Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Summary

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Abstract

Protokół przedstawia łatwą, efektywną i wszechstronną metodę przygotowania hydrożeli na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Hydrożel wytwarza się przez zmieszanie roztworów chitozanu glikolowego ze zsyntetyzowanym żelatorem polimerowym zakończonym benzaldehydem, a hydrożele uzyskuje się skutecznie w ciągu kilku minut w temperaturze pokojowej. Poprzez różne proporcje między chitozanem glikolowym, żelatorem polimerowym i zawartością wody uzyskuje się wszechstronne hydrożele o różnym czasie żelowania i sztywności. Po uszkodzeniu hydrożel może odzyskać swój wygląd i moduł, ze względu na odwracalność dynamicznych wiązań aminowych jako usieciowań. Ta samonaprawiająca się właściwość umożliwia wstrzykiwanie hydrożelu, ponieważ po procesie wstrzykiwania można go samoleczyć z wyciśniętych kawałków do integralnego hydrożelu luzem. Hydrożel jest również wieloraźny w odpowiedzi na wiele bodźców bioaktywnych ze względu na różne stany równowagi dynamicznych wiązań aminowych. Ten hydrożel został potwierdzony jako biokompatybilny, a mysie komórki fibroblastów L929 zostały osadzone zgodnie ze standardowymi procedurami, a proliferację komórek można było łatwo ocenić w procesie hodowli komórek 3D. Hydrożel może stanowić regulowaną platformę dla różnych badań, w których korzystne jest fizjologiczne naśladowanie środowiska 3D dla komórek. Wraz ze swoimi wieloreaktywnymi, samoregenerującymi się i wstrzykiwalnymi właściwościami, hydrożele mogą być potencjalnie stosowane jako wiele nośników dla leków i komórek w przyszłych zastosowaniach biomedycznych.

Introduction

Hydrożele to usieciowane materiały polimerowe o dużej zawartości wody i miękkich właściwościach mechanicznych, które były używane w wielu zastosowaniach biomedycznych^1,2. Hydrożele mogą zapewniać miękkie i wilgotne środowisko, które jest bardzo podobne do fizjologicznego otoczenia komórek in vivo. Dlatego hydrożele stały się jednym z najpopularniejszych rusztowań do hodowli komórkowych 3D^3,4. W porównaniu z hodowlą komórek na szalce Petriego 2D, hodowla komórkowa 3D szybko się rozwinęła, oferując mikrośrodowisko naśladowane przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM), w którym komórki mogą się kontaktować i składać w celu proliferacji i różnicowania⁵. Dodatkowo, hydrożele zawierające naturalne polimery mogą zapewnić biokompatybilne i sprzyjające środowisko dla komórek do namnażania się i różnicowania³. Hydrożele pochodzące z polimerów syntetycznych są preferowane ze względu na ich proste i przejrzyste składniki, które wykluczają złożone wpływy, takie jak białka pochodzenia zwierzęcego lub wirusy. Spośród wszystkich kandydatów na hydrożele do hodowli komórkowych 3D, zawsze preferowane są hydrożele, które są łatwe do przygotowania i mają stałe właściwości. Ważna jest również możliwość dostosowania właściwości hydrożelu do różnych wymagań badawczych⁶.

Tutaj wprowadzamy łatwe przygotowanie hydrożelu na bazie glikolu i chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej, która staje się wszechstronną platformą hydrożelową do hodowli komórek 3D⁷. W tej metodzie stosuje się dobrze znany, biokompatybilny chitozan glikolowy do ustanawiania ram sieci hydrożelu. Jego grupy aminowe reagują z glikolem polietylenowym zakończonym benzaldehydem jako żelatorem polimerowym, tworząc dynamiczne wiązania iminowe jako wiązania krzyżowe hydrożeli⁸. Dynamiczne wiązania iminowe mogą tworzyć się i rozkładać odwracalnie i reagować na otoczenie, nadając hydrożelom mechanicznie regulowane sieci usieciowane^9,10,11. Ze względu na wysoką zawartość wody, biokompatybilne materiały i regulowaną wytrzymałość mechaniczną, hydrożel jest z powodzeniem stosowany jako rusztowanie dla komórek L929 w hodowli komórek 3D^12,13. Protokół tutaj szczegółowo opisuje procedury, w tym syntezę żelatora polimerowego, przygotowanie hydrożelu, osadzanie komórek i hodowlę komórek 3D.

Hydrożel wykazuje również kilka innych cech ze względu na dynamiczne powiązania krzyżowe imin, w tym jego wielozadaniowość na różne bodźce biologiczne (kwas/pH, pochodna witaminy B6 pirydoksal, białko papaina, itp.), co wskazuje, że hydrożel może być indukowany do rozkładu w warunkach fizjologicznych⁸. Hydrożel jest również samoregenerujący się i można go wstrzykiwać, co oznacza, że hydrożel może być podawany za pomocą minimalnie inwazyjnej metody iniekcji i zyskać przewagę w dostarczaniu leków i komórek^14,15. Dodając dodatki funkcjonalne lub specjalne, wstępnie zaprojektowane żelatory polimerowe, hydrożel jest kompatybilny z uzyskaniem określonych właściwości, takich jak magnetyczność, temperatura, pH itp.^16,17, które mogą spełniać szeroki zakres wymagań badawczych. Właściwości te ujawniają potencjalną zdolność hydrożelu do bycia wielokrotnymi nośnikami do wstrzykiwań dla leków i komórek zarówno w badaniach biomedycznych in vitro, jak i in vivo.

Protocol

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Podczas wykonywania eksperymentów chemicznych należy stosować odpowiednie zasady bezpieczeństwa, w tym używać dygestorium i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice ochronne, fartuch laboratoryjny itp.). Protokół wymaga standardowych technik obchodzenia się z komórkami (sterylizacja, odzyskiwanie komórek, pasażowanie komórek, zamrażanie komórek, barwienie komórek itp.).

1. Przygotowanie hydrożeli

1. Synteza difunkcjonalizowanego glikolu polietylenowego zakończonego fazami benzaldehydu (DF PEG)
   1. Wstępne suszenie polimeru PEG
      1. Zważyć 4,00 g PEG (MW 4,000, 1,00 mmol), przenieść do kolby okrągłodennej (250 ml) i dodać toluen (100 ml).
         Uwaga: Inne PEG-i o różnej masie cząsteczkowej mogą działać w tworzeniu hydrożelu, ale prowadzą do różnej sztywności.
      2. Podgrzej roztwór za pomocą opalarki (lub płyty grzejnej o temperaturze około 40 °C), aby pomóc rozpuścić wszystkie polimery. Po rozpuszczeniu wszystkich polimerów użyj parownika, aby usunąć wszystkie rozpuszczalniki. Powtórz ten proces rozpuszczania i suszenia dwa razy, aby uzyskać wysuszone polimery PEG.
         UWAGA: Należy to robić w dygestorium z zachowaniem szczególnej ostrożności. Toluen jest łatwopalny.
   2. Reakcja terminacji benzaldehydu PEG
      1. Dodać mieszadło magnetyczne i tetrahydrofuran (THF, 100 ml) do kolby i rozpuścić PEG za pomocą mieszadła. Dodawać kolejno 4-karboksybenzaldehyd (0,90 g, 6,0 mmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (0,07 g, 0,6 mmol) do roztworów, aby całkowicie rozpuścić wszystkie ciała stałe.
      2. Dodać N,N'-dicykloheksylokarbodimid (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) do roztworu i dodać do kolby rurkę suszącą wypełnioną bezwodnym CaCl₂. Utrzymywać reakcję pod mieszaniem w temperaturze pokojowej (~ 20 °C) przez około 12 godzin.
   3. Proces po reakcji
      1. Po zakończeniu reakcji odfiltrować białe ciała stałe wytworzone w roztworze przez próżnię. Wlać roztwór do zimnego eteru dietylowego (500 ml) mieszając, aby wytrącić białe ciała stałe. Zbierz wszystkie białe ciała stałe przez filtr i wysusz je w dygestorium.
      2. Ponownie rozpuść białe ciała stałe w THF, odfiltruj wszelkie nierozpuszczalne białe ciała stałe, wlej roztwór do świeżego zimnego eteru dietylowego, aby wytrącić białe ciała stałe i wysusz. Powtórz ten proces dwa do trzech razy, a następnie umieść białe ciała stałe w piecu do suszenia próżniowego (20 °C, 0,1 mbar), aby całkowicie je wysuszyć. Zebrać biały proszek jako produkt końcowy: DF PEG zakończony benzaldehydem.
2. Przygotowanie hydrożeli
   1. Zważ różne ilości DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol; 0,22 g, 0,055 mmol; 0,44 g, 0,110 mmol) w probówce (10 ml), dodaj wodę dejonizowaną (5,0 ml) i użyj mieszadła wirowego lub magnetycznego, aby pomóc rozpuścić polimer.
   2. Rozpuść chitozan glikolowy (0,495 g, 6,18 x ^10-3 mmol) w wodzie dejonizowanej (15,0 ml) w probówce (50 ml) i użyj wiru przez kilka minut do homogenizacji roztworu chitozanu (3 % wag.).
   3. Dodawać kolejno roztwór chitozanu glikolowego (0,2 ml, 3 ml wag.) i roztwory DF PEG (0,2 ml) do probówki (2,0 ml). Użyj wiru, aby jednorodnie wymieszać roztwory, aby w ciągu kilku minut utworzyć hydrożele. Postępuj zgodnie ze stosunkami podanymi w Tabeli 1, aby uzyskać hydrożele o różnej wytrzymałości mechanicznej.
      Uwaga: Użyj metody odwracania rurki, aby określić, czy hydrożel już się uformował.
3. Analizy reologiczne
   1. Analizy reologiczne należy przeprowadzić na reometrze rotacyjnym z równoległą płytką stalową (średnica: 20 mm). Do testu żelowania rozprowadzić roztwór chitozanu glikolu (0,2 ml, 3% wag.) na dolnej płytce. Następnie równomiernie rozsypać kroplami roztwory wodne DF PEG (0,2 ml, 2% wag.) na powierzchnię roztworu chitozanu i szybko wymieszać pipetą. Opuść górną płytę i rozpocznij testowanie.
   2. W celu przeprowadzenia testu sztywności hydrożelu należy pociąć hydrożel na okrąg (średnica: 20 mm) i zmierzyć wartości modułu akumulacyjnego (G') w porównaniu z analizami częstotliwości przy 1% odkształceniu. Typowe wartości G' przy 6,3 rad s⁻¹ podano w tabeli 1.
      Uwaga: Przeprowadzić analizy reologiczne hydrożelu 0,5 godziny po utworzeniu hydrożelu, aby zapewnić dynamiczną stabilizację wiązania hydrożelu.
   3. Aby przetestować właściwości samonaprawiające hydrożelu, pokrój hydrożel na kawałki i zbierz kawałki razem, aby samonaprawić się do integralnego kawałka. Następnie wytnij kawałek hydrożelu, aby utworzyć okrąg (średnica: 20 mm) i umieść go na reometrze w celu przeprowadzenia analizy reologicznej.

2. 3D Hodowla komórek w hydrożelach

1. Przygotowanie roztworów żelujących hydrożel
   1. Zważyć DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) w sterylnej probówce (4,0 ml), dodać pożywkę do hodowli komórkowych (RPMI-1640, 2,0 ml) i użyć wiru lub mieszadła, aby pomóc rozpuścić polimer w celu uzyskania roztworu polimeru (20% wag.). Załaduj roztwór do strzykawki (10,0 ml), a następnie wysterylizuj go, przepuszczając przez mikronowy filtr zatrzymujący bakterie (0,22 μm).
   2. Zważyć chitozan glikolowy (0,165 g, 2,06 x ^10-3 mmol) w sterylnej probówce (15,0 ml), dodać pożywkę do hodowli komórkowych (RPMI-1640, 4,0 ml) i odwirować, aby pomóc rozpuścić polimer w celu otrzymania roztworu chitozanu glikolowego (4,0% wag.). Załaduj roztwór do strzykawki (10,0 ml) i przefiltruj go za pomocą filtra zatrzymującego bakterie 0,22 μm.
2. Hodowla komórek w hydrożelach
   UWAGA: Wszystkie procedury związane z komórkami należy wykonywać w kapturze do hodowli tkankowej. Wymagana jest podstawowa wiedza na temat techniki sterylnej.
   1. Przygotowanie zawiesiny komórek
      1. Hodowla komórek L929 w pożywce RPMI-1640 uzupełniona 10% FBS, 5% penicyliny (10 ml) na szalce Petriego (średnica 10 cm) i inkubacja w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Zmieniaj podłoże codziennie przed użyciem.
      2. Zebrać komórki L929 za pomocą PBS zawierającego trypsynę (0,025 w/v%) i EDTA (0,01% w/v), następnie odwirować (70 x g, 5 min) i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI-1640 (1,0 mL). Zliczanie komórek należy przeprowadzić przy użyciu standardowej obsługi tablicy do liczenia krwi. Ponownie zawieś komórki, aby dostosować stężenie komórek do ~ 3,75 × 10⁶ komórek/ml.
   2. Enkapsulacja komórek w hydrożelach
      1. Wymieszać zawiesiny komórek L929 (0,4 ml, 3,75 x 10⁶ komórek ^mL-1) z roztworem chitozanu glikolowego (0,4 ml) w probówce (4,0 ml) za pomocą wiru. Odmierzyć pipetą roztwór chitozanu L929/glikol (0,8 ml) do środka konfokalnej szalki Petriego (średnica 2,0 cm). Odpipetować roztwory DF PEG (0,2 ml) do tego samego naczynia i delikatnie odpipetować, aby wymieszać roztwór i wywołać tworzenie hydrożelu.
         Uwaga: Oceń tworzenie się hydrożelu, przechylając szalkę Petriego.
      2. W przypadku bezpośredniej hodowli komórkowej dodaj dodatkowe ilości pożywki hodowlanej RPMI-1640 (1,0 ml) na wierzch hydrożelu. Umieść hydrożele osadzone w komórkach (1,0 ml, 1,5% wag. glikol-chitozan, 4,0% wag. DF PEG, 1,5 × 10⁶ komórek ^mL-1) w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) i zmieniaj pożywkę każdego dnia. Przygotuj się do obrazowania komórek w 1., 3., 5. i 7. dniu po enkapsulacji komórek.
   3. W przypadku post-hodowli komórek 3D w hydrożelach po wstrzyknięciu, należy przygotować hydrożel wypełniony komórkami (1,0 ml, patrz krok 2.2.2) w strzykawce (10,0 ml, igła 48 G). Po uformowaniu się hydrożelu należy powoli wstrzyknąć hydrożel na szalkę Petriego w celu obrazowania konfokalnego. Dodaj dodatkową ilość pożywki hodowlanej (1,0 ml) na wierzch hydrożelu i zmieniaj go codziennie. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ) i przygotować do obrazowania.
      UWAGA: Należy sprawdzić i postępować zgodnie z protokołem bezpiecznej obsługi strzykawki.
3. Analiza żywotności komórek
   1. Obserwacja konfokalna
      1. Przepłukać hydrożele PBS (1,0 ml) dwa razy. Roztwory dioctanu fluoresceiny (FDA, 0,5 ml, 0,05 mg/ml) i jodku propidyny (PI, 0,5 ml, 0,08 mg/ml) barwić hydrożele roztworami dioctanu fluoresceiny (FDA, 0,05 ml/mL) i jodku propidyny (PI, 0,5 ml, 0,08 mg/ml) przez 15 min. Po zabarwieniu usuń wszystkie rozpuszczalniki.
      2. Obserwuj hydrożele za pomocą mikroskopu konfokalnego pod długościami fal wzbudzenia 488 nm i 543 nm, aby uwidocznić odpowiednio żywe i martwe komórki. Przeprowadź stosy Z przez każdą głębokość hydrożeli o każdej głębokości 2 μm, aby sprawdzić równomierny rozkład komórek w całym tekście.
         Uwaga: FDA barwi żywe komórki, podczas gdy PI barwi martwe komórki.
   2. Hydrożel (1,0 ml) rozkładać kwasem octowym (HAc, 3 v%, 1,0 ml) przez 5 min i pipetować do probówki (4,0 ml). Zebrać komórki za pomocą wirówki (70 x g, 5 min) i ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych RPMI-1640 (1,0 ml). Wykonaj liczenie komórek za pomocą tablicy do liczenia krwi.

Results

Schematyczne przedstawienie tego protokołu dotyczącego przygotowania hydrożelu i jego zastosowania jako hodowli komórek 3D jest oferowane w Rysunek 1. Informacje o zawartości i proporcjach hydrożelu przygotowanego o różnej wytrzymałości mechanicznej podsumowano w tabeli 1. Właściwość samoregenerująca i reologiczna hydrożelu przedstawia sztywność hydrożelu na podstawie modułu magazynowania w funkcji testu częstotliwości w Rysunek 2. Obrazy konfokalne komór...

Discussion

Hydrożel przedstawiony w tym protokole (ryc. 1) składa się z dwóch głównych składników: naturalnego chitozanu glikolu polimerowego i syntetycznego żelatora polimerowego zakończonego aldehydem DF PEG, które są materiałami biokompatybilnymi. Syntezę DF PEG przedstawiono przy użyciu jednoetapowej reakcji modyfikacji. PEG o masie cząsteczkowej 4 000 został wybrany w tym protokole ze względu na rozpuszczalność, efektywność modyfikacji, a także sztywność hydrożelu. Przygotowano serię hydrożeli o r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chitozan glikolowy	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% stopień deacetylacji
4-karboksybenzaldehyd	Shanghai Aladdin  Bio-Chem Technology Co., LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicykloheksylokarbodimid	Shanghai Aladdin  Bio-Chem Technology Co., LTD	538-75-0	99%
Chlorek wapnia bezwodny	Shanghai Aladdin  Bio-Chem Technology Co., LTD	10043-52-4	96%
4-dimetyloamiopryidyna	Shanghai Aladdin  Bio-Chem Technology Co., LTD	1122-58	99%
Glikol polietylenowy	Odczynnik chemiczny Sino-pharm	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Odczynnik chemiczny	109-99-9	99%
Toluen	Sino-pharm Odczynnik chemiczny	108-88-3	99%
Eter etylowy	Odczynnik chemiczny Sino-pharm	60-29-7	99%
Kwas octowy	Sino-pharm Odczynnik chemiczny	64-19-7	99%
Bezwodny CaCl2	Odczynnik chemiczny Sino-pharm	10043-52-4	99%
Dioctan fluoresceiny	Sigma	596-09-8	99%
Jodek propidyny	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 pożywka hodowlana	Gibco
Płodowa surowica bydlęca	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0,25%
PBS	Solarbio		0,01 M
Penicylina roztwór streptomycyny	Hyclon		10 000 U / ml
Reometr	TA Instrument		AR-G2
	Zeiss		710-3-kanałowy
L929 Komórki	ATCC		NCTC klon 929; Komórka L, L929, pochodna parownika szczepu L
	EYELA		N-1100
48-głowowa igła	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-guage
Mikroskop	Leica		DM3000 B
Oprogramowanie mikroskopowe	Imaris
Opalarka	Confu		KF-5843
szalka Petriego	NEST