GO) wykazała, że wiele procesów komórkowych, takich jak oddychanie tlenowe, jest wzbogaconych w zestaw genów regulowanych tlenem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wywoływanie niedotlenienia

  1. Jeden dzień lub więcej przed kursem czasu hipoksji: Przygotuj inkubator, system filtracji komórek, próżnię, zbiornik gazu, kolby, korki, szklane rurki i rurki, jak w tabeli materiałów.
  2. Zbiornik N2, inkubator, system próżniowy i filtrujący należy umieścić w bliskiej odległości, aby umożliwić szybkie przetwarzanie komórek.
  3. Przygotuj sterylne płynne podłoże YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy), mieszając składniki w szklanej butelce i autoklawując.
  4. Plan rozmieszczenia kolb w inkubatorze.
    UWAGA: Ze zbiornika N2 pierwsza kolba będzie syfonem wodnym, druga kolba będzie ostatnim punktem czasowym, trzecia kolba będzie przedostatnim punktem czasowym i tak dalej, aż do ostatniej kolby, która jest ostatnią syfonem. Rysunek 1 pokazuje kolejność i połączenia między kolbami.
  5. Dzień przed biegiem czasu zaszczepij kolonię drożdży w kulturze 5 ml płynnego YPD w sterylnej probówce. W szczególności zbierz pełną kolonię z talerza za pomocą sterylnego aplikatora w sztyfcie. Umieścić patyczek w płynie YPD i potrząsać patyczkiem, aż większość komórek znajdzie się w zawiesinie.
  6. Obracaj rurki w temperaturze 30 °C przez noc (~16 h).
    UWAGA: Po 16 godzinach komórki typu dzikiego osiągną nasycenie (~2 x 108 komórek/ml), na co wskazuje bardzo mętna hodowla. Inne szczepy mogą potrzebować więcej czasu, aby osiągnąć wysycenie i powinny być badane poprzez pomiar stężenia komórek za pomocą spektrofotometru, jak wskazano w kroku 1.9.4.
  7. W dniu kursu czasowego, po 16 godzinach inkubacji, rozcieńczyć nasyconą kulturę w stosunku 1:50 za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby umieścić 4 ml kultury przez noc w 196 ml płynnego YPD w sterylnej kolbie o pojemności 500 ml. Rośnie z wytrząsaniem z prędkością ~200 obr./min przez 4 godziny w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Po 4 godzinach kultura typu dzikiego osiągnie stężenie mid-log ~1-2 x 107 komórek/ml.
  8. Podczas 4-godzinnej inkubacji oznaczyć kolby (do hipoksji i syfonów wodnych) oraz probówki zbiorcze o pojemności 50 ml. Jeśli inkubator opisany w kroku 1.7 powyżej nie jest używany do przebiegu czasu hipoksji, włącz drugi inkubator i ustaw go na 30 °C.
  9. Tuż przed poddaniem komórek hipoksji:
    1. Dodaj ~50 ml wody do dwóch sterylnych kolb o pojemności 250 ml, które posłużą jako syfony.
    2. Napełnij 1/3 wiadra na lód ciekłym azotem i zanurz stojak z pianki polistyrenowej na 50 ml probówek wirówkowych.
    3. Skonfiguruj system filtrów do zbierania komórek. Dodaj sterylny krążek filtra do dolnej części systemu filtracji za pomocą sterylnej pęsety, uważając, aby dotykać tylko krawędzi dysku filtra. Umieść górną jednostkę filtra na dolnej jednostce filtra i zabezpiecz za pomocą clamps dostarczone z systemem. Upewnij się, że dolna i górna część są wyrównane tak, aby zapewnić szczelne uszczelnienie i brak wycieków.
    4. Zmierz stężenie komórek za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć ogniwa tak, aby można je było zmierzyć w zakresie liniowym spektrofotometru – OD600 między ~0,2 - 0,6, w zależności od spektrofotometru.
      UWAGA: Jedna jednostka OD600 to ~3 x 107 komórek/ml, w zależności od morfologii komórki i spektrofotometru. Oczekuje się stężenia ~1-2 x 107 komórek/ml, co odpowiada OD600 wynoszącemu ~0,33 - 0,66.
    5. Szybko uzyskaj próbkę czasu 0.
      1. Podłącz system filtrów do silnej (~10 mbar) próżni za pomocą rurki próżniowej i syfonu na kolby o pojemności 1 000 ml. Włącz odkurzacz. Wlej kulturę (zwykle ~20 ml) do górnej jednostki i poczekaj, aż płyn zostanie przeciągnięty przez filtr (~10 s, w zależności od siły podciśnienia).
      2. Ostrożnie wyjmij krążek filtra za pomocą czystej pęsety i umieść go w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Natychmiast umieść probówkę wirówkową w stojaku zanurzonym w ciekłym azocie. Co ważne, nie należy wstępnie schładzać probówek przed włożeniem filtra, ponieważ rurki eksplodują.
      3. Po >30 s umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu późniejszej ekstrakcji RNA. Po każdej filtracji wyczyść i ponownie zmontuj system filtrów. Przepłucz system, przeciągając wodę przez 10 sekund bez tarczy filtra. Na koniec wytrzyj system do sucha ręcznikiem papierowym.
    6. Rozcieńczyć 4-godzinną kulturę do różnych kolb dla różnych punktów czasowych, tak aby każda kolba osiągnęła stężenie w połowie logarytmu (~1-2 x 107 komórek/ml) we wskazanym punkcie czasowym hipoksji.
      UWAGA: Tabela 1 przedstawia rozcieńczenia, które zostały użyte dla haploidalnego szczepu S288C HAP1+ typu dzikiego. Zaleca się przetestowanie każdego szczepu w tych warunkach hipoksyjnej hodowli i odpowiednie dostosowanie rozcieńczeń.
    7. Po dodaniu komórek i pożywki do kolb należy zastąpić folię aluminiową zakrywającą otwór kolby korkiem zawierającym dwie włożone szklane rurki.
    8. Umieścić kolby w inkubatorze w układzie ustalonym wcześniej.
    9. Bezpiecznie podłącz rurkę, jak pokazano na Rysunek 1.
    10. Sprawdzić, czy wszystkie korki są mocno wciśnięte w otwory kolby.
  10. W czasie 0 otwórz zawór regulatora. Następnie ustaw przepływomierz na 3 l/min.
    UWAGA: W obu kolbach z wodą będzie można zaobserwować bulgotanie, wskazujące na prawidłowy przepływ gazu. Jeśli tak nie jest, sprawdź, czy wszystkie korki są dokręcone, a rurka jest prawidłowo zamocowana.
  11. Zamknij inkubator i ustaw prędkość wytrząsania na ~200 obr./min. Uruchom minutnik.
  12. Przed każdym punktem czasowym skonfiguruj system filtrów zgodnie z opisem powyżej w kroku 1.9.3.
  13. W każdym punkcie czasowym (np. 5 minut, 10 minut itd.) poproś dwie osoby o szybkie przetworzenie komórek w następujący sposób:
    1. Pierwsza osoba: wyjąć odpowiednią kolbę z uchwytu i wyjąć korek (z dołączoną szklaną rurką).
      UWAGA: Nie spowoduje to przerwania przepływu N2 do żadnej z pozostałych kolb hodowlanych, ale tymczasowo przerwie przepływ do ostatniego syfonu wodnego.
    2. Druga osoba: Odpipetuj 1 ml kultury i przelej do kuwety. Ponownie podłącz rurkę z kolby hodowlanej, która znajduje się teraz na końcu linii, do ostatniego syfonu wodnego (jedna rurka i jeden korek zostaną w tym czasie usunięte). Następnie zmierz stężenie komórek w kuwecie, jak opisano powyżej w kroku 1.9.4.
    3. Pierwsza osoba: Wlej pozostałą część kultury do systemu filtracji próżniowej, a następnie wykonaj filtrowanie i zamrażanie, jak opisano powyżej w kroku 1.9.5.
  14. Po zakończeniu wszystkich punktów czasowych wyłącz gaz N2. Najpierw zamknij reduktor i poczekaj, aż ciśnienie spadnie, a następnie wyłącz przepływomierz. Na koniec zdemontuj system i wyczyść wszystkie materiały wodą, a następnie 70% etanolem.

2. Ekstrakcja RNA

  1. Przygotować bufor RLT do oczyszczania kolumny RNA, zgodnie z opisem w tabeli materiałów.
  2. Przygotować roztwór roboczy DNazy, dodając 10 μl roztworu podstawowego DNazy do 70 μl buforu RDD na próbkę (patrz tabela materiałów).
  3. Wyjmij probówki o pojemności 50 ml zawierające filtry i komórki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść na lodzie do rozmrożenia (~15 min). Wykonaj następujące czynności z rurkami na lodzie.
  4. Oznacz probówki z nakrętką o pojemności 2 ml i umieść je na lodzie, po jednej probówce na każdą próbkę. Dodaj ~0,6 ml koralików przemytych kwasem do każdej probówki, używając 1,5 ml probówki do mikrowirówki, aby zgarnąć i zmierzyć kulki.
  5. Dodać 0,6 ml zimnego buforu RLT do probówek o pojemności 50 ml.
  6. Pipetować w górę i w dół, aby usunąć komórki z filtra i zawiesić w roztworze. Nie pozwól, aby filtr pozostał w roztworze, ponieważ filtr wchłonie roztwór. Usunąć cały roztwór wchłonięty przez filtr, używając końcówki pipety, aby docisnąć filtr do ścianki rurki.
  7. Przenieść cały płyn z probówki o pojemności 50 ml do zakręcanych probówek zawierających kulki.
  8. Umieść rurki z nakrętką w homogenizatorze młynka perełkowego i pracuj przez jedną minutę.
    Natychmiast umieść probówki na lodzie na trzy minuty. Ponownie umieść probówki w homogenizatorze i pracuj przez jedną minutę.
  9. Wyjmij probówki z homogenizatora i umieść na lodzie na 5 minut. Koraliki osiądą na dnie rurek.
  10. Pozostałe kroki wykonaj w temperaturze pokojowej.
  11. Za pomocą pipety przenieś tylko lizat (~350 μl), omijając kulki, do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  12. Mikrowirować przez 2 minuty z maksymalną prędkością, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  13. Dodaj 1 objętość 70% etanolu (wykonanego z 200-procentowego etanolu klasy biologii molekularnej). Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
  14. Przenieść roztwór i osad do kolumny RNA, która została umieszczona w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
  15. Wirować przez 15 s przy ≥12 000 x g i wyrzucić płyn (ciecz z probówki).
  16. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny. Wirować przez 15 s przy ≥12 000 x g i odrzucić przepływ.
  17. Dodać 80 μl mieszanki inkubacyjnej DNazy I do membrany kolumny (nie wchodzić na boki probówki) i pozostawić na 15 minut.
  18. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny. Mikrowirować przez 15 s przy ≥12 000 x g i odrzucić przepływ.
  19. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny. Mikrowirówka przez 15 s przy ≥12 000 x g i wyrzucić przepływ.
  20. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny. Mikrowirówka przez 2 minuty przy ≥12 000 x g.
  21. Ostrożnie wyjąć kolumnę i umieścić w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Mikrowirować na pełnych obrotach przez 1 minutę (do całkowitego wysuszenia membrany).
  22. Wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 30 μl wody wolnej od RNaz do membrany kolumny.
  23. Eluować RNA z kolumny przez mikrowirowanie przez 1 minutę w temperaturze ≥12 000 x g. Podczas ładowania kolumn do mikrowirówki upewnij się, że pokrywki probówki zbiorczej są skierowane w kierunku, w którym wirówka się obraca, aby zapobiec pękaniu pokrywek.
  24. Dodaj kolejne 30 μl wody wolnej od RNaz do membrany kolumny, utrzymując kolumnę w tej samej probówce do mikrowirówki.
  25. Mikrowirować przez 1 minutę przy ≥ 12 000 x g, tak aby końcowa objętość eluatu wynosiła 60 μl.
  26. Każdą probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 60 μl RNA należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

3. Określanie stężenia i jakości RNA

  1. Zmierzyć stężenie RNA i DNA w każdej próbce RNA za pomocą a) fluorometru, b) barwników fluorescencyjnych specyficznych dla DNA i RNA oraz c) probówek testowych, zgodnie z tabelą materiałów. Postępuj zgodnie z instrukcjami fluorometru i barwników.
  2. Alternatywnie należy zmierzyć stężenie kwasu nukleinowego za pomocą spektrofotometru UV ustawionego na 260 nm.
    UWAGA: Odczyt A260 wynoszący 1,0 odpowiada ~40 μg/ml jednoniciowego RNA.
  3. Przetestuj jakość RNA, uruchamiając RNA na komercyjnym analizatorze kwasów nukleinowych (patrz tabela materiałów) lub na standardowym żelu formaldehyd/agaroza 26.

4. Analiza sekwencyjna RNA

  1. Z całkowitego zapasu RNA uzupełnij 21 μl 100 ng/μl RNA w wodzie wolnej od RNaz. Użyj 1 μL z tych 21 μL, aby przetestować stężenie RNA, jak powyżej. Pozostałe 20 μl (2 μg) całkowitego RNA należy przesłać do zewnętrznego centrum sekwencjonowania w celu wzbogacenia mRNA, przygotowania biblioteki specyficznej dla nici (z ośmioma lub więcej kodami kreskowymi do multipleksowania) i sekwencjonowania (patrz tabela materiałów). Alternatywnie, lokalnie wykonaj wzbogacenie mRNA i przygotowanie biblioteki, a następnie prześlij bibliotekę do sekwencjonowania.
  2. Zbierz osiem lub więcej multipleksowanych próbek i zsekwencjonuj je na jednym torze sekwencera nowej generacji.
  3. Pobierz plik FASTQ zawierający wszystkie odczyty sekwencji i odpowiadające im odczyty indeksu. Pobierz również plik tekstowy zawierający kody kreskowe multipleksu.
    UWAGA: Odczyty indeksu mogą znajdować się w osobnym pliku FASTQ. Umieść wszystkie te pliki w jednym katalogu.
  4. Umieść podany tutaj skrypt powłoki, "fastq_pipeline.sh", w tym samym katalogu. Edytuj ten skrypt odpowiednio do eksperymentu i katalogów komputerowych.
    UWAGA: ten skrypt zawiera obszerne adnotacje wyjaśniające kroki. Krótko mówiąc, jakość skryptu przycina odczyty, mapuje odczyty do genomu i generuje plik rozdzielany tabulatorami zawierający liczbę odczytów na gen dla każdej próbki.
  5. Zdeponuj pliki FASTQ i surowe dane dotyczące liczby odczytów w NCBI's Gene Expression Omnibus przed publikacją 27. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi "Przesyłania danych sekwencji o wysokiej przepływności do lokalizacji geograficznej": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Zaimportuj dane liczby odczytów do środowiska statystycznego języka R i przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu skryptu języka R podanego w tym miejscu "time_course_script. R". Edytuj ten skrypt odpowiednio do eksperymentu i katalogów komputerowych.
    UWAGA: Ten skrypt zawiera obszerne adnotacje wyjaśniające kroki. Krótko mówiąc, ten skrypt importuje odczytane dane, normalizuje odczyty, identyfikuje geny, które zmieniają się znacząco w ciągu czasu, przeprowadza analizę PCA i tworzy wykresy ekspresji wybranych genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebieg czasowy hipoksji oraz analiza RNA-seq zostały przeprowadzone niezależnie trzy razy. Aby zbadać powtarzalność trzech powtórzeń, dane dotyczące ekspresji wszystkich genów przeanalizowano za pomocą analizy głównych składowych (PCA). Rysunek 2 przedstawia zmiany w próbkach w odniesieniu do dwóch pierwszych głównych składowych, które razem reprezentują 58,9% zmienności. Analiza ta wykazała, że każdy przebieg czasowy wykazuje podobne zmiany (co obrazuje zb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu poziomy mRNA dla wszystkich genów mierzono podczas niedotlenienia drożdży S. cerevisiae. Celem było przeanalizowanie, w jaki sposób globalna ekspresja genów zmienia się pod wpływem wzrostu w kontrolowanym środowisku bliskim beztlenowi. Podjęto kilka kroków w celu zapewnienia, że opisana tutaj metoda jest dokładnie kontrolowana i powtarzalna. Po pierwsze, komórki wystawiono na działanie precyzyjnie zdefiniowanego środowiska hipoksyjnego: 99,999% N2 w pożywkach bogatych (YPD). Inne badania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics Sequencing Core Facility na Uniwersytecie Princeton za porady techniczne oraz za przygotowanie biblioteki RNA i sekwencjonowanie. Praca ta była wspierana przez granty z Rowan University i NIH NIGMS R15GM113187 dla M.J.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zamknięty suchy inkubatorThermo ScientificMaxQ 4000Ustawiony na 30 stopni C. Zmodyfikuj drzwiczki, aby umożliwić wprowadzenie jednej rurki Tygon. Alternatywnie można użyć inkubatora New Brunswick G25, który zawiera port rurowy. Nie należy używać wytrząsarki do wody na wolnym powietrzu, ponieważ w probówkach między kolbami gromadzi się kondensacja, która może spowodować zanieczyszczenie krzyżowe kultur.
Uchwyt filtra do mikroanalizyMilliporeXX1002530średnicy 25 mm, wspornik ze stali nierdzewnej, nr 5 perforowany silikonowy korek mocowany w standardowej kolbie filtracyjnej 125 ml
Silne podciśnienieEdwardsE-LAB 2" dom" Próżnia może być za słaba. Alternatywnie użyj przenośnej pompy próżniowej zasilanej energią elektryczną, takiej jak ta wymieniona tutaj.
1,000 mlDziała jako pułapka próżniowa.
~ 2 stopy długości rur próżniowych o grubych ściankach, średnica wewnętrzna 3/8 cala, średnica zewnętrzna 7/8 calaTygon38TTDwa elementy: pierwszy łączy próżnię z pułapką, a drugi łączy syfon z systemem filtrów.
gazu N2czystość 99,999%, >1,000 psi, z regulatorem i regulatorem przepływu gazu
Autoklawizowana kolbaOtwór pokryty folią aluminiową. Po jednym dla każdego szczepu drożdży.
Autoklawizowane kolbyOtwory pokryte folią aluminiową. Po jednym na każdy punkt czasowy plus dwa na syfony.
Korki do kolb (rozmiar 6, dwa otwory o średnicy 5 mm)Sterylizowane 70% etanolem. Po jednym na każdą kolbę.
Rurka szklana, długość 9 cm lub 17 cm, średnica wewnętrzna 2 mm, średnica zewnętrzna 5 mmSterylizowane 70% etanolem. Dwie probówki na każdą kolbę. Umieść w otworach każdego korka. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z rozmieszczeniem rur 9- i 17-centymetrowych.
~25 cm długości rurki z tworzywa sztucznego, średnica wewnętrzna 5 mmTygonE-3603Jedna sztuka na każdą kolbę. Sterylizowane 70% etanolem.
Sterylne krążki filtracyjneMilliporeHAWP02500średnicy 25 mm, 0,45 &mikro; m wielkość porów, po jednym dla każdego punktu czasowego
Sterylne dH2O (~100 mL)
1 ml KuwetyDo pomiaru OD600 (tj. stężenia komórek)
50 ml sterylne probówkiPo jednej na każdy punkt czasowy
Czysta i sterylna pęseta
Ciekły azotDo zamrażania komórek
Koraliki płukane kwasemSigmaG8772Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C do komórek lizujących
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104Do oczyszczania kolumny RNA
BuforPrzygotuj przez dodanie 10 &mikro; L β-merkaptoetanolu na 1 ml buforu RLT, utrzymywać w temperaturze 4 °C.
2 ml probówki zbiorczeQiagenzawarte w Qiagen Rneasy Mini Kit
Bufor RPEQiagenzawarte w Qiagen Rneasy Mini
Kit Bufor RW1Qiagenzawarte w Qiagen Rneasy Mini Kit
Roztwory magazynowe i roboczeQiagen79254Enzym DNaza I występuje w postaci liofilizowanego proszku w szklanej fiolce. Za pomocą sterylnej igły i strzykawki wstrzyknąć 550 µ L wody wolnej od RNaz (dostarczanej w zestawie Qiagen) do fiolki. Wymieszaj, delikatnie odwracając butelkę. Aby uniknąć denaturacji enzymu, nie należy wirować. Za pomocą pipety wyjąć roztwór podstawowy z fiolki i przechowywać w zamrażarce (-20 ° C) w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (80 &mikro; L każdy). Roztworu podstawowego nie należy rozmrażać ani ponownie zamrażać.
Bufor RDDQiagenzawarty w zestawie Qiagen DNase
Kit Lodowate probówkiDo lizy komórek podczas ekstrakcji RNA
homogenizator młyna perełkowegoBiospec Mini-Beadbeater-24112011Przechowywać w chłodni
Bacto PeptoneBDDF0118do płynnych pożywek YPD
Ekstrakt drożdżowy Bacto BDDF0886do cieczy Pożywka YPD
glukozaFisherD16do płynnych pożywek YPD
Probówki do oznaczania kubitówThermo FisherQ32856do pomiaru stężenia kwasów nukleinowych
Quant-iTTM dsDNA BR Assay KitThermo FisherQ32853do pomiaru stężenia kwasów nukleinowych
Zestaw do oznaczania RNA Quant-iTTMThermo FisherQ32855do pomiaru stężenia kwasów nukleinowych
Fluorometr kubitowyThermo FisherQ33216do pomiaru stężenia kwasów nukleinowych
Komercyjny system elektroforezyAgilentBioanalyzer 2100do pomiaru jakości kwasów nukleinowych
Sekwencer nowej generacjiIlluminaHiSeq 2500do bibliotek sekwencjonowania
Zautomatyzowany system obsługi cieczyWafergenApollo 324do tworzenia biblioteki sekwencjonowania
Zestaw do izolacji mRNA PrepX PolyAWafergen400047do izolowania mRNA od całkowitego RNA
PrepX RNA SEQ dla zestawu Illumina Library KitWafergen400039do tworzenia bibliotek sekwencjonowania specyficznych dla nici z całkowitego rozdzielacza
kodów kreskowych RNAhttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, który zawiera poleceniehttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (zainstalowane przed TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (zainstalowany przed R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (wersja bezpłatna)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Kolba Wysokociśnieniowy zbiornik 500 ml 250 ml wirówkowe Qiagen RLT z nakrętką 2 ml gzip

Bibliografia

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106(2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13(2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Odpowiedź drożdży na hipoksjęPomiar poziomu mRNAAnaliza RNA-seqEksperyment z przebiegiem czasowymHipoksja indukowana azotemEkstrakcja całkowitego RNAKonwersja do cDNATworzenie bibliotek multipleksowychSekwencjonowanie nowej generacjiAnaliza DESeq2
Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.