Artykuł metodologiczny

RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

17.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56251

⸱

8 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono eksperymentalny protokół oceny systemów korzeniowych roślin uprawianych w glebie za pomocą RGB i obrazowania hiperspektralnego. Połączenie szeregów czasowych obrazu RGB z informacjami chemometrycznymi ze skanów hiperspektralnych optymalizuje wgląd w dynamikę korzeni roślin.

Streszczenie

Lepsze zrozumienie dynamiki korzeni roślin jest niezbędne do poprawy efektywności wykorzystania zasobów w systemach rolniczych i zwiększenia odporności odmian roślin uprawnych na stresy środowiskowe. Przedstawiono protokół eksperymentalny dla obrazowania RGB i hiperspektralnego systemów korzeniowych. Podejście to wykorzystuje ryzoboxy, w których rośliny rosną w naturalnej glebie przez dłuższy czas, aby obserwować w pełni rozwinięte systemy korzeniowe. Przedstawiono przykłady warunków eksperymentalnych do oceny roślin kłączowych w warunkach stresu wodnego i badania roli korzeni. Konfiguracja obrazowania RGB jest opisana w celu taniego i szybkiego ilościowego określenia rozwoju korzeni w czasie. Obrazowanie hiperspektralne poprawia segmentację korzeni od tła gleby w porównaniu z progowaniem opartym na kolorach RGB. Szczególną zaletą obrazowania hiperspektralnego jest pozyskiwanie informacji chemometrycznych na temat systemu korzenia-gleby w celu zrozumienia funkcjonalnego. Wykazano to za pomocą mapowania zawartości wody w wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie spektralne jest jednak bardziej złożone pod względem pozyskiwania, przetwarzania i analizy obrazu w porównaniu z podejściem RGB. Połączenie obu metod może zoptymalizować kompleksową ocenę systemu korzeniowego. Podano przykłady zastosowań integrujące cechy korzeni i nadziemia w kontekście fenotypowania roślin i badań fizjologicznych roślin. Dalszą poprawę obrazowania korzeniowego można uzyskać poprzez optymalizację jakości obrazu RGB z lepszym oświetleniem przy użyciu różnych źródeł światła oraz poprzez rozszerzenie metod analizy obrazu w celu wnioskowania o właściwościach strefy korzeniowej na podstawie danych spektralnych.

Wprowadzenie

Korzenie pełnią kilka istotnych funkcji dla roślin, takich jak magazynowanie asymilatów, kotwiczenie roślin lądowych w glebie oraz pobieranie i transport wody i składników odżywczych1. Z punktu widzenia ewolucyjnego uważa się, że formowanie osi korzeniowych było fundamentalnym warunkiem powstania roślin lądowych2. Pomimo tej ważnej roli, historycznie korzenie zajmowały jedynie marginalną pozycję w badaniach biologicznych. W czasach nowszych obserwuje się jednak rosnące zainteresowanie naukowe systemami korzeniowymi roślin, co przedstawiono na Rysunku 1.

Wykres trendów badań nad korzeniami, wykładniczy wzrost zainteresowania badaniami nad roślinami, dekady 1960-obecnie.
Rycina 1: Znaczenie badań nad korzeniami w naukach o roślinach.
Liczba badań związanych z korzeniami jako procent wszystkich opublikowanych badań nad roślinami w czasopismach SCI w ciągu ostatnich dekad. Wynik wyszukiwania w bazie Scopus przy użyciu słów kluczowych „plant” oraz „plant AND root”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Można wysnuć hipotezę, że za ostatnie postępy w badaniach nad korzeniami odpowiadają dwa główne powody. Po pierwsze, roślinność lądowa jest narażona na częstsze stresy środowiskowe w wyniku globalnych zmian3. W kontekście produkcji roślin uprawnych szacuje się, że na świecie około 30% obszarów rolniczych jest ograniczonych dostępnością wody i fosforu4,5. Spadek plonów spowodowany stresem jest główną przyczyną znacznych luk w plonowaniu, które w skali globalnej szacuje się na poziomie poniżej 50% potencjalnej produktywności dla agroekosystemów deszczowych6. Oprócz niskiej dostępności zasobów, wiąże się to również ze słabą efektywnością ich wykorzystania, tzn. niewystarczającą zdolnością rośliny do eksploatacji dostępnych zasobów7. Skutkuje to stratami zasobów mobilnych, takich jak azotany, co może negatywnie wpływać na inne ekosystemy. Przykładowo, obecna globalna efektywność wykorzystania azotu jest szacowana na 47%8. Lepsza efektywność wykorzystania zasobów poprzez ulepszone metody zarządzania i odmiany jest zatem niezwykle istotna zarówno dla zrównoważonego wzrostu produkcji rolniczej, jak i dla zrównoważenia środowiskowego. W tym kontekście korzenie roślin są uważane za kluczowy cel w celu ulepszenia upraw i systemów uprawy9,10.

Drugim istotnym tłem dla niedawnego zainteresowania korzeniami roślin są postępy technologiczne w metodach pomiarowych. Metody badania korzeni były przez długi czas ograniczone przez dwa kluczowe wyzwania: w przypadku pomiaru korzeni roślin rosnących w glebie musiały one zostać wyizolowane w celu kwantyfikacji, najczęściej poprzez wypłukiwanie11, co naruszało architektoniczny układ osi korzeniowych. Obserwacje korzeni in-situ z wykorzystaniem metod wykopaliskowych, pozwalające na zachowanie naturalnego położenia korzeni w glebie, były stosowane do opisów botanicznych12. Niemniej jednak są one bardzo czasochłonne i w związku z tym nie spełniają wymagań dotyczących przepustowości w porównawczej analizie strukturalno-funkcjonalnej systemu korzeniowego. Z drugiej strony, wysokoprzepustowe metody pomiaru architektury korzeni były wykonywane głównie na podłożach sztucznych i dla siewek13, w przypadku których ekstrapolacja do naturalnego środowiska wzrostu roślin jest dyskusyjna14.

Ostatni rozkwit badań nad korzeniami jest ściśle powiązany z postępem w metodach obrazowania15. Podejścia obrazowe w badaniach korzeni można podzielić umownie na trzy typy. Po pierwsze, istnieją metody 3D o wysokiej rozdzielczości, takie jak CT i MRI16. Metody te są najodpowiedniejsze do badania procesów interakcji korzeni roślin z glebą, takich jak zatorowość ksylemu indukowana suszą17. Zazwyczaj stosuje się je do stosunkowo niewielkich próbek, co pozwala na szczegółowe obserwacje. Porównanie CT i MRI dla doniczek o różnych rozmiarach oraz obrazowanie korzeni cienkich przedstawiono w18. Po drugie, istnieją wysokoprzepustowe metody obrazowania19,20. Metody te opierają się głównie na powszechnym obrazowaniu 2D RGB korzeni rosnących na podłożach sztucznych (żel, papier do kiełkowania), gdzie wysoki kontrast umożliwia stosunkowo prostą separację korzeni od tła. Są one odpowiednie do wysokoprzepustowego porównywania cech korzeni siewek różnych genotypów roślin uprawnych w standaryzowanych, sztucznych warunkach wzrostu13. Pomiędzy tymi dwoma podejściami znajdują się metody z wykorzystaniem rhizoboxów: wykorzystują one obrazowanie 2D korzeni rosnących w glebie przez dłuższy czas i charakteryzują się średnią przepustowością21,22. Aktualnym wyzwaniem w obrazowaniu (2D) korzeni jest rejestrowanie nie tylko opisów struktury, ale również wskaźników funkcjonalności korzeni23.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokoły eksperymentalne do obrazowania systemów korzeniowych hodowanych w ryzoboksach z wykorzystaniem (i) taniego i prostego, wykonanego na zamówienie zestawu do obrazowania RGB oraz (ii) bardziej złożonego zestawu do obrazowania NIR. Przedstawiono i omówiono przykładowe wyniki uzyskane z obu tych zestawów w kontekście fenotypowania roślin oraz badań nad fizjologią roślin.

Protokół

1. Rizoboksy do wzrostu roślin

UWAGA: System eksperymentalny wykorzystuje rizoboksy do uprawy roślin w celu obrazowania korzeni. Najpierw opisano konstrukcję boksów oraz zastosowane podłoże, a następnie przedstawiono szczegóły procedury napełniania.

  1. Konstrukcja rizoboksów
    1. Należy skonstruować rizoboksy (Rysunek 2>) z tylną płytą i bocznymi ramami wykonanymi z szarego PVC o grubości 15 mm. Rozmiar boksu powinien wynosić 300 mm x 1000 mm. Jako przednią szybkę należy zastosować szkło mineralne o grubości 6 mm, przymocowane do ramy z PVC za pomocą metalowych szyn przykręconych do ścian bocznych.
    2. W dolnej ramie należy wykonać trzy otwory umożliwiające odpływ nadmiaru wody. Otwory te można opcjonalnie zamknąć plastikowymi śrubami.
    3. Przed wypełnieniem należy dostosować wewnętrzną średnicę rizoboksu (w zakresie od 10 mm do 30 mm) poprzez wstawienie wielościennych płyt z PC. Dla większości upraw zaleca się pozostawienie wolnej przestrzeni wewnętrznej o szerokości 10 mm w celu zmniejszenia masy całego układu (masa rizoboksu bez gleby wynosi 13,2 kg).

Schemat konstrukcji ścianki z PVC, szkła i płyt wielościennych; projekt drenażu; oznaczone wymiary.
Rycina 2: Eksperymentalny system rhizoboxu i jego komponenty.
Rysunek po lewej przedstawia wymiary rhizoboxu, a rysunek po prawej jego pojedyncze komponenty: szarą tylną płytę z PVC z boczną ramą, przednią szybę mineralną, płyty wielościenne do regulacji średnicy wewnętrznej oraz metalowe kątowniki do mocowania przedniej szyby do tylnej komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Podłoże
    1. Wypełnić rizoboksy glebą polową (w tym doświadczeniu: gliniasto-piaszczystą glebą wierzchnią z czarnoziemu wapiennego) przesianą przez sito o oczkach 2 mm.
    2. Otworzyć rizoboksy, aby wypełnić podłoże do wewnętrznej komory (tylna płyta z bocznymi ramami) w pozycji poziomej, używając uprzednio nawilżonego podłoża. Wypełniać poziomo, aby uniknąć warstwowania i segregacji cząstek drobnych i grubych, co występuje podczas wypełniania w pozycji pionowej poprzez wsypywanie podłoża przez górny otwór.
    3. Nawilżyć podłoże przed wypełnianiem. W zależności od rodzaju podłoża (zwłaszcza od zawartości pyłu i iłu), nie przekraczać zawartości wody 0,12-0,18 cm3*cm-3, aby uniknąć rozmazania i degradacji struktury. Różnicę między wilgotnością wstępną a docelową dodać po wypełnieniu rizoboksów podłożem.
      UWAGA: Wypełnianie podłożem suchym (wysuszonym w suszarce) i późniejsze dodanie całej ilości wody nie jest zalecane, ponieważ może to doprowadzić do silnego osiadania podłoża i powstania dużych pęknięć.
  2. Przykład wypełniania krok po kroku
    1. Określić docelową zawartość wody. W tym przypadku została ona początkowo ustalona na 80% dostępnej dla roślin wody (PAW), przy której rośliny nie cierpią z powodu niedoboru wody.
    2. Wyznaczyć pojemność polową (FC) i punkt trwałego więdnięcia (PWP) podłoża. W tym przypadku FC uzyskano za pomocą rurki z PVC o wysokości równej wysokości rizoboksów (100 cm).
      1. Zamknąć rurkę na dole korkiem z małymi otworami drenażowymi, dodać 1 cm żwiru, aby zapobiec zapychaniu otworów przez drobniejsze cząstki podłoża, i wypełnić podłożem do takiej samej gęstości objętościowej, jakiej użyto dla rizoboksów (1,3 g cm-3).
      2. Nasycić rurkę wodą aż do wystąpienia drenażu i pozostawić na dwa dni w celu wyrównania (uzyskana zawartość wody jest z definicji równa pojemności polowej), zakrywając górny otwór folią spożywczą, aby zapobiec parowaniu. Wartość pojemności polowej osiągnięta dla gleby w tym doświadczeniu wyniosła 0,357 cm3 cm-3.
        UWAGA: Zawartość wody w punkcie PWP musi być znana wcześniej z standardowych metod fizyki gleby (np. pomiarów na płytce naciskowej24) lub z pedotransferowych funkcji opartych na teksturze25. W tym przypadku dla użytej gleby wynosi ona 0,12 cm3 cm-3.
      3. Przy pomiarze FC za pomocą ekstrakcji na płytce naciskowej, należy przyjąć zawartość wody przy potencjale macierzystym h=-100 hPa, a nie h=-330 hPa, aby odpowiadało to geometrii rizoboksu (wysokość 100 cm = 100 hPa).
      4. Obliczyć zawartość wody (WC) przy 80% PAW: WC (cm3 cm-3) = 0,80 (FC-PWP) + PWP. Dla limitów hydraulicznych gleby użytej w tym przypadku daje to objętościową zawartość wody przy 80% PAW równą 0,31 cm3 cm-3.
      5. Obliczyć ilość wody dla objętości rizoboksu wynoszącej 2850 cm3 (30 cm szerokości, 1 cm przestrzeni wewnętrznej, 95 cm wysokości, przy czym górne 5 cm pozostawić wolne od podłoża w celu podlewania). Daje to objętość wody 883,5 cm3, co odpowiada 883,5 g przy gęstości wody 1,0 g cm-3 w 20 °C.
    3. Określić gęstość objętościową (db) do wypełnienia rizoboksów. Tutaj ustalono ją na 1,3 g cm-3, co odpowiada wartościom typowym dla rolniczych gleb polowych. Ilość suchego podłoża potrzebna do wypełnienia objętości rizoboksu 2850 cm3 przy tej db wynosi 3705 g suchej gleby.
    4. Nawilżyć suchą glebę do grawimetrycznej zawartości wody 0,108 g g-1 (co odpowiada objętościowej zawartości wody 0,14 cm3 cm-3) poprzez dodanie 400 g wody do 3705 g suchej gleby i delikatnie wymieszać, aby uzyskać jednorodny rozkład wody. Ręcznie rozbić większe agregaty, aby wielkość cząstek była ≤ 2 mm.
    5. Wypełnić nawilżoną glebę do otwartych rizoboksów i delikatnie ją ubić za pomocą arkusza polistyrenu (30 x 10 x 1,5 cm), aby pokryć objętość wewnętrzną pudełka, co pozwoli uzyskać jednorodną db wynoszącą 1,3 g cm-3.
    6. Dodać pozostałą ilość wody (483,2 g), aby osiągnąć docelową zawartość wody 0,31 cm3 cm-3, rozpylając ją na powierzchnię za pomocą butelki z atomizerem. Zapewnić małą wielkość kropel, aby uniknąć degradacji struktury powierzchni i uzyskać jednorodne nawilżenie. Podczas rozpylania trzymać pudełko na wadze, aby monitorować ilość wody faktycznie dodanej do podłoża.
    7. Pozostawić wodę na 10 minut w celu redystrybucji, a następnie docisnąć szkło do powierzchni i przymocować je bocznymi metalowymi szynami. Średnia końcowa waga rizoboksów z nawilżonym podłożem wyniosła 17818 ± 68 g (13230 g wagi rizoboksu + 3705 g suchej gleby + 883 g wody).
      UWAGA: Jednorodna zawartość wody w boksach wypełnionych poziomo ulegnie redystrybucji po ustawieniu boksów w ich końcowej pozycji zgodnie z wynikającym gradientem potencjału. Jest to proces fizyczny we wszystkich doniczkach do wzrostu roślin, zależny od ich geometrii (wysokości), i eksperymentatorzy powinni być świadomi hydrauliki swoich doniczek26.

2. Konfiguracja komory klimatycznej

  1. Wyposażyć komorę klimatyczną (Rysunek 3) w 8 lamp LED zapewniających jednorodne oświetlenie o natężeniu 450 μmol m-2 s-1 z pikami widmowymi przy 440 (niebieski) i 660 (czerwony) nm dla optymalnego wzrostu roślin.

Schemat eksperymentu nad stresem roślin; układ LED, stacja pogodowa, przewodnictwo szparkowe, wykres deficytu prężności pary.
Rycina 3: Komora klimatyczna z ryzoboksami do eksperymentu nad stresem.
(A) Widok z lewej strony całej komory z oświetleniem LED, stacją pogodową i komputerem PC (służącym tutaj do rejestracji danych z higrometrów liściowych); widok z prawej strony z powiększeniem metalowej ramy utrzymującej ryzoboksy pod kątem 45 ° oraz drewnianych płyt użytych do osłony szklanego okna ryzoboksu przed światłem. (B) Eksperyment nad stresem u buraka cukrowego łączący cztery etapy z rodzajem stresu wynikającym z różnego zapotrzebowania atmosferycznego (wysokie/niskie) i dostępności wody w glebie (wysoka/niska). Zielone słupki średniego przewodnictwa szparkowego wskazują odpowiedź rośliny na stres. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Ustaw parametry otoczenia zgodnie z potrzebami roślin i wymaganiami eksperymentu. W tym przypadku zastosowano cykl oświetlenia obejmujący 14 godzin światła i 10 godzin ciemności. W fazie ukorzeniania roślin, przed rozpoczęciem zabiegów stresowych, ustaw temperaturę na 20° C w dzień i 15° C w nocy, a wilgotność względną utrzymuj na poziomie 50 ± 8%.
  2. Umieść ryzoboksy pod kątem 45°, wykorzystując do tego odpowiednią metalową ramę. Pozwala to zmaksymalizować wzrost korzeni w kierunku szklanej powierzchni dzięki grawitropizmowi.
  3. Zakryj szklane okno drewnianą płytą, aby utrzymać strefę korzeniową w ciemności i zapobiec wzrostowi glonów wywołanemu przenikaniem światła przez szklaną powierzchnię.

3. Przykładowa konfiguracja i zabiegi dla buraka cukrowego

  1. Przeprowadź wstępne kiełkowanie nasion buraka cukrowego na mokrej papierze filtrowanym przez trzy dni w temperaturze 20 °C w inkubatorze, aż do pojawienia się korzenia zakiełkowego. Zapewnia to wysiew roślin żywotnych.
    UWAGA: Wstępne kiełkowanie nie jest wymagane dla roślin o wysokiej energii kiełkowania, co pozwala uniknąć ryzyka uszkodzenia korzenia zakiełkowego podczas wysiewu. Jednak w przypadku nasion buraka cukrowego o grubej okrywie nasiennej ryzyko wystąpienia nasion nieżywotnych jest wysokie, a wstępne kiełkowanie znacznie przyspiesza wyłonięcie się korzenia zakiełkowego w porównaniu do bezpośredniego siewu do gleby.
  2. Za pomocą śrubokręta wykonaj niewielki otwór o głębokości około 1,5 cm w środku rhizoboxu, umieść w nim jedno nasiono za pomocą pęsety, kierując korzeń zakiełkowy w dół i przylegając do szklanego okna (poprawia to początkową widoczność), a następnie delikatnie przykryj je glebą.
  3. Na wierzchu gleby dodaj warstwę drobnego żwiru (2-4 mm) o grubości 0,5 cm, aby chronić agregaty glebowe przed rozpadem podczas nawadniania i ograniczyć straty z ewaporacji. Aby ułatwić wschodzenie, pozostaw powierzchnię gleby wolną od żwiru w miejscu, w którym umieszczono nasiono.
  4. Dodaj 10 g wody, aby wspomóc ukorzenienie.
  5. Podczas ukorzeniania i wczesnego wzrostu, aż do rozpoczęcia eksperymentalnych zabiegów stresowych, nawadniaj rhizoboxy co 2-4 dni, aby utrzymać początkową wilgotność na poziomie 80% PAW.
    1. Ilość wody do nawadniania określaj poprzez ważenie rhizoboxów i dodawanie wody aż do osiągnięcia początkowej masy każdego pojedynczego pojemnika. Przy nawadnianiu ręcznym używaj pipety, aby uniknąć degradacji struktury powierzchni podczas podlewania.
  6. Rozmieść rhizoboxy w pomieszczeniu klimatycznym zgodnie z ustalonym schematem. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na eksperymencie z sześcioma odmianami buraka cukrowego w pięciu powtórzeniach w całkowicie zrandomizowanym układzie (CRD).
    1. Zmieniaj położenie rhizoboxów za każdym razem, gdy są wyjmowane z metalnego uchwytu w celu ważenia i podlewania. Pozwala to uniknąć wpływu ewentualnej niejednorodności (oświetlenia) wewnątrz pomieszczenia klimatycznego.
  7. Określ czas rozpoczęcia zabiegów stresowych oraz rodzaj stresu. Zastosowano następujące ustawienia (Rysunek 4).
    1. Rozpocznij pomiary w stadium BBCH 15 (pięć rozwiniętych liści), gdy korzenie pokrywają około 75% głębokości rhizoboxu, a korona jest dostatecznie rozwinięta do pomiarów na liściach. Utrzymuj każdy etap przez co najmniej trzy dni, aby zapewnić adaptację do nowych ustawień, a następnie wykonaj pomiar.
    2. W przypadku obserwacji bez stresu utrzymuj ustawienia początkowe z optymalną wilgotnością gleby (80% PAW) i warunkami otoczenia (temperatura 20° C/15° C, rH 50 ± 8%), co daje dzienny deficyt ciśnienia pary wodnej (VPD) wynoszący 1,28 ± 0,1 kPa (por. Rysunek 3 C).
    3. Zwiększ zapotrzebowanie atmosferyczne do dziennego VPD na poziomie 2,45 ± 0,4 kPa poprzez podniesienie temperatury do 27°C/20°C i obniżenie rH do 35%, przy jednoczesnym utrzymaniu wilgotności gleby na poziomie 80% PAW.
    4. Następnie doprowadź do przesuszenia rhizoboxów do poziomu 40% PAW, co odpowiada zawartości wody 0,215 cm3 cm-3, poprzez wstrzymanie nawadniania. Przywróć początkowe warunki otoczenia z niskim zapotrzebowaniem atmosferycznym (VPD 1,28 kPa).
    5. Połącz stresy, zwiększając zapotrzebowanie atmosferyczne do VPD 2,45 kPa i utrzymując wilgotność gleby na poziomie 40% PAW.

4. Metody obrazowania korzeni

  1. Połączyć metody obrazowania, aby wykorzystać ich respective zalety, w zależności od docelowych informacji.
    1. Zastosować obrazowanie RGB w zakresie VIS do monitorowania wzrostu, architektury i morfologii korzeni w czasie, co z założenia wymaga częstych pomiarów. Zaletami obrazowania RGB są (i) niskie koszty, (ii) szybka akwizycja obrazów, (iii) niskie wymagania dotyczące miejsca na dysku twardym (rozmiar obrazu: 48 MB) oraz (iv) wysoka rozdzielczość (3648 x 5472 pikseli).
    2. Użyć obrazowania hiperspektralnego (HSI) w zakresie NIR, gdy wymagane są cechy chemometryczne korzeni i gleby. Zaletami są (i) cechy spektralne umożliwiające segmentację korzeni od tła gleby oraz (ii) dostęp do fizykochemicznych właściwości systemu (np. zawartość wody w glebie, wiek korzenia). Wadami są (i) dłuższy czas skanowania (około 16 minut na jeden rhizobox), (ii) duży rozmiar zbiorów danych (13,7 GB na obraz rhizoboxa), (iii) niższa rozdzielczość kamery NIR (320 x 256 pikseli) oraz (iv) większa złożoność analizy danych.
  2. Obrazowanie RGB korzeni
    1. Użyć komory obrazowania (Rysunek 4), która chroni przed światłem otoczenia i stabilizuje pozycję kamery, składającej się z metalowej ramy o szerokości 1 m i wysokości 1 m z ścianami bocznymi wyłożonymi płytami pilśniowymi. Z przodu zamocować kamerę w dwóch pozycjach w odległości 80 cm od rhizoboxa.
      1. Przymocować miarę zwijaną do ramy rhizoboxa za pomocą przezroczystej taśmy klejącej i umieścić rhizobox w uchwycie komory obrazowania.
      2. Oświetlić rhizobox za pomocą czterech świetlówek fluorescencyjnych o mocy 24 W, zamontowanych w odległości 80 cm od rhizoboxa. Zamontować również cztery lampy UV o mocy 15 W w odległości 20 cm od rhizoboxa jako alternatywne oświetlenie wykorzystujące autofluorescencję korzeni w przypadku niskiego kontrastu między korzeniem a (jasnym) tłem podłoża.
      3. Wykonać dwa zdjęcia (pozycja górna i dolna), aby objąć górną i dolną połowę rhizoboxa z zakładką wynoszącą około 3 cm.
    2. Pozyskać obrazy RGB za pomocą cyfrowej lustrzanki, która jest zamocowana za pomocą szybkozłączy w odpowiednich pozycjach komory obrazowania.
      1. Zastosować następujące ustawienia podczas korzystania ze świetlówek fluorescencyjnych. Dostosować te przykładowe ustawienia do wszelkich zmian w wymiarach i oświetleniu, a także do modelu kamery.
        1. Wyłączyć autofokus i stabilizator w obiektywie kamery. Ustawić kamerę w trybie manualnym.
        2. Ustawić czułość ISO na 500. Ustawić czas naświetlania na 13. Ustawić przysłonę na 5,6.
        3. Wyłączyć blokadę lustra. Ustawić balans bieli na Auto White Balance.
      2. Użyć następujących ustawień dla oświetlenia lampami UV:
        1. Wyłączyć autofokus i stabilizator w obiektywie kamery. Ustawić kamerę w trybie manualnym.
        2. Ustawić czułość ISO na 1000. Ustawić czas naświetlania na 13. Ustawić przysłonę na 5,6.
        3. Wyłączyć blokadę lustra. Ustawić balans bieli na Fluorescence.
    3. Połączyć obrazy RGB z góry i z dołu rhizoboxa w jeden obraz w edytorze zdjęć (np. Adobe Photoshop). Wykorzystać miarę zwijaną przy bocznej ramie rhizoboxów i kontrolować nakładające się obiekty (cechy korzeni i gleby).
      1. Skopiować dwa osobne obrazy, każdy o rozmiarze 3648 x 5472 pikseli, do nowego pliku o rozmiarze 3648 x 10944 pikseli z białym tłem.
      2. Zmniejszyć krycie warstwy dla jednego obrazu do 60% i wyrównać nakładające się części obrazów (miara, obiekty). Następnie przywrócić krycie warstwy do 100%.
      3. Na podstawie linijki na obrazie dodać dwie czerwone linie o długości dokładnie 1 cm w górnej części obrazu, gdzie nie ma korzeni. Linie te zostaną później wykorzystane podczas analizy obrazu do skalowania obrazu do prawidłowych wymiarów długości.
      4. Scalić wszystkie warstwy i usunąć za pomocą narzędzia kadrowania części obrazu znajdujące się poza oknem wypełnionym glebą.
      5. Zapisać obraz jako plik tiff do dalszej analizy.
      6. W przypadku obrazów z oświetleniem UV, przed zapisaniem zredukować kolory do skali szarości, korzystając z paska narzędzi Adjustments-Black & White i wybierając zdefiniowany filtr High Contrast Blue.
    4. Do segmentacji korzeni od tła gleby, a także do kwantyfikacji interesujących cech korzeni (np. długości, powierzchni, średnicy, rozgałęzień), użyć dowolnego oprogramowania do analizy korzeni (dostępne narzędzia można znaleźć na stronie www.plant-image-analysis.org). W niniejszej procedurze użyto programu WinRhizo.
      1. Otworzyć obraz tiff rhizoboxa w oprogramowaniu.
      2. skalibrować skalę długości obrazu, korzystając z pasków skalujących dodanych do obrazu.
      3. W menu Analizy wybrać Based on Color, a następnie Root & Background Distinction.
      4. Zdefiniować plik kalibracyjny z klasami kolorów odpowiadającymi korzeniom i glebie (tłu). Dla przykładów obrazów użytych tutaj (por. Rysunek 8>) zdefiniowano trzy klasy kolorów korzeni (stare korzenie boczne, młode korzenie boczne, korzeń palowy) oraz trzy klasy kolorów gleby.
      5. Dla obrazów w skali szarości (oświetlenie UV) wybrać (i) Based on grey levels oraz (ii) Pale Root on Black Background w menu Root & Background Distinction i zastosować lokalny próg intensywności Lagarde do segmentacji.
      6. Otworzyć plik danych, w którym zapisywane są wyniki.
      7. Uruchomić analizę, a następnie sprawdzić, czy istnieją obszary (np. przy krawędziach), które są błędnie dopasowane. W takim przypadku zdefiniować obszar wykluczenia i ponownie uruchomić analizę. Dla korzeni niezaklasyfikowanych dodać dodatkowe klasy kolorów i ponownie uruchomić analizę. Dla elementów błędnie zaklasyfikowanych jako korzenie aktywować/zwiększyć opcje filtrowania Debris & Rough Edges.

Układ obrazowania roślin z lampami UV i halogenowymi; uchwyt do ryzoboksów, mocowania kamer do analizy korzeni i nadziemnej części roślin.
Rycina 4: Komora obrazowania do pozyskiwania zdjęć RGB ryzoboksów.
Widok z lewej strony przedstawia przód, gdzie ryzoboksy są mocowane do obrazowania z wewnętrznymi źródłami światła; widok z prawej strony przedstawia tył, gdzie zamontowana jest kamera. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Hiperspektralne obrazowanie korzeni
    1. Konfiguracja sprzętowa
      1. Należy użyć hiperspektralnego systemu obrazowania korzeni (Rysunek 5) składającego się z (i) 14-bitowej monochromatycznej kamery NIR chłodzonej termoelektrycznie o zakresie spektralnym od 900 nm do 1700 nm, rozdzielczości 320 x 256 pikseli i częstotliwości odświeżania 100 Hz oraz (ii) spektrografu obrazującego o zakresie spektralnym od 900 nm do 2500 nm i rozdzielczości spektralnej 3,6 nm. Halogenowe źródło światła liniowego (cztery halogenowe reflektory 50 W) należy ustawić w geometrii 45°/-45°. Czujnik obrazujący należy zamontować na dwuosiowym systemie pozycjonowania. Okno skanowania ma rozmiar 240 x 1000 mm, co oznacza, że 30 mm na każdej krawędzi rhizoboxu nie jest objęte obrazem.
      2. Systemem steruje skrypt Matlab służący do (i) akwizycji standardów białego i ciemnego, (ii) ustawiania czasu integracji kamery, (iii) wyboru rozdzielczości przestrzennej (rozmiar piksela 0,1 mm; rozmiar piksela 1,0 mm) i spektralnej (wszystkie 222 pasma spektralne o rozdzielczości 3,6 nm; wygładzone widmo z 54 pasmami i rozdzielczością 14,8 nm) oraz (iv) definiowania obszaru skanowania na rhizoboxie.
      3. Obrazy należy zapisywać jako pliki SIF. Aby uniknąć problemów podczas zapisywania dużych plików, każdy skanowany pas obrazu (9 pasów na rhizobox) należy podzielić na cztery segmenty (trzy o długości 300 mm, jeden o długości 100 mm) i zapisać osobno z unikalną nazwą pliku składającą się z numeru pasa (od 1 do 9) i części (od 1 do 4), a także daty i godziny (RRRR.MM.DD GG:MM:SS). Pełny skan jednego rhizoboxu wymaga 13,7 GB miejsca na dysku twardym.
    2. Akwizycja i analiza obrazu.
      UWAGA: Rysunek 6 przedstawia etapy akwizycji, segmentacji i analizy obrazu.
      1. Akwizycja obrazu obejmuje wybór ustawień kamery dla optymalnej jakości obrazu i zdefiniowanie parametrów skanowania.
        1. W oprogramowaniu kamery należy określić czasy integracji dla skanu rhizoboxu oraz dla standardu białego.
          1. Otwórz interfejs graficzny (GUI) obrazowania i przesuń kamerę w miejsce rhizoboxu, w którym znajdują się korzenie.
          2. Dostosuj czas integracji kamery, kierując ją na jasny obiekt (tj. korzeń), w taki sposób, aby na histogramie wyświetlanym przez oprogramowanie wykorzystano około 85% pełnego zakresu dynamicznego kamery. Powtórz czynność dla standardu białego, przesuwając system pozycjonowania kamery na standard biały. Następnie zamknij oprogramowanie kamery.
        2. Otwórz GUI obrazowania Matlab i wprowadź wszystkie ustawienia dla bieżącego skanu rhizoboxu. Dla danych raportowanych w niniejszej pracy zastosowano następujące ustawienia:
          Czas integracji standardu białego: 1000
          Czas integracji rhizoboxu: 4000
          Rozdzielczość spektralna: pełna rozdzielczość (tj. 222 wąskopasmowe pasma spektralne)
          Pełna rozdzielczość przestrzenna (rozmiar piksela 0,1 mm)
          1. Przed każdą sesją obrazowania, np. raz dziennie, należy przeprowadzić akwizycję standardów ciemnego i białego. Standard ciemny reprezentuje szum kamery, natomiast standard biały określa maksymalną odbijalność. Dane te są niezbędne do normalizacji obrazu podczas wstępnego przetwarzania.
          2. Zdefiniuj, czy skanowany jest cały rhizobox, czy tylko jego część. W niniejszym przypadku obrazowano całe rhizoboxy. Następnie rozpocznij skanowanie.
      2. Obraz należy przetworzyć za pomocą skryptu Matlab. Opisano operacje wykonywane przez skrypt.
        UWAGA: Skrypty znajdują się obecnie w wersji nieudokumentowanej i można je uzyskać od autora korespondującego. Po odpowiednim udokumentowaniu zostaną udostępnione do pobrania ze strony internetowej instytucji autora korespondującego (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Złóż pełny pas obrazu z centrum rhizoboxu (zawierającego korzenie), łącząc cztery części pasa.
          UWAGA: Na tym etapie nie jest konieczne ani zalecane używanie obrazu spektralnego całego rhizoboxu (tj. wszystkich 9 pasów), ponieważ rozmiar pliku sprawiłby, że każdy krok obliczeniowy w Matlabie byłby bardzo czasochłonny, a informacje zawarte w jednym centralnym pasie są wystarczające dla pierwszych etapów analizy obrazu.
        2. Znormalizuj obraz, używając pozyskanych standardów ciemnego i białego oraz uwzględniając różne czasy integracji dla standardu białego i skanów rhizoboxu, które są automatycznie zapisywane w pliku podczas skanowania.
        3. Opcjonalnie zastosuj filtr wygładzający w celu usunięcia szumów z obrazu. Skrypt oferuje obecnie filtrowanie medianowe z jądrem 3x3 oraz korekcję wielokrotnego rozproszenia. Dla zaprezentowanej tutaj oceny obrazu nie zastosowano żadnych filtrów.
        4. Wyświetl obraz dla wszystkich zarejestrowanych pasm spektralnych, aby uzyskać wstępny wgląd i wybrać długość fali do wyświetlenia w celu wyznaczenia obszarów zainteresowania (por. segmentacja obrazu).
      3. Przeprowadź segmentację korzeni od tła glebowego w osobnym skrypcie, wykonując następujące kroki:
        1. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) dla korzenia i gleby, aby znaleźć cechy spektralne do segmentacji. Użyj narzędzia do swobodnego zaznaczania, aby oznaczyć ROI na obrazie wyświetlonym przy długości fali, która wcześniej została zidentyfikowana jako zapewniająca dobry kontrast między korzeniami a glebą. W tym przypadku użyj trzech ROI na korzeniu (stare i młode korzenie boczne, korzeń główny) i dwóch ROI w glebie (obszar suchy, wilgotny).
        2. Wyświetl prostokąt z zaznaczonymi ROI, a pozostałą część jako czarną maskę, i zwizualizuj obraz wybranych ROI dla wszystkich długości fal.
        3. Usuń z macierzy obrazu wszystkie linie zawierające piksele o intensywności spektralnej = 0 (piksele czarne).
        4. Połącz ROI korzenia i gleby w jedną macierz pierwszego planu (korzeń) i jedną macierz tła (gleba) w celu segmentacji.
        5. Wyszukaj pasma spektralne (intensywność pojedynczych widm lub stosunki spektralne), które zapewniają najlepszą separację między pierwszym planem korzenia a tłem glebowym27. Ilościowo określ różnicę między wynikającymi histogramami pikseli dla korzenia i gleby, używając odległości Bhattacharyyi28.
        6. Wybierz progową wartość intensywności oddzielającą histogramy.
        7. Utwórz obraz binarny, stosując wybrany próg do oryginalnego obrazu. Wszystkie piksele o intensywności mniejszej niż próg zostaną ustawione na zero, a te o wyższej intensywności na jeden (wykonuje to automatycznie skrypt).
        8. Zapisz obraz binarny jako plik tiff.
      4. Otwórz obraz binarny i przeanalizuj cechy korzeni. W menu Root & Background Distinction wybierz (i) Based on grey levels oraz (ii) Pale Root on Black Background i użyj global intensity threshold (obraz jest już zbinaryzowany).
      5. W celu mapowania zawartości wody z danych hiperspektralnych, pozyskaj zestaw danych kalibracyjnych i zastosuj równanie kalibracyjne do obrazu rhizoboxu.
        1. Podziel rhizobox na przedziały o szerokości 5 cm za pomocą arkuszy polistyrenowych i wypełnij je glebą (ten sam substrat i db co w eksperymencie) o różnych zawartościach wody (Rysunek 8).
        2. Oblicz odpowiednie ilości wody do zmieszania z glebą i wypełnij przedziały (według tej samej procedury, która została opisana w punkcie 1.3 dla całego rhizoboxu).
        3. Zeskanuj kalibracyjny rhizobox z tymi samymi ustawieniami, których użyto dla posadzonych rhizoboxów.
        4. Wykonaj następujące kroki za pomocą skryptu:
          1. Połącz cztery części pasa z kalibracyjnego pudełka do wody w jeden pas i znormalizuj go za pomocą standardów ciemnego i białego.
          2. W każdym przedziale o różnej zawartości wody wybierz prostokątne obszary i zapisz je w tablicy struktur.
          3. Określ cechę spektralną, która najlepiej rozróżnia przedziały zawartości wody. Jest to realizowane za pomocą algorytmu wyszukiwania globalnego maksimum różnic intensywności między średnimi widmami sąsiednich zawartości wody.
          4. Oblicz średnią wartość intensywności spektralnej dla tej cechy dla każdego przedziału zawartości wody w kalibracyjnym rhizoboxie.
          5. Dopasuj równanie regresji do bezpośrednio zmierzonej zawartości wody i odpowiedniego kwantyfikatora spektralnego.
          6. Zastosuj równanie regresji do każdego piksela niezaklasyfikowanego jako korzeń na obrazie rhizoboxu dla cechy spektralnej (pasma) określonej powyżej, która najlepiej koreluje z zawartością wody.

Układ spektrografu do analizy optycznej; oświetlenie halogenowe, ryzoboks, jednostka sterowania zasilaniem/ruchem.
Rysunek 5: Hiperspektralny skaner korzeni.
Wskazano główne komponenty skanera. Małe zdjęcie przedstawia kamerę podczas obrazowania ryzoboksu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy obrazowania hiperspektralnego: konfiguracja akwizycji, segmentacja, mapowanie wody, analiza chemometryczna.
Rycina 6: Etapy obrazowania hiperspektralnego korzeni.
Obrazowanie hiperspektralne korzeni składa się z trzech głównych etapów: (i) akwizycji obrazu, (ii) segmentacji obrazu oraz (iii) analizy danych spektralnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment kiełkowania nasion; gradienty wilgotności na polistyrenie i papierze do kiełkowania.
Rysunek 7: Rizoboks do kalibracji wody.
Rizoboks zawiera przegrody z podłożem o różnej zawartości wody, które są oddzielone arkuszami polistyrenu. Papier do kiełkowania w suchych przegrodach zapobiega wypłukiwaniu cząsteczek gleby do sąsiednich przedziałów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Przykłady zastosowań

UWAGA: Ilościowe informacje o korzeniach są stosowane w kontekście fenotypowania roślin (porównywania odmian) oraz w badaniach fizjologicznych roślin. Poniższe dane nadziemne zostały przedstawione, aby zilustrować te przypadki.

  1. Powierzchnia liści: Pomiar powierzchni liści przeprowadzać nieniszcząco na wybranych etapach eksperymentu, mierząc długość i szerokość liści jako wartości pośrednie. Alternatywnie można wykorzystać zdjęcia korony roślin29.
    1. Na koniec eksperymentu zmierzyć długość i szerokość liści oraz powierzchnię ściętych liści za pomocą miernika powierzchni liści. Skalibrować metodę nieniszczącą, stosując równanie regresji do par danych.
  2. Sucha masa: Na koniec eksperymentu zmierzyć nadziemną suchą masę, ścinając rośliny nożyczkami i susząc je przez 24 godziny w temperaturze 105 °C w suszarce.
  3. Przewodność szpalt aparatów szparkowych: Pomiar przewodności szpalt aparatów szparkowych przeprowadzić za pomocą porometru liściowego. Przed pomiarem pozostawić urządzenie w komorze klimatycznej na co najmniej jedną godzinę, aby czujniki wyrównały temperaturę z warunkami otoczenia, oraz kalibrować urządzenie za każdym razem, gdy zmienią się ustawienia otoczenia w komorze klimatycznej. Pomiary wykonać z co najmniej trzech liści na roślinę.

Wyniki

Przedstawiono przykładowe wyniki segmentacji korzeni w oparciu o obrazowanie RGB oraz HS. W przypadku obrazowania spektralnego zaprezentowano przykład mapowania wody w wysokiej rozdzielczości. Na koniec pokazano wyniki demonstrujące kontekst naukowy, w którym zastosowano dane o korzeniach oparte na obrazowaniu.

Pomiar korzeni w oparciu o obrazowanie RGB

Rysunek 8 przedstawia serię czasową obrazów korzenia buraka cukrowego odmiany Ferrara w przestrzeni RGB. Obrazy wykazują pewne artefakty wynikające z niejednorodnego oświetlenia ryzoboksów, z jaśniejszymi obszarami wzdłuż lewej strony oraz różnicą w jasności w miejscu nakładania się górnego i dolnego obrazu.

Badanie wzrostu korzeni w obrazowaniu RGB, burak cukrowy 'Ferrara', dni 20-35, analiza poklatkowa, schemat wzrostu.
Rysunek 8: Serie czasowe wzrostu korzeni z obrazowania RGB.
Zdjęcia przedstawiają odmianę buraka cukrowego Ferrara w różnych dniach po wysiewie (DAS). Na obrazach widoczne są artefakty wynikające z niejednorodnego oświetlenia po lewej stronie obrazu oraz pomiędzy obrazami górnym a dolnym. Paski skali, 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 9 przedstawia szczegóły segmentacji korzeni na podstawie progowania kolorystycznego dla odmiany Ferrara w 35. dniu po wysiewie (DAS). Jako punkt odniesienia (Rysunek 9A) wykorzystano obraz binarny, na którym wszystkie korzenie zostały śledzone ręcznie za pomocą tabletu graficznego. Czas potrzebny na ręczne śledzenie całego, w pełni rozwiniętego i gęstego systemu korzeniowego buraka cukrowego wyniósł około czterech godzin. Rysunek 9B ukazuje szczegółowy widok wybranego obszaru w górnej części obrazu, gdzie znajdują się stare korzenie boczne. W tym miejscu kilka osi korzeni nie zostało sklasyfikowanych przez progowanie kolorystyczne. Z kolei na dole (Rysunek 9C), gdzie przeważają białe młode korzenie, segmentacja oparta na kolorze prawidłowo klasyfikuje wszystkie osie korzeni. Zbinaryzowany system korzeniowy (Rysunek 9D) wykazuje czarny obszar po lewej stronie wynikający z artefaktu oświetlenia, który został zdefiniowany jako region wykluczenia przed przeprowadzeniem analizy ilościowej. Rysunek 9E przedstawia odpowiadające im histogramy pikseli wybranych cech (korzenie vs gleba) dla kanału czerwonego obrazu RGB odmiany Ferrara w 35. dniu DAS. Piksele korzeni (kolor niebieski) wyraźnie wykazują trzy piki odpowiadające jasnym młodym korzeniom bocznym, ciemnym starym korzeniom bocznym oraz korzeniowi palowemu. Pokrywanie się zakresów dla starych korzeni bocznych i tła gleby jest bardzo silne, co prowadzi do powstania niezaklasyfikowanych osi korzeni (por. Rysunek 9B).

Schemat segmentacji korzeni oparty na kolorach RGB z analizą histogramu typów korzeni i różnicowaniem gleby.
Rysunek 9: Segmentacja korzeni z wykorzystaniem progu kolorystycznego.
(A) Ręcznie zsegmentowany system korzeniowy przy użyciu tabletu graficznego, (B) obszar ze słabo zsegmentowanymi starymi osiami korzeni w górnej części obrazu i (C) prawidłowo zsegmentowane młode osie w dolnej części obrazu oraz (D) obraz binarny uzyskany z progowania opartego na kolorach. (E) Histogramy pikseli dla wybranych cech obrazu RGB. Korzenie są reprezentowane przez niebieskie słupki z zaznaczonymi różnymi typami korzeni; gleba jest reprezentowana przez czerwone słupki. Skala na A i D: 2 cm; skala na B i C: 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wynikowa całkowita widoczna długość korzenia określona dla obrazu referencyjnego poddanego segmentacji ręcznej wynosi 1534.1 cm, podczas gdy zautomatyzowana segmentacja oparta na kolorach daje całkowitą długość korzenia wynoszącą 1427.6 cm.

Obrazy w skali szarości uzyskane przy naświetlaniu UV nie zapewniły przewagi w przedstawionym przypadku i wykazały gorsze wyniki w porównaniu do progowania kolorystycznego (długość korzeni: 1679,7 cm). Starych korzeni nie udało się wysegmentować, a w obrazie wystąpiło więcej szumów, prawdopodobnie ze względu na niższą intensywność światła lamp UV. Jednak w przypadku młodych korzeni o wysokiej autofluorescencji i jasnym podłożu w tle, naświetlanie UV może nadal być rozwiązaniem, co pokazuje obraz z innego eksperymentu, w którym jako podłoże w tle zastosowano piasek (Rysunek 10).

Mikroskopia fluorescencyjna; struktura korzenia; po lewej: obraz konfokalny w odcieniach niebieskiego, po prawej: obraz w świetle przechodzącym.
Rysunek 10: Naświetlanie promieniami UV w celu wizualizacji korzeni na jasnym tle.
Przykład systemu korzeniowego pszenicy twardej rosnącej w rhizoboxie wypełnionym piaskiem kwarcowym. Rhizobox jest obrazowany przy użyciu oświetlenia dla (A) światło UV i (B) światło fluorescencyjne (dzienne). Paski skali, 2 cm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Pomiary korzeni oparte na HSI

Rysunek 11 przedstawia średnie widma dla trzech ROI korzeni (stara i młoda korzeń boczny, korzeń palowy) oraz dwóch ROI gleby (góra i dół ryzoboksu).

Wykres analizy spektralnej korzenia, znormalizowana odbijalność w funkcji długości fali, porównanie gleby i korzenia.
Rycina 11: Średnie widma korzenia i gleby.
Widma z obszarów zainteresowania (ROI) na korzeniu (trzy typy korzeni) oraz w glebie (góra i dół rizoboksu). Obszary ROI zostały wybrane w celu określenia optymalnego kryterium segmentacji pomiędzy korzeniem a glebą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Klarowne jest, że korzeń główny i młode korzenie boczne różnią się znacząco od tła pod względem intensywności większości pasm widmowych. W przypadku starych korzeni bocznych różnice w intensywności są znacznie mniejsze. Cechą, którą można wywnioskować wizualnie, jest odmienne nachylenie widma w obrębie regionu absorpcji wody (1450 nm). W tym obszarze nachylenie widm korzeni jest większe w porównaniu do widm gleby. Ponadto w regionie około 1100 nm można zidentyfikować zmianę w widmach korzenia głównego i młodych korzeni bocznych, która nie występuje w przypadku starych korzeni bocznych.

Rysunek 12A przedstawia wynik działania algorytmu wyszukiwania identyfikującego stosunek widm o najsilniejszym kontraście między pierwszym planem a tłem. Stosunek widm przy 1476 nm do 1076 nm zapewnia najlepszą separację korzeni od gleby. Wynikowy histogram pikseli pierwszego planu (korzenie) i tła (gleba) pokazano na Rysunku 12B. Mimo pewnego nakładania się danych, większość pikseli jest wyraźnie oddzielona od tła gleby. Po dopasowaniu bimodalnej krzywej Gaussa do histogramu i zastosowaniu odległości Bhattacharyya do kwantyfikacji, uzyskano wartość 7,80. Wartość powyżej 3,0 wskazuje na silny kontrast obrazu, co pozwala na niezawodną separację28.

Mapa cieplna widma i histogram dla analizy intensywności długości fali; analiza danych emisji optycznej.
Rycina 12: Różnica w odbiciu między pierwszym planem korzeni a tłem gleby dla różnych stosunków pasm widmowych oraz histogram pikseli dla stosunku widmowego użytego do segmentacji.
(A) Jasne kolory (żółty) wskazują wysoki kontrast między pierwszym planem a tłem, a ciemne kolory (niebieski) wskazują niski kontrast. Pierwsze 15 pasm zostało usuniętych ze względu na szum. Czerwone linie wskazują stosunek pasm o najwyższym kontraście. (B) Histogram pikseli korzeni (niebieski) i gleby (czerwony) dla widmowego stosunku segmentacji. Niebieskie słupki reprezentują korzeń, a czerwone słupki glebę. Wartość intensywności odpowiada stosunkowi pasma widmowego 160 do pasma widmowego 49. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Obraz binarny (Rysunek 13) został utworzony poprzez zastosowanie globalnego progu intensywności zidentyfikowanego stosunku widmowego na poziomie 1,008, obliczonego na podstawie odległości histogramu27. Analiza długości korzeni na tym obrazie wskazała całkowitą długość 1557,3 cm, co stanowi błąd wynoszący zaledwie 1,5% w porównaniu z referencyjnym obrazem śledzonym ręcznie.

Schemat struktury sieci neuronowej; drzewo dendrytyczne; obraz mikroskopowy; wizualizacja połączeń neuronowych.
Rycina 13: Obraz binarny systemu korzeniowego buraka cukrowego odmiany Ferrara.
Obraz uzyskano poprzez zastosowanie globalnego progu spektralnego. Pasek skali (lewy dolny róg), 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Choć segmentacja korzeni uległa poprawie dzięki wykorzystaniu informacji spektralnych w porównaniu do informacji opartych na kolorze, głównym celem obrazowania HS jest analiza chemometrycznych właściwości obrazu. Zostało to zilustrowane poprzez mapowanie zawartości wody w obrazie rhizoboxu.

Rysunek 14A przedstawia średnie widma przedziałów w kalibracyjnym rhizoboxie (por. Rysunek 7>) wypełnionym glebą o różnej zawartości wody. Kształt widm jest podobny pomiędzy przedziałami, co oznacza, że stosunek widmowy nie musi w tym przypadku zapewniać bardziej stabilnego kryterium klasyfikacji. W związku z tym za najlepsze kryterium separacji uznano intensywność w pojedynczym pasmie widmowym (1680 nm), w którym średnia różnica między sąsiednimi poziomami zawartości wody jest zmaksymalizowana. Wynikowe histogramy pikseli dla tej długości fali widmowej przedstawiono na Rysunku 14B.

Wykresy analizy spektralnej; (A) widma absorpcyjne, (B) rozkład intensywności dla stanów mokrych i suchych.
Rysunek 14: Cechy spektralne dla kalibracji zawartości wody.
(A) Średnie widma dziewięciu komór wodnych z kalibracyjnego ryzoboksu o różnej zawartości wody; (B) Histogramy pikseli dla komór wodnych w pasmie 216, gdzie średnia odległość między sąsiednimi komorami jest maksymalna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zależność między średnią intensywnością pikseli przy 1680 nm a zmierzoną zawartością wody przedstawiono na Rysunku 15.

Wykres wilgotności gleby; dopasowanie wykładnicze i liniowe. Zawartość wody względem współczynnika odbicia; pojemność polowa, punkt więdnięcia.
Rysunek 15: Zależność między widmowym współczynnikiem odbicia a objętościową zawartością wody.
Rysunek przedstawia pary danych zmierzonej zawartości wody i widmowego współczynnika odbicia wraz z empirycznymi krzywymi (liniową i wykładniczą) dopasowanymi do danych z wyłączeniem najwyższych wartości zawartości wody (czerwone trójkąty). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Odróżnienie wyższych zawartości wody na podstawie intensywności widmowej staje się trudne. Istotna regresja (liniowa lub wykładnicza) z wysokim R2 może być dopasowana do zawartości wody do około 0,30 cm3 cm-3. Bardziej wilgotnych warunków glebowych nie można wiarygodnie przewidzieć na podstawie wartości intensywności. Podobny przebieg zależności wykładniczej między odblaskowością a zawartością wody, z malejącą odpowiedzią przy zawartości wody powyżej 0,30 cm3 cm-3, stwierdzono również w innych badaniach30.

Obraz z ryzoboksu z dokładnym mapowaniem zawartości wody przedstawiono na Ryc. 16. Należy zwrócić uwagę na cztery aspekty. Po pierwsze, w częściach ryzoboksu z systemem korzeniowym widoczny jest obszar o niższej zawartości wody. Po drugie, najsilniejsze wyczerpanie wody koncentruje się w bezpośrednim sąsiedztwie pojedynczych osi korzeni. Po trzecie, strefy wyczerpania występują również tam, gdzie na powierzchni nie widać osi korzeni, co wskazuje na obszary, w których korzenie są ukryte w glebie. Po czwarte, mapowanie wody bez dalszego przetwarzania obrazu skutkuje plamistym wyglądem ze względu na agregaty glebowe. Może to wskazywać na niejednorodny rozkład zawartości wody w skali agregatu, ale także na wpływ morfologii powierzchni na jakość obrazu. Techniki chemometrycznego przetwarzania obrazów są opcją pozwalającą przezwyciężyć takie efekty morfologiczne w obrazach spektralnych31, lecz nie zostały one dotychczas zaimplementowane w skryptach Matlab użytych w tej pracy.

Schemat struktury neuronu; szczegół gałęzi dendrytycznych w analizie sieci neuronowej.
Rysunek 16: Mapowanie zawartości wody w rhizoboxie.
Kolory ciemnoniebieskie reprezentują obszary o wysokiej zawartości wody, a obszary od zielonych do czerwonych wskazują regiony o niskiej zawartości wody. Korzeń rośliny jest naniesiony na obraz w kolorze czarnym. Pasek skali (lewy dolny róg), 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przykłady zastosowań

Rysunek 17 wiąże ilościowe cechy korzeni uzyskane z analizy obrazu z pomiarami części nadziemnej.

Analiza danych dotyczących wzrostu roślin; wykresy długości korzeni, stosunku powierzchni, suchej masy i przewodnictwa szparkowego.
Rycina 17: Typowe przykłady zastosowań dla danych dotyczących korzeni.
(A) oraz (B) przedstawiają informacje o korzeniach wykorzystywane do charakterystyki nadziemnych i podziemnych części roślin w kontekście fenotypowania. (A) reprezentuje wzrost korzeni odmiany buraka cukrowego Ferrara, (B) porównuje sześć odmian buraka cukrowego hodowanych w ryzoboksach z wykorzystaniem stosunku powierzchni liści do korzeni (dane z jednej powtórzeń). (C) oraz (D) to zależności funkcjonalne między cechami, jakie spotyka się w badaniach fizjologicznych roślin. (C) pokazuje wpływ stosunku powierzchni liści do korzeni na produkcję suchej masy, a (D) zależność powierzchni korzeni od przewodnictwa szparkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 17A oraz 17B są istotne dla fenotypowania skupionego na kompleksowej charakterystyce nadziemnych i podziemnych części rośliny. Rycina 17A przedstawia wzrost korzenia buraka cukrowego odmiany Ferrara (por. Rycina 8 w celu obejrzenia obrazów). Rozrost systemu korzeniowego wskazuje na zdolność danej odmiany do eksploracji objętości gleby w określonym przedziale czasowym okresu wegetacyjnego. Rycina 17B pokazuje stosunek powierzchni liści do powierzchni korzeni u sześciu odmian buraka cukrowego, stanowiąc deskryptor równowagi między podażą rośliny (korzeń) a zapotrzebowaniem (liść).

Rysunki 17C i 17D przedstawiają przykłady istotnych zależności funkcjonalnych w badaniach fizjologicznych. Na Rysunku 17C stosunek powierzchni liści do powierzchni korzeni jest powiązany z masą suchej materii utworzoną podczas eksperymentu, co wskazuje na dominującą rolę powierzchni asymilacyjnej jako czynnika ograniczającego akumulację suchej materii. Brak istotności statystycznej pomimo stosunkowo wysokiego R2 wynika z niskiej liczby par danych (n=6) wykorzystanych w tym przypadku. Rysunek 17D wykazuje, że odmiany o większej powierzchni korzeni (poprawione pobieranie) charakteryzują się średnio wyższym przewodnictwem szparkowym w trakcie trwania eksperymentu. Większa powierzchnia korzeni prawdopodobnie podtrzymuje ekstrakcję wody, co wydłuża czas otwarcia szparek.

Dyskusja

Protokoły przewidują dwa uzupełniające się podejścia do obrazowania systemu korzeniowego uprawianego w glebie. Kluczowym krokiem dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych jest wypełnienie kizoboxów, które musi zapewnić równą i jednorodną warstwę substratu na przedniej szybie, aby zapewnić ścisły kontakt korzenia z glebą w oknie obserwacyjnym i uniknąć szczelin powietrznych. Jest to główny powód, dla którego zaleca się stosowanie stosunkowo drobnoziarnistej gleby przesianej o grubości < 2 mm: Większe kruszywa skutkują większą morfologią powierzchni w oknie obserwacyjnym z pustkami między kruszywami. Oprócz większego ryzyka odwodnienia wierzchołków korzeni, wymaga to również bardziej złożonych technik przetwarzania obrazu do mapowania wody31.

Modyfikacje protokołu skupiają się więc na usprawnieniu i szybkim napełnianiu kizoboxów. Obecnie czas napełniania wynosi około 30 minut na pudełko. Ponadto testowane jest zastosowanie ryzoboxów z dwoma szklanymi oknami do obrazowania z obu stron oraz modyfikacje optymalizujące jednorodność oświetlenia w celu uzyskania lepszych obrazów RGB. Dalsza rozbudowa sprzętowa może również rozważyć integrację optod planarnych32 , jak również obrazowania pojemnościowego33 z systemem rhizobox. Wykracza to jednak poza obecne działania modernizacyjne.

Modyfikacje oprogramowania koncentrują się na automatycznej rejestracji obrazu w celu połączenia górnych i dolnych obrazów RBG34. W przypadku obrazowania hiperspektralnego testowane są zaawansowane metody ekstrakcji cechbez nadzoru 28 , a także bardziej czułe metody wykrywania nadzorowanych celów, takie jak SVM35 . W ten sposób dane hiperspektralne potencjalnie pozwalają na ocenę wielu właściwości gleby, ryzosfery i korzeni36. Ponadto planowane jest opracowanie (pół)zautomatyzowanego oprogramowania do tworzenia obrazów korzeni ryzoboksów w oparciu o zmodyfikowaną wersję Root System Analyzer37 w celu ilościowego określenia cech morfologicznych (długość, średnica, powierzchnia) oraz architektonicznych (częstotliwość rozgałęzień, kąty rozgałęzień).

Głównym ograniczeniem protokołu w porównaniu z podejściami do obrazowania 3D jest ograniczenie właściwości widocznych na powierzchni, korzeni i ryzosfery. Wykazano jednak, że widoczne cechy korzeni są wiarygodnym wskaźnikiem zastępczym dla całego systemu korzeniowego21. Technikę rhizobox można łatwo połączyć z tradycyjnym destrukcyjnym pobieraniem próbek (płukaniem) pod koniec obrazowania dynamicznego wzrostu w celu walidacji stosunku widocznych do całkowitych cech systemu korzeniowego. Ponieważ zależność ta może się różnić w zależności od gatunku21, zaleca się destrukcyjne pobieranie próbek, aby zapewnić wiarygodne wnioskowanie z widocznych cech dla każdej nowej serii fenotypowania z różnymi gatunkami roślin uprawnych.

Kluczową zaletą przedstawionego tutaj protokołu jest połączenie realistycznych warunków uprawy (gleba), stosunkowo wysokiej potencjalnej przepustowości dla czasowo rozdzielczego obrazowania RGB oraz wnioskowania o funkcjonalności korzeni (np. poborze wody) za pomocą chemometrycznych danych dotyczących korzeni i ryzosfery z obrazowania hiperspektralnego. W ten sposób metody te przezwyciężają ograniczenia wnioskowania w wysokoprzepustowych metodach obrazowania sadzonek i korzeni nieglebowych14, a jednocześnie częściowo umożliwiają głęboki wgląd w fenotypowanie procesów funkcjonalnych przy mniejszej złożoności eksperymentalnej i wyższej przepustowości w porównaniu z zaawansowanymi metodami 3D15.

W nadchodzących eksperymentach protokół zostanie wykorzystany do zbadania wpływu mikoryzy na rozwój systemu korzeniowego i funkcjonalność roślin strączkowych, a także do fenotypowania cech korzeni gatunków roślin okrywowych w odniesieniu do struktury gleby, obiegu azotu i węgla.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy potwierdzają finansowanie z Austriackiego Funduszu Naukowego FWF za pośrednictwem Projektu o numerze P 25190-B16 (Korzenie odporności na suszę). Stworzenie infrastruktury obrazowania hiperspektralnego zostało wsparte finansowo przez Rząd Federalny Dolnej Austrii (Land Niederösterreich) w ramach projektu K3-F-282/001-2012. Dodatkowe fundusze na eksperyment z burakami cukrowymi otrzymano od Centrum Badań i Innowacji AGRANA GmbH (ARIC). Autorzy dziękują Craigowi Jacksonowi za wsparcie techniczne podczas eksperymentu i angielską korektę rękopisu. Podziękowania należą się również Markusowi Freudhofmaierowi, który przyczynił się do stworzenia systemu obrazowania RGB oraz Josefowi Schodlowi za konstrukcję mocowania rhizobox.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RhizoboxTechnisches Bü RO F&UUML; r BodenkulturEksperymentalny budowniczy
Lampy LED ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Świetlówka HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
Świetlówka UV Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Wersja rozszerzona 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013Regent Instruments Inc.
Kamera SWIR Xeva-1.7-320XenicsXEN-000105
Spektrograf Imspector N25ESpecim
Skaner do obrazowania hiperspektralnegoCarinthian Tech Research AGKonstruktor eksperymentalnyProjekt i montaż skanera do obrazowania hiperspektralnego oraz oprogramowania
Matlab R2106aMathworksW tym zestawy narzędzi do przetwarzania obrazu, przetwarzania sygnałów i statystyki oraz uczenia maszynowego
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Miernik powierzchni LI-COR
BASF Styradur Arkusze styropianuObi Baumarkt9706318Można stosować różne rodzaje arkuszy styropianu lub innego materiału oddzielającego różnie wilgotną glebę

Bibliografia

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. , DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
  5. Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284(2000).
  6. Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
  7. Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
  8. Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9 (10), 105011(2014).
  9. Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
  10. Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442(2013).
  11. Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
  12. Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. , DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
  13. Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
  14. Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
  15. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  16. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  17. Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
  18. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  19. Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1(2014).
  20. Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
  22. Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
  23. Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
  24. Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. , SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
  25. Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
  26. Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
  27. Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
  28. Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
  29. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29(2015).
  30. Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
  31. Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
  32. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
  33. Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
  35. Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679(2016).
  36. Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
  37. Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164 (1), 24-35 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie hiperspektralneobrazowanie RGBkonfiguracja rizoboksumapowanie zawarto ci wodysegmentacja korzenianaliza spektralnat o gleboweprzetwarzanie obraz w

Powiązane artykuły