Artykuł metodologiczny

Regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/56250

⸱

12 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ogólną strategię regeneracji komercyjnych mikroelektrod złotych wyposażonych w bezznacznikowy analizator komórek, mający na celu zaoszczędzenie na wysokich kosztach eksploatacji testów opartych na mikroprocesorach. Proces regeneracji obejmuje trawienie trypsyną, płukanie etanolem i wodą oraz etap wirowania, który umożliwia wielokrotne użycie mikroczipów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test komórkowy bez znaczników jest korzystny dla badań biochemicznych, ponieważ nie wymaga użycia zwierząt doświadczalnych. Ze względu na swoją zdolność do dostarczania bardziej dynamicznych informacji o komórkach w warunkach fizjologicznych niż klasyczne testy biochemiczne, ten bezznacznikowy test komórkowy w czasie rzeczywistym oparty na zasadzie impedancji elektrycznej przyciąga coraz większą uwagę w ciągu ostatniej dekady. Jednak jego praktyczne zastosowanie może być ograniczone ze względu na stosunkowo wysoki koszt pomiaru, w którym do analizatora komórek stosuje się kosztowne jednorazowe mikroczipy ze złota. W tym protokole opracowaliśmy ogólną strategię regeneracji złotych mikroelektrod z matrycą wyposażonych w komercyjny analizator komórek bez etykiety. Proces regeneracji obejmuje trawienie trypsyny, płukanie etanolem i wodą oraz etap wirowania. Proponowana metoda została przetestowana i wykazano, że jest skuteczna w przypadku regeneracji i wielokrotnego użycia komercyjnych płytek elektronicznych co najmniej trzy razy, co pomoże naukowcom zaoszczędzić na wysokich kosztach bieżących testów komórkowych w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki wydajnemu i mniej pracochłonnemu procesowi eksperymentalnemu, technologia komórkowa bez znaczników odnotowała szybki wzrost w ciągu ostatniej dekady do celów analitycznych i przesiewowych, takich jak w aspekcie proteomiki1,2, drug delivery3, etc.4,5 W porównaniu z tradycyjnymi metodami biochemicznymi mającymi na celu analizę komórek, bezznacznikowy test komórkowy w czasie rzeczywistym z prototypem opracowanym przez Giaevera i współpracowników before6 opiera się na zasadzie rejestrowania zmian sygnału elektrycznego na powierzchni mikrochipów podłączonych do komórek, które pozwalają na ciągły pomiar wzrostu lub migracji komórek w sposób ilościowy. Podążając za tą strategią, wprowadzono system elektronicznej detekcji komórek w czasie rzeczywistym (RT-CES) wykorzystujący zasadę wykrywania opartą na impedancji elektrycznej7,8, a ostatnio uruchomiono komercyjny analizator komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) do badań laboratoryjnych9.

Komercyjna analizator komórek w czasie rzeczywistym głównie odczytuje wywołane przez komórki sygnały impedancji elektrycznej, które wynikają z fizjologicznych zmian inkubowanych komórek, w tym proliferacji komórek, migracji, żywotności, morfologii i przylegania do powierzchni mikroprocesorów10,11. Takie sygnały elektryczne są następnie przekształcane przez analizator w bezwymiarowy parametr zwany indeksem komórki (CI) w celu oceny stanu ogniwa. Zmiana impedancji mikroczipów odzwierciedla głównie lokalne środowisko jonowe pokrytych ogniw na granicy faz elektroda/roztwór. W związku z tym wydajność analityczna analizatora komórkowego zależy w dużej mierze od rdzenia czujnika, jednorazowych mikroczipów (tj. tak zwanych płytek elektronicznych, np. 96/16/8-dołk), które są wykonane z ułożonych w układ złotych mikroelektrod litograficznie wydrukowanych na dnie dołków inkubacyjnych. Złote mikroelektrody łączą się w okrąg on-line (Rysunek 1) i pokrywają większość powierzchni dołków inkubacyjnych, co pozwala na dynamiczne i czułe wykrywanie przyłączonych komórek3,12,13,14. CI zwiększy się w przypadku większego pokrycia powierzchni komórek na chipie i zmniejszy się, gdy komórki zostaną wystawione na działanie substancji toksycznej powodującej apoptozę. Chociaż analizator komórek w czasie rzeczywistym jest często używany do określania cytotoksyczności11 i neurotoxicity15 i dostarcza więcej informacji kinetycznych niż klasyczna metoda punktów końcowych, jednorazowe płytki elektroniczne są najdroższymi materiałami eksploatacyjnymi.

Do tej pory nie było dostępnych metod regeneracji płytki elektronicznej, co prawdopodobnie wynika z faktu, że w grę wchodzą trudne warunki regeneracji, takie jak roztwór piranii lub kwas octowy16,17,18, które mogą zmienić stan elektryczny mikroczipów złota. Dlatego w procesie regeneracji płytki elektronicznej pożądana będzie łagodna i skuteczna metoda usuwania przylegających komórek i innych substancji z powierzchni wiórów złota. Niedawno opracowaliśmy protokół mający na celu regenerację jednorazowych płytek elektronicznych przy użyciu odczynników niekorozyjnych, a zregenerowane chipy zostały scharakteryzowane metodami elektrochemicznymi, a także optycznymi19. Stosując łatwo dostępne i umiarkowane odczynniki laboratoryjne, w tym trypsynę i etanol, ustaliliśmy ogólną metodę regeneracji komercyjnej płytki elektronicznej bez skutków ubocznych, która jest z powodzeniem stosowana do regeneracji dwóch głównych typów płytek elektronicznych (zarówno 16, jak i L8) stosowanych do RTCA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, proces regeneracji obejmuje etap trawienia trypsyny i płukania etanolem i wodą. Czas trawienia zmienia się w zależności od liczby użytych komórek, a rodzaj i liczba użytych komórek może się różnić w zależności od celów eksperymentalnych. Zaleca się sprawdzenie zregenerowanych mikroczipów metodami optycznymi i elektrochemicznymi w celu optymalizacji warunków regeneracji. Podczas eksperymentu mogą być zaangażowane rozpuszczalne i nierozpuszczalne substancje chemiczne, a tutaj szczegółowo opisano te dwa typowe przypadki procedur regeneracji.

1. Przygotowanie roztworów regeneracyjnych

UWAGA: Przygotuj i przetwarzaj wszystkie roztwory w sterylnych warunkach.

  1. Przygotuj świeży 0,25% (g/v) roztwór trypsyny. Trypsynę można kupić lub świeżo przygotować w następujący sposób.
    1. Rozpuść 0,25 g trypsyny w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7,4 (PBS).
    2. Mieszać roztwór, aż trypsyna całkowicie się rozpuści w temperaturze 4 oC. Mieszaj roztwór na niskich obrotach, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków.
    3. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Przygotuj 75% etanolu przy użyciu etanolu absolutnego. Wlać 75 ml absolutnego etanolu do kolby miarowej i dodawać wodę dejonizowaną, aż objętość osiągnie 100 ml. W razie potrzeby przeprowadzić dalszą sterylizację.

2. Inkubacja i proliferacja komórek A549 w płytkach elektronicznych

UWAGA: Płytki elektroniczne typu 16 i L8 są wykonane z ułożonych w układ złotych mikroelektrod litograficznie wydrukowanych na dnie dołków inkubacyjnych. Tablica elektroniczna 16 ma 16 dołków, podczas gdy tablica elektroniczna L8 ma 8 dołków. Studzienki płytki elektronicznej 16 są okrągłe, podczas gdy studzienki płytki elektronicznej L8 są zaokrąglonymi prostokątami. Objętość każdej płytki elektronicznej 8 dołka wynosi około 830 μl, a każdej płytki elektronicznej 16 dołka około 270 μl.

  1. Hodowla komórkowa A549
    1. Hodowla komórek A549 w pożywce Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną w naczyniu do hodowli komórkowej.
    2. Przejść przez komórki, gdy gęstość komórek osiągnie ~75%, a następnie przemyć przylegającą warstwę komórek 1 × PBS i trypsynizować 0,25% roztworem trypsyny przez 1 minutę w temperaturze 37 oC. Odwirować komórki przy 179 × g przez 5 minut, aby usunąć trypsynę. Ponownie zawiesić komórki w pożywce o pojemności 10 ml w celu dalszej hodowli lub innych eksperymentów.
      UWAGA: Roztwór komórek zawieszonych w pożywce jest tutaj oznaczony jako bufor zawiesiny komórek.
    3. Wyjmij 10 μl i policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Użyj pożywki RPMI-1640, aby dodatkowo rozcieńczyć bufor zawiesiny komórek, aby przygotować 30 000-80 000 komórek/ml buforu zawiesiny komórek do eksperymentów.
  2. Eksperyment proliferacji/cytotoksyczności i gromadzenie danych
    1. Dodać 50 μl (150 μl dla płytki elektronicznej L8) pożywki komórkowej do każdej studzienki inkubacyjnej płytki elektronicznej 16 i pozostawić na 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego w celu zrównoważenia. Ręcznie włożyć płytkę elektroniczną 16 do analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 oC.
    2. Uruchom program operacyjny analizatora komórek w czasie rzeczywistym na komputerze. Na domyślnej stronie konfiguracji wzorca eksperymentu wybierz pozycję "Model eksperymentu" i nazwij uruchomiony test.
    3. Na stronie Układ wybierz odpowiednie studnie, które są uwzględnione w eksperymencie i wprowadź informacje, takie jak typ komórki, liczba i nazwy leków w polach edycji. Na stronie Harmonogram dodaj kroki eksperymentalne, a następnie wybierz czas trwania (np. 12, 24 lub 48 godzin) każdego kroku i interwału pozyskiwania danych w czasie rzeczywistym.
      Uwaga: W tym przypadku interwał kroku 1 i 2 wynosi 1 minutę i 15 minut później.
    4. Zapisz plik i kliknij przycisk "Start", aby zmierzyć impedancję tła nośnika na jego stronie indeksu komórek; wynikowe dane zostaną automatycznie odjęte. Na stronie Wykres studni można odwiedzić wszystkie krzywe studni. Na stronie Wykres dodaj studnie, a zostanie wyświetlony wykres indeksu komórek czasowych.
    5. W eksperymencie proliferacji komórek najpierw kliknij przycisk "Pauza", aby wstrzymać program . Następnie wyjąć płytkę elektroniczną i dodać 100 μl buforu zawiesiny komórek A549 do dołka w temperaturze pokojowej. Pozostawić płytkę na 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby komórki mogły osiąść na dnie dołków inkubacyjnych.
    6. Ręcznie włóż płytkę elektroniczną do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Kliknij przycisk "Start", aby kontynuować eksperyment.
      Uwaga: Na stronie Wykres analizator w sposób ciągły rejestruje wartości indeksu komórek lub krzywe przez cały czas trwania eksperymentu.
    7. Po zakończeniu eksperymentu wejdź na stronę Wykres i otwórz plik eksperymentu. Następnie wybierz wszystkie testowane studzienki inkubacyjne i wynikowe krzywe indeksu komórkowego, które można uśrednić lub znormalizować po raz ostatni przed dodaniem leków farmaceutycznych lub zmianą pożywki, aby zmniejszyć różnice między testami. Na stronie Data Analysis (Analiza danych) można obliczyć EC50 lub IC50

3. Regeneracja płyt elektronicznych

UWAGA: Dla każdego etapu płukania, roztwór w płytce elektronicznej był dokładnie mieszany (5-10 razy) za pomocą pipety.

  1. Przypadek 1: Ocena cytotoksyczności leku przeciwnowotworowego
    1. Nasiona komórek A549 na płytce elektronicznej, jak opisano w sekcji 2.
    2. Najpierw rozpuść lek przeciwnowotworowy chlorowodorek doksorubicyny (DOX) w pożywce komórkowej. Powoli dodawaj DOX do komórek (końcowe stężenie DOX wynosi 30 μg/ml) za pomocą pipety. Zapisać CI zgodnie z opisem w punkcie 2.
      UWAGA: Zastosowana płytka elektroniczna została zregenerowana natychmiast po zakończeniu eksperymentu. W tym przypadku, ponieważ DOX jest rozpuszczalną substancją chemiczną, regeneracja płytki elektronicznej zgodnie z protokołem jest stosunkowo łatwa do przeprowadzenia i nie są wymagane żadne dodatkowe kroki.
    3. regeneracja
      1. Wyjmij elektroniczną płytkę zawierającą komórki ze stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Umieść zużytą płytkę elektroniczną w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj pożywkę hodowlaną za pomocą pipety. Odpipetować całe podłoże.
      2. Opłucz płytki elektroniczne 200 μl wodą dejonizowaną 3 razy w temperaturze pokojowej.
      3. Pozostałe komórki na płytkach elektronicznych trawić 0,25% świeżo przygotowanej trypsyny przez 1-2 godziny (200 μl/dołek) w inkubatorze w temperaturze 37 oC. Po zakończeniu trawienia wymieszać roztwór inkubacyjny 5-10 razy za pomocą pipety i odpipetować cały roztwór z okapu bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej.
      4. Wypłucz płytki elektroniczne odpowiednio 200 μl etanolu i 200 μl wody w następujący sposób: woda dejonizowana 2 razy, 100% etanol 2 razy; 75% etanol 2 razy; woda dejonizowana 2 razy. Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub bibułce, aby zdekantować pozostałą wodę o temperaturze pokojowej.
      5. Ultrafioletem sterylizuj zregenerowaną płytkę elektroniczną przez 1-2 godziny w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Podwój objętość wszystkich roztworów do regeneracji płytki elektronicznej L8.
  2. Przypadek 2: podawanie leku za pomocą materiału mezoporowatego.
    1. Użyj mezoporowatych materiałów krzemionkowych przypominających pręciki o średniej wielkości porów 5,6 nm jako matryc dostarczania leków, jak wcześniej informowano20.
      UWAGA: W tym przypadku płytka elektroniczna została wykorzystana do monitorowania wpływu uwalniania leku na komórki.
      1. Dodaj materiały mezoporowate do roztworu inkubacyjnego każdej studzienki płytek elektronicznych. Ponieważ materiały krzemionkowe nie są rozpuszczalne i wytrącają się w płytce elektronicznej, przepłucz płytkę w następujący sposób:
    2. Wykonaj kroki 3.1.3.1-3.1.3.3 zgodnie z opisem dla przypadku 1.
    3. Opłucz mikroczipy 200 μl dejonizowanej wody w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej.
    4. Wypłucz mikroczipy 200 μl absolutnego etanolu 2 razy w temperaturze pokojowej.
    5. Opłucz mikroczipy 200 μl 75% etanolu raz w temperaturze pokojowej.
    6. Dodaj 250 μl 75% etanolu do każdego dołka i uszczelnij płytkę elektroniczną folią uszczelniającą w temperaturze pokojowej.
    7. Wirować z prędkością 114 x g przez 2 minuty i opróżnić płytkę elektroniczną. Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub bibułce, aby zdekantować pozostałą wodę o temperaturze pokojowej.
    8. Powtórz kroki 3.2.5-3.2.7 raz.
    9. Ultrafioletem sterylizuj zregenerowaną płytkę elektroniczną przez 1-2 godziny w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Podwój objętość całego roztworu podczas płukania płytek elektronicznych L8.

4. Ocena efektu regeneracji

  1. Charakterystyka optyczna regenerowanej powierzchni płytki elektronicznej
    1. Za pomocą stalowej łyżki ostrożnie zdemontuj dolną część studzienki inkubacyjnej ze świeżej i zregenerowanej płytki elektronicznej, która zawiera ułożone w układ złote mikroelektrody. Zakładając plastikową rękawicę, ostrożnie wytrzyj część zawierającą mikroczip z płytki elektronicznej za pomocą stalowej łyżki.
    2. Umieść obie części na środku szklanych szkiełek mikroskopowych i zbierz wynikowe widma Ramana za pomocą mikroskopu Ramana wyposażonego w detektor CCD21.
      UWAGA: Spektrometr został wyposażony w laser o długości fali 633 nm, a widma rejestrowane były w odstępie 30 s naświetlania laserem na długości fali w zakresie 500-3500 cm-1. Obrazy optyczne uzyskano za pomocą mikroskopu Ramana przy użyciu soczewki oka 10x i obiektywu 50x. Rysunek 1A i Rysunek 1C również uzyskano przy użyciu zainstalowanego aparatu do mikroskopu Ramana.
    3. Aby ocenić żywotność przyłączonych komórek po wchłonięciu leku przeciwnowotworowego na świeżych i zregenerowanych płytkach elektronicznych, należy użyć konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego do monitorowania spontanicznej fluorescencji cząsteczek DOX wchłoniętych przez A549.
      1. Aby zarejestrować spontaniczną fluorescencję pochłoniętego DOX przez komórki (świeże i zregenerowane płytki elektroniczne z ogniwami A549), użyj obiektywu olejowego 63X i 485 nm jako długości fali wzbudzenia.
  2. Zachowania elektrochemiczne regenerowanych elektrod
    UWAGA: Ponieważ ręczny demontaż komercyjnej płytki elektronicznej jest trudny i nie jest idealny do oceny sprawdzonego stanu elektrycznego powierzchni, wydajność regeneracji protokołu oceniono przy użyciu zwykłej elektrody węglowej ze złota/szklistego (GCE) jako platformy testowej, na której przeprowadzono elektrochemiczną spektroskopię impedancji (EIS). Średnice elektrody Au i GCE wynoszą po 3 mm. Dane elektrochemiczne uzyskano za pomocą analizatora elektrochemicznego z układem trójelektrodowym, a pomiary impedancji przeprowadzono przy użyciu sygnału prądu przemiennego (AC) o amplitudzie 10 mV w szerokim zakresie częstotliwości od 100 kHz do 0,01 Hz.
    1. Przed pomiarem wypoleruj elektrodę Au i GCE do lustrzanej powierzchni za pomocą zawiesiny tlenku glinu na ściereczce do polerowania, a następnie wykonaj sonikację w wodzie, aby usunąć wszelkie cząstki.
    2. Aktywuj elektrodę Au w 0,5 M H2SO4. Uzyskaj dane EIS samej elektrody Au i GCE w 10 mM roztworze elektrolitu KCl zawierającym 1mM K3[Fe(CN)6] zgodnie z opisem22.
    3. Przygotować podstawowy roztwór ogniwa A549 zgodnie z ppkt 2.1.2 i 2.1.3. Upuść zawiesinę ogniw o objętości 10 μl na powierzchnię elektrody Au i GCE. Inkubować elektrodę Au i GCE zmodyfikowane komórkami w inkubatorze o temperaturze 37 oC przez 3 godziny. Uzyskaj dane EIS elektrody Au i GCE zmodyfikowanej ogniwami w 10 mM roztworze elektrolitu KCl zawierającym 1mM K3[Fe(CN)6].
    4. Zregeneruj elektrody za pomocą protokołu i zmierz EIS.
      1. Zanurz elektrodę Au i GCE modyfikowane komórkami w 0,25% trypsyny na 0,5-2 godziny. Przepłucz elektrodę Au i GCE delikatnie wodą 4 razy. Delikatnie przepłucz elektrody absolutnym etanolem 4 razy. Zanurz elektrodę Au i GCE w 75% etanolu na ~5 min. Delikatnie opłucz frytki 75% etanolem 4 razy.
      2. Uzyskać dane EIS regenerowanej elektrody Au i GCE w 10 mM roztworze elektrolitu KCl zawierającym 1mM K3[Fe(CN)6].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości powierzchni mikroczipów złota: Procedury regeneracji stosowane w tym protokole zostały opisane w Rysunek 1. Rysunek 2 pokazuje mikroskopijne obrazy powierzchni świeżych i zregenerowanych płytek elektronicznych przez mikroskop optyczny. Jak pokazano na Rysunek 2A i Rysunek 2C, obserwacje mikroskopowe wykazały, że praktycznie nie ma róż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tabeli 1 podsumowaliśmy kilka dostępnych metod 17,23,24,25,26 do regeneracji mikroczipów. Zasadniczo, metody te wymagały stosunkowo trudnych warunków eksperymentalnych, aby osiągnąć pełną regenerację chipów ze względu na obecność silnych oddziaływań cząsteczka-cząsteczka, takich jak kompleks immunologiczny stosowany w chipach SPR. Jednak te ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U1703118), projekt finansowany przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (PAPD), Program Jiangsu Shuangchuang, Otwarte Fundusze Państwowego Kluczowego Laboratorium Chemo/Biosensoringu i Chemometrii (2016015) oraz Narodowe Laboratorium Biomakromolekuł (2017kf05) oraz projekt Jiangsu Specially-Designated Professor, Chiny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczur: Sprague-DawleyCharles RiverCat# 400
mysz anty-szczur CD11b monoklonalny (klon OX42)Bio-RadCat# MCA275RPanoramowanie: 1:1,000; Barwienie: 1:500
Koza wielokolążkowa anty-Iba1 AbcamCat# AB5076Barwienie: 1:500
Królik poliklonalny anty-Ki67 Biblioteka Kot# AB15580Barwienie: 1:500
Alexa Fluor Donkey anty-mysz 594InvitrogenCat# 11055Barwienie: 1:500
Alexa Fluor Donkey anty-koza 488InvitrogenCat# A-21203Barwienie: 1:500
Alexa Fluor Donkey anty-Rabbit 647InvitrogenCat# A-31573Barwienie: 1:500
Triton-X (detergent w barwieniu ICC)Thermo FisherCat# 28313
Siarczan heparanuGalen Materiały laboratoryjneKat# GAG-HS01
HeparynaSigma Kat# M3149
Pepton z suchej masy mlecznejSigmaCat# P6838
TGF-β 2PeprotechCat# 100-35B
Mysz IL-34R& D SystemsCat# 5195-ML/CF
Cholesterol z wełny owczejAvanti Polar LipidsCat# 700000P
Kolagen IVCorning Kat# 354233
Kwas oleinowyCayman Chemicals Kat# 90260
11(Z)Kwas eikosadienowy (gondoiczny)Kajmany Chemikalia Kot# 20606
Calcein AM barwnikInvitrogenCat# C3100MP
Ethidium homodimer-1InvitrogenCat# E1169
DNaseIWorthingtonCat# DPRFS
Percoll PLUSGE HealthcareCat# 17-5445-02
Trypsyna SigmaCat# T9935
DMEM/F12GibcoCat# 21041-02
Penicylina / StreptomycynaGibcoCat# 15140-122
GlutaminaGibcoCat# 25030-081
N-acetylocysteina SigmaCat# A9165
InsulinaSigmaCat# 16634
Apo-transferyna SigmaCat# T1147
Selenin soduSigmaCat# S-5261
DMEM (wysoki poziom glukozy)GibcoCat# 11960-044
Dapi Fluoromount-GSouthern BiotechCat# 0100-20 
Poli-D-lizyna Tabliczki SigmaCat# A-003-E
Primaria VWRCat# 62406-456
Odczynniki podstawowe  reconstitution  Stężenie zastosowanePrzechowywanie
Apo-transferyna10 mg/ml w PBS 1:100-20&stopni; C
N-acetylocysteina5 mg/ml w H2O 1:1,000-20&stopni; C
Selenin sodu2,5 mg/ml w H2O 1:25,000-20&stopni; C
Kolagen IV200 μ g/ml w PBS 1:100-80&stopni; C
TGF-b220 μ g/ml w PBS 1:10,000-20&stopni; C
IL-34100 μ g/ml w PBS 1:1,000-80&stopni; C
Cholesterol z wełny owczej1,5 mg/ml w 100% etanolu 1:1,000-20&stopni; C
Siarczan heparanu1 mg/ml w H2O1:1,000-20° C
Kwas oleinowy/Kwas gondoinowyGondoinowy: 0,001 mg/ml; Oleinowy: 0,1 mg/ml w 100% etanolu 1:1,000-20&stopni; C
Heparyna50 mg/ml w PBS 1:100-20&stopni; C
Solutions  Przepis  Komentarze
Bufor perfuzyjny50 μ g/mL heparyny w DPBS++ (PBS z Ca++ i Mg+ +)Stosowaćw stanie lodowatym
Bufor dounkujący200 μ L 0,4% DNaseI w 50 ml DPBS++Stosować w stanie lodowatym
Bufor do płukania2 mg/ml peptonu z suchej masy mlecznej w DPBS++
Microglea Growth Medium (MGM)DMEM/F12 zawierające 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μ g/ml streptomycyny, 2 mM glutaminy, 5 μ g/ml N-acetylocysteiny, 5 μ g/ml insuliny, 100 μ g / ml apo-transferyny i 100 ng / ml seleninuUżyj lodowatego MGM, aby usunąć mikroglej z naczynia do immnopaningu.
Kolagen IV PowłokaMGM zawierająca 2 μ g/mL kolagen IV
Bufor seperacyjny mielinowy9 mL Percoll PLUS, 1 ml 10x PBS bez Ca++ i Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2Dobrze wymieszać po dodaniu  CaCl2 i MgCl2
TGF-b2/IL-34/Pożywki wzrostowe zawierające cholesterol (TIC) MGM zawierające ludzkie 2 ng/ml TGF-b2, 100 ng/ml mysiej IL-34, 1,5 μ g/ml cholesterolu z wełny owczej, 10 μ g/ml siarczanu heparanu, 0,1 &m; g/ml kwasu oleinowego i 0,001 μ g/ml kwasuUpewnij się, że dodałeś cholesterol do podłoża podgrzanego do 37 stopni C i nie dodawać więcej niż 1,5 μ g / ml lub wytrąci się. Nie filtruj mediów zawierających cholesterol. Zrównoważ pożywkę TIC z 10% CO2 przez 30 minut - 1 godzinę przed dodaniem do komórek, aby zapewnić optymalne pH.
, gdy jest zimny sodu gondonowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792(2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748(2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gold MicroelectrodesReal Time Cell AnalyzerTrypsin DigestionEthanol RinseSpinning StepElectronic Plate RegenerationCell Proliferation AssayCytotoxicity EvaluationElectrochemical Impedance SpectroscopyConfocal Microscopy

Powiązane artykuły