Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56228

⸱

6 października 2017

 , 
1Department of Chemistry, W.M. Keck Science Department of Claremont Mckenna, Pitzer, and Scripps College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Streszczenie

Dla każdego enzymu, wymagane są solidne, ilościowe metody do charakterystyki zarówno enzymów natywnych, jak i modyfikowanych. W przypadku polimeraz DNA syntezę DNA można scharakteryzować za pomocą testu syntezy DNA in vitro, a następnie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Celem tego testu jest ilościowe określenie syntezy zarówno naturalnego DNA, jak i zmodyfikowanego DNA (M-DNA). Podejścia te są szczególnie przydatne do rozdzielania oligonukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu, umożliwiając obserwację poszczególnych etapów podczas enzymatycznej syntezy oligonukleotydów. Metody te zostały zastosowane do oceny szeregu właściwości biochemicznych i biofizycznych, takich jak pomiar stałych szybkości w stanie ustalonym poszczególnych etapów syntezy DNA, wskaźnik błędów syntezy DNA i powinowactwo wiązania DNA. Stosując zmodyfikowane składniki, w tym między innymi zmodyfikowane trifosforany nukleozydów (NTP), M-DNA i/lub zmutowane polimerazy DNA, można skutecznie ocenić względną użyteczność par polimerazy substrat-DNA. W tym miejscu szczegółowo opisujemy sam test, w tym zmiany, które należy wprowadzić, aby dostosować się do nietradycyjnych strategii znakowania DNA starterowego, takich jak DNA znakowane fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni. Dodatkowo szczegółowo opisaliśmy kluczowe kroki techniczne dotyczące nalewania i uruchamiania żelu akrylowego, które często mogą być wyzwaniem technicznym.

Wprowadzenie

Polimerazy DNA przeprowadzają dokładną i wydajną syntezę DNA oraz są niezbędne do utrzymania integralności genomu. Zdolność do syntezy setek nukleotydów na sekundę bez popełniania błędów sprawia, że polimerazy DNA są również niezbędnymi narzędziami w biologii molekularnej i biotechnologii. Jednak właściwości te ograniczają również zastosowania substratów M-DNA; ogólnie rzecz biorąc, naturalne polimerazy DNA nie mogą syntetyzować wielu potencjalnie cennych substratów M-DNA, prawdopodobnie ze względu na wysoką presję selekcyjną przeciwko stosowaniu niestandardowych substratów in vivo. Wiele grup opracowało ukierunkowane podejścia ewolucyjne w celu wygenerowania zmutowanych polimeraz DNA zdolnych do syntezy M-DNA1a,2,3,4,5; Wysiłki te rozszerzyły biotechnologiczną użyteczność DNA6,7,8.

Aby ocenić zdolność zmutowanych polimeraz DNA do syntezy M-DNA, my9,10, a inni11,12,13 zazwyczaj używamy pomiarów in vitro aktywności polimerazy DNA, które są opisane w tym manuskrypcie. W tych eksperymentach polimerazy DNA są inkubowane jednocześnie z znakowanym dupleksem startera/matrycy i substratami trifosforanu nukleozydu; Produkty są oceniane za pomocą elektroforezy żelowej. W zależności od konkretnego pytania eksperymentalnego można stosować zmutowane polimerazy DNA, zmodyfikowane startery, zmodyfikowane matryce lub zmodyfikowane trifosforany nukleozydów, umożliwiające systematyczną biochemiczną ocenę aktywności zmutowanego enzymu.

Historycznie, te testy opierały się na radioaktywnym znaczniku 5' do śledzenia syntezy DNA; najczęściej stosowano 32P i 33P; zazwyczaj etykietowanie odbywa się za pomocą kinazy polinukleotydowej T411. Jednak ze względu na ograniczoną żywotność i stosunkowo wysoki koszt etykiet radioaktywnych oraz ich bezpiecznej utylizacji, nasza grupa zamiast tego używa syntetycznego 5' DNA znakowanego fluoroforem w bliskiej podczerwieni. Korzystając ze stosunkowo taniego żelowego imagera w bliskiej podczerwieni, zaobserwowaliśmy podobne granice wykrywalności jak w poprzednich badaniach z użyciem znaczników radioaktywnych (wyniki niepublikowane). Udało nam się odtworzyć wcześniejsze obserwacje9 i nie zaobserwowaliśmy żadnej dużej różnicy ilościowej w stosunku do wcześniej zmierzonych stałych szybkości (niepublikowane wyniki).

Aby przeanalizować rozmiar DNA, a tym samym zakres syntezy DNA, polegamy na metodach elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, opracowanych pierwotnie dla sekwencjonowania Sangera14 przed nadejściem elektroforezy kapilarnej15. Odległość separacji lub ruchliwości może być wykorzystana jako miara masy cząsteczkowej; Wielkoformatowe, pionowe żele poliakrylamidowe mogą osiągać rozdzielczość pojedynczego nukleotydu, umożliwiając ilościową obserwację oligonukleotydów DNA o różnej długości.

Podsumowując, te eksperymenty są solidną metodą charakterystyki polimerazy. Ze względu na wrażliwy na czas charakter reakcji, konieczne jest przygotowanie i pielęgnacja w celu osiągnięcia powtarzalnych wyników. Ponadto, chociaż żel akrylamidowy jest bardzo skutecznym sposobem pomiaru syntezy DNA, a także wielu innych reakcji modyfikujących DNA, z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu, może to być wyzwanie techniczne. Miejmy nadzieję, że ten protokół umożliwi użytkownikom przeprowadzanie tych eksperymentów, unikając przy tym najczęstszych błędów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Test aktywności

UWAGA: Istnieją dwa typowe typy testów, które często są przeprowadzane w celu scharakteryzowania polimeraz DNA przy użyciu metod opisanych tutaj. Różnią się one tym, czy jakościowo charakteryzują ogólną syntezę (obejmującą wiele etapów syntezy DNA), czy też ilościowo koncentrują się na poszczególnych etapach. Poniżej opisujemy niezbędne kroki dla każdego z nich.
UWAGA: Ponieważ montaż materiałów jest stosunkowo złożony, w przypadku eksperymentów, w których liczy się czas, zalecamy, aby wszystkie materiały zostały zmontowane wcześniej. Receptury wszystkich krytycznych składników testu są wymienione poniżej. Komercyjni dostawcy komponentów są wymienieni w Tabeli materiałów.

  1. 10x Receptura bufora SF (10x SFB)
    UWAGA: W naszych testach zazwyczaj używamy N-końcowego skrócenia polimerazy DNA I Thermus aquaticus, powszechnie znanego jako fragment Stoffela (SF)16,17. Poniższa reguła jest preferowanym buforem dla SF3,13. Inne mogą być podstawione w zależności od specyficznej polimerazy DNA.
    UWAGA: Końcowe stężenie składników buforu 10x SF to 500 mM Tris pH 8,5, 65 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA, 500 mM KCl (s) i woda ultraczysta. Pomiary dotyczą 1 ml buforu SF, co wystarcza na 100-200 testów, w zależności od skali. Bufor może być przechowywany przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C.
    1. Połącz 0,5 ml 1 M Tris, 65 μl 1 M MgCl2, 50 μl 10 mg/ml BSA i 0,0373 g KCl (s) w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 385 μl ultraczystej wody, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml.
  2. 1x Receptura bufora magazynowego (1x SB)
    UWAGA: Końcowe stężenie składników buforu 1x to 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 0,6 mM EDTA i 50% glicerolu. Przepis sprawia, że 20 ml 1x SB.
    1. Połącz 0,012 g naziemnej telewizji cyfrowej, 100 μl 0,5 M EDTA i napełnij stożkową probówkę o pojemności 50 ml 40 ml 100 mM Tris (pH 7,5), aby uzyskać 2xSB. Wymieszaj przez wirowanie.
    2. Przenieść 10 ml 2x SB do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć glicerolem, dodając 10 ml glicerolu do nowej stożkowej probówki.
  3. Przepis na pomarańczowy bufor hartowniczy (QBO)
    UWAGA: W przypadku stosowania etykiet radioaktywnych, użytkownicy często stosują błękit bromofenolowy i/lub cyjanol ksylenowy jako barwnik śledzący postęp elektroforezy. Jednak barwniki te będą słabo fluoryzować w obszarze bliskiej podczerwieni, zakłócając sygnał DNA. W związku z tym używamy Orange G zamiast nich dla wszystkich reakcji, które zawierają próbki. Chociaż stwierdziliśmy, że Orange G nadaje się do śledzenia ładowania żelem, stwierdziliśmy, że Orange G jest mniej spójny jako barwnik, który śledzi postęp elektroforezy; W związku z tym uruchamiamy puste pasy zawierające błękit bromofenolowy na zewnętrznych pasach żelu, które nie zawierają próbki, aby śledzić postęp żelu.
    1. Połącz 950 μl 95% formamidu z 25 μl 0,5 M EDTA i 25 μl ultraczystej wody. Dodaj 1 miarkę pomarańczowego barwnika G (~10 mg). Mieszać przez wirowanie.
      UWAGA: Formamid jest toksyczny; nosić środki ochrony osobistej (PPE), takie jak rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny, oraz utylizować jako odpady niebezpieczne.

2. Przebieg testu

  1. Charakterystyka jakościowa ogólnej aktywności
    UWAGA: W przypadku tego testu zazwyczaj utrzymujemy stałe stężenie M-NTP i zmieniamy czas. Celem jest ocena ogólnej charakterystyki białka, a nie pomiar poszczególnych etapów. Aby przygotować jedną reakcję, należy przygotować oddzielnie równą objętość dwóch oddzielnych składników, mieszaniny dupleksowej (opisanej w kroku 2.1.1) i mieszaniny dNTP (opisanej w kroku 2.1.2), a następnie połączyć, aby uzyskać końcową objętość 49 μl. Dodanie 1 μL 50x enzymu zainicjuje wtedy reakcję. Można przyjmować różne punkty czasowe; Zazwyczaj gaszimy po 0, 5, 15 i 60 minutach.
    1. Przygotowanie DNA duplex mix
      UWAGA: Mieszanka duplex składa się z 10x bufora SF, oligonukleotydu startera, oligonukleotydu matrycowego i ultraczystej wody. Całkowita objętość dodana do każdej reakcji wynosi 25 μl. 1 μl enzymu dodaje się do mieszanki wzorcowej bezpośrednio poprzedzającej rozpoczęcie doświadczenia.
      UWAGA: Do naszych testów zazwyczaj używamy 45-merowej matrycy i 18-merowego lub 23-merowego startera. Chociaż można użyć wielu różnych długości, zwykle używamy tej długości, ponieważ produkty (od 18 nukleotydów do 45 nukleotydów) można łatwo rozdzielić na poziomie pojedynczego nukleotydu przy użyciu opisanych protokołów elektroforezy żelowej. Ponieważ produkty oligonukleotydów zwiększają swoją długość, rozdzielenie produktów w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu może być trudne.
      UWAGA: W naszych eksperymentach używamy 5-calowej etykiety barwnika fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni na pasmie podkładu, aby obserwować produkty podkładowe. Kupujemy niestandardowe syntetyzowane oligonukleotydy z tą modyfikacją; Jednak etykieta ta może być włączona przy użyciu dowolnej liczby strategii etykietowania postsyntetycznego. Oligonukleotyd matrycowy nie jest znakowany, więc nie obserwuje się go za pomocą obrazowania żelowego. W przypadku obu oligonukleotydów przechowujemy oligonukleotydy w 100 μM w 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
      UWAGA: Ponieważ obserwujemy tylko starter, stosuje się dwukrotny nadmiar matrycy, aby zapewnić, że wszystkie startery (gatunki DNA, które są obserwowane) są wyżarzane do matrycy. Końcowe stężenie dupleksowe w tej reakcji wynosi 40 nM.
      UWAGA: Barwniki fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni są często nieco wrażliwe na światło; Jeśli to możliwe, podkład (i wszelkie roztwory zawierające podkład) pokrywamy folią. Dotyczy to również żelu poliakrylamidowego podczas jego pracy.
      UWAGA: Poniżej znajduje się reprezentatywny przykład syntezy 2'F M-DNA.
      1. Rozcieńczyć starter 1 i matrycę 1 (patrz tabela materiałów dla kolejności) do objętości 1 μM każdy w wodzie ultraczystej.
      2. Dla każdej reakcji testowej, w oddzielnych probówkach, połącz 5 μl 10x buforu SF, 2 μl 1 μM startera 1, 4 μL 1 μM matrycy 1 i 13 μL ultraczystej wody w probówkach kompatybilnych z termocyklerem.
      3. Wyżarzać dupleks w termocyklerze za pomocą następującego programu: 98 °C przez 2 min, 70 °C przez 5 min, 50 °C przez 5 min, 40 °C przez 5 min, utrzymywać w temperaturze 25 °C. Konkretny program może się różnić w zależności od temperatury wyżarzania dupleksu/szablonu. Zazwyczaj wolimy uwzględnić co najmniej jeden 5-minutowy krok w temperaturze wyżarzania, a następnie kolejny 5-minutowy krok w temperaturze 5 - 10 stopni poniżej temperatury wyżarzania.
    2. Przygotowanie 2x mieszaniny dNTP
      UWAGA: W zależności od eksperymentu możliwe jest użycie zmiennych dNTP i stężeń dNTP. Zazwyczaj w reakcji używamy 50 - 200 μM.
      1. Przygotować 25 μl roztworu zawierającego 100 μM każdego 2'F-NTP. Przechowuj M-NTP w odległości 100 mM.
    3. Przygotowanie 50x rozcieńczenia białka
      UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania enzymy należy przechowywać w temperaturze -20 °C w 1xSB. Po wyjęciu z zamrażarki w temperaturze -20 °C enzymy powinny być przechowywane na lodzie przez cały czas przed dodaniem do mieszanki wzorcowej. Rozcieńczenia enzymów powinny być codziennie przygotowywane świeżo ze skoncentrowanego wywaru. Skoncentrowany zapas enzymu należy natychmiast po użyciu umieścić z powrotem w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Ponieważ oceniamy przede wszystkim zmutowane polimerazy DNA, używamy tylko enzymów, które zostały wyrażone i oczyszczone w naszym laboratorium przy użyciu sprawdzonych metod9,10. W przypadku polimeraz zakupionych komercyjnie użytkownicy powinni uważać na optymalne dla różnych białek i ich kompatybilność z opisanymi w niniejszym dokumencie.
      UWAGA: Stężenia enzymów będą się różnić w zależności od eksperymentu. Tutaj pokazujemy reprezentatywny przykład syntezy 2'F-DNA.
      1. Aby uzyskać roztwór enzymatyczny o stężeniu 10 nM, rozcieńczyć 1 μl enzymu w 1x SB, aby uzyskać 50-krotne końcowe stężenie enzymu. Stężenie 50x roztworu powinno wynosić 500 nM. Na przykład, jeśli stężenie enzymu podstawowego wynosi 50 μM, dodaj 1 μl enzymu podstawowego do 99 μl 1x SB.
        UWAGA: Ponieważ enzym jest zwykle przechowywany w 50% glicerolu, roztwór jest dość lepki. Nawet w przypadku korzystania z bardzo dokładnych pipet nie zalecamy pipetowania mniej niż 0,5 μl, biorąc pod uwagę znaczenie dokładności i precyzji podczas rozcieńczania enzymów.
    4. Rozpoczęcie oznaczania
      1. Ustawić temperaturę suchej kąpieli na 50 °C.
      2. Dodać 24 μl wyżarzonej mieszanki duplex (patrz krok 2.1.1) do 25 μl 2x dNTP (patrz krok 2.1.2).
      3. Usunąć 9,8 μl mieszaniny z kroku 2.1.4.2 i dodać do 20 μl QBO (przepis znajduje się w sekcji 1.3). Podwielokrotność ta służy jako kontrola "bez enzymu" i powinna być otrzymywana dla każdej serii.
      4. Dodać 0,8 μl 50x enzymu (patrz krok 2.1.3.1) do mieszaniny duplex/dNTP. Pipetuj w górę i w dół za pomocą mikropipety o dużej objętości, aby dokładnie wymieszać.
      5. Po 5, 15 i 60 minutach wygasić reakcję, usuwając 10 μl każdego roztworu reakcyjnego i dodając do probówki mikrowirówkowej zawierającej 20 μl QBO (opisanej w sekcji 1.3).
      6. Po schłodzeniu reakcje mogą być przechowywane pod folią przez czas nieokreślony w temperaturze 4 °C lub -20 °C.
        UWAGA: W celu ilościowej charakterystyki poszczególnych etapów syntezy M-DNA można przeprowadzić bardzo podobny test w celu ilościowego uzyskania parametrów Michaelisa-Mentena. W tym teście wykorzystuje się wszystkie te same materiały. Parametry Michaelisa-Mentena można zmierzyć dla dNTP; w tym przypadku najważniejszą różnicą jest to, że zamiast dodawać mieszankę duplex do mieszanki dNTP, dodaje mieszankę duplex z enzymem do serii roztworów 2x dNTP. Podobnie parametry Michaelisa-Mentena można zmierzyć dla dupleksu DNA. Muszą być spełnione określone warunki, aby spełnić założenia potrzebne do zastosowania równania Michaelisa-Mentena. Te warunki i podstawowa mechanika testu są dobrze wyjaśnione w poprzednim artykule o metodach11.

3. Elektroforeza żelowa

UWAGA: Ponieważ nalewanie żelu jest wrażliwe na czas, wszystkie materiały są montowane wcześniej. Receptury wszystkich krytycznych składników testu są wymienione poniżej; dostawcy są wymienieni w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotowanie akrylamidu do żelu akryloamidowego 20%.
    UWAGA: Ten przepis zawiera 1 l mieszanki akrylamidu; Na żel zużywa się około 120 ml tego roztworu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej pod folią przez okres do jednego roku.
    UWAGA: Poliakryloamid jest neurotoksyczny. Ważne jest, aby nosić rękawice i fartuch laboratoryjny podczas wszystkich etapów nalewania żelu. Jeśli poliakrylamid dostanie się na rękawice, należy je natychmiast wymienić. Jeśli akryloamid nie jest polimeryzowany, należy umieścić zanieczyszczone materiały w oznakowanym worku na odpady poliakryloamidu.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano wstępnie zmieszany 40% akrylamid zawierający 38,67% akrylamidu i 1,33% bis-akrylamidu, aby uzyskać stosunek monomeru do sieciownika wynoszący 29:1.
    1. Odważyć 17 g wstępnie zmieszanego proszku KZM. Odważyć sześć oddzielnych porcji po 70 g mocznika (łącznie 420 g).
      UWAGA: Mocznik należy dodawać porcjami. Uważamy, że najlepiej podzielić go na sześć porcji.
    2. Ustaw plastikową zlewkę o pojemności 2 l na talerzu mieszającym. Dodaj jeden duży pręt mieszający do zlewki. Podczas mieszania przykryj zlewkę folią, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
    3. Dodać 500 ml 40% roztworu akrylamidu do zlewki. Upewnij się, że roztwór miesza.
    4. Dodać wcześniej zważone KZMS. Dodać jedną porcję mocznika. Pozostaw roztwór do wymieszania. Mocznik rozpuszcza się powoli i po pierwszym dodaniu może wydawać się mętny i biały. Powoli dodawaj pozostałe porcje mocznika do mieszaniny przez następną godzinę. Pozwól roztworowi mieszać się, aż stanie się całkowicie klarowny i bezbarwny.
      UWAGA: Zazwyczaj pozostawia się to na wymieszanie przez noc. Jeśli roztwór nadal się nie rozpuści, dodaj małe porcje wody i poczekaj, aż mocznik się rozpuści.
    5. Dodatek mocznika zwiększy objętość o blisko 1 l. Dodaj wodę, aby zwiększyć objętość dokładnie do 1 l.
    6. Przechowywać w butelce z przyciemnianego szkła o pojemności 1 l lub przykryć szklaną butelkę folią aluminiową.
  2. Nalewanie żelu akrylowego.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się ze szklanymi płytkami należy uważać, aby uniknąć kontaktu szklanych płytek z jakąkolwiek twardą powierzchnią. Jest to szczególnie ważne, ponieważ nieostrożne obchodzenie się z nim może spowodować małe pęknięcia szkła; Pęknięcia te mogą nie być widoczne, dopóki żel nie zacznie działać, co następuje w wyższej temperaturze. Używamy pierścieni korkowych, aby zapobiec temu niepożądanemu kontaktowi.
    1. Czyste talerze
      1. Zaopatrz się w dwie płytki żelowe o wymiarach 33 cm x 42 cm, jedną z karbem i jedną bez karbowania. Umieść talerze na oddzielnych pierścieniach korkowych.
      2. Dokładnie opłucz talerze wodą z mydłem. Upewnij się, że nie pozostały żadne smugi mydła ani plamy żelu.
      3. Zwróć uwagę, po której stronie talerza zlewa się mniej wody. Ta strona jest stroną skierowaną w stronę żelu.
        UWAGA: Jeśli żel zostanie uruchomiony po drugiej stronie płytki, może to utrudnić przenoszenie żelu.
    2. Suche talerze
      1. Użyj ręczników papierowych, aby wysuszyć obie strony każdego talerza.
      2. Użyj delikatnych wycieraczek roboczych, aby wysuszyć pozostałe obszary. Zwróć szczególną uwagę na krawędzie płyt, na które zostanie nałożona taśma.
      3. Opłucz szklane płytki ~70% etanolem i przetrzyj wycieraczkami roboczymi.
      4. Upewnij się, że nie ma włókien ręcznika papierowego ani kropelek wody. Mogą one powodować powstawanie pęcherzyków podczas nalewania żelu.
    3. Dodawanie odstępów
      1. Zaopatrz się w przekładki 0,75 mm. Przełóż palce w rękawiczkach pod wodą DI i delikatnie zwilż przekładki palcami w rękawiczkach.
      2. Umieść przekładki wzdłuż dłuższych krawędzi płyty z karbem. Oczyść wodę, która rozprysnęła się na resztę talerzy. Upewnij się, że przekładki są wyrównane ze szklaną płytą i nie zwisają z krawędzi.
    4. Żel uszczelniający
      1. Załóż suche rękawice. Ponownie osusz krawędzie szyby za pomocą delikatnych wycieraczek roboczych.
      2. Wyrównaj górną część blachy bez karbu nad blachą z karbem i powoli opuść, aby docisnąć blachy do siebie. Sprawdź ponownie, aby upewnić się, że krawędzie wszystkich blach są wyrównane.
      3. Za pomocą taśmy żelowej umieść taśmę na wszystkich krawędziach z wyjątkiem góry. Upewnij się, że taśma jest równomiernie wyrównana i szczelnie uszczelniona. Taśmę można nakładać jednym ruchem lub każdą stronę można wykonać indywidualnie. Odetnij końce taśmy brzytwą.
      4. Dodaj dodatkową warstwę taśmy na spód żelu. Im ciaśniejsza taśma, tym mniejsze prawdopodobieństwo, że żel wycieknie podczas nalewania.
      5. Przypnij boki szklanej kanapki białymi zaciskami. Dodaj 3 klipy z każdej strony i 4 klipsy na dole.
    5. Nalewanie żelu
      1. Przygotować 3 ml 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS), rozpuszczając 0,3 g nadsiarczanu amonu i rozcieńczając do 3 ml w wodzie ultraczystej.
        UWAGA: Na żel potrzeba 1,2 ml APS. Datuj tubę po jej wykonaniu. Roztwór APS traci ważność po 2 tygodniach i należy go przechowywać w temperaturze 4 °C.
      2. Przenieść 125 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do oddzielnej probówki do mikrowirówki.
        UWAGA: TEMED jest toksyczny; nosić środki ochrony osobistej, takie jak rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny podczas obsługi.
      3. Zdobądź butelkę ze spryskiwaczem i wyjmij spiczasty lejek. Odmierz 125 ml wody w cylindrze z podziałką i dodaj do butelki. Zaznacz poziom wody na zewnątrz butelki trwałym markerem. Wylej wodę. Ta zmodyfikowana butelka ze spryskiwaczem może być używana ponownie w nieskończoność przy odpowiednim czyszczeniu (patrz poniżej).
      4. Ustaw zakorkowane pierścienie obok zlewu, aby było miejsce na nałożenie żelu po jego wylaniu. Umieść tutaj kanapkę z talerzem. Umieść korek w zlewie, aby było miejsce, na którym można postawić talerze podczas nalewania żelu. Żel zostanie wlany do kanapki ze szklaną płytą pod kątem, tak aby spód spoczywał na korku, a góra spoczywała na krawędzi zlewu. Upewnij się, że pod tymi obszarami znajdują się podkładki na wypadek wylania się poliakrylamidu.
      5. Umieść roztwór APS i roztwór TEMED po drugiej stronie zlewu, razem z pustą butelką do spryskiwania. Umieść grzebień studzienki z żądaną liczbą studzienek z boku zlewu z talerzami. Umieść 4 zaciski w pobliżu.
        UWAGA: Następny krok w procedurze jest bardzo wrażliwy na czas. Przygotuj się na szybkie przejście przez te kroki. Istnieje ograniczona ilość czasu, aby mieszanina znalazła się między płytkami, zanim dojdzie do polimeryzacji. Wszystkie składniki (mikropipety ustawione na prawidłową objętość, roztwory, szklane płytki) są starannie ułożone, aby jak najszybciej nalać żel. Jeśli pożądana jest wolniejsza polimeryzacja, stężenia APS i TEMED można zmniejszyć o połowę; Będzie to jednak wymagało dłuższego czasu polimeryzacji.
      6. Wlej 20% roztwór żelu akrylowego do butelki ze spryskiwaczem do zaznaczonego punktu. Wlej trochę więcej roztworu żelu powyżej zaznaczonej linii, aby było wystarczająco dużo roztworu w przypadku małych wycieków. Jest to około 120 ml roztworu żelu.
      7. W tym samym czasie dodać 120 μl TEMED i 600 μl APS do roztworu żelu poliakrylamidowego w butelce ze spryskuwaniem. Szybko dodaj dodatkowe 600 μl APS do roztworu żelu poliakrylamidowego.
      8. Szybko zakręć butelkę ze spryskiwaczem i zawiruj. Umieść kanapkę z talerzem w zlewie.
      9. Rozpocznij nalewanie. Powinno to zająć tylko 1-2 minuty, aby uniknąć polimeryzacji. Powoli, ale systematycznie, zwiększaj ciśnienie w butelce ze spryskiwaczem, aby roztwór żelu wypłynął równomiernie. Jeśli roztwór zacznie nieregularnie rozpryskiwać się z butelki ze spryskiwaczem, zwolnij ciśnienie, aby butelka się napompowała, i wznów nalewanie. Obserwuj, aby upewnić się, że roztwór żelu pokrywa wszystkie obszary i nie przecieka z żadnej ze stron. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, zmień kąt nachylenia płyt. Bąbelki wyskoczą u góry i będą biegać szybciej, jeśli kąt będzie bardziej stromy. Kontynuuj nalewanie, aż roztwór dotrze do górnej części karbowanego obszaru i lekko przeleje się przez karbowaną krawędź. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza.
        UWAGA: Jeśli płyta warstwowa przecieka lub nie ma wystarczającej ilości roztworu żelu i roztwór nie dociera do górnej części płytek, żel nie może być użyty. Poczekaj, aż żel spolimeryzuje i odpowiednio oczyść.
      10. Dodaj grzebień do kanapki z talerzem. Umieść 4 zaciski na grzebieniu, aby docisnąć i umożliwić równomierne rozprowadzenie dołków.
      11. Pozostały roztwór żelu w butelce ze spryskiwaczem należy szybko wyrzucić do oznaczonych odpadów poliakrylamidowych. Wypłucz butelkę ze spryskiwaczem wodą DI 2-3 razy przez dyszę do spryskiwania.
        UWAGA: Ważne jest, aby wykonać to czyszczenie szybko, aby zapobiec zatykaniu się poliakrylamidu w butelce ze spryskiwaczem. Jeśli w dyszy dojdzie nawet niewielka ilość polimeryzacji, kolejny żel zostanie wlany zbyt wolno i nieskutecznie. Wyrzuć butelkę ze spryskiwaczem, jeśli nastąpi polimeryzacja.
  3. Uruchamianie żelu akrylowego
    1. Podczas polimeryzacji żelu należy wykonać 1x bufor do pracy TBE. Rozpuścić 17 g wstępnie zmieszanego KZM w 1 litrze ultraczystej wody. Potrząsać buforem, aż cały KZM się rozpuści.
    2. Usuń wszystkie spinki do segregatora z kanapki z talerzem.
    3. Użyj brzytwy, aby przeciąć taśmę i usuń taśmę ze wszystkich krawędzi kanapki z talerzem.
    4. Usuń cały spolimeryzowany żel z powierzchni szklanych. Użyj brzytwy wzdłuż krawędzi, aby zeskrobać pozostały żel. Wytrzyj talerze ręcznikami papierowymi i wodą, aby usunąć jak najwięcej pozostałości poliakryloamidu. Nadmiar akrylamidu i/lub taśmy może często ulec spaleniu podczas elektroforezy żelowej.
    5. Wyjmij grzebień studzienki, wypychając go równomiernie po obu stronach.
    6. Użyj brzytwy, aby odciąć nadmiar żelu wzdłuż górnej części kanapki z talerzem. Pokrój wzdłuż karbowanej krawędzi talerza.
    7. Użyj strzykawki i wody DI, aby przepłukać studnie i usunąć zanieczyszczenia ze studzienek. Upewnij się, że każda studzienka może być wypełniona wodą i nie jest zablokowana przez nadmiar spolimeryzowanego żelu.
    8. Umieść kanapkę z płytą w aparacie tak, aby dłuższa płyta była skierowana na zewnątrz, a przestrzeń z karbem była skierowana do wewnątrz.
    9. Dodaj klipsy, aby przypiąć płytę, płytkę warstwową i aluminiową razem z aparatem. Dodaj na zewnątrz talerza, aby zapewnić równomierny bieg.
    10. Dodaj bufor TBE, aby zakryć nacięcia podstawy i tylko tyle, aby zakryć studzienki u góry. Bufor KZM może być filtrowany i ponownie używany przez około 5 żeli.
    11. Podgrzewaj płytki przez 20 minut, uruchamiając elektroforezę żelową z mocą 50 W.
    12. Po podgrzaniu talerzy wyczyść studzienki. Użyj strzykawki i buforu KZM w kąpielach, aby wstrzyknąć pozostałe sole buforowe ze studzienek. Zrób to kilka razy, aby zapewnić czyste studnie. Jeśli studzienki nie są czyste, pasma będą się strzępić, a obraz nie będzie możliwy do zinterpretowania. Chociaż może to być czasochłonne, stwierdziliśmy, że jest to konieczne do uzyskania dobrych danych.
    13. Na najbardziej zewnętrzny pas ruchu po obu stronach odpipetować 5 μl 95% formamidu z błękitem bromofenolowym. Jest to ten sam roztwór co QBO, ale z błękitem bromofenolowym zamiast pomarańczy G. Zapewni to wizualizację, gdzie należy przeciąć żel do obrazowania i jak daleko w dół przebiegło DNA.
    14. Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie (wygenerowanej w sekcji 2.1.1), dodać 3 μl do pojedynczego dołka żelu. Po załadowaniu wszystkich próbek odczekaj 1 minutę, aż próbki się uspokoją.
    15. Załóż nakrętki zarówno na górną, jak i dolną plastikową wannę. Podłącz przewody do urządzenia. Kolor czerwony oznacza dodatni ładunek elektryczny, więc powinien znajdować się na dole, aby DNA biegło w dół.
    16. Podłącz przewody do źródła zasilania i ustaw na 50 - 55 W. Uruchom żel przez około 3 godziny lub do momentu, gdy czoło barwnika bromofenolowego spłynie co najmniej 2/3 w dół żelu.
  4. Obrazowanie żelu
    UWAGA: Ten żel jest niezwykle cienki i może być trudny w obsłudze. Należy zachować dużą ostrożność, aby zapobiec rozerwaniu i utracie całego żelu.
    UWAGA: W zależności od etykiety DNA może to wymagać użycia różnych obrazowania żelowego. Protokół ten wykorzystuje barwniki fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni, a obrazowanie próbek przeprowadzono na obrazie żelowym (patrz Tabela materiałów). Protokół jest napisany specjalnie dla tego imagera.
    1. Gdy front niebieskiego barwnika bromofenolowego spłynie co najmniej w 2/3 dół żelu (~ 28 cm), żel można zatrzymać, wyłączając zasilanie. Wyjmij żel z aparatu i umieść na pierścieniach korkowych.
    2. Oddziel płytki za pomocą małego separatora płyt klinowych. Umieść separator w wewnętrznym rogu nacięć, aby podciągnąć do góry. Zachowaj ostrożność i nie używaj nadmiernej siły; Nacięcia mogą pęknąć, jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk.
    3. Po zwolnieniu ssania między płytkami ostrożnie podnieś górną płytkę i określ, na której płytce znajduje się żel. Jeśli żel przyklei się do dolnej płytki, zdejmij górną płytkę i umieść na pierścieniu korkowym. Jeśli żel znajduje się na górnej płytce, która jest podnoszona, przesuwaj powoli, a żel może spaść z powrotem na dolną płytkę. Jeśli żel nie spadnie, ponownie poruszaj się powoli i wyciągnij pozostałą część żelu z dolnej płytki, a górną płytkę z żelem umieść na osobnym pierścieniu korkowym.
    4. Po rozdzieleniu płytek zobacz, gdzie znajduje się barwnik na żelu i usuń nadmiar żelu z góry i dołu żelu. Zazwyczaj w przypadku naszych konstruktów, wykorzystujących starter 18 lub 23 nukleotydów i matrycę 45 nukleotydów, nie ma DNA między przodem a dnem żelu niebieskiego barwnika bromofenolowego. Przetnij pionowo od barwnika do górnej części żelu. Przestrzenie między barwnikiem a krawędziami żelu również nie mają DNA. Na koniec przetnij kilka centymetrów poniżej przestrzeni studzienki na żelu. Na samej górze żelu nie ma kwasów nukleinowych.
      UWAGA: Pocięcie żelu do najmniejszego możliwego rozmiaru znacznie ułatwia jego przeniesienie na urządzenie do obrazowania. Jeśli żel jest zbyt duży, jest bardziej podatny na rozerwanie podczas przenoszenia. Chociaż często przycinamy żel przed obrazowaniem, zalecamy zachowanie szczególnej ostrożności podczas przycinania, ponieważ odpowiednie dane mogą zostać utracone, jeśli nie zostanie zachowana ostrożność. Aby sprawdzić, czy usunięte porcje zawierają dodatkowe dane, często wykonujemy dodatkowe skanowanie wyciętych części żelu, aby upewnić się, że żadne dane nie zostały utracone.
    5. Pokryj żel wodą, aby zapobiec wysuszeniu.
    6. Oczyść powierzchnię imagera. Za pomocą wycieraczek roboczych przetrzyj powierzchnię wodą i etanolem. Dodaj cienką warstwę wody do powierzchni, na której zostanie umieszczony żel.
    7. Przenieś żądaną porcję żelu na mokrą powierzchnię Li-Cor.
    8. Usuń pęcherzyki powietrza, delikatnie wyciskając je z żelu i przecierając wycieraczką zadaniową. Zachowaj ostrożność, ponieważ bardzo łatwo jest rozerwać żel, zbyt mocno dociskając pęcherzyki powietrza.
    9. Zobrazuj żel zgodnie z protokołami producenta. Przeanalizuj żel za pomocą dostępnego oprogramowania dla imagera.
    10. Podczas obrazowania żelu należy oczyścić przestrzeń roboczą, usuwając nadmiar żelu akrylamidowego, myjąc płytki i filtrując bufor TBE do ponownego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono wyniki poprawnej analizy żelowej z poliakryloamidu dla jakościowej charakterystyki ogólnej aktywności (opisanej w sekcji 2.1, Rycina 1) oraz kinetyki stanu stacjonarnego (opisanej w uwadze na końcu sekcji 2.1, Rycina 2>). Przedstawiono również przykład nieudanej analizy żelowej z poliakryloamidu (Rycina 3).

Należy zauważyć, że...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy test charakteryzujący syntezę M-DNA za pośrednictwem polimerazy DNA. Stosując znakowane w bliskiej podczerwieni startery DNA i elektroforezę w żelu poliakrylamidowym denaturującym w celu rozdzielenia oligonukleotydów o różnych rozmiarach, możemy uzyskać rozdzielczość pojedynczego nukleotydu na oligonukleotydach, umożliwiając precyzyjny pomiar syntezy. Podejścia te mogą być stosowane zarówno do pomiaru ogólnej aktywności enzymu (sekcja 2.1), jak i do pomiaru parametrów Michaelisa-Mentena w poszczególnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Research Corporation for Scientific Advancement (Cottrell College Scholar Award #22548) oraz przez TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tris HClPromegaH5123
Tris BasePromegaH5131
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
Acetylowany BSAPromegaPR-R3961
KClSigmaP4504
Ditiothreitol (tj. DTT)Research Products InternationalD11000
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (tj. EDTA) (roztwór 0,5M) Sigma03690-100mL
GlicerolSigmaG5516
FormamidAcrosAC42374-5000
Pomarańczowy GSigma AldrichO3756
Błękit bromofenolowyFisher Scientific50-701-6973
dNTPsFisher ScientificFERR0191
M-dNTP (ryboNTPs)Fisher Scientific45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (wszystkie inne zmodyfikowane NTP)TriLink Biotechnologiesassorted
primer 1IDT DNA / TriLink BiotechnologiesNiestandardowe syntezyUżywamy barwnika IR700, który można kupić jako niestandardową syntezę. Zazwyczaj kupujemy oligonukleotydy oczyszczone metodą HPLC. Sekwencja to 5'-dTAATACGACTCACTATAGGAGA, matryca
1IDT DNA / TriLink BiotechnologiesNiestandardowe syntezyZazwyczaj kupujemy oligonukleotydy oczyszczone metodą HPLC. Sekwencja to 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTCTATAGTGAGTCGTATTA
AcrylamideResearch Products InternationalA1140538,67% akrylamidu i 1,33% bis-akrylamidu
Tris/Boran/EDTA (TBE) stałeProdukty Badawcze MiędzynarodoweT22020
Mocznik ultraczystyProdukty badawcze MiędzynarodoweU20200
Taśma żelowaCBS ScientificGT-72-10
Duży biały zacisk sprężynowy polipropylenCBS ScientificGPC-0001
Nadsiarczan amonu (APS)Fisher ScientificBP179
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Fisher ScientificBP15020
Przekładki 0,75 mmCBS ScientificSGS-20-0740A
33x42 Zestaw płyt szklanych z karbemCBS ScientificSGP33-040A
Separator płytkowyklinowy CBS ScientificWPS-100
Grzebień do elektroforezy żelowejCBS ScientificSG33-0734
Urządzenie do elektroforezy żelowejCBS ScientificSG-400-33
wodaużywamy systemu Milli-Q firmy polimerazy
DNA MilliporePrzygotowujemy je w naszym laboratorium na podstawie opublikowanych protokołów.
ultraczysta

Bibliografia

  1. Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
  2. Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
  3. Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
  4. Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
  5. Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
  6. Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
  7. Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
  8. Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
  9. Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
  10. Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
  11. Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
  12. Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
  13. Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
  16. Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
  17. Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
  18. Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
  19. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  20. Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235(2016).
  21. Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fluorescencyjne DNA w bliskiej podczerwienitest syntezy DNAanaliza zmodyfikowanego DNAkinetyka stanu stacjonarnegotechnika wlewania eluprzygotowanie buforu TBEanaliza rozszerzenia primeraobrazowanie z rozdzielczo ci nukleotydow
Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.