Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dla każdego enzymu, wymagane są solidne, ilościowe metody do charakterystyki zarówno enzymów natywnych, jak i modyfikowanych. W przypadku polimeraz DNA syntezę DNA można scharakteryzować za pomocą testu syntezy DNA in vitro, a następnie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Celem tego testu jest ilościowe określenie syntezy zarówno naturalnego DNA, jak i zmodyfikowanego DNA (M-DNA). Podejścia te są szczególnie przydatne do rozdzielania oligonukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu, umożliwiając obserwację poszczególnych etapów podczas enzymatycznej syntezy oligonukleotydów. Metody te zostały zastosowane do oceny szeregu właściwości biochemicznych i biofizycznych, takich jak pomiar stałych szybkości w stanie ustalonym poszczególnych etapów syntezy DNA, wskaźnik błędów syntezy DNA i powinowactwo wiązania DNA. Stosując zmodyfikowane składniki, w tym między innymi zmodyfikowane trifosforany nukleozydów (NTP), M-DNA i/lub zmutowane polimerazy DNA, można skutecznie ocenić względną użyteczność par polimerazy substrat-DNA. W tym miejscu szczegółowo opisujemy sam test, w tym zmiany, które należy wprowadzić, aby dostosować się do nietradycyjnych strategii znakowania DNA starterowego, takich jak DNA znakowane fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni. Dodatkowo szczegółowo opisaliśmy kluczowe kroki techniczne dotyczące nalewania i uruchamiania żelu akrylowego, które często mogą być wyzwaniem technicznym.
Wprowadzenie
Polimerazy DNA przeprowadzają dokładną i wydajną syntezę DNA oraz są niezbędne do utrzymania integralności genomu. Zdolność do syntezy setek nukleotydów na sekundę bez popełniania błędów sprawia, że polimerazy DNA są również niezbędnymi narzędziami w biologii molekularnej i biotechnologii. Jednak właściwości te ograniczają również zastosowania substratów M-DNA; ogólnie rzecz biorąc, naturalne polimerazy DNA nie mogą syntetyzować wielu potencjalnie cennych substratów M-DNA, prawdopodobnie ze względu na wysoką presję selekcyjną przeciwko stosowaniu niestandardowych substratów in vivo. Wiele grup opracowało ukierunkowane podejścia ewolucyjne w celu wygenerowania....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Test aktywności
UWAGA: Istnieją dwa typowe typy testów, które często są przeprowadzane w celu scharakteryzowania polimeraz DNA przy użyciu metod opisanych tutaj. Różnią się one tym, czy jakościowo charakteryzują ogólną syntezę (obejmującą wiele etapów syntezy DNA), czy też ilościowo koncentrują się na poszczególnych etapach. Poniżej opisujemy niezbędne kroki dla każdego z nich.
UWAGA: Ponieważ montaż materiałów jest stosunkowo złożony, w przypadku eksperymentów, w których liczy się czas, zalecamy, aby wszystkie materiały zostały zmontowane wcześniej. Receptury wszystkich krytycznych składników testu są wymienione poniżej. Komercyjni ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiono wyniki poprawnej analizy żelowej z poliakryloamidu dla jakościowej charakterystyki ogólnej aktywności (opisanej w sekcji 2.1, Rycina 1) oraz kinetyki stanu stacjonarnego (opisanej w uwadze na końcu sekcji 2.1, Rycina 2>). Przedstawiono również przykład nieudanej analizy żelowej z poliakryloamidu (Rycina 3).
Należy zauważyć, że.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisaliśmy test charakteryzujący syntezę M-DNA za pośrednictwem polimerazy DNA. Stosując znakowane w bliskiej podczerwieni startery DNA i elektroforezę w żelu poliakrylamidowym denaturującym w celu rozdzielenia oligonukleotydów o różnych rozmiarach, możemy uzyskać rozdzielczość pojedynczego nukleotydu na oligonukleotydach, umożliwiając precyzyjny pomiar syntezy. Podejścia te mogą być stosowane zarówno do pomiaru ogólnej aktywności enzymu (sekcja 2.1), jak i do pomiaru parametrów Michaelisa-Mentena w poszczególnych .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Research Corporation for Scientific Advancement (Cottrell College Scholar Award #22548) oraz przez TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylowany BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Ditiothreitol (tj. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (tj. EDTA) (roztwór 0,5M) Sigma | 03690-100mL | ||
| Glicerol | Sigma | G5516 | |
| Formamid | Acros | AC42374-5000 | |
| Pomarańczowy G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Błękit bromofenolowy | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTP (ryboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (wszystkie inne zmodyfikowane NTP) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Niestandardowe syntezy | Używamy barwnika IR700, który można kupić jako niestandardową syntezę. Zazwyczaj kupujemy oligonukleotydy oczyszczone metodą HPLC. Sekwencja to 5'-dTAATACGACTCACTATAGGAGA, matryca |
| 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Niestandardowe syntezy | Zazwyczaj kupujemy oligonukleotydy oczyszczone metodą HPLC. Sekwencja to 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38,67% akrylamidu i 1,33% bis-akrylamidu |
| Tris/Boran/EDTA (TBE) stałe | Produkty Badawcze Międzynarodowe | T22020 | |
| Mocznik ultraczysty | Produkty badawcze Międzynarodowe | U20200 | |
| Taśma żelowa | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Duży biały zacisk sprężynowy polipropylen | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Nadsiarczan amonu (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| Przekładki 0,75 mm | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Zestaw płyt szklanych z karbem | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Separator płytkowy | klinowy CBS Scientific | WPS-100 | |
| Grzebień do elektroforezy żelowej | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Urządzenie do elektroforezy żelowej | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| woda | używamy systemu Milli-Q firmy polimerazy | ||
| DNA MilliporePrzygotowujemy je w naszym laboratorium na podstawie opublikowanych protokołów. |
Bibliografia
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
