Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Postępy w mikroskopii fluorescencyjnej i biologii komórki są ściśle ze sobą powiązane, a zwiększona zdolność do wizualizacji zdarzeń komórkowych często prowadzi do dramatycznych skoków w naszym zrozumieniu funkcjonowania komórek. Rozwój i dostępność mikroskopii superrozdzielczej znacznie rozszerzyły granice rozdzielczości optycznej z ~250-20 nm. Biolodzy nie są już ograniczeni do opisywania oddziaływań molekularnych w kategoriach kolokalizacji w ograniczonym obszarze dyfrakcji, ale teraz możliwe jest wizualizacja dynamicznych oddziaływań poszczególnych cząsteczek. W tym miejscu przedstawiamy protokół wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych za pomocą mikroskopii zubożenia w stanie podstawowym do obrazowania komórek stałych. Podajemy przykłady z dwóch różnych białek błonowych, elementu translokonu retikulum endoplazmatycznego, sec61β i zlokalizowanego w błonie plazmatycznej, bramkowanego napięciem kanału Ca2 + typu L (CaV1.2). Omówiono konkretne parametry mikroskopu, metody fiksacji, formułę bufora foto-przełączającego oraz pułapki i wyzwania związane z przetwarzaniem obrazu.
Wprowadzenie
Reakcje sygnalizacji komórkowej przekształcają zmieniające się środowisko wewnętrzne i zewnętrzne, aby zainicjować odpowiedź komórkową. Regulują wszystkie aspekty fizjologii człowieka, służąc jako podstawa uwalniania hormonów i neuroprzekaźników, bicia serca, widzenia, zapłodnienia i funkcji poznawczych. Zakłócenie tych kaskad sygnałowych może mieć poważne konsekwencje w postaci stanów patofizjologicznych, w tym raka, choroby Parkinsona i Alzheimera. Przez dziesięciolecia badacze biologiczni i medyczni z powodzeniem wykorzystywali białka fluorescencyjne, sondy i bioczujniki w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną jako podstawowe narzędzia do zrozumienia precyzyjnej....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Mycie szkiełek nakrywkowych
- Dzień przed przetworzeniem próbki należy oczyścić szkiełka nakrywkowe #1,5 metodą sonikacji w 1 M roztworze KOH przez 1 godzinę. Usuwa to wszelkie zanieczyszczenia fluorescencyjne, które mogą być obecne na szkiełkach nakrywkowych.
- Dokładnie spłucz KOH z szkiełek nakrywkowych wodą dejonizowaną.
- Po oczyszczeniu w KOH szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w 70% etanolu, aż będą gotowe do użycia.
2. Powlekanie szkła nakrywkowego
UWAGA: Kroki opisane w tej sekcji powinny być wykonywane w kapturze do hodowli komórkow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak opisano we wstępie, istnieje wiele różnych modalności obrazowania mikroskopowego o nadrozdzielczości. Niniejszy protokół koncentruje się na obrazowaniu o nadrozdzielczości metodą GSD. Reprezentatywne obrazy oraz mapy lokalizacji przedstawiono na Rysunku 2 i Rysunku 3.
Rysunek 2 przedstawia komórkę COS-7 przetransfekowaną białkiem ER, mC.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niedawna eksplozja technologii, które umożliwiają obrazowanie poza granicą dyfrakcji, stworzyła nowe możliwości wglądu w złożoność sygnalizacji komórkowej ssaków w przestrzeni i czasie. Technologie te obejmują STORM, STED, PALM, GSD, SIM i ich warianty (np. dSTORM, FPALM). Pomysłowość naukowców stojących za tymi technikami pozwoliła nam obejść ograniczenia narzucone przez prawa fizyki rządzące dyfrakcją światła. Pomimo tego ogromnego osiągnięcia, każda z tych technik idzie na pewien kompromis, aby osiągnąć super.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem od AHA dla R.E.D. (15SDG25560035). Autorzy pragną podziękować dr Fernando Santanie za użycie mikroskopu 3D Leica SR GSD oraz dr Johannesowi Hell za uprzejme dostarczenie przeciwciała FP1.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | Do czyszczenia szkła nakrywkowego |
| #1.5 szkło nakrywkowe 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | Do wzrostu/przetwarzania/obrazowania komórek |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Rozcieńczony do 1x wodą dejonizowaną |
| Poly-L-Lizyna | Sigma | P4832 | Wspomaga adhezję komórek do pokrywania szklanej |
| lamininy | Sigma | 114956-81-9 | Wspomaga adhezję komórek do szkła pokryciowego |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Pożywki do hodowli miocytów komorowych |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Pożywka do hodowli komórkowych |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media suplement |
| Penicylina/streptomycyna | Sigma | P4333 | Media suplement |
| 0,05% trypsyna-EDTA | Corning | 25-052-CL | Roztwór do hodowli komórkowych |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Przejściowy odczynnik do transfekcji |
| bez Ca2+ PBS | Gibco | 1419-144 | Hodowla komórkowa |
| 100% metanolu | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Utrwalanie komórek |
| Paraformaldehyd | Elektron Mikroskopia Sciences | 15710 | Utrwalanie komórek |
| Aldehyd glutarowy | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Utrwalanie komórek |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA lub inne alternatywne rozwiązanie blokujące |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent do przepuszczalności komórek |
| Królik anty-CaV1.2 (FP1) | Prezent | N/A | Istnieją komercyjne przeciwciała anty-CaV1.2, takie jak Alomone Labs Rb anty-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mysz monoklonalna anty-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Przeciwciało pierwszorzędowe |
| Alexa Fluor 647 donket anty-królicze IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Alexa Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Azydek sodu | Sigma | S2002 | Zapobiega rozwojowi drobnoustrojów w celu długotrwałego przechowywania próbek |
| Katalaza | Sigma | C40 | Składnik bufora fotoprzełączającego |
| Oksydaza glukozowa | Sigma | G2133 | Składnik buforowy fotoprzełączający |
| Tris | Sigma | T6066 | Składnik buforowy fotoprzełączający |
| chlorowodorek beta-merkaptoetyloaminy | Fisher | BP2664100 | Składnik buforowy fotoprzełączający |
| i beta;-merkaptoetanol | Sigma | 63689 | Składnik buforu fotoprzełączającego |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Składnik buforowy fotoprzełączający |
| Dekstroza | Fisher | D14-212 | Składnik buforowy fotoprzełączania |
| Szkiełka wgłębieniowe | Neolab | 1 – 6293 | Do montażu próbek |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | Do uszczelniania szkła nakrywkowego |
| sec61β- Plazmid mCherry | Addgene | 49155 | |
| Mikroskop 3D Leica SR GSD | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Roztwór | 20 % SEAblock w PBS | ||
| Pierwszorzędowy roztwór | 0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, w PBS | ||
| Wtórny roztwór | do inkubacji przeciwciał1:1000 w PBS |
Bibliografia
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
