Artykuł metodologiczny

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56260

⸱

8 listopada 2017

 ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Streszczenie

Embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą samoistnie odnawiać się i różnicować w wiele typów komórek ciała. Komórki pluripotencjalne są zatem pożądane do badań w medycynie regeneracyjnej i są obecnie w badaniach klinicznych nad chorobami oczu, cukrzycą, chorobami serca i innymi zaburzeniami. Potencjał różnicowania się w wyspecjalizowane typy komórek w połączeniu z ostatnimi postępami w technologiach edycji genomu, w tym systemem CRISPR/Cas, zapewnił dodatkowe możliwości dostosowania genomu iPSC do różnych zastosowań, w tym modelowania chorób, terapii genowej i stronniczych ścieżek różnicowania, by wymienić tylko kilka. Wśród dostępnych technologii edycji, CRISPR/Cas9 ze Streptococcus pyogenes okazał się narzędziem z wyboru do edycji genomu eukariotycznego w miejscu specyficznym. CRISPR są łatwo dostępne, niedrogie i bardzo wydajne w inżynierii ukierunkowanych edycji. System wymaga nukleazy Cas9 i sekwencji prowadzącej (20-merowej) specyficznej dla celu genomowego przylegającego do 3-nukleotydowego motywu protospacerowego "NGG" (PAM) w celu ukierunkowania Cas9 na pożądane locus genomowe, wraz z uniwersalnym znacznikiem wiążącym Cas9 RNA (razem nazywane pojedynczym przewodnikiem RNA lub sgRNA). W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół wydajnego generowania iPSC niezależnego od źródła i wolnego od śladu oraz opisujemy metodologie edycji genomu iPSC przy użyciu kompleksów rybonukleoproteiny Cas9 (RNP). Protokół edycji genomu jest skuteczny i może być łatwo multipleksowany przez wstępne kompleksowanie sgRNA dla więcej niż jednego celu z białkiem Cas9 i jednoczesne dostarczanie do komórek. Na koniec opisujemy uproszczone podejście do identyfikacji i charakterystyki iPSC z pożądanymi zmianami. Podsumowując, oczekuje się, że przedstawione strategie usprawnią generowanie i edycję iPSC dla różnorodnych aplikacji.

Wprowadzenie

Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego poprzez nadekspresję czynników przeprogramowujących zrewolucjonizowało badania nad komórkami macierzystymi, znajdując zastosowanie w modelowaniu chorób, medycynie regeneracyjnej i opracowywaniu leków. Dostępnych jest kilka metod przeprogramowania niewirusowych do dostarczania czynników przeprogramowujących i generowania iPSC, ale proces ten jest pracochłonny i niezbyt wydajny1. Metody wirusowe, choć skuteczne, wiążą się z problemami integracji wirusów i rakotwórczości2,3,4. W tym manuskrypcie opisujemy wykorzystanie cytoplazmatycznego wirusa Sendai do dostarczania czynników przeprogramowujących i ustanawiania linii iPSC wolnych od śladów, które nie mają integracji żadnych sekwencji wektorów wirusowych ze swoimi genomami5. Wirus Sendai to wirus RNA, który jest rozcieńczany z cytoplazmy komórki ~10 pasaży po infekcji i wytwarza obfite czynniki przeprogramowujące, co prowadzi do szybkiego i skutecznego przeprogramowania6,7. Ustalone iPSC można następnie łatwo przenieść na pożywkę wolną od karmienia, aby uniknąć użycia mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) jako komórek zasilających8.

W tej publikacji, oprócz opisu przeprogramowania za pośrednictwem wirusa Sendai, opisujemy również ulepszony protokół edycji iPSC, który ma potencjał do dostarczania nieograniczonej liczbie komórek ludzkich pożądanych modyfikacji genetycznych do badań. Wykorzystaliśmy technologię CRISPR/Cas9 do modyfikacji iPSC, która jest obecnie wykorzystywana w szerokim zakresie zastosowań, w tym do knock-inów i knock-outów, delecji genomowych na dużą skalę, badań przesiewowych w bibliotekach zbiorczych w celu odkrycia genów, inżynierii genetycznej wielu organizmów modelowych oraz terapii genowej9,10,11. Technika ta polega na tworzeniu kompleksów nukleazy Cas9 pochodzącej ze Streptococcus pyogenes i 20-merowych przewodników RNA, które osiągają rozpoznanie celu poprzez parowanie zasad z genomową sekwencją docelową przylegającą do sekwencji 3' nukleotydu protospacerowego sąsiadującego z sekwencją (PAM). Nukleaza Cas9 indukuje dwuniciowe pęknięcie ~ 3 nukleotydów z miejsca PAM, które jest następnie naprawiane głównie przez niehomologiczny szlak łączenia końców (NHEJ) prowadzący do insercji lub delecji w otwartej ramce odczytu, a tym samym funkcjonalny nokaut genów12.

Nasz ulepszony protokół zawiera szczegóły dotyczące hodowli ludzkich komórek trzustki, ich przeprogramowania na mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w celu osiągnięcia wyższej efektywności przeprogramowania, późniejszej adaptacji do hodowli bez karmowania na Matrigel, charakterystyki ustalonych iPSC, projektowania i przygotowania RNA pod kontrolą CRISPR, dostarczania do iPSC jako kompleksów RNP, sortowania pojedynczych komórek w celu wygenerowania linii klonalnych edytowanych iPSC, Łatwe przesiewanie i identyfikacja zmian oraz charakteryzacja klonów pojedynczych komórek. Delecje genomowe zostały skutecznie wygenerowane w tym badaniu poprzez wprowadzenie białka Cas9 i dwóch kompleksów CRISPR sgRNA RNP w celu wywołania dwuniciowych pęknięć (DSB) i delecji segmentu pośredniego. Metoda ta wykorzystuje zastosowanie dwóch prowadnic do generowania delecji w otwartej ramce odczytu, wysoką wydajność NHEJ prowadzącą do małej liczby klonów, które należy scharakteryzować, oraz łatwe wstępne badanie przesiewowe klonów za pomocą zautomatyzowanego urządzenia do elektroforezy kapilarnej, analizatora fragmentów. Te skuteczne metody edycji genomu w celu generowania modeli chorób opartych na ludzkich komórkach macierzystych wkrótce staną się standardowym i rutynowym podejściem w każdym laboratorium komórek macierzystych. Wreszcie, precyzyjna edycja genomu umożliwi wyjście poza modelowanie chorób komórek macierzystych i potencjalnie może pomóc w katalizowaniu terapii opartych na komórkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Protokół przeprogramowania

  1. Wytwarzanie ludzkiego iPSC z pierwotnych ludzkich komórek trzustki
    1. Pokryj 6-dołkową płytkę 1,5 mg/ml zimnego kolagenu i pozostaw do żelowania w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Umieść ludzkie pierwotne komórki trzustki o wczesnym pasażu w pożywce Prigrow III (~ 1 - 1,5 × 105 komórek) na pokrytej kolagenem 6-dołkowej płytce w dniu -2, aby osiągnąć około 2,5 × 105 komórek lub co najmniej 60% konfluencji na studzienkę w dniu transdukcji (dzień 0). W pierwszym badaniu należy umieścić na płytkach co najmniej 2-3 dołki, aby uzyskać jedną studzienkę z pożądaną konfluencją w dniu 0. Użyj co najmniej jednej studzienki jako kontrolki, aby policzyć komórki.
    3. W dniu transdukcji (dzień 0) ogrzej 1 ml pożywki Prigrow III w łaźni wodnej dla każdej studzienki, która ma być transdukowana. Zbierz komórki z jednej studzienki kontrolnej w 1 ml 10% pożywki FBS, używając 1 ml trypsyny/EDTA przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki odłączą się, aby przeprowadzić liczenie komórek. Aby uzyskać 10% pożywki FBS, dodaj DMEM, 10% FBS, 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu i 1% aminokwasów endogennych.
    4. Policz i sprawdź żywotność komórek za pomocą licznika komórek i oblicz objętość każdego wirusa potrzebną do osiągnięcia celu na podstawie liczby komórek i miana wirusa. Użyj wielokrotności infekcji (MOI) KOS = 5, hc-Myc = 5 i hKlf4 = 3 dla komórek trzustki.
    5. Rozmrozić jeden zestaw probówek wektorowych Sendai w temperaturze -80 °C przechowywanych na lodzie i ostrożnie dodać obliczoną objętość każdej z trzech probówek wektorowych Sendai do 1 ml pożywki Prigrow III, wstępnie podgrzanej do temperatury 37 °C. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać roztwór. Jedna studzienka w 6-dołkowej płytce wystarcza do transdukcji za pomocą wektorów wirusa Sendai w celu wygenerowania przeprogramowanych komórek.
    6. Odessać pożywkę Prigrow III z komórek i powoli dodawać mieszaninę wirusa przeprogramowującego do studzienek zawierających komórki. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżoną atmosferą o stężeniu 5%CO2.
    7. Ostrożnie wyrzuć mieszaninę wirusa na komórki i zastąp ją świeżą pożywką Prigrow III następnego dnia, 24 godziny po transdukcji. Hodować komórki przez 5 dni i zmieniać pożywkę co drugi dzień.
    8. W dniu 5 przygotuj MEF na 0,1% żelatynowych wstępnie powlekanych 10 cm szalkach hodowlanych (1,3 x106 komórek/naczynie). Hoduj MEF-y w kolbach T175 do 4 dnia, a następnie 5 dnia, wystaw komórki na działanie 6,000 radów ze źródła promieniowania γ przed wysiewem komórek13 lub użyj komercyjnego źródła MEF.
    9. W 6 dniu należy użyć 1 ml roztworu do oddzielania komórek przez 10 minut w celu odłączenia transdukowanych komórek, umieścić je wszystkie na szalkach MEF w pożywce Prigrow III z inhibitorem skał (5 mM bulionu, 10 μM końcowy) i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżoną atmosferą 5% CO2 .
    10. Następnego dnia zmień pożywkę Prigrow III na pożywkę hESC. Aby uzyskać 500 ml pożywki hESC, dodać DMEM/F-12, 20% (v/v) zamiennik surowicy nokautującej (KOSR), 5 ng/ml bFGF; 1 mM l-glutamina; 100 μM aminokwasów endogennych i 100 μM 2-merkaptoetanolu. Teraz delikatnie zmieniaj podłoże każdego dnia.
    11. Regularnie obserwuj płytki pod kątem pojawienia się grudek lub kolonii komórek wskazujących na przeprogramowane komórki. Przekształcone komórki tworzą agregaty klonalne o morfologii brukowej oraz dużym jądrze i jąderkach. Oznacz prawdopodobne kolonie "iPSC" i regularnie sprawdzaj ich wzrost.
    12. Prawie cztery tygodnie po transdukcji, gdy kolonie są gotowe do pobrania lub przeniesienia, przygotuj 24-dołkowe płytki MEF, posiewając 1,3 x 106 komórek/wstępnie pokrytą żelatynową płytkę, jak poprzednio, do transferu pojedynczych kolonii.
      1. Przygotować membranę matrycy (np. Matrigel), dzieląc ją na porcje w oparciu o współczynnik rozcieńczenia na certyfikacie analizy. Dodać jedną porcję do 25 ml DMEM/F-12, aby pokryć cztery płytki 6-dołkowe (1 ml/basenik) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem. Ręcznie pobrać 12-24 kolonie za pomocą sterylnej końcówki pipety do ich odessania i przenieść na płytki MEF w 500 μl pożywki hESC.
      2. Zassaj pożywkę w studni, aby delikatnie zakłócić lub rozbić kolonie. Wybierz również 24-48 kolonii na 24-dołkowych płytkach pokrytych membraną matrycy. W przypadku płyt powlekanych membraną należy stosować mTeSR1 (uzupełniony inhibitorem skał 10 μM) przez 24 godziny i wymieniać go codziennie. W ciągu 6-10 dni od pobrania kolonii są one gotowe do przeniesienia na nowe 24-dołkowe i/lub 12-dołkowe płytki membranowe w celu ekspansji klonalnej.
    13. W razie potrzeby oderwij kolonie na MEF-ach za pomocą kolagenazy 1 mg/ml przez 20 minut, przemyj dwukrotnie hESC/mTeSR1 i przenieś na 12- lub 24-dołkowe płytki pokryte membraną. Jeśli na membranie matrycy rośnie wystarczająca ilość wytrzymałych kolonii z kroku 1.1.12, zamroź kolonie na MEF za pomocą pożywki do zamrażania iPSC zgodnie z wytycznymi producenta.
    14. Oderwać wytrzymałe kolonie posiane na membranie w kroku 1.1.12, używając 500 μl dypazy przez 20 minut i ponownie rozłożyć na 12-dołkowych płytkach pokrytych membraną matrycową. Ręcznie zeskrob wszelkie zróżnicowane komórki lub zanieczyszczające komórki zasilające MEF, aby wzbogacić o pluripotencjalne klony na błonie.
    15. Ekspandować klony po 6-8 dniach, hodując je na płytkach pokrytych membraną, dysocjując roztworem dypazy, jak poprzednio, i posiewając agregaty małych komórek na świeżej płytce 6- lub 12-dołkowej pokrytej membraną. Zmieniaj podłoże mTeSR1 codziennie. Scharakteryzuj przeprogramowane klony za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną, barwienia immunologicznego markerów pluripotencji (OCT3/4 i NANOG), analizy FACS pluripotencjalnych markerów powierzchniowych i testów różnicowania. Hoduj i hoduj klony na płytkach pokrytych membraną do wszystkich testów, w tym edycji CRISPR, jak wyjaśniono powyżej, chyba że wyraźnie wymieniono inne rozwiązanie do powlekania.
  2. Charakterystyka ludzkich komórek iPS
    1. Barwienie fosfatazą alkaliczną
      UWAGA: Używany jest tutaj zestaw komercyjny. Zobacz tabelę materiałów.
      1. Płytka przypuszczalnych ludzkich iPSC na 24-dołkowej płytce i hodowla przez 4-5 dni z codzienną wymianą pożywki.
      2. Aby rozpocząć protokół barwienia, odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki 1 ml 1x PBS z 0,05% Tween 20 (PBST).
      3. Dodać 0,5 ml roztworu utrwalającego z zestawu na komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 do 5 minut. Odessać roztwór utrwalający, a następnie przemyć utrwalone komórki PBST. Nie pozwól, aby studzienki wyschły.
      4. Dodać 0,5 ml świeżo przygotowanego roztworu substratu AP do dołka, mieszając roztwór A, B i C. Inkubować komórki w ciemności (owinięte folią lub w ciemnym pojemniku) w temperaturze pokojowej przez 5 do 15 minut.
        UWAGA: Uważnie monitoruj zmianę koloru i zatrzymaj reakcję, gdy kolor stanie się jasny, aby uniknąć niespecyficznego barwienia.
      5. Zatrzymać reakcję, zasysając roztwór substratu AP i dwukrotnie przemywając studzienki 2 ml 1x PBS.
      6. Obserwuj kolonie pod mikroskopem i uchwyć obrazy w powiększeniu 4X lub 10X za pomocą dowolnego mikroskopu jasnego pola z kamerą.
    2. Barwienie immunologiczne
      1. Umieść ludzkie iPSC na 24-dołkowej płytce i hoduj przez 4-5 dni z codzienną wymianą pożywki.
      2. Umyj komórki raz krótko PBS i utrwal przez 20 minut 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS.
      3. Umyć trzy razy przez 10 minut (3x, 10 min) z PBS w temperaturze RT.
      4. Nasycić niespecyficzne miejsca 10% normalną surowicą kozią lub ośle (NS, w zależności od wyhodowanego przeciwciała drugorzędowego zwierzęcia) w PBS przez 40 minut w RT. Tylko w przypadku epitopów wewnątrzkomórkowych uwzględnij 0,3% TX-100 w PBS (TX/PBS), aby przepuszczalność.
      5. Mycie 3x5 min z PBS w RT.
      6. Rozcieńczyć przeciwciała OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 i SOX17 w świeżym roztworze 5% NS w PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
      7. Myć 3x przez 5 min z PBS w RT.
      8. Rozcieńczyć odpowiednie wtórne przeciwciała Alexa Fluor 488 lub 568 w 5% NS / PBS i inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      9. Prać 3x przez 5 min w RT.
      10. Inkubować z DAPI w PBS przez 10 minut i myć 2x przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Do robienia zdjęć używać mikroskopu fluorescencyjnego.
    3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
      1. Umieść ludzkie iPSC na 6-dołkowej płytce i hoduj, aż kolonie staną się zlewające się w 80% (co najmniej 105 komórek / próbkę) z codzienną zmianą pożywki mTeSR1.
      2. W dniu eksperymentu wyizolować komórki i zdysocjować do zawiesiny pojedynczej komórki, jak wyjaśniono powyżej w protokole. Umyć 10% podłożem FBS.
      3. W przypadku markerów powierzchniowych ponownie zawiesić w 0,5-1 ml 10% podłoża FBS i przechowywać na lodzie.
      4. W przypadku markerów wewnątrzkomórkowych należy ponownie zawiesić w 1 ml 4% PFA/PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyć 10% podłożem FBS. Zawiesić ponownie w 0,1% TX/PBS i inkubować przez 15 minut na lodzie. Umyj ponownie 10% podłożem FBS. Zawiesić w 0,5-1 ml 10% pożywki FBS i przechowywać na lodzie.
      5. Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do 50 μl 10% pożywki FBS zawierającej zalecaną ilość przeciwciał TRA-1-60, TRA-1-81 lub SSEA-4 i inkubować przez 30 minut do 1 godziny.
      6. Umyj dwa razy z 10% FBS.
      7. Zawiesić ponownie w 100 μl 10% pożywki FBS zawierającej fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe i inkubować przez 30 minut. Przemyć dwukrotnie 10% FBS i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości 10% FBS. Żywe komórki można odróżnić od martwych komórek za pomocą barwnika jodku propidyny dodanego w ilości <1 μg/ml, aby oszacować apoptozę komórek podczas procesu.
    4. Zróżnicowanie trójliniowe
      1. Wysiewać dwie 6-dołkowe płytki z 1,5-2 x 106 iPSC/dołek w podłożu mTeSR1 z 10 μM inhibitorem skał.
      2. Pozwól komórkom rosnąć przez 2-3 dni z codzienną wymianą podłoża mTeSR1, aż studzienki zlewają się w 80-90%.
      3. W celu indukcji ektodermy dodaj pożywkę do indukcji neuronalnej (NIM) zgodnie z instrukcjami producenta w 2-3 dołkach 6-dołkowych płytek.
      4. Zmień pożywkę na RPMI zawierającą 2% suplementu B27 minus insulinę i 12 μM CHIR99021 do indukcji mezodermy w 2-3 dołkach płytek14. Przez następne 24 godziny dodawaj tylko RPMI zawierające 2% suplementu B27 minus insulinę. Dodać 5 μM IWP4 do pożywki RPMI z 2% suplementem B27 minus insulina przez następne 24 godziny. Po 72 godzinach należy zastąpić pożywkę RPMI zawierającą 2% suplementu B27 prowadzącego do wytworzenia bijących kardiomiocytów w ciągu 2-3 dni.
      5. W celu indukcji endodermy, zmień pożywkę w studzienkach płytek 6-dołkowych na MCDB 131 uzupełnioną 1,5 g/l wodorowęglanu sodu, 1x Glutamax, 10 mM glukozy, 0,5% BSA, 100 ng/ml GDF8 i 5 μM CHIR99021 przez 24 godziny. Hodowla w tym samym podłożu bez CHIR99021 dla 2-3 d15.
      6. Postępuj zgodnie z protokołem barwienia immunologicznego z kroku 2 dla wszystkich trzech linii i sprawdź ekspresję odpowiednich markerów.

2. Edycja genomu ludzkiego iPSC za pomocą CRISPR-Cas9

  1. Otrzymywanie białka Cas9 i sgRNA
    1. Podwielokrotność białka Cas9 umieścić w probówkach do mikrowirówek w sterylnych warunkach i przechowywać podwielokrotności poprzez zamrożenie probówek w temperaturze -80 °C.
    2. Zaprojektuj dwa przewodnikowe RNA na gen w oparciu o oprogramowanie z MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) lub dowolne inne narzędzie internetowe do projektowania przewodników CRISPR. Celuj w pierwszy lub drugi ekson genu (w oparciu o otwartą ramkę odczytu), aby wygenerować nokauty. Wybieramy dwie prowadnice tak, aby ścinały się blisko siebie (~30-100 pz od siebie), a my możemy łatwo zwizualizować usunięcie za pomocą tego samego zestawu starterów przesiewowych. Wybierz przewodniki z danych wyjściowych oprogramowania na podstawie wyższego wyniku jakości i mniejszej liczby witryn poza celem. Zaprojektuj podkłady przesiewowe za pomocą programu primer blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Startery przesiewowe powinny znajdować się w odległości co najmniej 100 pz od miejsc cięcia Cas9, a rozmiar produktu PCR powinien wynosić korzystnie od 400-700 pz, aby ułatwić amplifikację metodą PCR.
    3. Zaprojektuj dwa komplementarne oligonologiczne DNA sgRNA (długość 19-22 nukleotydów w zależności od sekwencji prowadzącej) z miejscem cięcia Bsa1 na każdym końcu. OligonukleoDNA mogą być syntetyzowane komercyjnie i wyżarzane w celu utworzenia dwuniciowego DNA. Do wyżarzania należy dodać po 1 μl po 100 μM prowadnic, 25 μl buforu do wyżarzania (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) i 23 μl wody. Inkubować w termocyklerze zaprogramowanym na start w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, a następnie stopniowo schładzać do 25 °C przez 45 minut.
    4. Sklonuj 2 μl powstałego fragmentu do enzymu restrykcyjnego Bsa1 strawionego 1 μl wewnętrznego wektora promotora T7 pCR2.1 z miejscem wiązania Cas9 przy użyciu ligazy DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.
    5. Sekwencjonuj sklonowane fragmenty DNA, a gdy wierność zostanie ustalona, transkrybuj klony in vitro za pomocą zestawu T7 w celu wygenerowania pojedynczych przewodników RNA. Oczyść sgRNA za pomocą komercyjnego zestawu i eluuj w wodzie wolnej od RNaz. Sprawdź stężenie RNA.
  2. Transfekcja hiPSC
    1. Hoduj hiPSC w pożywce mTeSR1, jak opisano powyżej, aż komórki zlewają się w 40-50%.
    2. Dwie godziny przed nukleofekcją zastąp pożywkę 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 zawierającej 10 μM inhibitora skały.
    3. Godzinę później przygotuj dołki docelowe dla komórek nukleofektowanych, odsysając błonę, przygotowaną jak powyżej, z płytki 12-dołkowej i zastępując wstępnie podgrzanym 1 ml pożywki mTeSR1 inhibitorem skały 10 μM. Przechowywać w temperaturze 37 °C do inkubacji.
    4. Przygotować główną mieszaninę nukleofekcji (odpowiednio skalować w zależności od próbek) dla każdej próbki, dodając 16,4 μl pierwszorzędowego suplementu komórkowego P3; 3,6 μl suplementu 1 z zestawu nukleofektora; 0,5 μg białka Cas9 i 0,5 μg każdego sgRNA w 22 μl na objętość reakcji. Wektor pMAX GFP został również zanukleekowany zgodnie z zaleceniami producenta w komórkach, aby z grubsza oszacować wydajność iPSC transfekcji.
    5. Przemyć każdą studzienkę 2 ml RT PBS po zassaniu pożywki zawierającej inhibitor skały ze studzienek iPSC. Następnie odessać PBS, dodać 1 ml roztworu do odrywania komórek i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    6. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki mTeSR1 i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zdysocjowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki mTeSR1.
    7. Policz komórki za pomocą licznika komórek i oblicz całkowitą objętość wymaganą dla 0,5 x 106 komórek/transfekcję. Umieścić żądaną ilość komórek w 15-mililitrowej probówce wirówkowej, odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
    8. Zawiesić każdą jednostkę 0,5 x 106 komórek w 22 μl głównej mieszanki transfekcji przygotowanej w kroku 4. Szybko przenieś komórki do centralnej komory jednego dołka paska nukleokuwety. Umieść pasek w urządzeniu nukleofektorowym i komórkach nukleofektu za pomocą programu CB150.
    9. Po nukleofekcji szybko dodaj 80 μl wstępnie podgrzanej pożywki mTESR1 zawierającej 10 μM inhibitora skał do każdej studzienki komórek nukleofektowanych. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.
    10. Delikatnie przenieść komórki z paska do studzienek wstępnie pokrytej membraną 12-dołkowej płytki zawierającej pożywkę mTeSR1 z inhibitorem skał przygotowanym w kroku 3.
    11. Po 1 d zmienić na świeże podłoże mTeSR1 bez inhibitora skał. Zbierz komórki 2-3 d po nukleofekcji do sortowania pojedynczych komórek.
  3. Izolacja pojedynczych komórek docelowych hiPSC
    1. Na dzień przed sortowaniem należy przygotować 96-dołkowe płytki MEF, wysiewając 2 x 106 komórek/płytkę pokrytą żelatyną w 10% podłożu FBS. Około 70-80% klonów przeżywa po nukleofekcji, a do każdego eksperymentu edycyjnego można przygotować 2-3 płytki MEF.
    2. Po całonocnej inkubacji zmień pożywkę na pożywkę hESC (jak opisano wcześniej) uzupełnioną 100 ng/ml bFGF, 1x SMC4 (inhibitory dodawane do pożywki w celu zwiększenia żywotności pojedynczych komórek) i 5 mg/ml fibronektyny w celu zwiększenia adhezji.
    3. Wymienić pożywkę na hiPSC na płytce 12-dołkowej z mTeSR1 na pożywkę mTeSR1 uzupełnioną 1x SMC4 na co najmniej 2 godziny przed sortowaniem pojedynczych komórek.
    4. Odessać pożywkę z hiPSC i delikatnie przemyć komórki PBS. Dodać 500 μl roztworu oddzielającego komórki do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut po zaessaniu PBS. Wytworzyć zawiesinę jednokomórkową, dodając 1 ml mTeSR1 (nieuzupełnionego) do każdej studzienki i delikatnie pipetując w górę iw dół kilka razy.
    5. Umieścić zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml mTeSR1.
    6. Sortować komórki w pojedynczych komórkach za pomocą sortera komórek z dyszą 100 mm w sterylnych warunkach, z jedną komórką w osobnym dołku z 96-dołkowymi płytkami przygotowanymi w kroku 1.
    7. Cztery dni po sortowaniu powinno być widoczne tworzenie kolonii; w tym momencie zastąp pożywkę hodowlaną pożywką hESC uzupełnioną 1x SMC4.
    8. Osiem dni po sortowaniu zastąp pożywkę pożywką hESC i hoduj przez 2 dni.
    9. Odłącz kolonie za pomocą 1 mg / ml kolagenazy przez 20 minut i przenieś je na 24-dołkowe płytki pokryte błoną w mTeSR1 z inhibitorem skał. Pozwól klonom jednokomórkowym rosnąć i wyodrębnić ich genomowe DNA po ich zduplikowaniu lub rozszerzeniu. Użyj starterów specyficznych dla genu, aby amplifikować docelowe DNA metodą PCR.
    10. Użyj zestawu analizatora fragmentów do wstępnego badania przesiewowego docelowego regionu genomowego wszystkich klonów z amplifikacją PCR, przepuszczając je przez mieszankę żelu i barwnika zgodnie z instrukcjami producenta. Oszacuj wynikowy rozmiar fragmentu w oprogramowaniu PROSize, porównując go z odpowiednią drabiną, która jest uruchamiana z próbkami. Sekwencjonuj oczekiwane "edytowane" klony i analizuj dane sekwencjonowania, aby potwierdzić edycję lub usunięcia.
    11. Aby rozróżnić klony monoalleliczne i bialleliczne, amplifikuj edytowaną sekwencję za pomocą PCR i sklonuj w wektorze pJET1.2. Wyślij co najmniej 8-10 klonów do sekwencjonowania i sprawdź sekwencję, aby potwierdzić edycję w jednym lub obu allelach.
    12. Po pomyślnym zidentyfikowaniu ukierunkowanych klonów iPSC za pomocą genotypowania, należy zbadać, czy nie utraciły one pluripotencji ani nie uzyskały nieprawidłowości chromosomowych w tym procesie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej publikacji zastosowaliśmy prosty, lecz wydajny protokół generowania iPSC z ludzkich komórek trzustki przy użyciu wektorów wirusa Sendai, które nie integrują się z genomem ani nie pozostawiają śladów (footprint-free). Rysunek 1A przedstawia schematyczny przebieg tego protokołu przeprogramowania. Ludzkie komórki trzustki zakupiono komercyjnie, hodowano w medium Prigrow III i transdukowano wirusem Sendai zgodnie z powyższym opisem. Transdukowane, wr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych na komórki iPS stanowi istotny bodziec dla rozwoju dziedzin biologii podstawowej, medycyny spersonalizowanej, modelowania chorób, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej16. Wiele obecnych i szeroko stosowanych metod generowania iPSC u ludzi wymaga użycia wirusa z ryzykiem integracji z genomem gospodarza lub wektorów episomalnych o niskiej wydajności przeprogramowania. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę generowania iPSC bez karmienia z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

BT jest członkiem-założycielem RenOVAte Biosciences Inc.

Podziękowania

Praca w laboratorium była wspierana przez grant na staż podoktorski dla dr Anjali Nandal oraz grant eksploracyjny z Maryland Stem Cell Research Fund dla BT (TEDCO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wektory wirusowe Sendai - CytoTune-iPS 2.0 KitInvitrogenA16517Rozmrażanie na lodzie; S No: 1
Trypsyna EDTAGibco Life Tech25300-0540,05%, 100 ml; S No: 2
Inhibitor skał (Y-27632)MiliporeSCM075Użyj 10 μ M; S No: 3
DMEM/F-12 mediumInvitrogen11330-032S No: 4
Wymiana surowicy (KSR)Gibco10828028S No: 5
DMEMInvitrogen119600691X; S No: 6
Płodowa surowica bydlęcaThermo ScientificSH30071.03Podwielokrotność; S No: 7
L-glutamina (Glutamax, 100X), płynThermo Scientific350500611/100; S nr: 8
aminokwasów endogennychGibco11140-0501/100; S Nr: 9
2-merkaptoetanolGibco2198502355 mM, 1/1,000; S No: 10
HemacytometryHausser Hausser Scientific02-671-54S No: 11
0,1% roztwór żelatynySTEMCELL Technologies7903Inkubuj w 37º C przez 1 godzinę; Nr S: 12
Przeciwciało SSEA-4Santacruzsc-217041/100; S Nr: 13
TRA-1-81Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała 4745S1/200; S Nr: 14
OCT4 przeciwciałoSanta Cruzsc-52791/1,000; S No: 15
Kolagen I, Rat TailLife TechnologiesA10483-01Przechowywać w chłodzie; S Nr: 16
Alexa Fluor fluorescencyjna 488/568 (przeciwciała drugorzędowe)InvitrogenA21202 / A100421/2,000; S Nr: 17
DPBSHycloneSH30028LS1X; S Nr: 18
100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowejFalcon353003S No: 20
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFalcon353078S No: 21
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFalcon353046S No: 22
Zakres preparacyjny NikonSMZ745S No: 23
Osłona do kompletacjiNuAireNU-301S No: 24
15  ml Probówka wirówkowaGreiner Bio-One188271S Nr: 25
50  ml Probówka wirówkowaGreiner Bio-One227261S No: 26
Pirogronian soduInvitrogen11360S Nr: 28
β-merkaptoetanolSigmaM7522S No: 29
Prigrow III mediumABMTM003S No: 31
Hrabina i handel; Licznik komórekInvitrogenC10227S Nr: 32
System rentgenowski FaxitronFaxitronCellRad S No: 33
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104S No: 34
CollagenaseLife Technologies17104019zapas 1 mg / ml; S No: 35
DispaseSTEMCELL Technologies7923S No: 36
Matrigel z kwalifikacją hESCBD Biosciences354277Do rozcieńczenia użyj zimnego DMEM/F-12; Nr S: 37
bFGFR & D233-FBZapas 10 ug/ml; S No: 38
ParaformaldehydEMS157104% zapasów w PBS; Nr S: 39
TRA-1-60Santa Cruzsc-217051/100; Nr kat.: 40
NANOGReproCELLRCAB0004P-F1/100; S No: 41
Tween 20SigmaP9416-100MLS No: 42
Zestaw fosfatazy alkalicznejStemgent00-0055S No: 43
Białko Cas9PNA BioCP01-50Rozmrażanie i podwielokrotność; S No: 44
Serum kozie lub osłaSigmaD9663/G9023S No: 45
Triton X-100SigmaX100-100MLS No: 46
DAPIThermo ScientificD1306S No: 47
TrisSigma9285-100MLS No: 48
NaCLSigmaS7653-250GS No: 49
EDTASigmaBP2482-500S Nie: 50
Ligaza DNA T4NEBM0202TS Nr: 51
Zestaw Mega Shortscript T7Thermo ScientificAM1354S No: 52
Zestaw Mega ClearThermo ScientificAM1908Nr S: 53
SMC4BD Biosciences354357S No: 54
FibronectinSTEMCELL Technologies7159S No: 55
Zestaw do klonowania CloneJETThermo ScientificK1232S No: 56
Analizator fragmentówTMAdvanced AnalyticalNr S: 57
mTeSR1 medium kitSTEMCELL Technologies5850Ciepła do temperatury pokojowej; S No: 58
Medium mFreSR™STEMCELL Technologies5855S No: 59
Medium zamrażające CryoStor®STEMCELL Technologies7930S Nr: 60
MEFsGlobalstemGSC-6301GS No: 61
L-glutaminaInvitrogen25030081S No: 62
Ludzkie komórki trzustkiABMT0159Nr S: 63
STEMdiff™ Indukcja neuronalna MediumTechnologie komórek macierzystych5835Nr S: 64
RPMIThermofisher11875-093Nr S: 65
2% B27-insulinaThermofisherA1895601Nr S: 66
CHIR99021Technologie Stemcell72052Nr S: 67
Technologie macierzysteIWP472552Nr S: 68
2% B27Thermofisher17504044S No: 69
MCDB 131Life Technologies10372019S No: 70
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS8761-100MLNr S: 71
GlukozaSigma-AldrichG8270-100GNr S: 72
BSAProliant68700Nr S: 73
GDF8Pepro-Tech120-00Nr S: 74
TUJ1 przeciwciałoEMD MiliporeAB9354S Nr: 75
NKX2-5 przeciwciałoSanta CruzSc-14033S No: 76
Przeciwciało SOX17R & Systemy DAF1924S No: 77
Jodek propidynyThermo ScientificP3566S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector&handel;LonzaAAF-1002S No: 79
FACSAria II (sorter komórek)BD biosciencesSORP UVS No: 80

Bibliografia

  1. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
  5. Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612(2012).
  6. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
  7. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594(2014).
  9. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
  10. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559(2017).
  11. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
  12. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
  13. McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
  15. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
  16. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
  17. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
  18. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNP CRISPR Cas9Protok edycji genomuiPSC bez lad w edycji footprint freeMetoda nukleofekcjiSortowanie pojedynczych kom rekBarwienie na fosfataz alkalicznAnaliza immunofluorescencyjnaZestaw do analizy fragment w Fragment analyzer kit

Powiązane artykuły