Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

DOI:

10.3791/56244

⸱

4 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inst. of Neuroscience and Physiology, Dept. of Psychiatry and Neurochemistry, Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, 2Clinical Neurochemistry Laboratory, Sahlgrenska University Hospital, 3Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę opracowaną do identyfikacji endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). W tym celu połączono wcześniej opracowaną metodę opartą na filtracji odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) i analizie spektrometrii mas z etapem wstępnego frakcjonowania HPLC w fazie odwróconej o wysokim pH offline.

Wydzielanie do płynu mózgowo-rdzeniowego jest główną drogą usuwania cząsteczek wydalanych przez komórki ośrodkowego układu nerwowego. W ten sposób wiele procesów zachodzących w ośrodkowym układzie nerwowym znajduje odzwierciedlenie w płynie mózgowo-rdzeniowym, co czyni go cennym płynem diagnostycznym. Płyn mózgowo-rdzeniowy ma złożony skład, zawierający białka w zakresie stężeń 8 - 9 rzędów wielkości. Oprócz białek, wcześniejsze badania wykazały również obecność dużej liczby endogennych peptydów. Chociaż są one mniej szczegółowo badane niż białka, mogą one również być potencjalnie interesujące jako biomarkery.

Endogenne peptydy zostały oddzielone od zawartości białka CSF poprzez filtrację MWCO. Poprzez usunięcie większości zawartości białka z próbki możliwe jest zwiększenie objętości badanej próbki, a tym samym również całkowitej ilości endogennych peptydów. Złożoność przefiltrowanej mieszaniny peptydów rozwiązano poprzez włączenie etapu wstępnego frakcjonowania HPLC z odwróconą fazą (RP) przy zasadowym pH przed analizą LC-MS. Frakcjonowanie połączono z prostym schematem konkatenacji, w którym 60 frakcji połączono w 12, dzięki czemu można było skrócić czas analizy, jednocześnie w dużej mierze unikając koelucji.

Automatyczna identyfikacja peptydów została przeprowadzona przy użyciu trzech różnych programów do identyfikacji peptydów/białek, a następnie połączenie wyników. Różne programy były raczej komplementarne niż porównywalne, przy czym mniej niż 15% identyfikacji pokrywało się między nimi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomarkery w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) obecnie przekształcają badania nad zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. W chorobie Alzheimera, najczęstszej chorobie neurodegeneracyjnej, dotykającej ponad 60 milionów ludzi na całym świecie1,2, tryplet biomarkerów składający się z peptydu amyloidu beta, białka tau stabilizującego mikrotubule i fosforylowanej formy tau, może wykryć chorobę z wysoką czułością i swoistością, i został uwzględniony w kryteriach badań diagnostycznych3. W przypadku innych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i stwardnienie rozsiane, badania proteomiczne zidentyfikowały wielu kandydatów na biomarkery, z których niektóre są obecnie oceniane w badaniach klinicznych4,5,6.

Oprócz białek, CSF zawiera również obfitość endogennych peptydów7,8,9,10,11,12. Peptydy te, stanowiąc produkty rozpadu wielu białek pochodzenia mózgowego, stanowią również potencjalnie ważne źródło biomarkerów choroby. Aby zwiększyć inwentarz zidentyfikowanych endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym i umożliwić analizy endopeptydomiczne płynu mózgowo-rdzeniowego w badaniach klinicznych, opracowano metodę przygotowania próbki i analizy LC-MS (krótki schemat protokołu został zawarty w Rysunek 1). Zastosowanie tej metody w niedawnym badaniu zaowocowało identyfikacją prawie 16 400 endogennych peptydów płynu mózgowo-rdzeniowego w zbiorczych próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego od kilku osób o niespecyficznej diagnozie, rozszerzając znaną endopeptydome płynu mózgowo-rdzeniowego dziesięciokrotnie13. Metoda ta może być opcjonalnie stosowana w połączeniu z metodą znakowania izobarycznego w celu oznaczania ilościowego.

Przygotowanie próbki

Głównym źródłem masy białkowej w płynie mózgowo-rdzeniowym są składniki osocza (np. albuminy i immunoglobuliny) przechodzące przez barierę krew-mózg14,15. Ich wysoka liczebność utrudnia wykrywanie mało obfitych składników próbek pochodzących z mózgu. Peptydy endogenne można łatwo oddzielić od białek o wysokiej obfitości, co pozwala na użycie znacznie większej objętości ekstraktu peptydowego CSF do analizy LC-MS, umożliwiając w ten sposób wykrywanie peptydów o mniejszej obfitości.

W przedstawionym tutaj protokole, filtracja z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) została użyta do oddzielenia peptydów płynu mózgowo-rdzeniowego od frakcji białkowej; metoda, która została użyta w kilku poprzednich badaniach8,9,10,11,12,16. Po etapie filtracji nastąpił etap wstępnego frakcjonowania RP HPLC w trybie offline przeprowadzony na ruchomym gradiencie faz o wysokim pH. Wykonując dwa etapy RP HPLC w tandemie, przy czym główną różnicą jest pH, różnica w selektywności między tymi dwoma etapami wynika głównie ze zmienionej retencji peptydów w wyniku różnych stanów ładunku peptydowego. Zastosowanie wstępnego frakcjonowania peptydów o wysokim pH przed LC-MS w warunkach kwaśnych okazało się skuteczne w zwiększaniu identyfikacji peptydów17,18, a nawet lepsze w tym celu w złożonych próbkach biologicznych w porównaniu z bardziej ortogonalnymi trybami separacji19, takie jak silna wymiana jonów kotów (SCX) i RP20. Aby skrócić czas analizy, zastosowano schemat konkatenacji, łączący co 12frakcję (np. frakcje 1, 13, 25, 37 i 49), który ze względu na wysoką zdolność rozdzielczą RP HPLC nadal w dużej mierze unikał koelucji peptydów z różnych frakcji w LC-MS step20,21.

Identyfikacja peptydu

Identyfikacja peptydów w badaniach peptydomicznych różni się od identyfikacji w badaniach proteomicznych tym, że w przeszukiwaniu bazy danych nie można określić rozszczepienia enzymów, w związku z czym wskaźniki identyfikacji są zwykle niższe11. Niedawne badanie13 wykazało, że wskaźniki identyfikacji endogennych peptydów uzyskanych za pomocą Sequest i Mascot uległy znacznej poprawie, gdy domyślny algorytm punktacji odpowiedniego oprogramowania został zmodyfikowany przy użyciu adaptacyjnego algorytmu punktacji Percolator, co wskazuje, że optymalne algorytmy punktacji dla peptydów endogennych różnią się od algorytmów peptydów tryptycznych13. W badaniu tym stwierdzono, że identyfikacja oparta na automatycznym sekwencjonowaniu peptydów de novo przy użyciu oprogramowania PEAKS (BSI) jest komplementarna z dwiema wyszukiwarkami opartymi na odciskach palców jonów fragmentów, co skutkuje znacznie większym zestawem zidentyfikowanych peptydów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany poniżej protokół jest udoskonaloną wersją tego użytego w poprzednim badaniu, w którym zidentyfikowano dużą ilość endogennych peptydów w ludzkim CSF15. Aktualizacje oryginalnego protokołu obejmują niewielkie zmiany w chemicznej obróbce wstępnej płynu mózgowo-rdzeniowego, a także optymalizację gradientu stosowanego do wstępnego frakcjonowania HPLC o wysokim pH, w trybie offline.

Względy etyczne

Wszystkie badania szwedzkich materiałów dla pacjentów i kontroli zostały zatwierdzone przez komisje etyczne: St. Göran (ref. 2005-554-31/3). Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego z Amsterdam Dementia Cohort oraz próbki pobrane w National Hospital for Neurology and Neurosurgery w Londynie zostały wykorzystane do badań za pisemną zgodą wszystkich uczestniczących pacjentów i zgodą regionalnych komisji etycznych. Wykorzystany materiał składał się głównie z resztek płynu mózgowo-rdzeniowego z próbek pobranych w celu diagnozy, które zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację przed włączeniem do naszych badań. Nie ma możliwości prześledzenia wstecz próbki do konkretnego dawcy lub grupy dawców.

1. Ekstrakcja ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF):

  1. Ekstrakcja płynu mózgowo-rdzeniowego przez nakłucie lędźwiowe (musi być wykonane przez przeszkolonego lekarza) przy użyciu standardowego protokołu22.
  2. Usunąć resztki komórek i inny nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 20 minut.
  3. Sprawdź wzrokowo próbki płynu mózgowo-rdzeniowego pod kątem przebarwień, które mogą wskazywać na zanieczyszczenie krwi wynikające z krwawienia kłutego. Znacznie wyższe stężenie białka we krwi i obecność proteaz może mieć duży wpływ na wyniki analiz.

2. Wstępna obróbka płynu mózgowo-rdzeniowego (objętość próbki 1,5 ml, bez oznaczania ilościowego):

  1. Rozmrozić 1,5 ml podwielokrotności płynu mózgowo-rdzeniowego w temperaturze pokojowej (RT), przenieść zawartość do probówek polipropylenowych o pojemności 10 ml i dodać 80 μl 1 M wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) jako środka buforowego.
  2. Dodać 0,65 ml 8 M chlorowodorku guanidyny (GdnHCl) (stężenie aktywne GdnHCl: 2,4 M) i delikatnie wirować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Czynnik chaotropowy, GdnHCl, zarówno wpływa na lepkość rozpuszczalnika, jak i oddziałuje z łańcuchem polipeptydowym, co powoduje, że rozwijanie się białka jest korzystne energetycznie23. W ten sposób GdnHCl rozpuszcza agregaty białkowe i zwiększa odzysk endogennych peptydów podczas późniejszej filtracji.
  3. Dodać 60 μl z 200 mM wodnego chlorowodorku tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) (stężenie aktywne TCEP: 6 mM) i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę w celu redukcji disiarczków cysteiny.
  4. Dodać 35 μl 400 mM jodoacetamidu (IAA) (aktywne stężenie IAA: 4 mM) i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, aby alkilować cysteiny. Dodanie grupy alkilowej zapewnia, że reszty cysteiny nie mogą spontanicznie tworzyć nowych mostków dwusiarczkowych w żadnym momencie podczas późniejszego przygotowania próbki.
  5. Dodaj 3,25 ml zdejonizowanej wody i krótko zmieszaj, aby rozcieńczyć próbkę przed filtracją MWCO, co daje całkowitą objętość próbki 5,5 ml. Ten etap służy do rozcieńczenia GdnHCl do poziomu poniżej 1 M, ponieważ zaobserwowano, że wyższe stężenie czasami powoduje wypłukiwanie substancji polimerowych z urządzeń filtrujących.

3. Wstępna obróbka płynu mózgowo-rdzeniowego (objętość próbki 10 x 150 μL, etykietowanie izobaryczne-kwantyfikacja):

  1. Rozmrozić 150 μl porcji płynu mózgowo-rdzeniowego pobranych od 10 osób w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść zawartość do pojedynczych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml o niskim stopniu wiązania i dodać 8 μl 1 M TEAB jako środek buforowy.
  2. Dodać 65 μl 8 M GdnHCl (stężenie aktywne GdnHCl: 2,4 M) i delikatnie wirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  3. Dodać 6 μl z 200 mM wodnego roztworu TCEP (stężenie aktywne TCEP: 6 mM) i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę w celu redukcji dwusiarczków cysteiny.
  4. Dodać 3,5 μl 400 mM wodnego roztworu IAA (stężenie aktywne IAA: 6 mM) i inkubować w temperaturze pokojowej i ciemności przez 30 minut do alkilowanych cystein.
  5. Przygotuj zestaw do etykietowania izobarycznego (np. odczynnik do etykietowania izobarycznego Tandem Mass Tag 10plex). Pozwolić, aby fiolki z odczynnikiem do znakowania izobarycznego osiągnęły temperaturę RT przed ich otwarciem, aby uniknąć niepotrzebnego uwodnienia odczynnika, dodać 41 μl acetonitrylu (AcN) klasy HPLC i rozpuścić przez delikatne mieszanie przez 5 minut.
  6. Przenieść 30 μl izobarycznego roztworu odczynnika do znakowania do odpowiedniej próbki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Odczynnik do znakowania izobarycznego zawiera grupę estrową NHS, która reaguje z pierwszorzędowymi aminami obecnymi na N-końcach peptydów, a także z resztami lizyny.
  7. Dodać 8 μl 5% hydroksyloaminy (aktywne stężenie hydroksyloaminy: 0,16%) i delikatnie wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby wygasić reakcję znakowania. Ponieważ oddzielnie oznakowane próbki mają być połączone, należy upewnić się, że reakcja etykietowania została wygaszona. Poprzez dodanie dużej ilości grup aminowych w postaci hydroksyloaminy, pozostały odczynnik do znakowania izobarycznego może reagować i w ten sposób staje się obojętny.
  8. Połączyć zawartość każdej z 10 indywidualnie oznakowanych próbek w jednej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml.
  9. Dodać 6,4 ml wody dejonizowanej do połączonej próbki i krótko odwirować, aby zmniejszyć stężenie AcN z 12% do 3% i do stężenia GdnHCl GdnHCl poniżej 1 M, ponieważ zaobserwowano, że wyższe stężenie czasami powoduje wypłukiwanie substancji polimerowych z urządzeń filtrujących.

4. Filtracja odcięcia masy cząsteczkowej

  1. W celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń, kondycjonuj filtry MWCO, ładując 10 ml wodnego roztworu 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB i odwirowując przez 15 minut przy 2,500 x g i RT, odrzucając przepływ (FT).
  2. Załadować całą objętość próbki na filtr (5 ml nieznakowanego płynu mózgowo-rdzeniowego (krok 2.5) lub 10 ml izobarycznie znakowanego płynu mózgowo-rdzeniowego (krok 3.9)) i wirować przez 30 minut przy 2 500 x g i RT, pozostawić przepływ (FT) w pojemniku zbiorczym. W wyniku filtracji peptydy i małe białka są oddzielane od większych białek i resztkowych szczątków komórkowych. Ten krok może być postrzegany jako peptydomiczny odpowiednik zastosowania proteolitycznego trawienia białek do generowania peptydów w eksperymentach proteomicznych.
  3. Załadować 5 ml 25 mM TEAB (wodnego) na filtry i odwirowywać przez 15 minut przy 2 500 x g i RT, w celu zwiększenia odzysku peptydów.
  4. Zmieszać połączone FT z dwóch poprzednich etapów (łącznie 10 ml próbki nieznakowanej lub 15 ml próbki znakowanej izobarycznie) i przystąpić do zakwaszania próbki.

5. Odsalanie i oczyszczanie próbki przez ekstrakcję do fazy stałej

  1. Przefiltrowaną próbkę należy zakwasić z kroku 4.4 przed ekstrakcją do fazy stałej (SPE). Zakwaszenie przeprowadza się w celu poprawy interakcji substancji rozpuszczonej (peptydu) z fazą stacjonarną wkładu SPE.
  2. Dla próbki nieznakowanej (objętość 10 ml): dodać 550 μl 1% kwasu trifluorooctowego (TFA) - całkowita objętość próbki: 10,55 ml z 0,05% TFA.
  3. Dla próbki znakowanej izobarycznie (objętość 15 ml): dodać 20 ml 0,1% TFA w celu zakwaszenia i obniżenia stężenia AcN z 3% do 1% - całkowita objętość próbki: 30 ml z 0,066% TFA.
    UWAGA: TFA jest również dodawany ze względu na jego funkcję odczynnika parującego jony, który poprawia retencję peptydów, które same w sobie nie są zdolne do wystarczająco silnej interakcji hydrofobowej z materiałem wypełniającym wkład SPE, aby mogły zostać zachowane.
  4. Jeżeli pH >3, miareczkować próbkę 20% kwasem fosforowym, aż pH próbki osiągnie <3.
  5. Kondycjonować wkłady SPE przez dodanie 1 ml 84% AcN, 0,1% kwasu mrówkowego (FA) i wyrzucić FT. Powtórz raz. Kondycjonowanie filtra wkładowego jest wymagane w celu usunięcia niepożądanych substancji, które w przeciwnym razie wymywałyby się wraz z peptydami w kolejnych etapach; Ponadto kondycjonowanie zwiększa przepuszczalność filtra.
  6. Wyrównać wkład SPE przez dodanie 1 ml 0,1% TFA, wyrzucić FT. Powtórzyć raz. Upewnij się, że filtr nie wyschnie po ostatnim kroku wyrównania - utrzymuj niewielką objętość na górze filtra. Równoważenie filtra z wkładem przeprowadza się w celu przygotowania filtra do zatrzymywania peptydów poprzez usunięcie substancji hydrofobowej (acetonitrylu) pozostałej po etapie kondycjonowania.
  7. Załaduj całą objętość próbki (10,55 ml dla próbek nieoznakowanych lub 30 ml dla próbek znakowanych izobarycznie), w razie potrzeby w kilku porcjach i pozwól, aby FT wpadł w odpady. Upewnij się, że wkład nie wyschnie między rundami ładowania próbki lub po załadowaniu ostatniej objętości próbki - utrzymuj niewielką objętość na górze filtra.
  8. Przepuść 1 ml 0,1% TFA przez filtry, aby usunąć sole i odczynniki, a następnie wyrzuć FT. Powtórz raz. Upewnij się, że wkład nie wyschnie po każdym etapie prania - trzymaj niewielką ilość płynu na wierzchu wkładu.
  9. Umieść 1,5 ml mikroprobówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania pod wkładem i eluuj próbkę, przepuszczając 1 ml 84% AcN, 0,1% FA przez wkład.
  10. Usunąć rozpuszczalniki z odsolonej próbki przez odparowanie w wirówce próżniowej, uruchomić bez aktywnego ogrzewania do wyschnięcia, przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do frakcjonowania o wysokim pH.

6. Frakcjonowanie próbek HPLC metodą odwróconej fazy offline w trybie offline

  1. Przygotować wodne fazy ruchome o wysokim pH (HpH):
    Bufor HpH A: Czysta woda
    Bufor HpH B: 84% AcN
    HpH Bufor C: 25 mM NH4OH
    Bufor ładujący HH: 2,5 mM NH4OH, 2% AcN
    Uwaga: Bufor ładujący HpH jest używany jako roztwór transportowy i bufor próbki
  2. Ponownie rozpuścić próbkę w 16 μl buforu ładującego HpH przez delikatne mieszanie przez 20 minut
  3. Załadować 15 μl próbki do systemu HPLC z wewnętrznym kolektorem frakcji dla płytek z 96 głębokimi dołkami, skonfigurowanych zgodnie z Batth i wsp.20 z niewielkimi zmianami. Frakcjonować przy przepływie 100 μl/min przez stabilną pH kolumnę separacyjną (C18 3,5 μm, 2,1 mm x 250 mm) i zbierać jedną frakcję na minutę w liniowym nachyleniu 60 minut.
  4. Stosować następujące punkty czasowe gradientu: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, zbiór frakcji początkowej; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; zbiór frakcji końcowej; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% i t = 90 min, B = 1%, C = 10%.
  5. Zbieraj frakcje powtarzalnie w 12 dołkach w okrągłym wzorze, łącząc w ten sposób frakcje oddalone od siebie o 12 minut, co daje 12 frakcji, z których każda zawiera 6 połączonych podfrakcji.
  6. Usunąć rozpuszczalnik z próbek przez wirowanie próżniowe w temperaturze pokojowej i prędkości 3000 obr./min do momentu wyschnięcia, a następnie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C przed analizą LC-MS.

7. LC-MS

  1. Przygotować fazy ruchome w postaci wody wodnej:
    Bufor A: 0,1% FA
    Bufor B: 0,1% FA, 84% AcN
    Bufor ładowania: 0,05% TFA, 2% AcN
    Uwaga: Bufor załadowczy jest używany jako roztwór transportowy, bufor próbki i faza ruchoma dla pompy podawczej.
  2. Ponownie rozpuścić każdą z 12 frakcji przez dodanie 6 μl buforu ładującego i wytrząsanie w temperaturze pokojowej przez 20 minut
  3. Załadować 5 μl próbki do nanoprzepływowej HPLC, działającej w konfiguracji kolumny pułapki (kolumna pułapki: 75 μm x 2 cm, C18, 100 A wielkość porów, wielkość cząstek 3 μm; kolumna separacyjna: C18, 75 μm x 500 mm, wielkość porów 100 A, wielkość cząstek 2 μm i przeprowadzić separację peptydów przy natężeniu przepływu 150 nL/min, stosując następujący gradient: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min, B = 26%; t = 170 min, B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = 181 min, B = 2%, i t = 210 min, B = 2%.
  4. Wykonaj MS na hybrydowym spektrometrze masowym o wysokiej rozdzielczości podłączonym do HPLC za pośrednictwem interfejsu nano-ESI. Rejestruj pełne widma skanowania w trybie MS przy ustawieniu rozdzielczości 120 000 (cel 2.0e5 AGC) w zakresie m/z 350 - 1 400.
    1. Uruchom spektrometr mas w trybie akwizycji zależnej od danych, wybierz widma MS/MS z dziesięciu najintensywniejszych pików o m/z > 150 i w zakresie intensywności 1.0e4-1.0e5 do analizy jonów fragmentowych. Wyizoluj jony prekursorowe za pomocą kwadrupolowego okna izolacyjnego 1 m/z, maksymalnego czasu wtrysku 100 ms i soczewki RF na poziomie 60%.
    2. Zastosuj wykluczenie dynamiczne z czasem wykluczenia wynoszącym 15 s i tolerancją m/z ±10 ppm. Przeprowadź fragmentację w komórce dysocjacji energii o wyższej energii kolizji (HCD) i zarejestruj akwizycje MS/MS w orbicie z rozdzielczością 50 000 (wartość docelowa 5,0e4 AGC).

8. Identyfikacja peptydów

  1. W celu identyfikacji peptydów prześlij pliki .raw wynikowe z analizy spektrometrii mas do wyszukiwarki proteomicznej, stosując następujące ustawienia:
    UWAGA: W naszym poprzednim badaniu15, trzy wyszukiwarki; Mascot v2.4, Sequest HT i PEAKS v7.5 były używane równolegle, a określone tutaj ustawienia zostały zastosowane dla wszystkich trzech wyszukiwarek, chyba że określono inaczej. Większość regulowanych ustawień jest uniwersalna do identyfikacji peptydów/białek i powinna mieć odpowiednie ustawienia w każdej danej wyszukiwarce.
    Selektor widma:
    Min. masa prekursora: 350 Da
    Max. masa prekursora: 5 000 Da
    Typ skanowania: Full
    Próg sygnału/szumu: 1,5 < br / > Wyszukiwanie w bazie danych sekwencji
    Baza danych: UniProt_SwissProt [version2015_11]
    Taksonomia: Homo sapiens
    Enzym: brak
    Max. brakujące dekolty: 0
    Instrument (tylko maskotka): ESI-Trap
    Min. długość peptydu (tylko SequestHT): 6
    Max. długość peptydu (tylko SequestHT): 144
    Tolerancja masy prekursora: 15 ppm
    Tolerancja masy fragmentu: 0,05 Da
    Modyfikacje statyczne: karbamidometyl (C); [Jeśli jest oznaczone] TMT10plex (N-Term)
    Modyfikacje dynamiczne: Utlenianie (M); [Jeśli jest oznaczone] TMT10plex (K)
    Walidator dopasowania widma peptydów (PSM)
    Perkolator (tylko Maskotka i Sequest HT) lub Decoy Fusion (tylko PEAKS)
    Docelowy FDR: 0,01
    Walidacja na podstawie: wartości q

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda została zastosowana i oceniona w trzech badaniach przed wprowadzeniem wstępnego frakcjonowania próbek (Tabela 1). W pierwszym badaniu wykorzystano LC offline do wykrywania frakcji płynu mózgowo-rdzeniowego na płytce docelowej MALDI i uzyskano 730 zidentyfikowanych endogennych peptydów11. W dwóch kolejnych badaniach zastosowano znakowanie izobaryczne. Przede wszystkim w badaniu klinicznym/kontrolnym w celu identyfikacji i charakterystyki potencjalnych biomarkerów w endopeptydom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie etapu wstępnego frakcjonowania HPLC o wysokim pH RP do wcześniej opracowanego protokołu odzyskiwania endogennych peptydów metodą ultrafiltracji z masą cząsteczkową11 zmniejszyło względną złożoność próbki, a tym samym umożliwiło badanie 5-krotnie większej objętości próbki. To z kolei zwiększyło stężenie podzbioru peptydów obecnych w każdej frakcji, a tym samym zwiększyło szanse na wykrycie peptydów o niskiej obfitości.

Przeprowadzając strategię identyfikacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych sprzecznych interesów, finansowych lub innych, między autorami.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielkie podziękowania dla Tanveer Batth i kolegów za porady w konfiguracji metody wstępnego frakcjonowania.

Ta praca była wspierana przez fundusze ze Szwedzkiej Rady ds. Badań, Fundacji Wallström i Sjöblom, Fundacji Gun and Bertil Stohne Stiftelse, Fundacji Magnusa Bergwalla, Fundacji Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Fundacji Knuta i Alice Wallenbergów, Frimurarestiftelsen, oraz FoU-Västra Götalandsregionen.

Głównymi odbiorcami funduszy na ten projekt byli Kaj Blennow, Henrik Zetterberg i Johan Gobom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  1 M Wodorowęglan trietyloamonuFluka, Sigma-Aldrich17902-100MLHERBATA&
nbsp; 8 M chlorowodorek guanidynySigma-AldrichG7294-100MLGdnHCl
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfinyPierce20490TCEP
JodoacetamidSIGMAI1149-5GIAA
Hydroksyloamina 50% (w/w)Sigma-Aldrich457804-50ML
Acetonitryl, dalekie UV, stopień gradientu HPLCSigma-Aldrich271004-2LSieć AcN
Kwas mrówkowyFluka, Sigma-Aldrich 56302-1mL-FFA
Kwas triflourooctowySigma-AldrichT6508-10AMPTFA
Roztwór wodorotlenku amonuSigma-Aldrich 30501-1L-1MNH4OH
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 z membraną Ultracel-30Merck MilliporeUFC903024MWCO
Sep-Pak C18, 100 mgWodyWAT023590kolumna SPE
Resprep 12-portowy rozdzielacz SPE Restek26077Kolektor próżniowy
TMT10plex Zestaw odczynników do etykiet izobarycznychThermo Fisher Scientific90110TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC SystemDionex5200.0356Separacja próbek online
Ultimate 3000 RPLC Szybki system binarnyseparacji DionexIQLAAAGABHFAPBMBEZFrakcjonowanie offline o wysokim pH
Orbitrap Fusion Tribrid spektrometrmasowy Thermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCXSpektrometr masowy do analizy próbek
Proteome Discoverer 2.0 Thermo Fisher ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUHProteomika platforma wyszukiwania
Mascot v2.4Matrix Science - Wyszukiwarka proteomiki
Sequest HTThermo - Wyszukiwarka proteomiki
SZCZYTY v7.5 Rozwiązania bioinformatyczne Inc.) - Wyszukiwarka proteomiki
Uznanie PepMap 100, 75 i mikro; m x 2 cm, C18, 100 & wielkość porów, 3 i mikro; m wielkość cząstekThermo Fisher Scientific164535Kolumna pułapkowa (nano HPLC)
Uznanie PepMap C18, 75 i mikro; m x 500 mm, 100Å Wielkość porów,  2 i mikro; m wielkość cząstekKolumna separacyjnaThermo Fisher Scientific164942
Koncentratory o dużej pojemności Savant SpeedVac KoncentratorThermo Fisher ScientificSC210A-230SpeedVac/Vacuum
Peptyd XBridge Kolumna BEH C18, 130Å, 3.5 µ m, 2,1 mm X 250 mmWoda186003566Kolumna separująca (mikroHPLC)
Filtr (nano HPLC)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
  2. Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
  3. Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
  4. Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
  5. Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
  6. Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
  7. Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
  8. Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
  9. Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
  10. Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
  11. Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555(2012).
  12. Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
  13. Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
  14. Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
  15. Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
  16. Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11(2016).
  17. Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
  18. Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
  19. Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
  20. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  21. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  22. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
  23. Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
  24. Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Filtracja MWCOHPLC w fazie odwr conejanaliza LC MSprefrakcjonowanie peptyd wpeptydy endogennespektrometria masidentyfikacja peptyd w

Powiązane artykuły