Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56255

⸱

28 listopada 2017

 ,  ,  , 
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest umożliwienie wykrywania in vivo specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej w modelu mysim.

Streszczenie

Obecne metodologie zabijania specyficznego dla antygenu są ograniczone do stosowania in vitro lub wykorzystywane w modelach chorób zakaźnych. Nie ma jednak protokołu przeznaczonego specjalnie do pomiaru zabijania swoistego dla antygenu bez infekcji. Protokół ten został opracowany i opisuje metody przezwyciężenia tych ograniczeń, umożliwiając wykrywanie specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej przez limfocyty T CD8 + in vivo. Osiąga się to poprzez połączenie modelu szczepienia z tradycyjnym testem uśmiercania docelowego znakowanym CFSE. Ta kombinacja pozwala badaczowi bezpośrednio i szybko ocenić potencjał CTL specyficzny dla antygenu, ponieważ test nie jest zależny od wzrostu guza lub infekcji. Ponadto odczyt opiera się na cytometrii przepływowej, a więc powinien być łatwo dostępny dla większości badaczy. Głównym ograniczeniem badania jest określenie osi czasu in vivo, która jest odpowiednia dla testowanej hipotezy. Różnice w sile antygenu i mutacjach w limfocytach T, które mogą powodować różnicową funkcję cytolityczną muszą być dokładnie ocenione w celu określenia optymalnego czasu na pobranie i ocenę komórek. Odpowiednie stężenie peptydu do szczepienia zostało zoptymalizowane dla hgp10025-33 i OVA257-264, ale dalsza walidacja byłaby potrzebna dla innych peptydów, które mogą być bardziej odpowiednie dla danego badania. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na szybką ocenę funkcji zabijania in vivo i może być dostosowany do dowolnego antygenu.

Wprowadzenie

Istnieje wiele protokołów do oceny potencjału cytolitycznego (CTL) limfocytów T CD8+ lub CD4+. Ocenę tę można łatwo przeprowadzić in vitro w kontrolowanych warunkach1,2,3. Ponadto modele chorób zakaźnych, takie jak LCMV, klasycznie zbadały funkcję CTL poprzez wykorzystanie różnicowo znakowanych komórek docelowych CFSE (ester sukcynimidylowy 5-(i 6)-karboksyfluoresceiny), w których komórki znakowanehi CFSE są pulsowane peptydem, a komórkidocelowe znakowane lo CFSE pozostają niepulsacyjne. Komórki są następnie wstrzykiwane w stosunku 1:1 i oceniane pod kątem utraty celów impulsowych znakowanychznakiem hi CFSE za pomocą cytometrii przepływowej4. Modele szczepionki i odrzucenia wykorzystano również podobne strategie do oceny zabijania in vivo zarówno przez limfocyty T CD8 +, jak i CD4 +, a także komórki NK5,6. Jest to potężny test, ale wymaga użycia czynników zakaźnych, które pobudzają układ odpornościowy przed docelowym wstrzyknięciem.

Ten protokół, z drugiej strony, nie wymaga wcześniejszego zakażenia gospodarza, a zamiast tego wykorzystuje strategię szczepień, aby przygotować układ odpornościowy przed docelowym wstrzyknięciem. Szczepienie to składa się z preparatu peptydowego na bazie wody, który wymaga podania koktajlu immunostymulującego o nazwie covax7, składającego się z agonisty receptora Toll-podobnego 7 (TLR7) (imikwimod w kremie), agonistycznego przeciwciała anty-CD40 i interleukiny-2 (IL-2) prowadzącego do synergicznego połączenia środków immunostymulujących w celu wywołania specyficznego dla peptydu pobudzenia i silnej odpowiedzi immunologicznej. W związku z tym test ten zapewnia szybki odczyt funkcji CTL, ponieważ szczepionka jest podawana wraz z komórkami w celu oceny funkcji zaledwie trzy dni przed wstrzyknięciem komórek docelowych. Ponadto przygotowanie COVAX jest na tyle silne, że zdolność zabijania limfocytów T specyficznych dla antygenu można zaobserwować między 4 a 24 godzinami po wstrzyknięciu.

Głównym ograniczeniem tego protokołu jest określenie in vivo harmonogramu wykrywania zabijania celu, który jest odpowiedni zarówno dla antygenu, jak i testowanej hipotezy. Należy przeprowadzić staranną ocenę, ponieważ zmiany w sile antygenu, jak również zmiany genetyczne testowane w limfocytach T mogą skutkować różnicową funkcją CTL, która wymagałaby innego czasu wykrywania zabijania celu. Ponadto, podczas gdy odpowiednie stężenie peptydu do szczepienia zostało zoptymalizowane dla ludzkiego antygenu czerniaka glikopeptydu 100 (hgp10025-33) i albuminy jaja kurzego257-264 (OVA257-264)8,9, zastosowanie innego modelu antygenu, który może być bardziej odpowiedni dla danego badania, wymagałoby dalszej walidacji. Ze względu na przewidywane różnice w zdolności docelowych antygenów do stymulowania funkcji efektora CTL w połączeniu z COVAX jako adiuwantem, optymalizacja stężenia dawki IL-2 i częstotliwości dawkowania może być niezbędna do osiągnięcia pożądanego celu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na szybką ocenę funkcji zabijania in vivo i może być dostosowany do dowolnego antygenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Teksańskiego MD Anderson Cancer Center.

1. Przygotowanie peptydu do szczepionki

  1. Rozpuścić liofilizowany peptyd w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do odpowiedniego stężenia i wirować przez 30 s.
    UWAGA: Dla hgp10025-33 stężenie końcowe wynosi 1 mg/ml, a dla OVA257-264 stężenie końcowe wynosi 0,5 mg/ml. Należy rozpuścić peptyd przed wstrzyknięciem. Nie przechowywać po rozpuszczeniu.

2. Izolacja splenocytów od transgenicznej myszy

UWAGA: Izolacja komórek ze śledziony musi być przeprowadzona w sterylny sposób.

  1. Poddaj eutanazji transgeniczną mysz OT-1 przy użyciu zatwierdzonej metody uduszenia CO2 i usuń śledzionę.
    UWAGA: Na tym etapie wykorzystuje się odpowiednią mysz transgeniczną specyficzną dla wybranego peptydu.
    1. Połóż mysz na prawym boku. Spryskaj lewą stronę myszy 70% etanolem (EtOH). Podciągnij skórę za pomocą kleszczy i przetnij skórę nożyczkami chirurgicznymi; Śledziona będzie widoczna w jamie otrzewnej. Delikatnie rozetnij jamę otrzewnej, aby uzyskać dostęp do śledziony. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy.
  2. Zdezagregować śledzionę, umieszczając ją w filtrze 70 μm na szalce Petriego z 2 ml pożywki A (PBS z 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS)) i rozbijając śledzionę końcem tłoka.
    1. Zebrać splenocyty z szalki Petriego i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyj szalkę Petriego 5 ml pożywki A dwukrotnie, aby zebrać wszystkie komórki. Dodać pożywkę A do 25 ml i odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 475 x g.
  3. Odessać komórki i ponownie zamieszać w 1 ml/na śledzionę buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 10 ml pożywki A i odwirować w temperaturze pokojowej przy 475 x g. Zawiesić osad w 10 ml pożywki A i usunąć zanieczyszczenia, filtrując zawiesinę komórek przez filtr 70 μm do czystego stożkowego o pojemności 50 ml.
  4. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Zawiesić komórki w PBS do końcowego stężenia 106 - 1006 komórek/ml. W przypadku zabijania swoistego dla OVA257-264 zawiesić ponownie w 106 komórkach/ml, a w przypadku zabijania swoistego dla hgp10025-33, zawiesić ponownie w 1006 komórek/ml.
    1. Wirować pozostałe komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 15 ml zimnego PBS w celu przepłukania komórek. Powtórz krok prania jeszcze raz. Wiruj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 475 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w zimnym PBS zgodnie z końcową objętością oznaczoną w kroku 2.4.
    2. Przenieść zawiesinę jednokomórkową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymać na lodzie do momentu wstrzyknięcia do myszy biorcy C57/BL6.

3. Wstrzykiwanie splenocytów od myszy transgenicznych

  1. Umieść mysz odbiorczą C57/BL6 w unieruchomieniu grzbietem do góry. Spryskaj obszar podstawy ogona iniekcji 70% alkoholem izopropylowym. Podać dożylnie 100 μl zawiesiny jednokomórkowej (sekcja 2) do żyły ogonowej za pomocą igły o sile 27 G, skośną stroną skierowaną do góry.

4. Administracja COVAX

UWAGA: Jeśli komórki są wstrzykiwane po południu, covax powinien być podawany następnego ranka w ciągu 18 godzin od wstrzyknięcia komórek.

  1. Umieść mysz w przezroczystym pudełku znieczulającym z 1-3% izofluranem. Po całkowitym znieczuleniu myszy przenieś je do stożków nosowych przymocowanych do kolektora w komorze anestezjologicznej. Trzymaj myszy w ryzach grzbietem do góry.
    UWAGA: Znieczulenie potwierdza się krótkim uszczypnięciem palca u nogi w celu sprawdzenia, czy nie została wywołana reakcja na odstawienie. Prawo federalne ogranicza stosowanie izofluranu na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii.
  2. Spryskaj obszar podstawy ogona iniekcji 70% alkoholem izopropylowym. Wstrzyknąć podskórnie 100 μl roztworu peptydowego (z sekcji 1) za pomocą igły 27 G ze strzykawką wnikającą na głębokość 4 - 5 mm w okolicę podstawy ogona, stroną ze skosem igły skierowaną do góry.
    UWAGA: Myszy szczepi się w jednym boku za pomocą wstrzyknięcia podskórnego u podstawy ogona10.
  3. Wstrzyknąć 100 μl przeciwciała anty-CD40 (0,5 mg/ml zapasu) bocznie do miejsca wstrzyknięcia szczepionki.
  4. Ostrożnie nałożyć imikwimod w postaci kremu 50 mg/mysz w miejscach szczepienia. Krem imikwimod należy wcierać w powierzchnię, aż krem przestanie być widoczny i całkowicie się wchłonie.
  5. Wstrzyknąć 100 μl 100 000 j.m./ml białka rhIL-2 dootrzewnowo (i.p.) w dolną część brzucha. Obserwuj myszy przez 5 minut po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia.
    UWAGA: W tym momencie eksperyment jest wstrzymany na 3 dni.

5. Izolacja docelowych splenocytów do znakowania za pomocą CFSE

UWAGA: Izolacja komórek ze śledziony musi być przeprowadzona w sterylny sposób.

  1. Poddać eutanazji myszy C57BL/6 zgodnie z zatwierdzoną metodą uduszenia CO2 . Usuń śledzionę (śledziony) jak w kroku 2.1.1. Zdezagregować śledzionę i umyć splenocyty jak w krokach 2.2.1 - 2.2.3. Lizować czerwone krwinki, jak w krokach 2.3 - 2.3.2.
  2. Usunąć komórki do zliczenia za pomocą hemocytometru i obliczyć końcowe stężenie komórek przy 106 komórkach/ml w roztworze znakującym CFSE (opisanym w kroku 7). Wirować pozostałe komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g. Odessać supernatant.

6. Pulsowanie peptydów docelowych splenocytów

UWAGA: Pulsowanie peptydów musi być wykonywane w sterylny sposób.

  1. Zawieś komórki w 106 komórkach / ml w kompletnym pożywce (pożywka RPMI 1640 z 10% FBS, 1% L-glutaminą (L-Gln), 1% penicyliną / streptomycyną (Pen / Strep)). Podziel komórki na 2 probówki (stożkowe 15 ml). Oznacz każdą probówkę jako pulsacyjną lub niepulsacyjną.
  2. Dodaj peptyd do probówki oznaczonej jako pulsacyjny. W przypadku pulsacji OVA257-264 dodaj 1 μg/ml, a w przypadku pulsacji hgp10025-33 dodaj 2 μg/ml.
    UWAGA: Komórki bez pulsacji przechodzą taką samą inkubację jak komórki pulsacyjne, tylko bez dodatku peptydu.
    1. Inkubować komórki + peptyd w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Dodaj 10 ml kompletnej pożywki (pożywka RPMI 1640 z 10% FBS, 1% L-glutaminą (L-Gln), 1% penicyliną/streptomycyną (Pen/Strep)) do każdej probówki, aby przemyć zarówno pulsacyjne, jak i niepulsacyjne komórki docelowe. Wirować pozostałe komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g. Odessać supernatant.

7. Przygotowanie CFSE do oznaczania docelowych splenocytów

  1. Przygotować roztwór do znakowania CFSE podczas mycia komórek w kroku 6.3; komórki pulsacyjne zostaną oznaczone jako CFSEhi, a komórki bez impulsów jako CFSElo. Przygotuj 1 ml roztworu znakującego CFSE na 106 komórek.
    UWAGA: CFSE jest wrażliwy na światło i powinien być przez cały czas chroniony przed światłem.
    1. Przygotuj pożywkęznakowaną CFSE hi, dodając 1 μL/ml CFSE (5 mM roztworu podstawowego) dla końcowego stężenia 5 μM/ml w pożywce RPMI 1640 z 2% FBS.
    2. Przygotować pożywkę do znakowania CFSE, dodając 1 μL/ml CFSE (0,5 mM roztwór podstawowy) do końcowego stężenia 0,5 μM/ml Pożywki RPMI 1640 z 2% FBS.

8. Znakowanie docelowych splenocytów za pomocą CFSE

UWAGA: Etykietowanie CFSE musi być wykonywane w sterylny sposób.

  1. Ponownie zawiesić pulsacyjne i niepulsacyjne komórki docelowe (od kroku 6.3) przy 106 komórkach/ml pożywki znakującej CFSE. Ponownie zawiesić komórki pulsacyjne za pomocą przygotowanych pożywekznakujących CFSE hi, a ogniwa bez impulsów za pomocą przygotowanych pożywekdo znakowania CFSE o niskiej etykiecie.
  2. Mieszaj komórki i podłoża znakujące CFSE przez delikatne odwrócenie lub wirowanie. Nie mieszać przez wirowanie. Inkubować komórki i pożywki znakujące CFSE w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Mieszaj komórki co 5 minut.
  3. Dodać 10 ml kompletnej pożywki do każdej zawiesiny komórek i wirować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml zimnego PBS. Wirować komórki w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 475 x g.
  5. Powtórz krok 8.4.
  6. Policz komórki i wymieszaj pulsacyjne peptydowe, znakowanehip CFSE z niepulsacyjnymi,CLSE nisko znakowanymi komórkami w stosunku 1: 1 do wstrzyknięcia myszom biorcy. Zachować podwielokrotność 1 x 106 mieszanych komórek do wykorzystania do podstawowej oceny cytometrii przepływowej (sekcja 11).
    UWAGA: Ostateczna objętość do wstrzykiwań wynosi 100 μl na mysz. Ostateczna liczba komórek to 10e6 komórek. Należy wziąć pod uwagę utratę objętości w strzykawce i igle, którą należy oszacować na 500 μl.

9. Wstrzykiwanie komórek docelowych

UWAGA: Utrzymuj komórki oznaczone znakiem CFSE przed światłem przed i w trakcie wstrzyknięcia tak bardzo, jak to możliwe.

  1. Umieść myszy odbiorcy C57BL/6 w unieruchomieniu grzbietem do góry. Spryskaj obszar podstawy ogona iniekcji 70% alkoholem izopropylowym. Podać dożylnie 100 μl zawiesiny jednokomórkowej do żyły ogonowej skośną stroną skierowaną do góry.

10. Ponowna izolacja komórek docelowych

UWAGA: Czas wykonania tego kroku jest krytyczny i zależy od cytotoksyczności CTL oraz siły antygenu do stymulacji. W celu oceny zabicia celu impulsowego OVA257-264, komórki należy pobrać 4 - 6 godzin po wstrzyknięciu. Ponieważ komórki znakowane CFSE są wrażliwe na światło, śledziony przetwarzają się w ciemności.

  1. Poddać eutanazji myszy C57BL/6 biorcy zgodnie z zatwierdzoną metodą uduszenia CO2 .
  2. Usuń śledzionę (śledziony) jak w kroku 2.1.1. Zdezagregować śledzionę i umyć splenocyty jak w krokach 2.2.1 - 2.2.3. Lizować czerwone krwinki, jak w krokach 2.3 - 2.3.2.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FAC) (1% BSA + PBS) w celu oceny za pomocą cytometrii przepływowej.

11. Logika bramkowania do określania aktywności CTL za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Wykonaj ocenę aktywności CTL przy użyciu standardowego protokołu cytometrii przepływowej. Pobieraj komórki za pomocą kanału FITC na cytometrze przepływowym z laserem 488 nm do wzbudzenia11.
    1. Bramka na żywych limfocytach przy użyciu parametrów rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC). Podbramka w żywej bramce limfocytów dla całej populacji CFSE-dodatniej.
      UWAGA: Wstrzyknięte komórki znakowane CFSE będą stanowić niewielki podzbiór wszystkich limfocytów obecnych w śledzionie. Komórki CSFE-dodatnie powinny pojawiać się jako dwie odrębne populacje na skali logarytmicznej.
    2. Użyj formatu histogramu, aby określić procent populacji bez impulsów (lewy pik, CFSElo) i pulsacyjnych (prawy pik, CFSEhi). Utrata komórekhi CFSE wskazuje na aktywność CTL specyficzną dla antygenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed wstrzyknięciem komórek docelowych znakowanych CFSE, mieszaninę komórek w stosunku 1:1 analizuje się za pomocą cytometru przepływowego w celu określenia częstotliwości bazowej zarówno dla komórek docelowych CFSEhi , jak i CFSElo. Rysunek 1A przedstawia strategię bramkowania służącą do wykrywania zmian w populacjach CFSE; wstępna brama jest tworzona z wykorzystaniem parametrów FSC i SSC. Następnie całkowita populacja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż ten protokół jest prosty, istnieje kilka krytycznych kroków, które należy dokładnie wykonać. Przygotowanie COVAX po wstrzyknięciu badanej limfocytu T specyficznej dla antygenu jest konieczne, aby zobaczyć ewentualne zabicie impulsowych celów. Chociaż możliwe jest, że szczepionka COVAX na bazie wody wywołuje ostry stan zapalny, w przypadku przewlekłej fazy zapalnej zastąpienie krótkotrwałego preparatu na bazie wody podejściem opartym na oleju o powolnym uwalnianiu antygenu może przynieść lepsze wyniki

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez badania NIH (A1R03AI120027 (RN) i 1R21AI20012 (RN)), Institutional Research Grant (RN), start-up grant (RN) i MD Anderson CIC seed grant (RN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6 do 12 tygodniowe samice myszy C57BL/6 Charles River027C57 Czarne 6 myszy
OT-1 6-12 tygodniowe samice myszy Jackson Labs003831
hgp10025– 33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257– 264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL Imikwimod
krem 5% Fougera51672-4145-6Aldara Krem
mAb specyficzny dla CD40 BioXcellBE0016-2klon białka FGK4.5
rhIL-2 Hoffman LaRoche Inc136Rekombinowane ludzkie białko IL-2
70% alkohol izopropylowy Przygotowanie KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023Sól fizjologiczna buforowana fosforanami
FBSLife Technologies26140-079RBC w surowicy bydlęcej
 Life TechnologiesA10492-01Bufor do lizy czerwonych krwinek
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-glutamina Life Technologies25030081
Pen/StrepLife Technologies15140122penicylina/streptomycyna
CFSELife TechnologiesC345545-(i 6)-karboksyfluoresceina dioctan sukcynimidylu ester
surowicy bydlęcej Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma A4503
1,5 ml MCT z podziałką naturalną Fisher05-408-129probówka do mikrowirówek
70% etanoluFisherBP8201500EtOH
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%   Life Technologies15250-061
HemocytometrFisher267110
Igła o rozmiarze 27 BD305109
strzykawka 1 mlBD309659
płodowy bufor do lizy

Bibliografia

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627(2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zabijanie swoiste dla antygenuznakowanie CFSEcytometria przepływowapulsowanie peptydemizolacja splenocytówocena aktywności CTLzabijanie komórek docelowych
In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.