Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56239

⸱

5 listopada 2017

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California School of Medicine, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Streszczenie

Postępy w mikroskopii fluorescencyjnej i biologii komórki są ściśle ze sobą powiązane, a zwiększona zdolność do wizualizacji zdarzeń komórkowych często prowadzi do dramatycznych skoków w naszym zrozumieniu funkcjonowania komórek. Rozwój i dostępność mikroskopii superrozdzielczej znacznie rozszerzyły granice rozdzielczości optycznej z ~250-20 nm. Biolodzy nie są już ograniczeni do opisywania oddziaływań molekularnych w kategoriach kolokalizacji w ograniczonym obszarze dyfrakcji, ale teraz możliwe jest wizualizacja dynamicznych oddziaływań poszczególnych cząsteczek. W tym miejscu przedstawiamy protokół wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych za pomocą mikroskopii zubożenia w stanie podstawowym do obrazowania komórek stałych. Podajemy przykłady z dwóch różnych białek błonowych, elementu translokonu retikulum endoplazmatycznego, sec61β i zlokalizowanego w błonie plazmatycznej, bramkowanego napięciem kanału Ca2 + typu L (CaV1.2). Omówiono konkretne parametry mikroskopu, metody fiksacji, formułę bufora foto-przełączającego oraz pułapki i wyzwania związane z przetwarzaniem obrazu.

Wprowadzenie

Reakcje sygnalizacji komórkowej przekształcają zmieniające się środowisko wewnętrzne i zewnętrzne, aby zainicjować odpowiedź komórkową. Regulują wszystkie aspekty fizjologii człowieka, służąc jako podstawa uwalniania hormonów i neuroprzekaźników, bicia serca, widzenia, zapłodnienia i funkcji poznawczych. Zakłócenie tych kaskad sygnałowych może mieć poważne konsekwencje w postaci stanów patofizjologicznych, w tym raka, choroby Parkinsona i Alzheimera. Przez dziesięciolecia badacze biologiczni i medyczni z powodzeniem wykorzystywali białka fluorescencyjne, sondy i bioczujniki w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną jako podstawowe narzędzia do zrozumienia precyzyjnej organizacji przestrzennej i czasowej tych sygnałów komórkowych.

Mocnymi stronami technik optycznych, takich jak mikroskopia epifluorescencyjna, konfokalna czy mikroskopia z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRF), są ich czułość, szybkość i kompatybilność z obrazowaniem żywych komórek, podczas gdy głównym ograniczeniem jest ich rozdzielczość ograniczona dyfrakcją, co oznacza, że struktury lub kompleksy białkowe mniejsze niż 200-250 nm nie mogą być rozwiązane. Wraz z teoretycznym i praktycznym rozwojem deterministycznej superrozdzielczości (np. mikroskopia wymuszonej emisji zubożenia (STED1), strukturalnej mikroskopii oświetleniowej (SIM2) lub stochastycznej superrozdzielczości (np. fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna (PALM3) lub zubożenia stanu podstawowego (GSD4,5)), rozdzielczość boczna i osiowa w mikroskopii fluorescencyjnej została rozszerzona poza barierę dyfrakcyjną, do rzędu kilkudziesięciu nanometrów. W ten sposób badacze mają teraz niezrównaną zdolność do wizualizacji i zrozumienia, w jaki sposób dynamika i organizacja białek przekłada się na funkcjonowanie na poziomie zbliżonym do molekularnego.

Mikroskopia zubożenia stanu podstawowego, po której następuje powrót pojedynczej cząsteczki (GSDIM), lub po prostu GSD, jak jest znana, omija limit dyfrakcji, zmniejszając liczbę jednocześnie emitujących fluorofory4,5. Wysokoenergetyczne światło laserowe jest używane do wzbudzania próbki znakowanej fluoroforem, bombardując elektrony fotonami i zwiększając prawdopodobieństwo, że przejdą one "odwrócenie spinu" i wejdą w stan potrójny lub "ciemny" ze stanu wzbudzonego4. To skutecznie wyczerpuje stan podstawowy, stąd nazwa "zubożenie stanu podstawowego". W stanie trypletowym fluorofory nie emitują fotonów, a próbka wydaje się ciemniejsza. Jednak te fluorofory stochastycznie wracają do stanu podstawowego i mogą przejść przez kilka fotonów emitujących przejścia ze stanu wzbudzonego do podstawowego przed powrotem do stanu trypletowego. Przy mniejszej ilości fluoroforów emitowanych w danym momencie, wybuchy fotonów emitowane z poszczególnych fluoroforów stają się przestrzennie i czasowo odrębne od sąsiednich fluoroforów. Rozbłysk fotonów można dopasować do funkcji Gaussa, której obliczony środek ciężkości odpowiada położeniu fluoroforu z precyzją lokalizacji, która zależy od apertury numerycznej (NA) soczewki, długości fali światła używanej do wzbudzenia i, co najważniejsze, liczby fotonów emitowanych na fluorofor. Jednym z ograniczeń GSD jest to, że ponieważ tylko podzbiór fluoroforów aktywnie emituje w danym momencie, tysiące obrazów muszą zostać zebrane w ciągu kilku minut, aby zbudować kompletną mapę lokalizacji. Długi czas akwizycji w połączeniu z wysokim zapotrzebowaniem na moc lasera oznacza, że GSD lepiej nadaje się do próbek stacjonarnych niż na żywo.

Ten artykuł opisuje przygotowanie stałych próbek do obrazowania mikroskopowego w superrozdzielczości białek rezydujących w błonie i retikulum endoplazmatycznym (ER) (lista niezbędnych materiałów eksploatacyjnych i odczynników znajduje się w Tabeli Materiałów). Przedstawiono przykłady, w jaki sposób protokół ten można łatwo dostosować do ilościowego określenia wielkości i stopnia grupowania kanałów Ca2+ bramkowanych napięciem typu L (Cav1,2) w sarkolemmie miocytów serca lub wykorzystać do wizualizacji dystrybucji komórkowej ER. Zrozumienie rozmieszczenia i organizacji tych składników komórkowych jest niezwykle ważne dla zrozumienia inicjacji, translacji i ostatecznie funkcji wielu kaskad sygnalizacyjnych zależnych od Ca2 +. Na przykład kanały Cav1.2 są fundamentalnie ważne dla sprzężenia wzbudzenia-skurczu, podczas gdy uwalnianie Ca2 + za pośrednictwem receptora z ER jest prawdopodobnie najbardziej wszechobecną kaskadą sygnalizacyjną w komórkach ssaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mycie szkiełek nakrywkowych

  1. Dzień przed przetworzeniem próbki należy oczyścić szkiełka nakrywkowe #1,5 metodą sonikacji w 1 M roztworze KOH przez 1 godzinę. Usuwa to wszelkie zanieczyszczenia fluorescencyjne, które mogą być obecne na szkiełkach nakrywkowych.
    1. Dokładnie spłucz KOH z szkiełek nakrywkowych wodą dejonizowaną.
    2. Po oczyszczeniu w KOH szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w 70% etanolu, aż będą gotowe do użycia.

2. Powlekanie szkła nakrywkowego

UWAGA: Kroki opisane w tej sekcji powinny być wykonywane w kapturze do hodowli komórkowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

  1. Użyj kleszczyków, aby usunąć pojedyncze szkiełko nakrywkowe z 70% roztworu etanolu i szybko podpal, aby usunąć nadmiar. Umieść szkiełka nakrywkowe w płytce 6-dołkowej. Jeśli spalanie w kapturze hodowlanym nie jest możliwe, rozważ autoklawowanie szkiełek nakrywkowych po spłukaniu wodą dejonizowaną i/lub sterylizacji pod światłem UV w kapturze hodowlanym przez co najmniej 30 minut.
  2. Aby wspomóc adhezję komórek, szkiełka nakrywkowe należy pokrywać sterylną 0,01% poli-L-lizyną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać poli-L-lizynę i przepłukać szkiełka nakrywkowe sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wysuszyć na powietrzu i wstawić na noc do lodówki.
  4. Następnego ranka wyjmij szkiełka nakrywkowe z lodówki i dodaj 300 μl lamininy o stężeniu 50 μg/ml przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że laminina jest ostrożnie umieszczona bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym.
    UWAGA: Ten etap lamininy nie jest konieczny w przypadku komórek COS-7 lub komórek HEK293, ale jest wymagany w przypadku izolowanych miocytów komorowych. Inne komórki pierwotne, takie jak komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych lub neurony, mogą lepiej przylegać do szkiełek nakrywkowych pokrytych kolagenem lub fibronektyną.

3. Przygotowanie komórek

  1. Hodowane komórki
    1. Hoduj komórki COS-7 (lub preferowaną linię komórkową) na 10-centymetrowej szalce hodowlanej w 10 ml pożywki hodowlanej Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny (PS). Hodować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, zbierz je z 10-centymetrowej płytki, zasysając pożywkę DMEM i dodając 5 ml 0,05% roztworu trypsyny-EGTA. Gdy komórki zaczną się zaokrąglać i odłączać, natychmiast zneutralizuj trypsynę za pomocą uzupełnionego DMEM.
      1. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby usunąć komórki z naczynia. Kilkakrotnie przyłożyć pożywkę pipetą do dna szalki, aby usunąć wszelkie przylegające komórki i równomiernie rozprowadzić je w pożywce.
    3. Umieść komórki na 35-milimetrowych szalkach hodowlanych, aby osiągnąć 70% konfluencji do transfekcji. Uzupełnij objętość podłoża w naczyniu do 2 ml świeżym roztworem DMEM/FBS/PS.
    4. Transfekcję komórek COS-7 z pożądanymi konstruktami plazmidowego DNA (np. sec61β-mPlazmid wiśniowy), przy użyciu odpowiedniego odczynnika do transfekcji i zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Ekspresja białka może zająć 24-48 godzin, w zależności od użytego plazmidu i/lub odczynnika do transfekcji.
  2. Dorosłe miocyty komorowe myszy
    1. Wyizoluj miocyty komorowe dorosłej myszy przy użyciu dobrze znanej metody perfuzji Langendorffa6. Ponownie zawiesić powstałą osadę miocytów w pożywce 199 (M199) uzupełnionej 2,5% FBS i 1% PS.

4. Komórki poszycia

  1. Transfekowane komórki COS-7
    1. Odessać 2 ml roztworu DMEM/FBS/PS z szalki 35 mm i dodać 1 ml PBS wolnego od Ca2+. Włóż naczynie do inkubatora na 2 minuty. Zbierz komórki z naczynia, najpierw zasysając PBS wolny od Ca2+, a następnie dodając 1 ml 0,05% roztworu trypsyny-EGTA.
      1. Gdy komórki zaczną się zaokrąglać i odłączać, natychmiast zneutralizuj trypsynę za pomocą 1 ml suplementowanego DMEM. Delikatnie pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że transfekowane komórki są równomiernie rozprowadzone w 2 ml zawiesiny trypsyny-EGTA-DMEM.
    2. Płytka transfekowała komórki COS-7 na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną o odpowiedniej gęstości, tak aby można było uwidocznić pojedyncze komórki, i wypełniła objętość naczynia do 2 ml DMEM/FBS/PS (np. dodać 90 μl zawiesiny komórek do szkiełka nakrywkowego, a następnie dodać 1,910 μl uzupełnionego DMEM, zawirować naczynie, aby równomiernie rozprowadzić komórki).
      UWAGA: Komórki nie muszą być liczone, ale objętość komórek, które mają być dodane do każdej potrawy, będzie się różnić w zależności od zbiegu komórek.
    3. Umieść posiane komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na noc, aby umożliwić komórkom przyleganie i regenerację.
  2. Dorosłe miocyty komorowe myszy
    1. Odessać miocyty z lamininą i płytkami bezpośrednio na powlekane szkiełka nakrywkowe w odpowiedniej gęstości, aby można było uwidocznić poszczególne komórki. Będzie to zależało od gęstości żywotnych komórek uzyskanych z izolacji.
    2. Zrównoważyć zawiesinę komórek w kopule na szkiełku nakrywkowym i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na ~45 minut, aby umożliwić adhezję.

5. Utrwalenie komórek

  1. Usunąć komórki z inkubatora i ostrożnie odessać pożywkę.
    1. Przepłucz przylegające komórki raz za pomocą PBS.
    2. Napraw komórki za pomocą utrwalacza zoptymalizowanego pod kątem indywidualnego zastosowania i przeciwciał.
      UWAGA: Ważnym kryterium, o którym należy pamiętać przy wyborze utrwalacza, jest zachowanie struktury komórkowej próbki, przy jednoczesnym zapewnieniu, że nie ma zmian konformacyjnych w badanym antygenie. Dla celów niniejszego protokołu omówiono utrwalanie za pomocą 3% paraformaldehydu/0,1% aldehydu glutarowego (PFA/GA) oraz utrwalanie 100% metanolem.
  2. Wiązanie PFA/GA transfekowanych komórek COS-7 eksprymujących Sec61β-mCherry
    1. Wymieszaj 1,9 ml 16% PFA i 20 μl 50% GA i dodaj PBS, aby uzyskać końcową objętość 10 ml.
    2. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego roztworu PFA/GA do każdego naczynia z komórkami i utrwalaj na 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odessać PFA/GA i przepłukać komórki 3 razy PBS.
    4. Umyj przylegające komórki PBS, 5 razy po 5 minut każda. Wszystkie kroki mycia należy wykonywać na rotatorze ustawionym na umiarkowaną prędkość (np. 50 cykli na minutę).
    5. Następnie zredukuj wolne grupy aldehydowe za pomocą 1 ml świeżo przygotowanego 0,1% m/objętości borowodorku sodu w wodzie dejonizowanej.
    6. Wypłucz komórki dwukrotnie, a następnie umyj 3 razy przez 5 minut w PBS, aby usunąć wszelkie ślady borowodorku sodu i alkoholu, który wytwarza, gdy reaguje z wolnymi aldehydami.
  3. Utrwalanie metanolu w miocytach komorowych dorosłych myszy
    1. Ostrożnie dodaj 1 ml lodowatego 100% metanolu do komórek. Przechylić płytkę 6-dołkową i odpipetować metanol do ścianki bocznej, a nie bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe. Następnie przechyl 6-dołkową płytkę z powrotem do poziomu, aby metanol mógł równomiernie przemyć komórki. Utrwalać przez 5 minut w temperaturze -20 °C.
    2. Odessać utrwalacz i przepłukać komórki 3 razy PBS.
    3. Przemyj przylegające komórki PBS, 5 razy po 5 minut każda na rotatorze.

6. Blokowanie niespecyficznego wiązania

  1. Blokować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Do blokowania nieswoistego wiązania przeciwciał można stosować różne roztwory, w tym 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) lub surowicę nieimmunologiczną tego samego gatunku co przeciwciało pierwszorzędowe.

7. Wykrywanie

  1. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Zassać roztwór blokujący. Nie myć ani nie spłukiwać.
    2. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego w następujący sposób (patrz krok 7.1.5): rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do stężenia 10 μg/ml (lub stężenia sugerowanego przez producenta) w roztworze do inkubacji przeciwciał (patrz tabela materiałów). Zrównoważ tę niewielką objętość na szkiełku nakrywkowym i ostrożnie ułóż na wierzchu kwadrat plastikowej folii parafinowej. Pomaga to rozprowadzić niewielką objętość przeciwciała na szkiełku nakrywkowym i chroni przed parowaniem.
    3. Umieść 6-dołkową płytkę w komorze wilgotnościowej i inkubuj przez noc w lodówce.
    4. Rano wyjmij komórki z komory wilgotnościowej, ostrożnie usuń kwadrat filmu parafinowego z powierzchni szkiełka nakrywkowego i odessaj roztwór przeciwciała pierwotnego.
    5. Spłukać 3 razy PBS, a następnie przemyć 5 razy przez 5 minut roztworem bloku myjącego (patrz Tabela Materiałów) na rotatorze.
      UWAGA: Ten protokół wykorzystuje następujące przeciwciała, mysie przeciwciało monoklonalne anty-RFP dla obrazów wyświetlanych w Rysunek 2 i królicze poliklonalne przeciwciało FP17 anty-CaV1.2 (prezent od prof. Johannesa Hella, UC Davis) dla obrazów wyświetlanych w Rysunek 3. Jeśli chodzi o komorę wilgotnościową, sprawdza się plastikowe pudełko na lunch z ciasno przylegającą pokrywką, wyłożone mokrymi ręcznikami papierowymi. PBS może być stosowany do etapów mycia, jednak protokół ten poprawia specyficzność etykietowania i zmniejsza tło dzięki zastosowaniu rozcieńczonego roztworu blokującego do etapów mycia.
  2. Inkubacja przeciwciał wtórnych
    1. Odessać roztwór płuczący i dodać 200 μl sprzężonego roztworu przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonego w stosunku 1:1000 w roztworze do inkubacji przeciwciał. Umieść kwadrat folii parafinowej na wierzchu szkiełka nakrywkowego (patrz krok 7.1.2).
    2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Odessać przeciwciało wtórne i spłukać 3 razy PBS.
    4. Umyj komórki rozcieńczonym roztworem blokującym 5 razy przez 5 minut na bujaku.
    5. Umyć 3 razy przez 5 minut za pomocą PBS.
      UWAGA: Ten protokół opisuje użycie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego Alexa 647 i sprzężonego przeciwciała drugorzędowego anty-królika Alexa 647 odpowiednio dla Rysunek 2 i Rysunek 3. Do znakowania pojedynczych białek preferowanym fluoroforem jest Alexa 647 ze względu na wysoką liczbę fotonów (poprawia precyzję lokalizacji) i niski cykl pracy (poprawia rozdzielczość czasową)8. Dostępnych jest wiele innych opcji przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem, takich jak barwniki Atto lub Cy. Patrz Dempsey i wsp.8 oraz Chozinski et al.9 do kompleksowych ocen przydatności kilku fluoroforów/barwników do obrazowania w superrozdzielczości.

8. Po fiksacji (krok opcjonalny)

  1. Rozcieńczyć 50 μl 50% GA w 10 ml PBS, aby otrzymać 0,25% roztwór GA. Komórki po utrwaleniu przez 10 minut w tym roztworze w temperaturze pokojowej.
  2. Myć PBS 3 razy przez 5 minut na rotatorze.

9. Przechowywanie próbek

  1. Próbki należy przechowywać w lodówce (4 °C) w pojemniku wyłożonym folią aluminiową w celu ochrony przed światłem do czasu obrazowania.
  2. W przypadku długotrwałego przechowywania próbek (do kilku miesięcy) należy przechowywać w PBS zawierającym 3 mM azydek sodu, aby zapobiec rozwojowi bakterii.

10. Przygotowanie bufora do obrazowania GSD w superrozdzielczości

  1. Przygotować roztwór "GLOX" do oczyszczania tlenu w następujący sposób:
    1. W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodaj 12,5 μl katalazy (zapas 34 mg/ml), 3,5 mg oksydazy glukozowej i 0,5 μl 1 M Tris (pH = 8) do 49,5 μl PBS.
    2. Krótko przemieszać, aby rozpuścić składniki w roztworze, a następnie odwirować przy 20 800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: stwierdzono, że roztwory oczyszczające tlen, takie jak GLOX, sprzeciwiają się fotowybielaniu. GLOX należy przechowywać w lodówce do jednego tygodnia. Powtórz krok wirówki za każdym razem, gdy jest używana.
  2. Przygotować roztwór tiolu indukujący fotoprzełączanie w następujący sposób:
    1. Przygotować 100 mM roztwór β-merkaptoetyloaminy (MEA) w PBS i zmodyfikować pH do pH 8 lub alternatywnie użyć β-merkaptoetanolu (βME). Porcjowany roztwór MEA należy przechowywać w zamrażarce (-20 °C) przez okres do 1 tygodnia.
  3. Bezpośrednio przed obrazowaniem należy przygotować końcowy bufor przełączający na lodzie, dodając do siebie tiol i składniki pochłaniające tlen. Na 500 μL GLOX-MEA dodać 5 μl GLOX do 50 μl MEA (pH = 8) i 445 μl buforu soli fizjologicznej (2,5 ml 1 M Tris pH = 8, 29,22 mg NaCl (10 mM stężenie końcowe), 5 g glukozy i 47,5 ml wody). Alternatywnie, dla roztworu GLOX-βME dodać 5 μl GLOX do 5 μL βME i 490 μl buforu soli fizjologicznej.
    1. Roztwory należy przechowywać na lodzie i używać w razie potrzeby do mocowania próbek na szkiełkach wgłębieniowych.
      UWAGA: Roztwory zawierające tiol, takie jak βME lub MEA, indukują fotoprzełączanie barwników na bazie cyjaniny, takich jak Alexa 64710 lub barwników na bazie ksantenu, takich jak Alexa 568. βME daje lepsze wyniki z Alexa 647, podczas gdy MEA jest preferowana dla Alexa 568 lub gdy 2 białka mają być obrazowane za pomocą podejścia podwójnego znakowania z wykorzystaniem zarówno Alexa 568, jak i 647. Bufor ulegnie pogorszeniu w ciągu kilku godzin z powodu zakwaszenia. Doprowadzi to do zmniejszenia średniej liczby fotonów w próbce. Aby temu zapobiec, zaleca się wykonanie nowego bufora fotoprzełączania po 2-3 godzinach lub w przypadku zaobserwowania spadku średniej liczby fotonów lub znacznego wydłużenia czasu potrzebnego do indukowanej fotoprzełączania. Niedawny artykuł opisywał nowy bufor do obrazowania Ox-EA, którego jeszcze nie testowaliśmy, ale podobno wykazuje stabilny poziom pH przez kilka dni i działa lepiej niż GLOX w zastosowaniach obrazowania wielokolorowego11.

11. Próbki montażowe

  1. Zamontuj szkiełka nakrywkowe z oznakowanymi komórkami (patrz sekcje 1-9) na szkiełkach wgłębieniowych, używając 100 μl bufora do obrazowania.
  2. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego klejem silikonowym, aby zapobiec szybkiemu utlenianiu bufora obrazowania. Poczekaj kilka minut, aż klej silikonowy całkowicie się utwardzi w przeciwnym razie szkiełko nakrywkowe będzie dryfować podczas obrazowania.
    UWAGA: Klej silikonowy nie stwardnieje w kontakcie z βME. Należy pamiętać o wysuszeniu krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby klej silikonowy nie miał kontaktu z buforem obrazowania.

12. Akwizycja obrazu

  1. W Tabeli 1 znajduje się lista parametrów obrazowania używanych w Rysunek 2 i Rysunek 3.
    1. Aby rozpocząć, wybierz odpowiedni laser do oświetlenia próbki w zależności od wybranego fluoroforu. System SR-GSD zastosowany w tym protokole wyposażony jest w lasery dużej mocy (488 nm, 1,4 KW/cm2; 532 nm, 2,1 KW/cm2; 561 nm, 2,1 KW/cm2 642 nm, 2,1 KW/cm2). Rysunek 2 używał lasera o długości fali 642 nm.
  2. Używaj soczewki obiektywowej z olejkiem o wysokim NA. Zastosowany tu system SR-GSD wyposażony jest w obiektyw HC PL APO 160X/1,43 NA.
  3. Wybierz odpowiednią kostkę do obrazowania dichroicznego. System SR-GSD w tym protokole wyposażony jest w 488 HP-T, 532 HP-T, 568 HP-T, 642 HP-T z filtrami pasmowo-przepustowymi emisji 505-605 nm, 550-650 nm i 660-760 nm.
  4. Wybierz tryb akwizycji 2D. Ustaw aparat w trybie przenoszenia klatek i czas ekspozycji na 10 ms (100 Hz). Ustaw wzmocnienie EM na 300. Wybierz próg wykrywania.
    UWAGA: Niskie progi dają obrazy z wysokim tłem. Wysokie progi mogą odfiltrować interesujący nas sygnał. Określić próg na podstawie kontroli ujemnych, takich jak obrazowanie szkiełek nakrywkowych komórek nietransfekowanych lub komórek inkubowanych wyłącznie z przeciwciałami drugorzędowymi.
  5. Włącz automatyczną kontrolę zdarzeń i ustaw liczbę zdarzeń na obrazy na 8.
  6. Wprowadź rozmiar piksela w zakładce Akwizycja GSD (zacznij od rozmiaru piksela 10 nm lub 20 nm). Upewnij się, że "Tryb histogramu" jest wybrany na karcie Narzędzia GSD w opcjach obliczania obrazu w wysokiej rozdzielczości przed pobraniem obrazu.
  7. Aby zobrazować białka na błonie plazmatycznej, wybierz tryb TIRF i zmodyfikuj kąt padania, aby określić głębokość penetracji.
  8. Aby wysłać elektrony do stanu ciemnego (zwanego pompowaniem), ustaw intensywność lasera na 100%.
  9. Wybierz wykrywanie pojedynczej cząsteczki podczas pompowania i ustaw automatyczne wykrywanie, gdy korelacja ramki wynosi 0,20.
  10. W celu akwizycji ustaw intensywność lasera na 50%.
  11. Ustaw liczbę ramek akwizycji na 60 000,
    UWAGA: Badacz może stwierdzić, że próbka wymaga więcej lub mniej ramek. Zmodyfikuj liczbę klatek na podstawie obserwacji fotowybielania fluoroforu i zatrzymaj akwizycję, gdy nie zostaną wykryte żadne dalsze zdarzenia.
  12. Rozpocznij pobieranie.
    UWAGA: Na początku akwizycji wszystkie cząsteczki barwnika są w stanie fluorescencyjnym, a następnie przechodzą w stan ciemny. Gdy korelacja klatek osiągnie 0,20, rozpocznie się pobieranie obrazów. Gdy na klatkę zostanie wykrytych mniej niż 8 zdarzeń, laser 405 włączy się, zachęcając fluorofory do przejścia ze stanu ciemnego do stanu podstawowego. Podczas pozyskiwania obrazów do zbioru danych n = x komórek od n = y zwierząt, parametry takie jak głębokość penetracji TIRF, próg wykrywania i liczba pozyskanych klatek powinny być stałe.

13. Analiza obrazu

  1. Aby określić ilościowo rozmiar klastra białek, użyj funkcji "analizuj cząstki" w ImageJ.
    UWAGA: Dalsza analiza może być przeprowadzona przy użyciu stochastycznej analizy lokalizacji względnej opartej na mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM-RLA) lub podobnej13.
    1. Przeprowadź analizę skupień (Rysunek 3) przy użyciu ImageJ w następujący sposób:
    2. Otwórz plik obrazu, który chcesz przeanalizować. Powinna to być mapa lokalizacji pojedynczej cząsteczki na histogramie 10 nm, wygenerowana w oprogramowaniu do obrazowania opisanym powyżej (sekcja 12).
    3. Dostosuj jasność i kontrast, aby zobrazować obraz: Kliknij menu obrazu, wybierz dostosuj, a następnie jasność i kontrast. Kliknij opcję automatyczną.
    4. Zmień typ obrazu na 8-bitowy: Wybierz menu obrazu, a następnie wybierz typ i wybierz 8-bitowy.
    5. Ustaw skalę obrazu: Otwórz menu analizy, kliknij ustaw skalę i wprowadź następujące parametry: odległość = 1, znana odległość = 10, 1 piksel = 10 nm.
    6. Aby wybrać pomiary, które chcesz uzyskać, otwórz menu analizy, wybierz ustaw pomiary i zaznacz pole obok opcji obszaru.
    7. Dostosuj próg obrazu. Otwórz menu obrazu, wybierz dostosuj, a następnie wybierz próg, wybierz powyżej/poniżej. Przesuń wartość maksymalną do 255, a następnie przesuń wartość minimalną do 1, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.
    8. Aby przeanalizować cząstki, otwórz menu analizy, wybierz pozycję analizuj cząstki. Umieść znacznik wyboru, aby wybrać jednostki pikseli, wyświetlić wyniki i podsumować. Ustaw rozmiar na 4-nieskończoność (ponieważ rozdzielczość wynosi ~20 nm), wybierz opcję gołych konturów i kliknij OK. Zostanie utworzony plik podsumowania, który będzie zawierał szczegóły analizy, takie jak średni rozmiar klastra i liczba klastrów na obrazie.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność przy wyciąganiu wniosków na temat liczby białek w danym klastrze, ponieważ liczba zlokalizowanych punktów nie jest liniowo skorelowana z liczbą białek. GSD lokalizuje barwniki, które są sprzężone z przeciwciałami, co powoduje błąd wiązania, który przesuwa znacznik fluorescencyjny z epitopu o >10 nm w dowolnym kierunku. Dodatkowo, jeśli stosuje się przeciwciała poliklonalne, więcej niż jedno przeciwciało może wiązać się z pojedynczym antygenem, a aby jeszcze bardziej zagmatwać sprawę, komercyjne przeciwciała drugorzędowe są sprzężone średnio z 3-6 cząsteczkami barwnika, więc jeden fluorofor nie zawsze równa się jednemu białku. Błąd sprzężenia można zmniejszyć, koniugując barwnik bezpośrednio z przeciwciałem pierwszorzędowym (eliminując przeciwciało wtórne) lub stosując schemat znakowania oparty na nanociałach14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak opisano we wstępie, istnieje wiele różnych modalności obrazowania mikroskopowego o nadrozdzielczości. Niniejszy protokół koncentruje się na obrazowaniu o nadrozdzielczości metodą GSD. Reprezentatywne obrazy oraz mapy lokalizacji przedstawiono na Rysunku 2 i Rysunku 3.

Rysunek 2 przedstawia komórkę COS-7 przetransfekowaną białkiem ER, mC...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niedawna eksplozja technologii, które umożliwiają obrazowanie poza granicą dyfrakcji, stworzyła nowe możliwości wglądu w złożoność sygnalizacji komórkowej ssaków w przestrzeni i czasie. Technologie te obejmują STORM, STED, PALM, GSD, SIM i ich warianty (np. dSTORM, FPALM). Pomysłowość naukowców stojących za tymi technikami pozwoliła nam obejść ograniczenia narzucone przez prawa fizyki rządzące dyfrakcją światła. Pomimo tego ogromnego osiągnięcia, każda z tych technik idzie na pewien kompromis, aby osiągnąć super...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem od AHA dla R.E.D. (15SDG25560035). Autorzy pragną podziękować dr Fernando Santanie za użycie mikroskopu 3D Leica SR GSD oraz dr Johannesowi Hell za uprzejme dostarczenie przeciwciała FP1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KOHThermo ScientificP250-500Do czyszczenia szkła nakrywkowego
#1.5 szkło nakrywkowe 18 x 18 mmMarienfeld Superior0107032)Do wzrostu/przetwarzania/obrazowania komórek
10x PBSThermo ScientificBP3994Rozcieńczony do 1x wodą dejonizowaną
Poly-L-LizynaSigmaP4832Wspomaga adhezję komórek do pokrywania szklanej
lamininySigma114956-81-9Wspomaga adhezję komórek do szkła pokryciowego
Medium 199Thermo Scientific11150-059Pożywki do hodowli miocytów komorowych
DMEM 11995Gibco11995Pożywka do hodowli komórkowych
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Scientific10437028Media suplement
Penicylina/streptomycynaSigmaP4333Media suplement
0,05% trypsyna-EDTACorning25-052-CLRoztwór do hodowli komórkowych
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-019Przejściowy odczynnik do transfekcji
bez Ca2+ PBSGibco1419-144Hodowla komórkowa
100% metanoluThermo Fisher ScientificA414-4Utrwalanie komórek
ParaformaldehydElektron Mikroskopia Sciences15710Utrwalanie komórek
Aldehyd glutarowySigma AldrichSLBR6504VUtrwalanie komórek
SEAblockThermo Scientific37527BSA lub inne alternatywne rozwiązanie blokujące
Triton-X 100SigmaT8787Detergent do przepuszczalności komórek
Królik anty-CaV1.2 (FP1)PrezentN/AIstnieją komercyjne przeciwciała anty-CaV1.2, takie jak Alomone Labs Rb anty-CaV1.2 (ACC-003)
Mysz monoklonalna anty-RFPRockland Inc.200-301-379Przeciwciało pierwszorzędowe
Alexa Fluor 647 donket anty-królicze IgG (H+L)Invitrogen (Thermo Scientific)A31573Przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)Invitrogen (Thermo Scientific)A11031Przeciwciało drugorzędowe
Azydek soduSigmaS2002Zapobiega rozwojowi drobnoustrojów w celu długotrwałego przechowywania próbek
KatalazaSigmaC40Składnik bufora fotoprzełączającego
Oksydaza glukozowaSigmaG2133Składnik buforowy fotoprzełączający
TrisSigmaT6066Składnik buforowy fotoprzełączający
chlorowodorek beta-merkaptoetyloaminyFisherBP2664100Składnik buforowy fotoprzełączający
i beta;-merkaptoetanolSigma63689Składnik buforu fotoprzełączającego
NaClFisherS271-3Składnik buforowy fotoprzełączający
DekstrozaFisherD14-212Składnik buforowy fotoprzełączania
Szkiełka wgłębienioweNeolab1 – 6293Do montażu próbek
TwinsilPicodent13001000Do uszczelniania szkła nakrywkowego
sec61β- Plazmid mCherryAddgene49155
Mikroskop 3D Leica SR GSDLeica
ImageJ
Roztwór20 % SEAblock w PBS
Pierwszorzędowy roztwór0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, w PBS
Wtórny roztwórdo inkubacji przeciwciał1:1000 w PBS
bloku myjącego do inkubacji przeciwciał

Bibliografia

  1. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
  2. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  5. Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).
  6. Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302(2011).
  7. Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  9. Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
  10. Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
  11. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  12. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  13. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  14. Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
  15. Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
  16. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  17. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  18. Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia z ubytkiem stanu podstawowegoobrazowanie utrwalonych kom rektryb TIRFbufor do prze czania fotochemicznegoroztw r usuwaj cy tlendetekcja pojedynczych cz steczekkwantyfikacja obrazustruktura cewek retikulum endoplazmatycznegoobrazowanie kardiomiocyt w
Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.