Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56237

⸱

23 października 2017

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Oligodendrocyty mielinizujące sprzyjają szybkiemu rozprzestrzenianiu potencjału czynnościowego i przetrwaniu neuronów. Opisano tutaj protokół specyficznej dla oligodendrocytów ekspresji białek fluorescencyjnych w organotypowych wycinkach mózgu z późniejszym obrazowaniem poklatkowym. Ponadto przedstawiono prostą procedurę wizualizacji niebarwionej mieliny.

Streszczenie

Neurony polegają na izolacji elektrycznej i wsparciu troficznym oligodendrocytów mielinowych. Pomimo znaczenia oligodendrocytów, zaawansowanych narzędzi wykorzystywanych obecnie do badania neuronów, naukowcy zajmujący się oligodendrocytami tylko częściowo się zastanowili. Barwienie specyficzne dla typu komórki za pomocą transdukcji wirusa jest użytecznym podejściem do badania dynamiki żywych organelli. W artykule opisano protokół wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu poprzez transdukcję z wirusem związanym z adenowirusem (AAV) przenoszącym geny dla mitochondrialnych ukierunkowanych białek fluorescencyjnych pod kontrolą transkrypcyjną promotora białka zasadowego mieliny. Zawiera protokół tworzenia organotypowych wycinków mózgu myszy koronalnej. Następnie następuje procedura obrazowania poklatkowego mitochondriów. Metody te można przenieść na inne organelle i mogą być szczególnie przydatne do badania organelli w osłonce mielinowej. Na koniec opisujemy łatwo dostępną technikę wizualizacji niebarwionej mieliny w żywych wycinkach za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej (CoRe). CoRe nie wymaga dodatkowego sprzętu i może być przydatne do identyfikacji osłonki mielinowej podczas obrazowania na żywo.

Wprowadzenie

Istota biała mózgu składa się z aksonów komórek nerwowych owiniętych mieliną, wyspecjalizowaną przedłużoną błoną plazmatyczną utworzoną przez oligodendrocyty. Mielina jest niezbędna do szybkiej i niezawodnej propagacji potencjału czynnościowego i długoterminowego przeżycia mielinizowanych aksonów, a utrata mieliny może powodować dysfunkcję neurologiczną. Pomimo ich znaczenia, właściwości oligodendrocytów są mniej znane w porównaniu z neuronami i astrocytami. W związku z tym opracowano mniej narzędzi do badania oligodendrocytów.

Obrazowanie na żywo organelli komórkowych, takich jak mitochondria, retikulum endoplazmatyczne (ER) lub różne struktury pęcherzykowe, może być przydatne do badania dynamicznych zmian w organellach w czasie. Tradycyjnie, obrazowanie żywych oligodendrocytów przeprowadzono w monokulturach1,2. Jednak oligodendrocyty w monokulturze nie wykazują zwartej mieliny, a zatem organotypowe lub ostre wycinki mózgu mogą być lepszą opcją podczas badania lokalizacji i ruchu organelli. Lokalizacja małych organelli i białek w osłonce mielinowej może być trudna ze względu na niewielką odległość między mielinowym aksonem a otaczającą go osłonką mielinową. W związku z tym same procedury barwienia immunologicznego pod mikroskopem nie mają rozdzielczości przestrzennej, aby odróżnić organelle w osłonce mielinowej od tych w mielinizowanym aksonie. Można to rozwiązać poprzez transdukcję wirusa z genami białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na organelle, napędzanych przez promotory specyficzne dla typu komórki. Zaletą jest specyficzna dla komórki i rzadka ekspresja, która umożliwia dokładną ocenę lokalizacji i dynamiki organelli. Zwierzęta transgeniczne mogą być również wykorzystywane do osiągnięcia takiej ekspresji specyficznej dla komórek ukierunkowanej na organelle3. Jednak produkcja i utrzymanie zwierząt transgenicznych jest kosztowne i zwykle nie zapewnia rzadkiej ekspresji, którą można osiągnąć metodami wirusowymi.

Opisana tutaj metoda wykorzystuje transdukcję wirusową oligodendrocytów za pomocą mitochondrialnych białek fluorescencyjnych (dsred lub białka zielonej fluorescencji, GFP) napędzanych przez podstawowy promotor białka mieliny (MBP-mito-dsred lub MBP-mito-GFP) do wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu. Ponadto ekspresja innego białka fluorescencyjnego w cytoplazmie (GFP stosowanego razem z mito-dsred lub tdtomato stosowanego z mito-GFP) jest wykorzystywana w celu umożliwienia wizualizacji morfologii komórki, w tym przedziałów cytoplazmatycznych osłonki mielinowej. Protokół zawiera procedurę tworzenia organotypowych wycinków mózgu (zmodyfikowana wersja protokołu opisanego przez De Simoni i Yu, 20064,5). Następnie opisujemy procedurę obrazowania poklatkowego do badania ruchu mitochondriów. W tej procedurze wykorzystuje się pionowy mikroskop konfokalny z ciągłą wymianą podłoża obrazowego, konfigurację, która umożliwia łatwe stosowanie leków lub innych zmian podłoża podczas obrazowania. Procedurę obrazowania poklatkowego można wykonać na dowolnym mikroskopie konfokalnym, z dodatkowym sprzętem do konserwacji żywych plastrów, jak opisano poniżej. Protokół zawiera również kilka wskazówek dotyczących optymalizacji obrazowania i zmniejszenia fototoksyczności.

Na koniec, opisany jest szybki i prosty sposób wizualizacji niebarwionej mieliny za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej (CoRe). Może to być przydatne do identyfikacji osłonki mielinowej podczas obrazowania na żywo. W ostatnich latach opracowano kilka technik obrazowania mieliny bez konieczności barwienia, ale większość z nich wymaga specjalnego sprzętu i specjalistycznej wiedzy6,7,8. Opisana tutaj procedura wykorzystuje właściwości odblaskowe osłonki mielinowej i jest uproszczoną wersją mikroskopii spektralnej konfokalnej odbicia (SCoRe, w której kilka długości fal laserowych jest łączonych w celu wizualizacji mieliny)9. CoRe można wykonać na dowolnym mikroskopie konfokalnym, który jest wyposażony w laser 488 nm i filtr emisyjny pasmowo-przepustowy 470 - 500 nm lub przestrajalny filtr emisyjny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Norweski Urząd ds. Badań nad Zwierzętami. Dostawcy i numery katalogowe materiałów eksploatacyjnych i innych wymaganych urządzeń są dostępne w wykazie materiałów na końcu dokumentu.

1. Przygotowanie plastrów organotypowych

UWAGA: Ten przepis wykorzystuje dwa młode myszy w 7-9 dniu po urodzeniu (p7-9), które dają 24 organotypowe plastry podzielone na dwie sześciodołkowe szalki hodowlane. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnym kapturze i należy używać rękawiczek nitrylowych lub lateksowych. Należy stosować wyłącznie składniki przeznaczone do hodowli komórkowych.

  1. Butelki do autoklawu, narzędzia do preparowania (1 duże nożyczki, 1 małe nożyczki, 1 duża płaska szpatułka, 1 mała zaokrąglona i zaostrzona szpatułka oraz 1 kleszczyk, szczegółowe informacje znajdują się na liście materiałów), szklane pipety, końcówki do pipet i chusteczki higieniczne używane do przygotowania plastrów.
  2. Ponieważ połowa szklanych pipet powinna być używana z dużym otworem, oderwij wąską końcówkę.
    1. Naciąć pisakiem diamentowym (jeśli jest dostępny) wokół pipety tuż poniżej punktu, w którym szklanka zaczyna się zwężać. Następnie umieść spiczasty koniec pipety w rękawicy nitrylowej lub podobnej. Ostrożnie odłamać końcówkę, zginając pipetę, jednocześnie dociskając ją do stołu roboczego.
    2. Następnie stępić złamany koniec, pocierając kawałek papieru ściernego lub lekko stopić na palniku Bunsena. Złamane pipety służą do przenoszenia pociętych plasterków mózgu, przy czym złamany koniec jest zamieniony w gumową bańkę, a duży otwarty koniec dotyka roztworu/plasterków.
      UWAGA: Nie odbywa się to w sterylnym kapturze i można to zrobić z kilkudniowym wyprzedzeniem.
  3. Przygotuj potrawy kulturowe.
    UWAGA: Można to zrobić dzień przed krojeniem lub co najmniej 2 godziny przed krojeniem.
    1. Sterylizuj membrany z politetrafluoroetylenu (PTFE) ("konfetti"). Użyj dwóch sterylnych kleszczy, aby usunąć pojedyncze konfetti z otaczających niebieskich kawałków plastiku i wysterylizuj, zanurzając dwukrotnie na szalce Petriego zawierającej 96% etanolu (EtOH). Następnie połóż konfetti płasko na sterylnej dużej szalce Petriego do wyschnięcia.
      UWAGA: Konfetti to hydrofilowe membrany PTFE podobne do membran we wkładkach hodowlanych. Użycie konfetti wspomaga obrazowanie na żywo, ponieważ pojedyncze plasterki można łatwo przenieść z wkładki do zestawu mikroskopowego poprzez podniesienie konfetti za pomocą kleszczyków (szczegóły patrz 4.8). Alternatywnie, plastry mózgu można hodować bez konfetti (w którym plastry przyczepiają się bezpośrednio do membrany wkładki hodowlanej). W takim przypadku wkładkę membrany należy przeciąć skalpelem, aby przenieść plasterek do kąpieli mikroskopowej.
    2. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej (przepis w tabeli odczynników) do każdej studzienki sześciodołkowych szalek hodowlanych.
    3. Umieść jedną wkładkę hodowlaną w każdym dołku za pomocą sterylnych kleszczy. Unikaj pęcherzyków powietrza między wkładką a pożywką hodowlaną.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić pieniądze i środowisko, możliwe jest ponowne wykorzystanie wkładek hodowlanych. Można to zrobić poprzez dokładne płukanie w destylowanymH2O(dH2O), a następnie inkubację w 70% EtOH przez co najmniej 24 godziny aż do ponownego użycia. Przygotowując się do nowej hodowli, wysuszyć inserty na płytce do hodowli komórkowej w świetle ultrafioletowym (UV) przez 15-30 minut.
    4. Umieść dwa (wysterylizowane i suche) konfetti na każdej z wkładek hodowlanych. Umieść konfetti w kierunku krawędzi wkładek, aby zminimalizować zachodzenie na siebie.
    5. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  4. Zimne bąbelkowe podłoże preparacyjne (przepis w tabeli odczynników) z gazowym wodorotlenkiem (95% O2/5% CO2 ). Aby roztwór był sterylny, podłącz probówkę z butli z gazem do sterylnego filtra strzykawkowego (wielkość porów 0,22 μm).
    1. Podłącz drugi koniec filtra strzykawkowego do sterylnej rurki podłączonej do sterylnej szklanej pipety. Umieść szklaną pipetę w roztworze, przykryj parafilmem i włącz gaz. Utrzymuj podłoże preparacyjne na lodzie.
  5. Przygotuj obszar rozwarstwiania/krojenia.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby ta procedura była wykonywana w sterylnym kapturze. Jeśli nie jest to możliwe, wibratomium można pozostawić na stole warsztatowym. W takim przypadku zaleca się stosowanie siatki na włosy i maski na twarz.
    1. Za pomocą żyletki z pojedynczą krawędzią wytnij prostokątny kawałek (około 2 cm x 0,5 cm) żelu agarozowego (przepis w tabeli odczynników) i przyklej go do stolika wibratomu tak, aby dłuższy bok był skierowany w stronę ostrza wibratomu.
    2. Oczyść wszystkie powierzchnie i części wibratomu za pomocą 70% EtOH i przetrzyj autoklawowanymi chusteczkami do tkanek.
      UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie elementy, które będą miały kontakt z tkanką mózgową, były całkowicie suche, ponieważ EtOH może uszkodzić komórki.
    3. Przymocuj sterylną żyletkę do wibratomu i sprawdź wibracje, czy wibratom ma tę funkcję.
    4. Umieść autoklawowane narzędzia preparacyjne w kapturze razem z autoklawowanymi chusteczkami higienicznymi, czterema małymi szalkami Petriego, skalpelem o zaokrąglonych krawędziach, 2 szklanymi pipetami z gumowymi gruszkami, dwiema otwartymi szklanymi pipetami (patrz ppkt 1.1) i super klejem (spryskanym EtOH).
    5. Wlej bąbelkową pożywkę preparacyjną do łodzi wibratomicznej i do czterech małych szalek Petriego.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko bezpośrednio przed preparacją, ponieważ pożywka od tego momentu nie jest bąbelkowana ani trzymana na lodzie.
  6. Analizuj i montuj mózgi.
    UWAGA: Aby uzyskać zdrowe plastry, ten krok należy wykonać szybko i precyzyjnie. Potrzebna jest pewna praktyka.
    1. Poddaj zwierzę eutanazji #1 poprzez zwichnięcie szyi zgodnie z lokalnymi wytycznymi, a następnie odetnij głowę dużymi nożycami.
    2. Za pomocą małych, ostrych nożyczek szybko usuń skórę, wykonując strzałkowe nacięcie od szyi do nosa i odciągnij na bok, aby odsłonić czaszkę.
      1. Przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie boczne nacięcia nad wewnętrzną częścią kości czołowych i szwem lamboidalnym (granica między mózgiem a móżdżkiem).
      2. Użyj kleszczy, aby zgiąć czaszkę z każdej strony. Nerwy czaszkowe są odcinane od mózgu poprzez włożenie zaokrąglonej, ostrej szpatułki pod brzuszną stronę mózgu i delikatne przesuwanie szpatułki na boki.
    3. Użyj żyletki z pojedynczą krawędzią, aby wykonać koronalne cięcie rostralne do móżdżku.
      UWAGA: To cięcie określi kąt, pod jakim zostaną przycięte plasterki. Dlatego powinien być wykonany pod kątem prostym.
    4. Wyjmij mózg z czaszki i ułóż go na małej szalce Petriego zawierającej pożywkę do preparacji.
    5. Powtórz kroki 1.6.1. - 1.6.4. dla zwierzęcia #2 i umieść ten mózg na drugiej szalce Petriego.
      UWAGA: Zwierzęta nie są bezpłodne. Wykonaj sekcję po jednej stronie kaptura, a następnie przejdź na drugą, czystą stronę po usunięciu mózgu z czaszki.
    6. Zmień rękawiczki.
    7. Przymocuj mózg do sceny wibratomu: dodaj cienką warstwę super kleju do sceny tuż przed zamontowanym żelem agarozowym. Przytrzymaj mózg #1 dużą płaską szpatułką tak, aby świeżo ścięta (ogonowa) strona dotykała szpatułki, a strona brzuszna była skierowana (i była jak najbliżej) żelu agarozowego.
      1. Następnie delikatnie umieść mózg na kleju, spychając go ze szpatułki za pomocą zestawu kleszczy. Upewnij się, że zostawiłeś wystarczająco dużo miejsca na mózg #2.
        UWAGA: Ważne jest, aby mózgi były dobrze przymocowane do sceny, ale bez nadmiernego kleju, ponieważ może to utrudniać cięcie.
    8. Natychmiast po zamontowaniu mózgu #1 użyj dużej szpatułki, aby dodać kilka kropli pożywki preparacyjnej na wierzch mózgu. Dzięki temu mózg będzie wilgotny, utwardzi klej i zapobiegnie jego przyklejaniu się do boków mózgu.
    9. Powtórz kroki 1.6.7 i 1.6.8 dla mózgu #2.
    10. Przymocuj stolik do łodzi wibratomowej.
  7. Wytnij plastry koronalne o grubości 230 μm o amplitudzie 1 - 1,5 mm, częstotliwości 85 Hz i prędkości 0,2 mm/s. Zbierz plastry o grubości około 1,4 mm rostral i 2,1 mm ogonowo do Bregmy.
    1. Zebrać plastry po pokrojeniu każdego plasterka za pomocą otwartych szklanych pipet (pkt. 1.1). Przenieść plastry na szalkę Petriego zawierającą podłoże do preparacji. Użyj zaokrąglonego skalpela, aby pokroić plastry na dwie części, dzieląc dwie półkule.
  8. Gdy wszystkie plastry zostaną pokrojone, umieść je w naczyniach z kulturami.
    1. Wyjmij szalkę hodowlaną (pojedynczo) z inkubatora.
    2. Używając szklanych pipet z otwartym końcem, ostrożnie przenieś po jednym plasterku do każdego z konfetti.
      UWAGA: Plastry powinny leżeć płasko na środku konfetti. Wymaga to pewnych umiejętności. Jeśli jednak niektóre plastry nie są idealne, lepiej je zostawić, niż tracić czas na próby ich przeniesienia, ponieważ ważne jest, aby wszystkie plasterki zostały wprowadzone do inkubatora tak szybko, jak to możliwe.
    3. Użyj szklanej pipety (spiczasta końcówka), aby delikatnie usunąć nadmiar podłoża bez dotykania plasterka.
      UWAGA: Plastry nie powinny być zanurzane w płynie podczas inkubacji. W związku z tym nadmiar pożywki należy zassać tak, aby plastry były wystawione na działanie powietrza (cienka warstwa pożywki nadal będzie pokrywać plastry). Plastry, które pozostają zanurzone w płynie, zwykle są niezdrowe lub umierają (4 i nasze obserwacje).
    4. Przenieś naczynie z powrotem do inkubatora, gdy wszystkie konfetti będą miały jeden plasterek.
    5. Powtórz kroki 1.7.8. - 1.8.4. dla dania #2.
  9. Zmień pożywkę hodowlaną.
    UWAGA: Należy to zrobić dzień po pokrojeniu (dzień 1 in vitro, DIV1), a następnie co 2-3 dni.
    1. Podgrzej pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej lub w inkubatorze.
    2. W sterylnym kapturze użyj odsysania próżniowego lub zwykłej pipety ze sterylną końcówką, aby zassać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Odbywa się to poprzez delikatne przechylenie naczynia (o około 30 stopni) i umieszczenie końcówki pipety na krawędzi wkładu hodowlanego.
    3. Usuń około 800 μl z każdej studzienki (pozostawiając tylko tyle podłoża, aby dno wkładki było pokryte podłożem). Następnie, za pomocą czystej pipety, dodaj 800 μl podgrzanego podłoża do każdego dołka. Następnie umieść szalki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.

2. Transdukcja wirusa

  1. Kup lub stwórz AAV z plazmidem, który Cię interesuje, zgodnie z wcześniejszym opisem10,11.
    UWAGA: Protokół ten opisuje zastosowanie serotypu AAV 2/8 (AAV 2/8) przenoszącego mitochondrialny celowany dsred lub GFP jako gen reporterowy pod kontrolą transkrypcyjną promatora białka mielinowego podstawowego 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred lub AAV2/8 MBP_mito_GFP) do wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów. AAV 2/8 przenoszący GFP lub tdtomato jako gen reporterowy sterowany przez ogólny promotor CAG (AAV 2/8 CAG_GFP lub AAV 2/8 CAG_tdtomato) służy do wizualizacji cytoplazmy oligodendrocytów. Tak więc połączenie MBP_mito_dsred AAV2/8 z AAV 2/8 CAG_GFP daje czerwone mitochondria i zieloną cytoplazmę w oligodendrocytach, podczas gdy połączenie MBP_mito_GFP AAV2/8 i AAV 2/8 CAG_tdtomato daje zielone mitochondria i czerwoną cytoplazmę. Konstrukcje są opisane bardziej szczegółowo w innym miejscu13.
  2. W 7 dniu in vitro (DIV7) transdukować oligodendrocyty za pomocą AAV.
    UWAGA: Przestrzegaj przepisów bezpieczeństwa dotyczących pracy z AAV. Upewnij się, że masz odpowiednie szkolenie i wymagane jest zatwierdzenie poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie poniższe punkty należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przy użyciu rękawic i fartucha laboratoryjnego. Tutaj opisano zastosowanie AAV do obszaru kory mózgowej plastrów, ponieważ jest to obszar, który wykazuje najlepszą regenerację.
    1. Rozcieńczyć AAV w podgrzanej (37 °C) pożywce hodowlanej. Zaleca się rozcieńczenia około 2 × 109 kopii genomu/ml (GC/ml), aby uzyskać rzadką transdukcję oligodendrocytów, która umożliwia obrazowanie pojedynczych komórek w wycinku. Należy jednak przeprowadzić pilotaż z zastosowaniem różnych mian, aby zapewnić gęstość transdukowanych oligodendrocytów, która jest odpowiednia dla konkretnych eksperymentów. Jeśli używane są dwa różne AAV, należy je wymieszać w tym samym roztworze i jednocześnie dodać do plasterka.
    2. Dodaj około 1,3 μl rozcieńczonego AAV do każdej plastry: Upewnij się, że zewnętrzna strona końcówki pipety jest sucha. Odpipetować 1,3 μl rozcieńczonego AAV i trzymać pipetę nad korą mózgową, jak najbliżej, nie dotykając plasterka końcówką pipety (w odległości około 1 mm).
    3. Następnie powoli wypchnij roztwór z pipety. Gdy roztwór dotknie plasterka, przesuń końcówkę pipety po korze mózgowej, aby rozprowadzić roztwór na całym obszarze kory.
      UWAGA: Tę procedurę należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć trzymania plastrów poza kapturem dłużej niż to konieczne. Zrób to na jednym talerzu na raz i włóż pierwsze naczynie z powrotem do inkubatora przed rozpoczęciem na talerzu #2. Uzyskanie zadowalającej dystrybucji AAV bez uszkadzania tkanki wymaga pewnej praktyki i pewnej ręki.
  3. Jeśli w laboratorium komórkowym dostępny jest pionowy mikroskop fluorescencyjny, ekspresję białka można sprawdzić w czasie hodowli, umieszczając naczynie pod mikroskopem.
    UWAGA: Naczynie nie powinno być trzymane poza inkubatorem dłużej niż 2 - 5 minut.

3. Obrazowanie poklatkowe

UWAGA: Obrazowanie można przeprowadzić, gdy poziomy ekspresji markerów fluorescencyjnych są wystarczające, a wycinki wyglądają zdrowo (zwykle DIV11-14).

  1. Upewnij się, że mikroskop, perfuzja i ogrzewanie są prawidłowo ustawione, tak aby bąbelkowy roztwór do obrazowania był podgrzewany i mógł wchodzić i wychodzić z kąpieli.
    UWAGA: Istnieją różne rozwiązania dla komór kąpielowych. Prosta wersja jest przedstawiona tutaj.
    1. Wykonaj wchodzenie i wyloty wanny za pomocą igieł strzykawek (wygiętych pod kątem ~45°), które są przymocowane do boków wanny za pomocą kleju blu-tack/fun.
    2. Upewnić się, że rurka przechodzi z butelki z roztworem do obrazowania z ciągłym bąbelkami, przez pompę perystaltyczną, przez rurkę grzewczą jednostki grzewczej, a następnie do igły strzykawki wlotowej w kąpieli.
    3. Podłączyć kolejną rurkę do wylotu igły strzykawki. Rurka ta przechodzi następnie przez pompę perystaltyczną i wraca do butelki z roztworem do obrazowania (lub do butelki na odpady).
  2. Roztwór do obrazowania bąbelkowego (przepis w tabeli odczynników) z gazowym wodorotlenkiem.
    UWAGA: Powinno to rozpocząć co najmniej 15 minut przed obrazowaniem i kontynuować przez cały eksperyment.
  3. Włączyć pompę perystaltyczną i grzałkę, a następnie przepuścić roztwór przez kąpiel, aby uzyskać optymalną temperaturę kąpieli (37 ± 0,5 °C). Upewnij się, że czujnik termometru podłączony do jednostki temperatury jest zanurzony w roztworze kąpieli.
  4. Włącz mikroskop, lampę fluorescencyjną i odpowiednie lasery.
  5. Ustaw odpowiednią ścieżkę światła dla próbki.
    UWAGA: Będzie się to różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu i sondy. Ogólna wiedza na temat korzystania z mikroskopu konfokalnego jest wymagana i nie będzie tutaj omawiana.
  6. Użyj obiektywu do zanurzenia w wodzie o odpowiednim powiększeniu i aperturze numerycznej (nie dotyczy). Używamy obiektywu planapochromatycznego z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie (n.d. 1.0).
  7. Otwórz otwór, aby uzyskać przekrój optyczny około 2 - 2,5 μm dla filmu poklatkowego. Zmniejsza to występowanie mitochondriów przesuwających się poza ostrość podczas filmu poklatkowego.
  8. Przenieś plasterek organotypowy do kąpieli:
    1. Dodaj kroplę roztworu do obrazowania lub pożywki hodowlanej do małej plastikowej szalki Petriego.
    2. W sterylnym kapturze użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść jeden plasterek organotypowy z wkładki membranowej do kropli. Kleszcze powinny dotykać tylko konfetti, a nie plasterka.
    3. Przykryj szalkę Petriego pokrywką.
    4. Natychmiast umieść naczynie hodowlane zawierające resztę plastrów z powrotem w inkubatorze.
    5. Przynieś szalkę Petriego zawierającą plasterek do mikroskopu.
    6. Wyłączyć pompę perystaltyczną podczas przenoszenia plastra do kąpieli mikroskopowej. Najpierw użyj kleszczy, aby podnieść konfetti z plasterkiem z szalki Petriego na wierzch wanny (konfetti będzie się unosić). Następnie umieść dwie końcówki kleszczy po obu stronach konfetti tak, aby dotykały konfetti bez dotykania plasterka, i przepchnij konfetti przez roztwór na dno wanny. Wyśrodkuj konfetti na środku wanny.
    7. Użyj kleszczy, aby umieścić kotwicę przytrzymującą (harfę) na wierzchu konfetti, nie dotykając plasterka.
      UWAGA: Harfa to platynowa kotwica w kształcie podkowy, która służy do zapobiegania unoszeniu się lub dryfowaniu plastra w wannie. W przypadku ostrych plastrów cienkie struny biegną z jednej strony harfy na drugą (przypominając harfę muzyczną). W przypadku plastrów organotypowych harfa powinna być bezsznurkowa i dopasowana do rozmiaru konfetti w taki sposób, aby mogła leżeć na wierzchu konfetti bez dotykania plasterka.
    8. Ponownie włącz pompę perystaltyczną.
  9. Opuścić obiektyw w dół do próbki.
  10. Wybierz komórkę i region do obrazu.
    UWAGA: Unikaj nadmiernej ekspozycji komórek na światło laserowe, ponieważ może to spowodować toksyczność komórek (patrz wskazówki w poniższych punktach).
    1. Użyj okularów i świetlówki, aby znaleźć zdrowo wyglądający oligodendrocyt o prawidłowym wyrazie. Zazwyczaj oligodendrocyty, które mają silną nadekspresję białka fluorescencyjnego, wydają się niezdrowe. Niezdrowe oligodendrocyty będą miały procesy o wyglądzie blobby, a mitochondria będą wyglądały na pofragmentowane. W zdrowych oligodendrocytach soma i procesy wydają się gładkie, a mitochondria mają różną długość (choć zwykle znacznie krótszą niż w neuronach i astrocytach13,14,15).
    2. Umieść interesującą Cię komórkę na środku pola widzenia.
    3. Użyj funkcji "na żywo" w oprogramowaniu (dla mikroskopów Leica i Zeiss), aby zidentyfikować komórkę na ekranie i wybrać obszar zainteresowania, np. część komórki, która zawiera kilka procesów pierwotnych lub osłonek mielinowych, lub pojedynczy proces lub osłonkę mielinową.
      UWAGA: Aby móc zobrazować jak najwięcej procesów/osłon, wybierz obszary zawierające procesy, które leżą względnie płasko w kierunku x-y.
    4. Powiększ pole zainteresowania (zwykle tworząc obraz o rozmiarze piksela 0,14 - 0,30 μm).
    5. Za pomocą narzędzia "regiony" narysuj prostokąt wokół obszaru i wybierz opcję skanowania tylko wybranego regionu. Czas skanowania, a co za tym idzie ekspozycja lasera, jest skracany przez skanowanie tylko wybranego obszaru.
      UWAGA: Prostokątne obszary poziome będą skanowane szybciej niż regiony pionowe ze względu na mniejszą liczbę potrzebnych zeskanowanych linii. Jeśli skanowany jest pionowy obszar prostokątny, czas skanowania można skrócić, obracając pole skanowania o 90 stopni (za pomocą narzędzia do obracania).
  11. Dostosuj moc i wzmocnienie lasera, aby uzyskać dobry widok na mitochondria.
    UWAGA: Użyj minimalnej wymaganej mocy lasera. Jeśli to możliwe, zwiększaj wzmocnienie, a nie moc lasera. Oprócz powodowania toksyczności komórek, zbyt wysoka moc lasera z czasem wybiela obrazowane obiekty, co wymaga dalszego zwiększenia mocy lasera lub wzmocnienia podczas skanowania. Wymagana moc i wzmocnienie lasera będą zależeć od poziomu ekspresji i mikroskopu. W mikroskopie konfokalnym LSM700 do obrazowania DSRED lub tdtomato używamy lasera o długości fali 555 nm i mocy 20-40 μW, a do obrazowania GFP (moc lasera mierzona na tylnej aperturze obiektywu) wykorzystuje się laser o długości fali 488 nm o mocy 20 - 30 μW. Wzmocnienie jest ustawione na wysokim poziomie dla obrazowania na żywo, zwykle w zakresie 700 - 800 dla GFP i 850-980 dla dsred i tdtomato. Wysokie wzmocnienie może powodować więcej szumów tła, które są usuwane przez zwiększenie przesunięcia cyfrowego (wartości przesunięcia zwykle mieszczą się w zakresie od 0 do 15). Z naszego doświadczenia wynika, że użycie MBP_mito_GFP daje lepszy stosunek sygnału do szumu niż MBP_mito_dsred.
  12. Wybierz prędkość skanowania.
    UWAGA: Zminimalizuj czas skanowania, korzystając z dużej szybkości skanowania i rysując mały obszar skanowania (patrz punkt 4.10.5 poniżej). Możliwe jest również zaoszczędzenie czasu skanowania poprzez wykonanie skanowania dwukierunkowego. Nie jest to jednak zalecane ze względu na gorszą jakość obrazu.
  13. Ustaw częstotliwość i czas trwania nagrywania poklatkowego, np. rób obrazy co 2 sekundy przez łącznie 20 minut w celu obrazowania mitochondriów w oligodendrocytach.
    UWAGA: Częstotliwość i czas trwania należy ustawić zgodnie z ruchliwością obiektów zainteresowania. Wyższa częstotliwość wystawi próbkę na działanie większej ilości światła laserowego, ale szybciej poruszające się obiekty wymagają również krótszego całkowitego czasu trwania filmów poklatkowych (np. mitochondria w neuronach, które poruszają się częściej i ze znacznie większą prędkością niż mitochondria w oligodendrocytach, są zwykle obrazowane co sekundę przez łącznie 2 minuty16).
  14. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe.
    UWAGA: Mitochondria mogą tracić ostrość i/lub dryfować poza obrazowany obszar podczas nagrywania. Aby zminimalizować wibracje i ruch, wyreguluj wloty i wyloty wanny i w razie potrzeby zmniejsz prędkość pompy. Zwykle nadal występują niewielkie zmiany ostrości. W związku z tym wymagane jest ciągłe monitorowanie ekranu podczas obrazowania, z niewielkimi korektami ostrości podczas nagrywania.
  15. Uchwyć stos Z całej komórki w celu przyszłej identyfikacji komórki i zobrazowanego procesu.
    UWAGA: Aby uzyskać lepszą rozdzielczość, otwór otworkowy należy zresetować do 1 przewiewnej jednostki dla stosu z.
  16. Opcjonalnie: Wizualizacja niebarwionej mieliny.
    UWAGA: W oligodendrocytach transdukowanych (cytoplazmatycznym) GFP, osłonki mielinowe można zwykle zidentyfikować jako proste linie cytoplazmy (grzbiety cytoplazmatyczne) połączone z procesem pierwotnym (patrz Rysunek 2 A i B). Jeśli jednak ekspresja GFP jest zbyt słaba lub nie stosuje się markera cytoplazmatycznego, możliwe jest uwidocznienie osłonki mielinowej za pomocą konfokalnej mikroskopii odbicia (CoRe), jak wyjaśniono tutaj.
    1. Ustaw nową ścieżkę światła w oprogramowaniu ze wzbudzeniem laserowym przy 488 nm i wychwytuj emitowane światło o tej samej długości fali, np. 470-500 nm.
    2. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie, aż mielina będzie widoczna (patrz przykład w Rysunek 3). Używając mikroskopu LSM 510 Meta, zwykle używamy mocy lasera 7 - 12 μW (mierzonej na tylnej aperturze obiektywu).
  17. Opcjonalnie: przygotowanie plastrów do barwienia immunologicznego.
    1. Jeśli obrazowana komórka musi zostać zidentyfikowana po barwieniu immunologicznym, uchwyć obraz komórki w małym powiększeniu (10x) i wskaż jej lokalizację na obrazie, rysując strzałkę lub coś podobnego. Aby ułatwić wykrycie komórki, zaleca się również ręczne narysowanie mapy całego wycinka, wskazującej lokalizację komórki.
    2. Utrwal plasterek w 4% paraformaldehydzie (PFA) na shakerze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: PFA jest szkodliwy. Używaj odzieży ochronnej i używaj tylko w wentylowanym kapturze.
    3. Rozcieńczyć utrwalacz w stosunku 1:10 w PBS i pozostawić w temperaturze 4°C do momentu rozpoczęcia immunohistochemii, jak opisano w innym miejscu17.
      UWAGA: Chociaż plastry można pozostawić w rozcieńczonym utrwalaczu na kilka tygodni, fluorescencja może wyblaknąć. Zaleca się wykonanie immunohistochemii w ciągu 10 dni od utrwalenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Organotypowe skrawki mózgu, które były hodowane i transdukowane zgodnie z powyższym opisem, wykazały rzadki rozkład oligodendrocytów korowych wykazujących ekspresję mito_dsred i GFP. Immunobarwienie z użyciem przeciwciał przeciwko Olig2 i MBP potwierdziło, że ekspresja była specyficzna dla oligodendrocytów (Rycina 1).

W przypadku obrazowania żywych komórek, przetransdukowane oligodendrocyty rozpozna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół tworzenia kultur organotypowych jest zmodyfikowaną wersją18 protokołu opisanego przez De Simoni i Yu (2006)5. Najważniejsze zmiany zostały przedstawione poniżej. Bufor Tris jest dodawany do pożywki hodowlanej, co poprawia przeżywalność wycinków poza inkubatorem podczas transdukcji wirusa i zmiany pożywki komórkowej. Zmianie uległa również procedura sterylizacji konfetti. Podczas gdy inne protokoły sterylizują konfetti przez autoklawowanie, nie zalecam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Lindzie Hildegard Bergersen i Magnarowi Bjøråsowi za dostęp do laboratorium komórkowego i sprzętu, pracownikom Janelia Molecular Biology Shared Resource do produkcji plazmidów i wirusów oraz Koenowi Vervaeke za pomoc w pomiarach mocy lasera. Prace te zostały sfinansowane przez Norweskie Stowarzyszenie Zdrowia, Norweską Radę ds. Badań Naukowych, a sprzęt mikroskopowy został sfinansowany przez Norbrain.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza Sigma A9539
BD Microlance 19GBD301500Igły do wchodzenia i wylotu kąpieli
Gaz wodorotlenkowyAGA105701
Żarówki do pipet markiSigma-AldrichZ615927
Palnik Bunsena (palnik na ciekły propan)VWR89038-530
Zespół kablowy do sterowników grzałkiWarner Instruments64-0106 Regulator temperatury - część termometru
CaCl2Fluka21100
CO2 AGA100309CO2 do inkubatora
Szkło osłonowe, kwadratowe CorningThermo  Fischer Scientific13206778Do mocowania pod wanną w celu obrazowania na żywo. Uszczelnij klejem lub wazeliną.
D-(+)-GlucoseSigmaG7021
Delikatne kleszczeFinescience11063-07Do preparacji
Diamentowe pióro do rysowaniaTed Pella Inc.54463
Jednorazowe szklane pipety Pasteura 230 mmVWR612-1702Pipety szklane
Dwustronna żyletka ze stali nierdzewnejMikroskopia elektronowaSciences#7200Żyletka do wibratomu
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
Krążki z bibuły filtracyjnejSchleicher & Schuell300,220Bibuła filtracyjna służąca do filtracji PFA
Fun tackLoctite1270884Służy do podłączania/regulacji położenia wlotów i odpływów w wannie
Ręcznik do rąk C-Fold 2Katrin344388
Harfa, płaska do komory RC-41,WarnerInstruments  64-1418Harfa do przytrzymywania konfetti w kąpieli. Przed użyciem odetnij sznurki z plastrami organotypowymi. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir, Model 1.2Heto-Holten96004000MKaptur z przepływem laminarnym
Surowica końska, inaktywowana termicznieGibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
LCR Membrana, PTFE, MiliporeFHLC0130Konfetti 
Leica VT1200Leica14048142065Vibratome
MEM-Glutamax z HEPESThermo  Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Mikro łyżka Heyman Typ BMikroskopia elektronowa Sciences62411-BMała, zaokrąglona szpatułka z zaostrzonym końcem do rozwarstwienia
Jednostka filtrująca Millex-GPMilliporeSLGPM33RAFiltr strzykawkowy
Millipore Wkład do hodowli komórek milikomórkowych, 30 mmMilliporePICM03050Wkładki do hodowli komórkowych
Moduł sterowania prędkością Minipuls 3GILSONF155001Pompa perystaltyczna do obrazowania na żywo - Część modułu sterującego (podłączyć do głowicy dwukanałowej)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon Delta SurfaceThermo  Fischer Scientific140675Płytka hodowlana
Zawiesina nystatynySigma-AldrichN1638
Obiektyw W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC Zeiss441452-9900-000 Obiektyw do zanurzenia w wodzie używany do obrazowania na żywo. (WD=2.5mm), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldehyd, granulowanamikroskopia elektronowa Sciences#19208
Komora perfuzyjna PC-RSiSkiYou  15280000EKąpiel do obrazowania na żywo
Penicylina-Streptomycyna, płynInvitrogen15070-063
Szalka Petriego 140 mm Heger1075Duża szalka Petriego 
szalka Petriego 92x16 mm Sarstedt 82.1473Średnia szalka Petriego 
Petridish 55x14,2 mmVWR391-0868Mała szalka Petriego
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP4417Tabletki PBS
R2 Dwukanałowa głowica GILSONF117800Pompa perystaltyczna do obrazowania na żywo - Dwukanałowa część głowicy (wymaga modułu sterującego)
Szpatułki okrągłe/płaskie, stal nierdzewnaVWR82027-528Duża szpatułka do rozwarstwiania
Papier ściernyVWRMMMA63119Opcjonalnie, do wygładzania potłuczonego szkła Pipety
Nożyczki,  17,5 cmFinescience14130-17Duże nożyczki do preparacji
Nożyczki, 8,5 Finescience14084-08Małe, ostre nożyczki do  preparowania
Pojedyncza krawędź, ostrze klejnotuMikroskopia elektronowa Nauki#71972Żyletka z pojedynczą krawędzią
Pojedynczy podgrzewacz roztworu w linii SH-27BWarner Instruments64-0102Regulator temperatury - część grzewcza
Steritop-GP Jednostka filtrująca, 500 ml, 45mmMilliporeSCGPT05REFiltr do sterylizacji
rozwiązania Super klej precyzyjnyLoctite1577386
Ostrze skalpela chirurgicznego nr 22Swann Morton Ltd.209Zaokrąglone ostrze skalpela
Regulator temperatury TC324BWarner Instruments64-0100Regulator temperatury do obrazowania na żywo (wymaga grzałki roztworu i montażu)
Baza TrizmaSigma T1503
Trizma HClSigmaT3253
Inkubator z płaszczem wodnym seria IIForma Scientific78653-2882Inkubator

Bibliografia

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mitochondria oligodendrocyt wtransdukcja AAVobrazowanie mitochondri wpodstawowe bia ko mielinyrejestracja time lapserefleksja konfokalnadostarczanie wektor w wirusowychekspresja bia ek fluorescencyjnych
Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.