RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

Summary

Przedstawiono eksperymentalny protokół oceny systemów korzeniowych roślin uprawianych w glebie za pomocą RGB i obrazowania hiperspektralnego. Połączenie szeregów czasowych obrazu RGB z informacjami chemometrycznymi ze skanów hiperspektralnych optymalizuje wgląd w dynamikę korzeni roślin.

Abstract

Lepsze zrozumienie dynamiki korzeni roślin jest niezbędne do poprawy efektywności wykorzystania zasobów w systemach rolniczych i zwiększenia odporności odmian roślin uprawnych na stresy środowiskowe. Przedstawiono protokół eksperymentalny dla obrazowania RGB i hiperspektralnego systemów korzeniowych. Podejście to wykorzystuje ryzoboxy, w których rośliny rosną w naturalnej glebie przez dłuższy czas, aby obserwować w pełni rozwinięte systemy korzeniowe. Przedstawiono przykłady warunków eksperymentalnych do oceny roślin kłączowych w warunkach stresu wodnego i badania roli korzeni. Konfiguracja obrazowania RGB jest opisana w celu taniego i szybkiego ilościowego określenia rozwoju korzeni w czasie. Obrazowanie hiperspektralne poprawia segmentację korzeni od tła gleby w porównaniu z progowaniem opartym na kolorach RGB. Szczególną zaletą obrazowania hiperspektralnego jest pozyskiwanie informacji chemometrycznych na temat systemu korzenia-gleby w celu zrozumienia funkcjonalnego. Wykazano to za pomocą mapowania zawartości wody w wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie spektralne jest jednak bardziej złożone pod względem pozyskiwania, przetwarzania i analizy obrazu w porównaniu z podejściem RGB. Połączenie obu metod może zoptymalizować kompleksową ocenę systemu korzeniowego. Podano przykłady zastosowań integrujące cechy korzeni i nadziemia w kontekście fenotypowania roślin i badań fizjologicznych roślin. Dalszą poprawę obrazowania korzeniowego można uzyskać poprzez optymalizację jakości obrazu RGB z lepszym oświetleniem przy użyciu różnych źródeł światła oraz poprzez rozszerzenie metod analizy obrazu w celu wnioskowania o właściwościach strefy korzeniowej na podstawie danych spektralnych.

Introduction

Korzenie pełnią kilka podstawowych funkcji dla roślin, takich jak magazynowanie asymilatów, zakotwiczenie roślin lądowych w glebie oraz pobieranie i transport wody i składników odżywczych¹. Z ewolucyjnego punktu widzenia tworzenie osi korzeniowych jest uważane za podstawowy warunek wstępny pochodzenia roślin lądowych². Pomimo tej ważnej roli, historycznie korzenie zajmowały jedynie marginalną pozycję w badaniach biologicznych. Jednak w ostatnich czasach rośnie zainteresowanie naukowców systemami korzeniowymi roślin, czego dowodem jest Rysunek 1.

Rysunek 1: Znaczenie badań korzeni w naukach o roślinach.
Liczba badań związanych z korzeniami jako procent wszystkich opublikowanych badań nad roślinami w czasopismach SCI w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Wynik wyszukiwania ze Scopus za pomocą słów kluczowych "roślina" i "roślina ORAZ korzeń". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Można przypuszczać, że dwa główne powody leżą u podstaw ostatnich postępów w badaniach nad korzeniami. Po pierwsze, roślinność lądowa jest narażona na częstsze stresy środowiskowe w wyniku globalnych zmian³. W kontekście produkcji roślinnej szacuje się, że na całym świecie około 30% powierzchni użytków rolnych jest ograniczonych przez wodę i fosfor^4,5. Stres związany z obniżeniem plonów jest główną przyczyną znacznych różnic w plonach, które są globalnie szacowane na niższe niż 50% potencjalnej produktywności dla agroekosystemów zasilanych deszczem⁶. Oprócz niskiej dostępności zasobów, jest to również związane ze słabą efektywnością wykorzystania zasobów, tj. niewystarczającą zdolnością zakładu do wykorzystania dostępnych zasobów⁷. Powoduje to straty zasobów mobilnych, takich jak azotany, które mogą negatywnie wpływać na inne ekosystemy. Na przykład obecna globalna efektywność wykorzystania azotu jest szacowana na 47%⁸. Lepsze efektywne wykorzystanie zasobów dzięki ulepszonym metodom zarządzania i odmianom ma zatem duże znaczenie zarówno dla trwałego wzrostu produktów rolnych, jak i dla zrównoważenia środowiskowego. W tym kontekście korzenie roślin są uważane za kluczowy cel dla ulepszonych upraw i systemów upraw^9,10.

Drugim ważnym tłem dla niedawnego zainteresowania korzeniami roślin jest postęp technologiczny w metodach pomiaru. Metody korzeniowe od dawna są ograniczone przez dwa kluczowe wyzwania: do pomiaru korzeni roślin rosnących w glebie musiały one zostać wyizolowane w celu ilościowego określenia, głównie za pomocą washing¹¹, zaburzając w ten sposób architektoniczny układ osi korzeniowych. Obserwacja korzeni in situ przy użyciu metod wykopaliskowych, zachowując w ten sposób naturalne położenie korzeni w glebie, została wykorzystana do opisu botanicznego¹². Są one jednak bardzo czasochłonne, a tym samym nie spełniają wymagań dotyczących przepustowości porównawczej strukturalno-funkcjonalnej analizy systemu korzeniowego. Z drugiej strony, wysokoprzepustowe metody pomiaru architektury korzeni były w większości wykonywane na sztucznych pożywkach i dla sadzonek roślin ¹³, gdzie ekstrapolacja do naturalnego środowiska wzrostu roślin jest wątpliwa¹⁴.

Niedawny boom badań nad korzeniami jest ściśle związany z postępem w metodach obrazowania¹⁵. Podejścia do obrazowania w badaniach źródłowych można z grubsza podzielić na trzy typy. Po pierwsze, istnieją metody 3D o wysokiej rozdzielczości, takie jak CT i MRI¹⁶. Metody te są najbardziej odpowiednie do badania procesów interakcji korzeni roślin z glebą, takich jak zator ksylemu wywołany suszą¹⁷. Zazwyczaj stosuje się je do stosunkowo małych próbek, gdzie umożliwiają szczegółowe obserwacje. Porównanie tomografii komputerowej i rezonansu magnetycznego dla doniczek o różnych rozmiarach i obrazowania drobnych korzeni znajduje się w¹⁸. Po drugie, istnieją wysokoprzepustowe metody obrazowania^19,20. Metody te opierają się głównie na powszechnym obrazowaniu 2D RGB korzeni rosnących na sztucznym podłożu (żel, papier do kiełkowania), gdzie wysoki kontrast umożliwia stosunkowo prostą sekcję między korzeniami a tłem. Są one odpowiednie do wysokoprzepustowego porównania cech korzeni siewek o różnych genotypach upraw w standaryzowanych warunkach sztucznego wzrostu¹³. Pomiędzy tymi dwoma podejściami znajdują się metody rhizobox: wykorzystują obrazowanie 2D korzeni rosnących w glebie przez dłuższy czas i mają średnią przepustowość^21,22. Niedawnym wyzwaniem dla obrazowania korzeni (2D) jest uchwycenie również wskaźników funkcjonalności roota oprócz opisu struktury²³.

W tym artykule prezentujemy eksperymentalne protokoły obrazowania systemów korzeniowych hodowanych w ryzoboksach przy użyciu (i) taniego i prostego zestawu do obrazowania RGB na zamówienie oraz (ii) bardziej złożonego zestawu do obrazowania NIR. Przykładowe wyniki uzyskane z tych dwóch konfiguracji są pokazane i omówione w kontekście fenotypowania roślin i badań fizjologicznych roślin.

Protocol

1. Ryzoboxy do uprawy roślin

UWAGA: System eksperymentalny wykorzystuje ryzoboxy do uprawy roślin do obrazowania korzeni. Najpierw opisana jest konstrukcja skrzynek i użyte podłoże, a następnie podane są szczegóły dotyczące procedury napełniania.

1. Projektowanie ryzoboxów
   1. Stwórz rhizoboxy (Rysunek 2) z tylną płytą i bocznymi ramkami wykonanymi z szarego PVC o wytrzymałości 15 mm. Użyj pudełka o wymiarach 300 mm x 1000 mm. Do szyby przedniej należy użyć szkła mineralnego o grubości 6 mm, które jest przymocowane do ramy PCV za pomocą metalowych szyn przykręcanych do ścian bocznych.
   2. Wykonaj trzy otwory w dolnej ramie, aby umożliwić odprowadzenie nadmiaru wody. Otwory te można opcjonalnie zamknąć za pomocą plastikowych.
   3. Przed napełnieniem należy dostosować średnicę wewnętrzną ryzoboxa (od 10 mm do 30 mm), wkładając arkusze wielokomorowe z PC. W przypadku większości upraw zalecana jest wewnętrzna przestrzeń wynosząca 10 mm, aby zmniejszyć wagę całego systemu (waga rhizoboxa bez gleby wynosi 13,2 kg).

Rysunek 2: System eksperymentalny Rhizobox i jego elementy.
Rysunek po lewej stronie przedstawia wymiary kłącza, a po prawej jego pojedyncze elementy, czyli szarą tylną płytę z PCV z ramką boczną, przednie szkło mineralne, arkusze wielokomorowe o zmiennej średnicy wewnętrznej i metalowe kątowniki do mocowania przedniej szyby do tylnej komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. substrat
   1. Wypełnij kłącza ziemią polową (w tym eksperymencie: gliniastą gliną mułową z czarnoziemu wapiennego) przesianą do wielkości cząstek 2 mm.
   2. Otwórz kłącza w celu napełnienia podłoża do komory wewnętrznej (tylna płyta z ramkami bocznymi) w pozycji poziomej za pomocą wstępnie zwilżonego podłoża. Wypełniać poziomo, aby uniknąć nakładania warstw i segregacji między drobnymi i grubymi cząstkami, co ma miejsce podczas napełniania w pozycji pionowej poprzez wlewanie podłoża przez górny otwór.
   3. Podłoże należy wstępnie zwilżyć przed wypełnieniem. W zależności od rodzaju podłoża (szczególnie ze względu na zawartość mułu i gliny), nie należy przekraczać zawartości wody 0,12-0,18 cm³*^cm-3, aby uniknąć rozmazywania i degradacji struktury. Dodaj różnicę między wstępnym mieszaniem a docelową zawartością wody po napełnieniu podłoża do kizoboxów.
      UWAGA: Nie zaleca się wypełniania suchym podłożem (w piekarniku), a następnie dodawania całej wody, ponieważ może to spowodować silne osiadanie podłoża i powstawanie dużych pęknięć.
3. Przykład wypełniania krok po kroku
   1. Określ docelową zawartość wody. Tutaj początkowo ustawiono ją na 80% wody dostępnej dla roślin (PAW), gdzie rośliny nie cierpią z powodu niedoboru wody.
   2. Określić pojemność pola (FC) i stały punkt więdnięcia (PWP) podłoża. Tutaj uzyskaj FC za pomocą rurki PVC o równoważnej wysokości (100 cm) jak ryzoboxy.
      1. Zamknąć rurkę u dołu ścierniskiem z małymi otworami drenażowymi, dodać 1 cm żwiru, aby uniknąć zamykania otworów przez drobniejsze podłoże i wypełnić podłoże do takiej samej gęstości nasypowej, jaką zastosowano w kłączoboxach (1,3 g ^cm-3).
      2. Nasycić rurkę wodą, aż nastąpi drenaż i pozostawić ją na dwa dni do wyrównania (wynikowa zawartość wody jest z definicji równoważna pojemności pola), jednocześnie przykrywając górny otwór folią spożywczą, aby uniknąć parowania. Wartość pojemności pola osiągnięta dla gleby w tym doświadczeniu wyniosła 0,357 cm^{3 cm-3},
         UWAGA: Zawartość wody w PWP musi być znana z wyprzedzeniem ze standardowych metod fizycznych gleby (np. pomiary płyty dociskowej²⁴) lub z funkcji pedotranfer opartych na teksturze²⁵. Tutaj jest to równe 0,12 cm^{, 3 cm-3} dla użytej gleby.
      3. Również przy pomiarze FC za pomocą ekstrakcji za pomocą płytki ciśnieniowej należy przyjąć zawartość wody o potencjale matrycowym h=-100 hPa, a nie h=-330 hPa, aby odpowiadała geometrii ryzoboxa (wysokość 100 cm = 100 hPa).
      4. Obliczyć zawartość wody (WC) przy 80% PAW: WC (cm^{3 cm-3}) = 0,80 (FC-PWP) + PWP. W przypadku zastosowanych tutaj ograniczeń hydraulicznych gleby daje to objętościową zawartość wody przy 80% PAW wynoszącą 0,31 cm^{3 cm-3}.
      5. Oblicz ilość wody dla ryzoboxa o objętości 2850 cm^{3 (}30 cm szerokości, 1 cm przestrzeni wewnętrznej, 95 cm wysokości, z górą 5 cm wolną od podłoża do podlewania). Daje to objętość wody 883,5^cm3 równą 883,5 g przy gęstości wody wynoszącej 1,0 g ^cm-3 w temperaturze 20 °C.
   3. Określić gęstość nasypową (_{d b}) do wypełnienia kłączoboxów. Tutaj ustaw na 1,3 g ^cm-3 odpowiadające wartościom zwykle występującym w glebach rolnych. Ilość suchego podłoża potrzebna do wypełnienia objętości kizoboxa wynosząca 2850^cm3 przy tym d_b równa się 3705 g suchej gleby.
   4. Wstępnie zwilżyć suchą glebę do grawimetrycznej zawartości wody 0,108 g ^g-1 (równej objętościowej zawartości wody 0,14 cm^{3 cm-3}), dodając 400 g wody na 3705 g suchej gleby i delikatnie wymieszać, aby uzyskać jednorodny rozkład wody. Większe kruszywa należy rozdrabniać ręcznie, aby utrzymać wielkość cząstek ≤ 2 mm.
   5. Wstępnie zwilżoną glebę należy wsypać do otwartych pojemników na kłącza i delikatnie zagęścić za pomocą arkusza styropianu (30 x 10 x 1,5 cm), aby pokryć wewnętrzną objętość skrzynki, uzyskując w ten sposób jednorodną gęstość 1,3 g ^cm-3.
   6. Dodać pozostałą ilość wody (483,2 g), aby osiągnąć docelową zawartość wody 0,31 cm^{3 cm-3} poprzez spryskanie powierzchni za pomocą butelki z rozpylaczem. Zapewnij mały rozmiar kropli, aby uniknąć degradacji struktury powierzchni i jednorodnego zwilżania. Utrzymuj pudełko w równowadze podczas opryskiwania, aby monitorować ilość wody faktycznie dodanej do podłoża.
   7. Pozwól wodzie ponownie się rozprowadzić przez 10 minut, a następnie dociśnij szklankę do powierzchni i przymocuj ją bocznymi metalowymi szynami. Średnia masa końcowa kłączoboxów ze zwilżonym podłożem wynosiła 17818 ± 68 g (13230 g masy ryzoboxa + 3705 g suchej gleby + 883 g wody).
      UWAGA: Jednorodna zawartość wody wypełniona w poziomych pudełkach zostanie ponownie rozprowadzona, gdy skrzynki zostaną ustawione w końcowej pozycji zgodnie z powstałym gradientem potencjału. Jest to proces fizyczny zachodzący we wszystkich doniczkach do wzrostu roślin, zgodnie z ich geometrią (wysokością), a eksperymentatorzy powinni być świadomi ich hydrauliki doniczkowej²⁶.

2. Klimatyzacja pomieszczenia

1. Wyposaż pomieszczenie klimatyczne (Rysunek 3) w 8 lamp LED zapewniających jednorodne oświetlenie 450 μmol ^{m-2 s-1} z pikami widmowymi przy 440 (niebieski) i 660 (czerwony) nm dla optymalnego wzrostu roślin.

Rysunek 3: Komora klimatyczna z kłączoboxami do eksperymentu ze stresem.
(A) Widok z lewej strony na całą komorę z oświetleniem LED, stacją pogodową i komputerem PC (tutaj do rejestrowania higrometrów liściowych); Widok z prawej strony ze zbliżeniem na metalową ramę trzymającą ryzoboxy pod kątem 45° i drewniane płyty służące do osłaniania szyby z ryzoboxa przed światłem. (B) Doświadczenie stresowe z burakami cukrowymi łączące cztery etapy stresu ze względu na różne zapotrzebowanie atmosferyczne (wysokie/niskie) i dostępność wody w glebie (wysokie/niskie). Zielone paski średniej przewodności aparatów szparkowych wskazują reakcję roślin na stres. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Ustaw parametry otoczenia zgodnie z potrzebami rośliny/eksperymentu. Tutaj użyj 14 godzin światła i 10 godzin ciemności do oświetlenia. Podczas zakładania roślin i przed rozpoczęciem zabiegów stresowych należy ustawić temperaturę na 20°C w dzień i 15°C w nocy i utrzymywać wilgotność względną na poziomie 50 ± 8%.
3. Umieść kłączoboxy pod kątem 45°, używając odpowiedniej metalowej ramy. Maksymalizuje to wzrost korzeni w kierunku powierzchni szkła z powodu grawitropizmu.
4. Zakryj szklane okno drewnianą płytą, aby utrzymać strefę korzeniową w ciemności i uniknąć wzrostu glonów z powodu światła przenikającego przez szklaną powierzchnię.

3. Przykładowa konfiguracja i obróbka buraków cukrowych

1. Nasiona buraka cukrowego należy wstępnie kiełkować na mokrej bibule filtracyjnej przez trzy dni w temperaturze 20 °C w inkubatorze, aż do pojawienia się korzonka. Zapewnia to siew z żywotnymi roślinami.
   UWAGA: Wstępne kiełkowanie nie jest wymagane w przypadku roślin o dużym wigorze kiełkowania, co pozwala uniknąć ryzyka uszkodzenia korzonki podczas siewu. Jednak w przypadku nasion buraka cukrowego z grubą owocnią ryzyko niezdolnych do życia nasion jest wysokie, a wstępne kiełkowanie znacznie przyspiesza wschody korzonków w porównaniu z siewem bezpośrednim do gleby.
2. Wywierć mały otwór na głębokość około 1,5 cm gleby w środku kłącza za pomocą śrubokręta, umieść w nim jedno ziarno za pomocą pęsety z korzonkiem skierowanym w dół i obok szklanego okienka (poprawia to początkową widoczność) i delikatnie przykryj je ziemią.
3. Na wierzch gleby nałóż warstwę 0,5 cm drobnego żwiru (2-4 mm), aby chronić agregaty glebowe przed zalaniem podczas nawadniania i zmniejszyć straty związane z parowaniem. Aby ułatwić wschody, utrzymuj powierzchnię gleby wolną od żwiru w miejscu, w którym umieszczono nasiona.
4. Dodaj 10 g wody, aby poprawić ustawienie.
5. Podczas zakładania i wczesnego wzrostu, aż do rozpoczęcia eksperymentalnych zabiegów stresowych, rikoboxy należy nawadniać co 2-4 dni, aby utrzymać początkową wilgotność na poziomie 80% PAW.
   1. Określ wymaganą ilość wody do nawadniania, ważąc ryzoboxy i dodając wodę, aż do osiągnięcia początkowej wagi każdego pojedynczego pudełka. Do ręcznego nawadniania należy używać pipety, aby uniknąć degradacji struktury powierzchni podczas podlewania.
6. Ułóż kłączpudełka zgodnie z ustalonym projektem w pomieszczeniu klimatycznym. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na eksperymencie z sześcioma odmianami buraka cukrowego w pięciu powtórzeniach w całkowicie randomizowanym projekcie (CRD).
   1. Zmieniaj położenie ryzoboxów za każdym razem podczas wyjmowania ich z metalowego uchwytu w celu zważenia i podlewania. Pozwala to uniknąć skutków resztkowej (świetlnej) niejednorodności wewnątrz pomieszczenia klimatycznego.
7. Określ czas rozpoczęcia leczenia stresu i rodzaj stresu. Używane są tutaj następujące ustawienia (Rysunek 4).
   1. Pomiary rozpoczynamy w BBCH 15 (pięć rozwiniętych liści), z korzeniami pokrywającymi około 75% głębokości kłącza i baldachimem wystarczająco rozwiniętym do pomiarów przy liściach. Utrzymuj każdy stage przez co najmniej trzy dni, aby zapewnić adaptację do nowych ustawień i dokonać pomiaru.
   2. W przypadku obserwacji bezstresowych należy zachować ustawienia początkowe z optymalną wilgotnością gleby (80% PAW) i warunkami otoczenia (temperatura 20°C/15°C, 50 ± 8% wilgotności względnej), co daje deficyt ciśnienia pary w ciągu dnia (VPD) wynoszący 1,28 ± 0,1 kPa (por. Rysunek 3 C).
   3. Zwiększenie zapotrzebowania atmosferycznego na poziom VPD w ciągu dnia na poziomie 2,45 ± 0,4 kPa poprzez zwiększenie temperatury do 27°C/20°C i zmniejszenie wilgotności względnej do 35%, przy jednoczesnym utrzymaniu wilgotności gleby na poziomie 80% PAW.
   4. Następnie wysuszyć kłącza do 40% PAW, co odpowiada zawartości wody 0,215 ^{cm3 cm-3}, wstrzymując nawadnianie. Zresetuj początkowe warunki otoczenia przy niskim zapotrzebowaniu atmosferycznym (VPD 1,28 kPa).
   5. Połącz naprężenia zwiększające zapotrzebowanie atmosferyczne do VPD 2,45 kPa i utrzymuj wilgotność gleby na poziomie 40% PAW.

4. Metody obrazowania korzeni

1. Łącz metody obrazowania, aby wykorzystać ich zalety i w zależności od docelowych informacji.
   1. Zastosuj obrazowanie RGB w zakresie VIS, aby śledzić wzrost, architekturę i morfologię korzeni w czasie, co domyślnie wymaga częstych pomiarów. Zaletami obrazowania RGB są (i) niskie koszty, (ii) szybka akwizycja obrazu, (iii) niskie zapotrzebowanie na miejsce na dysku twardym (rozmiar obrazu: 48 MB) oraz (iv) wysoka rozdzielczość (3648 x 5472 pikseli).
   2. Obrazowanie hiperspektralne (HSI) należy stosować w zakresie NIR, gdy wymagane są cechy chemometryczne korzenia i gleby. Zaletami są (i) cechy spektralne do segmentacji między korzeniami a tłem gleby oraz (ii) dostęp do właściwości fizykochemicznych systemu (np. zawartość wody w glebie, wiek korzeni). Wadami są (i) dłuższy czas skanowania (około 16 minut na rhizobox), (ii) duży rozmiar zbiorów danych (13,7 GB na obraz rhizobox) oraz (iii) niższa rozdzielczość kamery NIR (320 x 256 pikseli) oraz (iv) większa złożoność analizy danych.
2. Obrazowanie korzenia RGB
   1. Użyj pudełka do obrazowania (Rysunek 4), które osłania przed światłem otoczenia i ustala pozycję kamery, składającej się z metalowej ramy o szerokości 1 m i wysokości 1 m ze ścianami bocznymi wyłożonymi preszpanami. Z przodu ustaw kamerę w dwóch pozycjach w odległości 80 cm od ryzoboxa.
      1. Przymocuj taśmę do ramy rhizobox za pomocą przezroczystej taśmy klejącej i umieść rhizobox w uchwycie pudełka do obrazowania.
      2. Oświetlić kłączobox za pomocą czterech świetlówek o mocy 24 W przymocowanych w odległości 80 cm od kłączoboxa. Zamontuj również cztery lampy UV o mocy 15 W w odległości 20 cm od ryzoboxa jako alternatywne oświetlenie wykorzystujące autofluorescencję korzenia w przypadku niskiego kontrastu między korzeniem a (jasnym) tłem podłoża.
      3. Zrób dwa zdjęcia (górna i dolna pozycja), aby pokryć górną i dolną połowę kłącza zakładką około 3 cm.
   2. Uzyskuj obrazy RGB za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej, która jest mocowana za pomocą szybkozłączek w odpowiednich pozycjach pudełka do obrazowania.
      1. Podczas korzystania ze świetlówek należy zastosować następujące ustawienia. Dostosuj te przykładowe ustawienia do wszelkich zmian wymiarów i oświetlenia, a także do modelu kamery.
         1. Wyłącz autofokus i stabilizator na obiektywie aparatu. Ustaw aparat w trybie ręcznym.
         2. Ustaw czułość ISO na 500. Ustaw czas otwarcia migawki na 13. Ustaw Przysłonę na 5.6.
         3. Wyłącz blokadę lusterka. Ustaw balans bieli na Automatyczny balans bieli.
      2. Użyj następujących ustawień oświetlenia za pomocą lamp UV:
         1. Wyłącz autofokus i stabilizator na obiektywie aparatu. Ustaw aparat w trybie ręcznym.
         2. Ustaw czułość ISO na 1000. Ustaw czas otwarcia migawki na 13. Ustaw Przysłonę na 5.6.
         3. Wyłącz blokadę lusterka. Ustaw balans bieli na Fluorescencja.
   3. Połącz obrazy RGB z góry i z dołu ryzoboxa w jeden obraz w edytorze zdjęć (np. Adobe Photoshop). Użyj taśmy na bocznej ramie kłączoboksów i kontroluj nakładające się na siebie obiekty (cechy korzeniowe i glebowe).
      1. Skopiuj dwa oddzielne obrazy, każdy o rozmiarze 3648 x 5472 pikseli, do nowego pliku o rozmiarze 3648 x 10944 pikseli i białym tle.
      2. Zmniejsz krycie warstwy dla jednego obrazu do 60% i wyrównaj nakładające się części obrazów (taśma, obiekty). Następnie przywróć krycie warstwy do 100%.
      3. Na podstawie linijki na obrazie dodaj dwie czerwone linie o długości dokładnie 1 cm na górze obrazu, gdzie nie ma korzeni. Linie te są później używane podczas analizy obrazu w celu przeskalowania obrazu do prawidłowych wymiarów długości.
      4. Scal wszystkie warstwy i usuń części obrazu poza okno wypełnione ziemią za pomocą narzędzia do przycinania.
      5. Zapisz obraz jako plik tiff do dalszej analizy.
      6. W przypadku obrazów z oświetleniem UV należy zredukować kolory do skali szarości przed zapisaniem za pomocą paska narzędzi Dopasowania - Czarno-białe i wybraniu predefiniowanego filtra Niebieski o wysokim kontraście.
   4. Do segmentacji korzeni i tła glebowego, a także do ilościowego określenia interesujących cech korzeni (np. długość, powierzchnia, średnica, rozgałęzienie) należy użyć dowolnego oprogramowania do analizy korzeni (dostępne narzędzia znajdują się w www.plant-image-analysis.org). Tutaj używany jest WinRhizo.
      1. Otwórz obraz tiff w oprogramowaniu rhizobox.
      2. Skalibruj skalę długości obrazu za pomocą pasków skalowania dodanych do obrazu.
      3. Wybierz opcję Na podstawie koloru w menu Analiza, w którym wybierz opcję Rozróżnienie korzenia i tła.
      4. Zdefiniuj plik kalibracyjny z klasami kolorów odpowiadającymi korzeniom i glebie (tło). Dla przykładowych obrazów użytych tutaj (por. Rysunek 8) zdefiniowano trzy klasy kolorów korzeni (stare boczne, młode boczne, korzeń palowy) i trzy klasy kolorów gleby.
      5. W przypadku obrazów w skali szarości (oświetlenie UV) wybierz (i) Na podstawie poziomów szarości i (ii) Blady odcień na czarnym tle w menu Rozróżnienie korzenia i tła i użyj lokalnego progu intensywności Lagarde'a do segmentacji.
      6. Otwórz plik danych, w którym zapisywane są wyniki.
      7. Uruchom analizę, a następnie sprawdź, czy istnieją obszary (np. na krawędziach), które są niezgodne. W takim przypadku należy zdefiniować obszar wykluczenia i ponownie uruchomić analizę. W przypadku pierwiastków, które nie są sklasyfikowane, dodaj dodatkowe klasy kolorów i ponownie uruchom analizę. W przypadku elementów błędnie sklasyfikowanych jako korzenie, aktywuj/zwiększ opcje filtrowania Zanieczyszczenia i Ostre krawędzie.

Rysunek 4: Skrzynka obrazowania do pozyskiwania obrazów ryzoboxów RGB.
Widok z lewej strony z przodu, do której przymocowane są ryzoboxy do obrazowania ze źródłami światła w środku; Prawy widok z tyłu, gdzie zamontowana jest kamera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Hiperspektralne obrazowanie korzeni
   1. Konfiguracja sprzętowa
      1. Użyj hiperspektralnego systemu obrazowania korzeni (Rysunek 5) składającego się z (i) chłodzonej termoelektrycznie 14-bitowej monochromatycznej kamery NIR o zakresie widmowym od 900 nm do 1700 nm, 320 na 256 pikseli i częstotliwości odświeżania 100 Hz oraz (ii) spektrografu obrazującego o zakresie spektralnym od 900 nm do 2500 nm i rozdzielczości spektralnej 3,6 nm. Ułóż halogenowe źródło oświetlenia liniowego (cztery reflektory halogenowe o mocy 50 W) w geometrii 45°/-45°. Zamontuj czujnik obrazowania na dwuosiowym systemie pozycjonowania. Okno skanowania ma wymiary 240 x 1000 mm, co oznacza, że 30 mm na każdej krawędzi ryzoboxa nie jest zasłonięte obrazem.
      2. Steruj systemem za pomocą skryptu Matlab w celu (i) akwizycji standardu bieli i ciemności, (ii) ustawienia czasu integracji kamery, (iii) wyboru rozdzielczości przestrzennej (rozmiar piksela 0,1 mm; rozmiar piksela 1,0 mm) i spektralnej (wszystkie 222 pasma spektralne o rozdzielczości 3,6 nm; wygładzone widmo o rozdzielczości 54 pasm i rozdzielczości 14,8 nm) oraz (iv) zdefiniowania obszaru skanowania na ryzoboxie.
      3. Zapisuj obrazy jako pliki SIF. Aby uniknąć problemów podczas zapisywania dużych plików, podziel każdy krok zeskanowanego obrazu (9 kroków na kłączobox) na cztery segmenty (trzy o długości 300 mm, jeden o długości 100 mm) i zapisz osobno z unikalną nazwą pliku składającą się z numeru kroku (od 1 do 9) i części (od 1 do 4) oraz daty i godziny (YYYY. MM.DD GG:MM:SS). Cały skan rhizobox wymaga miejsca na dysku twardym o pojemności 13,7 GB.
   2. Akwizycja i analiza obrazu.
      UWAGA: Rysunek 6 pokazuje etapy akwizycji, segmentacji i analizy obrazu.
      1. Akwizycja obrazu obejmuje wybór ustawień kamery w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu oraz określenie parametrów skanowania.
         1. Określ czasy integracji kamery dla skanowania rhizobox i białego standardu w oprogramowaniu kamery.
            1. Otwórz graficzny interfejs użytkownika obrazowania i przesuń kamerę do pozycji kłącza, w której znajdują się korzenie.
            2. Dostosuj czas integracji kamery skierowanej na jasny obiekt (np. root) w taki sposób, aby około 85% pełnego zakresu dynamicznego kamery było wykorzystywane na histogramie wyświetlanym przez oprogramowanie. Powtórz te czynności dla białego standardu, przesuwając system pozycjonowania kamery tak, aby wycelować w biały standard. Następnie zamknij oprogramowanie aparatu.
         2. Otwórz graficzny interfejs użytkownika Matlab Imaging i wprowadź wszystkie ustawienia dla bieżącego skanowania rhizobox. W przypadku danych raportowanych w tym miejscu użyj następujących ustawień:
            Czas integracji biały standard: 1000
            Czas integracji rhizobox: 4000
            Rozdzielczość spektralna: Pełna rozdzielczość (tj. 222 wąskie pasma spektralne)
            Pełna rozdzielczość przestrzenna (rozmiar piksela 0,1 mm)
            1. Wzorce ciemności i bieli należy oznaczyć przed każdym cyklem obrazowania, np. raz dziennie. Ciemny standard reprezentuje szum aparatu, podczas gdy biały standard zapewnia maksymalny współczynnik odbicia. Dane te są wymagane do normalizacji obrazu podczas przetwarzania wstępnego.
            2. Określ, czy skanowany ma być cały rhizobox, czy tylko jego część. W tym przypadku obrazowane są całe ryzoboxy. Następnie rozpocznij skanowanie.
      2. Przetwarzaj obraz za pomocą skryptu Matlab. Operacje wykonywane przez skrypt są opisane.
         UWAGA: Skrypty są obecnie w wersji nieudokumentowanej i można je uzyskać od autora korespondencyjnego. Po odpowiednim udokumentowaniu będą one dostępne do pobrania ze strony internetowej instytucji autora korespondencyjnego (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
         1. Skomponuj cały krok obrazu od środka kłącza (zawierającego korzenie), łącząc cztery części kroku.
            UWAGA: Na tym etapie nie jest ani konieczne, ani zalecane korzystanie z obrazu spektralnego całego rhizoboxa (tj. wszystkich 9 kroków), ponieważ rozmiar pliku sprawi, że każdy krok obliczeniowy w Matlabie będzie bardzo czasochłonny, a informacje zawarte w jednym centralnym kroku są wystarczające do pierwszych kroków analizy obrazu.
         2. Znormalizuj obraz, korzystając z uzyskanych standardów ciemnej i białej bieli oraz biorąc pod uwagę różne czasy integracji skanów białego standardu i rhizobox, które są automatycznie zapisywane podczas skanowania w pliku.
         3. Opcjonalnie zastosuj filtr wygładzający, aby usunąć szum z obrazu. Skrypt oferuje obecnie filtrowanie mediany jądra 3x3 i wielokrotną korektę rozproszenia. Do przedstawionej tutaj oceny obrazu nie są stosowane żadne filtry.
         4. Wyświetl obraz we wszystkich zarejestrowanych pasmach widmowych, aby uzyskać pierwszy wgląd i zdecydować o długości fali, która ma być wyświetlana w celu wyboru obszarów zainteresowania (por. segmentacja obrazu).
      3. Wykonaj segmentację między korzeniami a tłem gleby w osobnym skrypcie, wykonując następujące czynności.
         1. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) dla korzeni i gleby, aby znaleźć cechy spektralne do segmentacji. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby zaznaczyć ROI na obrazie wyświetlanym na wcześniej zidentyfikowanej długości fali z dobrym kontrastem między korzeniami a glebą. W tym przypadku użyj trzech ROI na korzeniu (stare i młode boczne, korzeń palowy) i dwóch ROI w glebie (suchy, mokry region).
         2. Wyświetl prostokąt z wybranymi ROI i pozostałą częścią jako czarną maskę i wizualizuj wybrany obraz ROI na wszystkich długościach fal.
         3. Usuń wszystkie linie w matrycy obrazu zawierające piksele o intensywności widmowej = 0 (czarne piksele).
         4. Połącz ROI korzeni i gleby w jedną macierz pierwszego planu (korzeń) i jedną macierz tła (gleba) w celu segmentacji.
         5. Przeszukaj pasma spektralne (intensywność pojedynczych widm lub współczynniki spektralne) zapewniające najlepszą separację między pierwszym planem korzenia a tłem gleby²⁷. Określ ilościowo rozróżnienie między wynikowymi histogramami pikseli dla korzenia i gleby, korzystając z Bhattacharyya distance²⁸.
         6. Wybierz wartość intensywności progowej oddzielającą histogramy.
         7. Utwórz obraz binarny, stosując wybrany próg do oryginalnego obrazu. Spowoduje to ustawienie wszystkich pikseli o intensywności mniejszej niż próg na zero, a tych o większej intensywności na jeden (wykonywane automatycznie przez skrypt).
         8. Zapisz obraz binarny jako plik tiff.
      4. Otwórz obraz binarny i przeanalizuj cechy główne. Wybierz (i) Na podstawie poziomów szarości i (ii) Blady odcień na czarnym tle w menu Rozróżnienie prymy i tła i użyj globalnego progu intensywności (obraz jest już zbinaryzowany).
      5. Aby zmapować zawartość wody na podstawie danych hiperspektralnych, należy pobrać zestaw danych kalibracyjnych i zastosować równanie kalibracyjne do obrazu ryzoboxa.
         1. Podziel ryzobox na 5-centymetrowe przegrody, używając arkuszy styropianu, aby wypełnić je ziemią (tym samym podłożem i_{d b}, które zostały użyte w eksperymencie) o różnej zawartości wody (Rysunek 8).
         2. Obliczyć odpowiednie ilości wody, które należy zmieszać z glebą i wypełnić komory (ta sama procedura, jak opisana w ppkt 1.3 dla całego kłącza).
         3. Zeskanuj ryzobox kalibracyjny z tymi samymi ustawieniami, które są używane w przypadku posadzonych ryzoboxów.
         4. Wykonaj następujące kroki za pomocą skryptu.
            1. Połącz cztery części kroku z pudełka do kalibracji wody w jeden krok i znormalizuj go za pomocą ciemnych i białych standardów.
            2. Wybierz prostokątne pudełka w każdej komorze z inną zawartością wody i zapisz je w tablicy strukturalnej.
            3. Określ cechę spektralną, która najlepiej oddziela przedziały zawartości wody. Odbywa się to za pomocą algorytmu wyszukiwania globalnego maksimum różnic intensywności między średnimi widmami sąsiedniej zawartości wody.
            4. Obliczyć średnią wartość natężenia widmowego dla tej cechy dla każdego przedziału zawartości wody w ryzoboxie kalibracyjnym.
            5. Dopasuj równanie regresji do bezpośrednio zmierzonej zawartości wody i odpowiedniego kwantyfikatora spektralnego.
            6. Zastosuj równanie regresji do każdego piksela, który nie został sklasyfikowany jako pierwiastek na obrazie ryzoboksu oraz do cechy widmowej (pasma) określonej powyżej, która najlepiej odnosi się do zawartości wody.

Rysunek 5: Hiperspektralny skaner korzeni.
Wskazane są główne elementy skanera. Mały obrazek przedstawia kamerę podczas obrazowania ryzoboxa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Etapy hiperspektralnego obrazowania korzeni.
Hiperspektralne obrazowanie korzeni składa się z trzech głównych etapów: (i) akwizycji obrazu, (ii) segmentacji obrazu oraz (iii) analizy danych spektralnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Rhizobox do kalibracji wody.
Rhizobox zawiera przegródki z podłożem o różnej zawartości wody, które są podzielone arkuszami styropianu. Papier do kiełkowania w suchych komorach zapewnia, że cząsteczki gleby nie spłukują się do sąsiednich komór. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Przykłady zastosowań

UWAGA: Ilościowe informacje o korzeniach są stosowane w kontekście fenotypowania roślin (porównanie odmian) oraz do badań fizjologicznych roślin. Poniższe dane naziemne są zgłaszane jako przykład tych przypadków.

1. Powierzchnia liścia: Zmierz powierzchnię liścia w sposób nieniszczący na wybranych etapach eksperymentu za pomocą długości i szerokości liści jako wskaźnika zastępczego. Alternatywnie można użyć obrazów baldachimu²⁹.
   1. Na koniec eksperymentu zmierz długość i szerokość liści wraz z powierzchnią przyciętych liści za pomocą miernika powierzchni liści. Skalibruj metodę nieniszczącą, stosując równanie regresji do par danych.
2. Sucha masa: Pod koniec doświadczenia zmierz suchą masę nad ziemią, przycinając rośliny nożyczkami i susz je przez 24 godziny w temperaturze 105 °C w piekarniku.
3. Przewodność aparatów szparkowych: Zmierz przewodność aparatów szparkowych za pomocą porometru liściowego. Przed pomiarem należy trzymać urządzenie przez co najmniej godzinę w komorze klimatycznej, aby czujniki mogły zrównoważyć się z warunkami otoczenia i kalibrować urządzenie za każdym razem, gdy ustawienia otoczenia w komorze klimatycznej są zmieniane. Wykonaj pomiary z co najmniej trzech liści na roślinę.

Results

Przykładowe wyniki są prezentowane dla segmentacji korzeni na podstawie obrazowania RGB i HS. Do obrazowania spektralnego podano przykład mapowania wody o wysokiej rozdzielczości. Na koniec przedstawiono wyniki, które pokazują kontekst naukowy, w którym stosowane są dane źródłowe oparte na obrazach.

Pomiar główny na podstawie RGB

Rysunek 8 przedstawia szereg czasowy obrazu korzenia RGB odmiany buraka cukrowego Ferrara. Obrazy ujawniają pewne artefakty pochodzące z niejednorodnego oświetlenia kizoboxów, z jaśniejszymi obszarami po lewej stronie i różną jasnością w obszarze nakładającym się między górnymi i dolnymi obrazami.

Rysunek 8: Szereg czasowy wzrostu korzenia z obrazowania RGB.
Zdjęcia przedstawiają odmianę buraka cukrowego Ferrara w różnych dniach po wysiewie (DAS). Obrazy pokazują niektóre artefakty spowodowane niejednorodnym oświetleniem po lewej stronie obrazu oraz między górnymi i dolnymi obrazami. Podziałka skali, 2 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9 przedstawia szczegóły dotyczące segmentacji korzeni na podstawie progu koloru dla odmiany Ferrara w dniu po wysiewie (DAS) 35. Jako odniesienie (Rysunek 9A) używany jest obraz binarny, w którym wszystkie korzenie były ręcznie śledzone za pomocą tabletu graficznego. Czas potrzebny na ręczne śledzenie całego, w pełni rozwiniętego, gęstego systemu korzeniowego buraka cukrowego wynosił około czterech godzin. Rysunek 9B przedstawia szczegółowy widok wybranego obszaru na górze obrazu, gdzie znajdują się stare korzenie boczne. W tym przypadku kilka osi głównych nie jest klasyfikowanych według progu koloru. Na dole (Rysunek 9C) Z drugiej strony, gdzie przeważają białe młode korzenie, segmentacja oparta na kolorach prawidłowo klasyfikuje wszystkie osie korzeniowe. Binaryzowany system korzeniowy (Rysunek 9D) pokazuje obszar po lewej stronie artefaktu oświetlenia, który został zdefiniowany jako obszar wykluczenia przed przeprowadzeniem analizy ilościowej. Rysunek 9E pokazuje odpowiadające histogramy pikseli wybranych cech (korzenie vs. gleba) dla kanału czerwonego obrazu RGB z Ferrary na DAS 35. Piksele korzenia (kolor niebieski) wyraźnie pokazują trzy szczyty odpowiadające jasnym młodym bocznym, ciemnym starym bocznym i korzeniowi palowym. Nakładanie się starych bocznych elementów na tło gleby jest bardzo silne, co prowadzi do powstania niesklasyfikowanych osi korzeniowych (por. Rysunek 9B).

Rysunek 9: Segmentacja korzeni za pomocą progu koloru.
(A) Ręcznie podzielony system korzeniowy za pomocą tabletu graficznego, (B) obszar ze słabo posegmentowanymi starymi osiami korzeniowymi na górze i (C) prawidłowo posegmentowanymi młodymi osiami na dole obrazu, oraz (D) obraz binarny uzyskany z progowania opartego na kolorach. (E) Histogramy pikseli dla wybranych cech obrazu RGB. Korzenie są reprezentowane przez niebieskie paski ze wskazanymi różnymi typami korzeni; Gleba jest reprezentowana przez czerwone paski. Podziałka w A i D, 2 cm; podziałka w B i C, 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wynikowa całkowita widoczna długość korzenia określona ilościowo dla ręcznie segmentowanego obrazu referencyjnego wynosi 1534,1 cm, podczas gdy automatyczna, oparta na kolorach segmentacja daje całkowitą długość korzenia 1427,6 cm.

Obrazy w skali szarości z oświetlenia UV nie zapewniają przewagi w przedstawionym tutaj przypadku i wypadły gorzej w porównaniu z progami kolorów (długość korzenia: 1679,7 cm). Starych korzeni nie można było podzielić na segmenty, a na obrazie było więcej szumów, prawdopodobnie z powodu mniejszego natężenia światła lamp UV. Jednak w przypadku młodych korzeni o wysokiej autofluorescencji i jasnym podłożu tła, oświetlenie UV może być nadal opcją, jak pokazano na obrazie uzyskanym z innego eksperymentu, w którym piasek został użyty jako podłoże tła (Rysunek 10).

Rysunek 10: Oświetlenie UV w celu wizualizacji korzeni na jasnym tle.
Przykład z systemu korzeniowego pszenicy durum rosnącego w kłączu wypełnionym piaskiem kwarcowym. Ryzobox jest obrazowany z oświetleniem dla (A) światła UV i (B) światła fluorescencyjnego (dziennego). Podziałka skali, 2 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pomiary główne na podstawie HSI

Rysunek 11 przedstawia średnie widma dla trzech ROI korzeni (stary i młody boczny, korzeń palowy) oraz dwóch ROI gleby (góra i dół ryzoboxa).

Rysunek 11: Średnie widma korzeni i gleby.
Widma z obszarów zainteresowania (ROI) na korzeniu (trzy typy korzeni) i w glebie (górna i dolna część kizoboxa). Zwroty z inwestycji są dobierane w celu określenia optymalnego kryterium segmentacji między korzeniem a glebą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jest oczywiste, że korzenie kranowe i młode korzenie boczne różnią się znacznie od tła intensywnością większości pasm spektralnych. W przypadku starych bocznych różnice w intensywności są znacznie mniejsze. Cechą, którą można wywnioskować wizualnie, jest różne nachylenie widma wokół obszaru absorpcji wody (1450 nm). W tym przypadku nachylenie widm korzeniowych jest większe w porównaniu z widmami glebowymi. Ponadto można zidentyfikować zmianę widm kranowych i młodych bocznych w obszarze około 1100 nm, która nie występuje w starych bocznych.

Rysunek 12A pokazuje wynik algorytmu wyszukiwania, identyfikując stosunek widmowy z najsilniejszym kontrastem między pierwszym planem a tłem. Stosunek widm przy 1476 nm do 1076 nm zapewnia najlepszą separację między korzeniami a glebą. Wynikowy histogram pikseli pierwszego planu korzeni i tła gleby jest pokazany w Rysunek 12B. Chociaż niektóre piksele częściowo się pokrywają, większość pikseli jest wyraźnie oddzielona od tła gleby. Dopasowując bimodalną krzywą Gaussa do histogramu i używając odległości Bhattacharyya do kwantyfikacji, uzyskuje się wartość 7,80. Wartość wyższa 3,0 oznacza silny kontrast obrazu, który umożliwia niezawodną separację²⁸.

Rysunek 12: Różnica w współczynniku odbicia między pierwszym planem korzenia a tłem gleby dla różnych współczynników pasma spektralnego i histogramu pikseli przy stosunku widmowym użytym do segmentacji.
(A) Jasne kolory (żółty) wykazują duży kontrast między pierwszym planem a tłem, ciemne kolory (niebieski) wykazują niski kontrast. Pierwsze 15 pasm zostało usuniętych z powodu szumów. Czerwone linie wskazują współczynnik pasma o najwyższym kontraście. (B) Histogram pikseli korzeni (niebieski) i gleby (czerwony) przy stosunku widma segmentacji. Niebieskie paski reprezentują korzeń, a czerwone paski glebę. Wartość natężenia odpowiada stosunkowi pasma widmowego 160 do pasma widmowego 49. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obraz binarny (Rysunek 13) jest tworzony przez zastosowanie globalnego progu intensywności zidentyfikowanego stosunku widmowego o wartości 1,008 obliczonej na podstawie odległości histogramu²⁷. Analiza długości korzenia tego obrazu daje całkowitą długość 1557,3 cm, co stanowi błąd wynoszący tylko 1,5% w porównaniu z ręcznie śledzonym obrazem referencyjnym.

Rysunek 13: Binarny obraz systemu korzeniowego buraka cukrowego odmiany Ferrara.
Obraz uzyskuje się poprzez zastosowanie globalnego progu spektralnego. Podziałka skali (lewy dolny róg), 2 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Chociaż segmentacja korzeni poprawiła się przy użyciu informacji spektralnej w porównaniu z informacją opartą na kolorach, głównym celem obrazowania HS jest analiza właściwości obrazu chemometrycznego. Przykładem może być mapowanie zawartości wody w obrazie ryzoboxa.

Rysunek 14A pokazuje średnie widma komór w ryzoboxie kalibracyjnym (por. Rysunek 7) wypełnionych ziemią o różnej zawartości wody. Kształt widm jest podobny między przedziałami, tzn. w tym przypadku stosunek widmowy niekoniecznie zapewnia bardziej stabilne kryterium klasyfikacji. W związku z tym natężenie w pojedynczym paśmie widmowym (1680 nm), w którym średnia różnica między sąsiednią zawartością wody jest maksymalizowana, jest określane jako najlepsze kryterium separacji. Wynikowe histogramy pikseli dla tej długości fali spektralnej są pokazane na Rysunek 14B.

Rysunek 14: Cechy spektralne do kalibracji zawartości wody.
(A) średnie widma dziewięciu komór wodnych z kłącza kalibracyjnego o różnej zawartości wody; (B) Histogramy pikseli dla komór wodnych w paśmie 216, gdzie średnia odległość między sąsiednimi komorami jest maksymalna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zależność między średnią intensywnością pikseli przy 1680 nm a zmierzoną zawartością wody jest pokazana w Rysunek 15.

Rysunek 15: Zależność między odbiciem widmowym a objętościową zawartością wody.
Rysunek przedstawia pary danych zmierzonej zawartości wody i spektralnego współczynnika odbicia z krzywymi empirycznymi (liniowymi i wykładniczymi) dopasowanymi do danych z wyłączeniem najwyższej zawartości wody (czerwone trójkąty). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odróżnienie wyższej zawartości wody od intensywności widmowej staje się trudne. Znaczna regresja (liniowa lub wykładnicza) o wysokim R² może być dopasowana do zawartości wody do około 0,30 cm^{3 cm-3}. Bardziej wilgotnych warunków glebowych nie można wiarygodnie przewidzieć na podstawie wartości intensywności. Podobne zachowanie wykładniczej zależności między współczynnikiem odbicia a zawartością wody ze zmniejszającą się reakcją na zawartość wody wyższą o 0,30 cm^{3 cm-3} stwierdzono również w innych badaniach³⁰.

Obraz ryzoboxa z dokładnym odwzorowaniem zawartości wody jest pokazany w Rysunek 16. Należy zwrócić uwagę na cztery aspekty. Po pierwsze, w ukorzenionych częściach kłącza można zobaczyć obszar o niższej zawartości wody. Po drugie, najsilniejsze zubożenie koncentruje się w okolicach pojedynczych osi korzeniowych. Po trzecie, strefy zubożenia występują również tam, gdzie na powierzchni nie są widoczne żadne osie korzeniowe, co wskazuje na obszary, w których korzenie są ukryte w glebie. Po czwarte, mapowanie wody bez dalszego przetwarzania obrazu skutkuje niejednolitym wyglądem ze względu na zagregowaną glebę. Może to wskazywać na niejednorodny rozkład zawartości wody w skali zagregowanej, ale także na wpływ morfologii powierzchni na jakość obrazu. Techniki chemometrycznego przetwarzania obrazów są opcją pozwalającą przezwyciężyć takie efekty morfologiczne w obrazach spektralnych³¹, ale nie są jeszcze zaimplementowane w używanych tutaj skryptach Matlab.

Rysunek 16: Mapowanie zawartości wody na kłączoboxie.
Kolory ciemnoniebieskie reprezentują obszary o wysokiej zawartości wody, obszary od zielonego do czerwonego pokazują obszary o niskiej zawartości wody. Korzeń rośliny jest nałożony na obraz w kolorze czarnym. Podziałka skali (lewy dolny róg), 2 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przykłady zastosowań

Rysunek 17 łączy ilościowe cechy korzenia z analizy obrazu z pomiarami naziemnymi.

Rysunek 17: Typowe przykłady zastosowań dla danych głównych.
(A) i (B) pokazują informacje o korzeniach wykorzystywane do charakterystyki roślin nadziemnych i podziemnych w kontekście fenotypowania. (A) przedstawia przyrost korzeni odmiany buraka cukrowego Ferrara, (B) porównuje sześć odmian buraka cukrowego uprawianych w ryzoboksach pod względem stosunku powierzchni liści do korzeni (dane z jednej kontrpróby). (C) i (D) są funkcjonalnymi relacjami między cechami znalezionymi w badaniach fizjologicznych roślin. (C) pokazuje wpływ stosunku powierzchni liści do korzeni na produkcję suchej masy oraz (D) stosunek powierzchni korzeni do przewodnictwa aparatów szparkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 17A i 17B są istotne dla fenotypowania, koncentrując się na kompleksowej charakterystyce roślin naziemnych i podziemnych. Rysunek 17A pokazuje wzrost korzeni odmiany buraka cukrowego Ferrara (por. Rysunek 8 dla obrazów). Ekspansja systemu korzeniowego wskazuje na zdolność odmiany do badania objętości gleby w danym okresie wegetacji. Rysunek 17B pokazuje stosunek powierzchni liści do korzeni sześciu odmian buraka cukrowego, dostarczając deskryptora równowagi między podażą roślin (korzeń) a popytem (liść).

Rysunki 17C i 17D podają przykłady funkcjonalnych relacji będących przedmiotem zainteresowania w badaniach fizjologicznych. W Rysunek 17C stosunek powierzchni liści do korzeni jest związany z suchą masą powstałą podczas eksperymentu, wskazując na dominującą rolę powierzchni asymilującej jako czynnika ograniczającego akumulację suchej masy. Brak istotności, pomimo stosunkowo wysokiego R², jest związany z małą liczbą użytych tutaj sparowanych danych (n=6). Rysunek 17D pokazuje, że odmiany o większej powierzchni korzeni (lepsza absorpcja) mają średnio wyższą przewodność aparatów szparkowych w trakcie eksperymentu. Wyższy obszar korzenia najwyraźniej podtrzymuje ekstrakcję wody, przedłużając w ten sposób otwarcie aparatów szparkowych.

Discussion

Protokoły przewidują dwa uzupełniające się podejścia do obrazowania systemu korzeniowego uprawianego w glebie. Kluczowym krokiem dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych jest wypełnienie kizoboxów, które musi zapewnić równą i jednorodną warstwę substratu na przedniej szybie, aby zapewnić ścisły kontakt korzenia z glebą w oknie obserwacyjnym i uniknąć szczelin powietrznych. Jest to główny powód, dla którego zaleca się stosowanie stosunkowo drobnoziarnistej gleby przesianej o grubości < 2 mm: Większe kruszywa skutkują większą morfologią powierzchni w oknie obserwacyjnym z pustkami między kruszywami. Oprócz większego ryzyka odwodnienia wierzchołków korzeni, wymaga to również bardziej złożonych technik przetwarzania obrazu do mapowania wody³¹.

Modyfikacje protokołu skupiają się więc na usprawnieniu i szybkim napełnianiu kizoboxów. Obecnie czas napełniania wynosi około 30 minut na pudełko. Ponadto testowane jest zastosowanie ryzoboxów z dwoma szklanymi oknami do obrazowania z obu stron oraz modyfikacje optymalizujące jednorodność oświetlenia w celu uzyskania lepszych obrazów RGB. Dalsza rozbudowa sprzętowa może również rozważyć integrację optod planarnych³² , jak również obrazowania pojemnościowego³³ z systemem rhizobox. Wykracza to jednak poza obecne działania modernizacyjne.

Modyfikacje oprogramowania koncentrują się na automatycznej rejestracji obrazu w celu połączenia górnych i dolnych obrazów RBG³⁴. W przypadku obrazowania hiperspektralnego testowane są zaawansowane metody ekstrakcji cech^{bez nadzoru 28} , a także bardziej czułe metody wykrywania nadzorowanych celów, takie jak SVM³⁵ . W ten sposób dane hiperspektralne potencjalnie pozwalają na ocenę wielu właściwości gleby, ryzosfery i korzeni³⁶. Ponadto planowane jest opracowanie (pół)zautomatyzowanego oprogramowania do tworzenia obrazów korzeni ryzoboksów w oparciu o zmodyfikowaną wersję Root System Analyzer³⁷ w celu ilościowego określenia cech morfologicznych (długość, średnica, powierzchnia) oraz architektonicznych (częstotliwość rozgałęzień, kąty rozgałęzień).

Głównym ograniczeniem protokołu w porównaniu z podejściami do obrazowania 3D jest ograniczenie właściwości widocznych na powierzchni, korzeni i ryzosfery. Wykazano jednak, że widoczne cechy korzeni są wiarygodnym wskaźnikiem zastępczym dla całego systemu korzeniowego²¹. Technikę rhizobox można łatwo połączyć z tradycyjnym destrukcyjnym pobieraniem próbek (płukaniem) pod koniec obrazowania dynamicznego wzrostu w celu walidacji stosunku widocznych do całkowitych cech systemu korzeniowego. Ponieważ zależność ta może się różnić w zależności od gatunku²¹, zaleca się destrukcyjne pobieranie próbek, aby zapewnić wiarygodne wnioskowanie z widocznych cech dla każdej nowej serii fenotypowania z różnymi gatunkami roślin uprawnych.

Kluczową zaletą przedstawionego tutaj protokołu jest połączenie realistycznych warunków uprawy (gleba), stosunkowo wysokiej potencjalnej przepustowości dla czasowo rozdzielczego obrazowania RGB oraz wnioskowania o funkcjonalności korzeni (np. poborze wody) za pomocą chemometrycznych danych dotyczących korzeni i ryzosfery z obrazowania hiperspektralnego. W ten sposób metody te przezwyciężają ograniczenia wnioskowania w wysokoprzepustowych metodach obrazowania sadzonek i korzeni nieglebowych¹⁴, a jednocześnie częściowo umożliwiają głęboki wgląd w fenotypowanie procesów funkcjonalnych przy mniejszej złożoności eksperymentalnej i wyższej przepustowości w porównaniu z zaawansowanymi metodami 3D¹⁵.

W nadchodzących eksperymentach protokół zostanie wykorzystany do zbadania wpływu mikoryzy na rozwój systemu korzeniowego i funkcjonalność roślin strączkowych, a także do fenotypowania cech korzeni gatunków roślin okrywowych w odniesieniu do struktury gleby, obiegu azotu i węgla.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rhizobox	Technisches Bü RO FÜ r Bodenkultur	Eksperymentalny budowniczy
Lampy LED ATUM HORTI 600	Klutronic	AHI10600F
Świetlówka HiLite T5 Day	Juwel Aquarium	86324
Świetlówka UV Eurolite 45cm slim 15 W	Conrad	593384 - 62
Canon EOS 6D	Canon Austria GmbH	8035B024
Adobe Photoshop CS5 Wersja rozszerzona 12.0 x 32	Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013	Regent Instruments Inc.
Kamera SWIR Xeva-1.7-320	Xenics	XEN-000105
Spektrograf Imspector N25E	Specim
Skaner do obrazowania hiperspektralnego	Carinthian Tech Research AG	Konstruktor eksperymentalny	Projekt i montaż skanera do obrazowania hiperspektralnego oraz oprogramowania
Matlab R2106a	Mathworks		W tym zestawy narzędzi do przetwarzania obrazu, przetwarzania sygnałów i statystyki oraz uczenia maszynowego
AP4 Poromoeter	Delta-T-Devices
LI-3100C Miernik powierzchni LI-COR
BASF Styradur Arkusze styropianu	Obi Baumarkt	9706318	Można stosować różne rodzaje arkuszy styropianu lub innego materiału oddzielającego różnie wilgotną glebę