Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Podsumowanie

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Streszczenie

Popularność systemu CRISPR/Cas9 zarówno do inżynierii genomu, jak i epigenomu wynika z jego prostoty i zdolności adaptacyjnych. Efektor (nukleaza Cas9 lub martwe białko fuzyjne dCas9 z nukleazą) jest ukierunkowany na określone miejsce w genomie przez mały syntetyczny RNA znany jako przewodnik RNA lub gRNA. Dwuczęściowy charakter systemu CRISPR umożliwia jego zastosowanie w badaniach przesiewowych, ponieważ biblioteki plazmidów zawierające kasety ekspresyjne tysięcy pojedynczych gRNA mogą być używane do badania wielu różnych miejsc w jednym eksperymencie.

Do tej pory, sekwencje gRNA do budowy bibliotek były prawie wyłącznie generowane przez syntezę oligonukleotydów, co ogranicza osiągalną złożoność sekwencji w bibliotece i jest stosunkowo kosztowne. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), prostej i opłacalnej metody generowania wysoce złożonych bibliotek gRNA opartej na enzymatycznym trawieniu wejściowego DNA. Ponieważ biblioteki CORALINA mogą być generowane z dowolnego źródła DNA, istnieje wiele opcji dostosowywania, co umożliwia dużą różnorodność ekranów opartych na CRISPR.

Wprowadzenie

Adaptacja bakteryjnego systemu CRISPR/Cas9 jako narzędzia do celowania molekularnego spowodowała najnowszą rewolucję w biologii molekularnej. Nigdy wcześniej manipulowanie chromatyną w określonych lokalizacjach genomu nie było tak łatwe. Typowe zastosowania CRISPR obejmują ukierunkowane mutacje genów¹, inżynieria genomu², edycja epigenomu³, aktywacja transkrypcji i wyciszanie genów⁴. Jedną ze szczególnych zalet systemu CRISPR jest to, że jego zastosowania nie ograniczają się do dobrze zbadanych miejsc kandydujących, ponieważ biblioteki gRNA umożliwiają mniej stronnicze badania przesiewowe. Ułatwiają one odkrywanie funkcjonalnych loci w genomie bez wcześniejszej wiedzy eksperymentalnej. Jednak budowa biblioteki gRNA opiera się obecnie głównie na syntezie oligonukleotydów, a możliwości zakupu bibliotek gRNA, które nie są pochodzenia ludzkiego lub mysiego, nie są regionami docelowymi poza otwartymi ramkami odczytu, są ograniczone. Tak więc, chociaż ekrany CRISPR już okazały się niezwykle potężne^5,6,7,8, ich pełny potencjał nie został jeszcze wykorzystany.

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznych metod generowania gRNA, ostatnio opracowano dwie strategie. Oba opierają się na kontrolowanym trawieniu enzymatycznym docelowego DNA, a nie na niestandardowej syntezie oligonukleotydów. Podczas gdy CORALINA⁹ wykorzystuje nukleazę mikrokokkową, jedyna obecnie dostępna alternatywna metoda, CRISPR-EATING¹⁰, wykorzystuje enzymy restrykcyjne (HpaII, ScrFI, BfaI i MmeI). Co ważne, obie techniki mogą być stosowane do dowolnego wejściowego DNA, które służy jako źródło sekwencji protospacerowych gRNA. Podczas gdy metoda CRISPR-EATING wykorzystuje strategię zmniejszania liczby sklonowanych gRNA, których miejsca docelowe nie są śledzone przez wymagany S.pyogenes PAM (protospacer sąsiedni motyw), generuje ona tylko niewielki ułamek wszystkich możliwych funkcjonalnych gRNA dla danego regionu. Z drugiej strony CORALINA jest w stanie wygenerować wszystkie potencjalne gRNA dla sekwencji źródłowej, ale zawiera również większą część niefunkcjonalnych przewodników. Generowanie bibliotek gRNA poprzez kontrolowaną aktywność nukleazy umożliwia tworzenie kompleksowych bibliotek gRNA dla dowolnego gatunku, dowolnego białka Cas9 lub systemu efektorowego w prosty i opłacalny sposób. Co więcej, CORALINA można dostosować do dostosowywania, ponieważ odpowiednie wybory wejściowe i wektorowe definiują typ, rozmiar i zawartość biblioteki. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół, który można wykorzystać do generowania kompleksowych bibliotek gRNA z różnych źródeł DNA (Rysunek 1), w tym bakteryjnych sztucznych chromosomów (BAC) lub genomowego DNA⁹. Reprezentatywne wyniki towarzyszące temu protokołowi uzyskano poprzez zastosowanie protokołu CORALINA do DNA BAC.

Protokół

1. Trawienie DNA za pomocą nukleazy mikrokokowej

1. Przeprowadzić reakcję optymalizacyjną dla każdej nowej partii enzymu nukleazy mikrokokowej (MNazy).
   UWAGA: Należy przetestować liczbę jednostek użytej MNazy (przy użyciu szeregowego rozcieńczenia, Rysunek 2A). Zwykle 5-10 U MNazy trawi 1 μg oczyszczonego genomowego DNA lub BAC do zakresu 5-100 pz w warunkach opisanych poniżej.
2. Na reakcję należy umieścić 1 μl 10x buforu MNazy, 1x albuminę surowicy bydlęcej (BSA), 1 μg docelowego DNA, 1 μl MNazy (0,1-50 jednostek) w 10 μl objętości reakcyjnej.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
4. Natychmiast dezaktywować enzym przez dodanie 1 μl 500 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA).

2. Separacja fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (STRONA)

1. Dodaj bufor próbki/barwnik ładujący żel do próbek DNA i załaduj na 20% żel PAGE. Załaduj odpowiednią drabinkę DNA do wymiarowania (drabinka DNA 5 pz). Nie należy przeciążać żelu (1 μg DNA na studzienkę).
2. Uruchom żele w odpowiednim buforze 1x TRIS-Boran-EDTA (TBE) pod napięciem 150 V (stałym) przez około 1,5 godziny lub do momentu, gdy dolny front barwnika (błękit bromofenolowy, kolor ciemnoniebieski), który przemieszcza się z prędkością około 15 pz, osiągnie dolny koniec żelu.
3. Zabarwić żel za pomocą ultrawrażliwego barwnika kwasu nukleinowego i wizualizować w świetle UV.
4. Na podstawie obrazu żelu określ optymalne stężenie MNazy do trawienia DNA o wielkości do 20-30 pz.
5. Użyj zoptymalizowanego stężenia MNazy do trawienia docelowego DNA, powtarzając kroki 1.2-2.2. Zazwyczaj przeprowadzenie 10-12 reakcji (tj. 10-12 μg całkowitego materiału wyjściowego) daje wystarczającą ilość strawionego DNA po ekstrakcji żelem PAGE, aby przejść do kolejnych etapów.
6. Za pomocą sterylnego skalpela przeciąć żel obok pasa znacznika i zabarwić tylko część żelu zawierającą drabinę świeżym buforem do biegania 1x TBE zawierającym 1X ultraczułego barwnika kwasu nukleinowego. Wizualizacja drabiny DNA i wycięcie fragmentów DNA trawionych przez MNazę w zakresie wielkości około 18-30 pz za pomocą żyletki.
   UWAGA: Unikaj wystawiania strawionych fragmentów MNazy na działanie światła UV. Możliwe jest użycie źródła światła niebieskiego (zamiast UV) lub zrobienie zdjęcia drabiny w promieniowaniu UV, wydrukowanie go w skali i wykorzystanie go do kierowania wycinaniem fragmentów DNA trawionych przez MNazę). Ten krok pozwala uniknąć barwienia i wystawienia fragmentów DNA na działanie światła UV. Do tego kroku zawsze używaj nieużywanego, sterylnego jednorazowego skalpela lub żyletki, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Przenieś plasterek żelu do probówki mikrowirówkowej.
8. Pozostałą część żelu zabarwić kwasem nukleinowym jak powyżej, wystawić na działanie światła UV i nagrać obraz, aby zachować zapis etapu wycinania żelu.

3. Izolacja fragmentów DNA z żeli PAGE-Metoda Crush and Soak

UWAGA: Ten krok został zaadoptowany z Sambrook et al.¹¹

1. Przygotować żelowy bufor solubilizacyjny PAGE (1,88 ml 4 M octanu amonu, 150 μl 1 M octanu magnezu, 30 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (pH 8) w ultraczystym_H2Odo całkowitej objętości 15 ml).
2. Zmiażdż wycięty plasterek żelu o ściankę probówki do mikrowirówki za pomocą sterylnej końcówki pipety.
3. Dodać 2 objętości żelu buforu do solubilizacji PAGE i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin na obrotowej platformie.
4. Odwirować próbki przez 1 minutę z maksymalną prędkością w mikrowirówce. Przenieść sklarowany osad do nowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie przenieść żadnych pokruszonych kawałków żelu.
5. Dodać 0,5 objętości buforu do rozpuszczania PAGE do granulki żelu, odwirować i powtórzyć wirowanie (krok 3.4). Połączyć supernatanty.
6. Ekstrahować fragmenty DNA za pomocą standardowej ekstrakcji fenolowo-chloroformowej.
   UWAGA: Fenol jest toksyczny w kontakcie ze skórą lub po połknięciu. Kluczowe znaczenie mają środki ostrożności, takie jak rękawice, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i praca pod wyciągiem. Wszystkie odpady zawierające fenol należy utylizować zgodnie z regulaminem instytutu.
   1. Dodać jedną objętość alkoholu fenolowo-chloroformowego: izoamylowego (25:24:1) do próbki i dokładnie
   przemieszać.
   2. Wirować przez 10 minut z maksymalną prędkością (16 000 x g) w wirówce stołowej w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki. Należy uważać, aby nie przenosić fenolu podczas pipetowania.
   3. Powtórz kroki 3.6.1 i 3.6.2 jeden raz.
   4. Dodać niewielką ilość (0,2 μl) glikogenu, 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2 objętości 100% etanolu (EtOH).
   5. Wirować i inkubować w temperaturze -20 °C przez kilka godzin lub przez noc.
   6. Wirować przez 30 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki stołowej.
   7. Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć osad DNA 70% EtOH.
   8. Wirować przez 30 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki stołowej.
   9. Usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu osad DNA. Upewnij się, że cały EtOH wyparował, ale uważaj, aby nie przesuszyć granulki.
   10. Rozpuścić osad DNA w 12 μl_H2O.
       UWAGA: Ekstrakcja żelu PAGE jest bardzo nieefektywna. Na każde 10 μg początkowego DNA trawionego za pomocą MNazy spodziewaj się odzyskania 1-20 ng oczyszczonych fragmentów po ekstrakcji żelem. Kontroluj ilość i integralność fragmentów, ładując 1/6^th (2 μL) na żel PAGE (Rysunek 2C).

4. Zakończ naprawę fragmentów trawionych przez MNazę, oczyszczonych żelem

1. Przygotuj następującą reakcję za pomocą zestawu do stępiania DNA: 10 μl oczyszczonego DNA z kroku 3.6.10, 1,5 μl 10-krotnego buforu tępiącego, 1,5 μl 1 mM mieszaniny dNTP, 0,6 μl enzymu stępiającego, 1,4 μl_H2O.
2. Inkubować w temperaturze 22 °C przez 30 minut, a następnie inaktywować enzym w temperaturze termicznej przez inkubację w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
3. Dodać 85 μl_H2Oi przeprowadzić oczyszczanie reakcyjne przy użyciu standardowej ekstrakcji fenolem/chloroformem i wytrącania EtOH (jak opisano w sekcji 3.6). Natychmiast przejdź do podwiązania łącznika.

5. Generacja konsolidatora

UWAGA: Łączniki muszą być wzmocnione równolegle z sekcją 3, aby móc natychmiast przystąpić do ligacji łączników. Użyte poniżej sekwencje starterów muszą być odpowiednie dla wybranego wektora ekspresyjnego gRNA. Prezentowane tutaj zostały zaprojektowane dla wektora pgRNA-pLKO.1. ⁹ Do amplifikacji łącznika 5' z pgRNA-pLKO.1 użyj sekwencji starterów 5'-linker-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) i 5'-linker-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), co daje amplikon 689 bp. Do amplifikacji łącznika 3' z pgRNA-pLKO.1 należy użyć starterów 3'-linker-F: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) i 3'-linker-R: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), które dają amplikon 848 bp.

1. Amplifikacja PCR sekwencji adaptera z wektora ekspresyjnego gRNA (przy użyciu wybranych odczynników i niestandardowych sekwencji starterów, jeśli to konieczne). W przypadku pgRNA-pLKO.1 należy przeprowadzić następującą reakcję PCR o objętości 50 μl: 25 μl głównej mieszanki PCR, 2,5 μl startera F (10 μM), 2,5 μl startera R (10 μM), 0,1 ng wektora ekspresyjnego gRNA (pgRNA-pLKO.1) w H₂O.
2. Inkubować reakcje na termocyklerze w następujących warunkach: 1 cykl 98 °C przez 30 s, 32 cykle 98 °C przez 10 s, 59 °C przez 10 s, 72 °C przez 30 s, 1 cykl 72 °C przez 10 min.
3. Oczyść reakcje PCR za pomocą odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 30 μl H₂O.
4. Aby wymusić kierunkową ligację łącznika do naprawionych na końcu, trawionych przez MNazę fragmentów DNA, należy trawić łączniki za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych (tutaj HindIII i SacII). Skonfiguruj następujące reakcje:
   1. Do trawienia łącznika 5' z HindIII należy użyć 30 μl oczyszczonego amplikonu łącznika 5' z kroku 5.3., 5 μl buforu, 3 μl HindIII (20U/μL) i 12 μL H₂O.
   2. Do roztwarzania łącznika 3' z workiem SacII należy użyć 30 μl oczyszczonego amplikonu łącznika 3' z kroku 5.3., 5 μl buforu, 3 μl workaII (20 U/μL) i 12 μl_H2O.
5. Inkubować trawienie w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
6. Dodaj barwnik ładujący żel DNA i uruchom trawienie enzymu restrykcyjnego na 1% żelu agarozowym. Wyciąć pasma przy 637 pz (5' ekstrakt linker) i 295 bp (3' digest linker).
7. Oczyść DNA z wyciętych kawałków żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.

6. Podwiązanie łącznika i amplifikacja wkładek

1. Ustawić reakcję ligacji 14 μl, używając równomolowych ilości trawionych przez MNazę, naprawionych na końcach fragmentów i sekwencji łącznikowych.
   UWAGA: Proporcje konsolidatora do fragmentu mogą być zoptymalizowane. Zaleca się włączenie reakcji bez kontroli fragmentów (NFC).
   1. Użyj 5 ng fragmentów trawionych przez MNazę (naprawionych i oczyszczonych na końcu), 120 ng łącznika 5' (trawienie HindIII, oczyszczone), 55 ng łącznika 3' (trawienie SacII, oczyszczone), 1,4 μl buforu ligazy T4 i 1,4 μl skoncentrowanej ligazy DNA T4 w H₂O.
2. Reakcje ligacji inkubować w temperaturze 16 °C przez 16 godzin. Nie dezaktywować enzymu na gorąco. Przejdź natychmiast do nick-translation.
   UWAGA: Naprawione końcowo fragmenty trawione przez MNazę dostarczają fosforanów 5' niezbędnych do ligacji łączników, ponieważ sam łącznik jest niefosforylowany.
3. Do reakcji ligacji (i reakcji NFC) dodać następujące elementy: 25 μl mieszanki głównej Taq 2X (zdolnej do translacji nacięć), 2,5 μl startera Linker-Minus450-F (10 μM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 μl startera Linker-Plus275-R (10 μM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) i 6 μL_H2O.
4. Dołącz kontrolkę bez szablonu (NTC). Inkubuj reakcje na termocyklerze w następujących warunkach: 1 cykl (tłumaczenie nick): 72 °C przez 20 min, 1 cykl: 95 °C przez 5 min, 3-4 cykle: 95 °C przez 15 s, 58 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s, 1 cykl: 72 °C przez 5 min.
5. Przeprowadzić oczyszczanie reakcji za pomocą odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej o stosunku próbki do kulki 1:1. Eluować w 40 μl H₂O.
6. Dalej amplifikować żądany fragment (łącznik 5' + łącznik fragmentu MNazy + łącznik 3') za pomocą odpowiednich odczynników PCR i następujących starterów:
   1. Użyj 12,5 μl mieszanki wzorcowej PCR, 1,25 μl startera Linker-Minus450-F (10 μM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1,25 μl startera Linker-Plus275-R (10 μM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2,5 μl oczyszczonego produktu translacji nick z kroku 6.4. i 7,5 μl H₂O. Zastosuj następujące warunki: 1 cykl: 98 °C przez 30 s, 10-16 cykli: 98 °C przez 10 s, 63°C przez 10 s, 72°C przez 15 s, 1 cykl: 72 °C przez 10 min.
      UWAGA: W razie potrzeby można skonfigurować kilka reakcji równolegle, aby upewnić się, że jest wystarczająca ilość produktu PCR do kolejnych kroków. Aby uwidocznić niewielkie ilości produktu PCR na żelu agarozowym, należy ustawić dodatkowe reakcje, jak w kroku 6.5 i zwiększyć liczbę cyklu z 15 do 32. Reakcja ta może być wykorzystana jako kontrola jakości, jeśli amplikony nie są widoczne po 15 cyklach. Uwzględnij również kontrolkę bez szablonu (NTC).

7. Wybór rozmiaru

UWAGA: Ten krok oddziela fragmenty MNase z prawidłowo dołączonym łącznikiem 5' i 3' od fragmentów z dwoma linkerami 5' lub dwoma 3' w zależności od rozmiaru.

1. Połącz wszystkie 15-cyklowe reakcje PCR z kroku 6.5., dodaj barwnik ładujący DNA i uruchom na 0,8% żelu agarozowym. Wytnij wystające prążki w temperaturze 869 pz i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
2. Określić ilościowo ilość DNA (np. za pomocą spektrofotometru).

8. Klonowanie fragmentów amplifikowanych PCR do wektora ekspresji gRNA przez zespół Gibsona

1. Przygotuj mieszankę wzorcową montażu w następujący sposób:
   UWAGA: Poniższe kroki są zaczerpnięte z Gibson et al.¹².
   1. Utworzyć 6 ml izotermicznego buforu reakcyjnego przez połączenie 3 ml 1 M tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris)-HCl pH 7,5, 300 μL 1 M MgCl, 60 μL 100 mM trifosforanu deoksyguanozyny (dGTP), 60 μL 100 mM trifosforanu deoksyadenozyny (dATP), 60 μL 100 mM trifosforanu deoksytymidyny (dTTP), 60 μL 100 mM trifosforanu deoksycytydyny (dCTP), 300 μl 1 M ditiotreitolu (DTT), 1,5 g glikolu polietylenowego (PEG)-8000, 300 μl 100 mM dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD) w ultraczystym_H2O.
      UWAGA: Ten bufor może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C.
   2. Stwórz 1,2 ml wzorcowej mieszanki montażowej, łącząc 320 μl izotermicznego buforu reakcyjnego 5X, 3 μl 10 U/μL egzonukleazy T5, 20 μl polimerazy DNA 2 U/μL, 160 μl 40 μL ligazy DNA w ultraczystym_H2O. Użyj 15 μl głównej mieszanki montażowej z 5 μl wkładki.
      UWAGA: Mieszanka wzorcowa zespołu może być porcjowana i przechowywana w temperaturze -20 °C, gdzie jest stabilna przez ponad rok i toleruje wiele cykli zamrażania i rozmrażania. Wybrana ilość egzonukleazy T5 jest idealna do stosowania przy długich zwisach.
2. Trawienie szkieletowe wektora
   UWAGA: Upewnij się, że trawisz wystarczającą ilość wektora jako dane wejściowe dla żądanej liczby reakcji montażu w kroku 8.3.
   1. Na reakcję dodać następujące elementy: 1,5 μg wektora ekspresyjnego gRNA (pgRNA-pLKO.1), 5 μl buforu, 1,5 μl AgeI (5U/μL) i 38,5 μL H₂O. Inkubować trawienie w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
3. Defosforylacja zlinearyzowanego wektora.
   UWAGA: Ten krok jest zalecany, ale nie jest absolutnie konieczny. Egzonukleaza T5 w mieszance głównej w większości usunie nawisy WiekuI, zanim ligaza DNA Taq będzie miała szansę zadziałać. Dlatego nie oczekuje się nadmiernej religacji wektora.
   1. Dodać 2,5 μl enzymu fosfatazy alkalicznej krewetek (rSAP, 1 U/μL).
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie inaktywować enzym przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
4. Wykonaj oczyszczanie DNA
   UWAGA: Zaleca się wykonanie etapu ekstrakcji żelem agarozowym. Alternatywnie można zastosować oczyszczanie kolumnowe lub kulkowe. Ważne jest, aby sprawdzić, czy trawienie wektora jest zakończone, np. za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Dla porównania, niestrawiony wektor powinien być prowadzony równolegle.
5. Określić ilościowo ilość oczyszczonego, strawionego wektora w próbce.
6. Skonfiguruj zespół z 2-krotnym nadmiarem molowym wkładek do wektora. Na 20 μl reakcji użyj 100 ng wektora (trawienie AgeI z kroku 8.5), 12,2 ng wkładki (z kroku 7.1.), 15 μl mieszanki zbiorczej z kroku 8.1.2. w H₂O.
7. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
8. Oczyść reakcje za pomocą oczyszczania kolumnowego. Zawiesić DNA w 75 μl_H2O(lub odpowiedniej objętości w zależności od skali elektroporacji).
   UWAGA: Wydajność przemiany w dużym stopniu zależy od czystości DNA. Dodatkowe etapy oczyszczania (np. ekstrakcja fenolem/chloroformem) mogą poprawić wydajność.

9. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek TG1 E. coli

1. Upewnij się, że wszystkie butelki i kolby wirówki są wolne od detergentów, spłukując, a następnie napełniając wodą destylowaną przed autoklawowaniem.
   UWAGA: Ten krok pomaga usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą mieć wpływ na wydajność transformacji. Wodę należy wylać bezpośrednio przed użyciem. Alternatywnie wskazane może być użycie jednorazowych butelek do wirowania.
2. Upewnij się, że butelki wirówkowe, probówki i roztwory używane do przygotowania elektrokompetentnych ogniw są schładzane na lodzie przed użyciem. Najlepiej jest przeprowadzić następujące kroki w chłodni, aby zminimalizować wahania temperatury, które mogą mieć wpływ na wydajność transformacji.
3. Przygotuj podłoże 2TY. Do 16 g baktotryptonu baktonowego, 10 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl dodać wodę destylowaną do 1 L, wymieszać i autoklawować. Przechowywać podłoże w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować szalki do testów biologicznych pokrytych agarem 2TY i 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające odpowiedni antybiotyk. Przechowywać talerze w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Wybór antybiotyku zależy od charakteru wektora ekspresji gRNA, dla pgRNA-pLKO.1 należy użyć ampicyliny 100 μg/ml.
5. Zeskrobać z glicerolu komórek TG1, aby zaszczepić 10 ml pożywki 2TY (bez antybiotyków).
6. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez noc (~16 h) z wytrząsaniem przy 225 obr./min.
7. Zaszczepić 1 l pożywki 2TY (bez antybiotyków) 10 ml kultury na noc (rozcieńczenie 1/100) i podzielić ją równo między dwie kolby o pojemności 2 litrów (zawierające przegrody).
8. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 225 obr./min, aż do osiągnięcia OD600 nm 0,55 (mniej więcej po 1,5 - 2 godzinach). Używaj spektrofotometru, aby regularnie sprawdzać OD600 nm.
9. Schładzać kultury na lodzie przez 30 minut.
10. Podziel kulturę równo między cztery butelki wirówkowe o pojemności 500 ml (wstępnie schłodzone na lodzie).
11. Wirować przez 15 minut przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C we wstępnie schłodzonej wirówce.
12. Zdekantować supernatanty i dodać 1 objętość (tj. 250 ml) wstępnie schłodzonego, lodowacego, sterylnego, destylowanego_H2Odo każdej z butelek wirówkowych. Zawiesić osad bakteryjny, obracając lub odwracając butelkę (lub delikatnie pipetując, jeśli to konieczne).
    UWAGA: Łatwiej jest ponownie zawiesić pellet, dodając najpierw niewielką ilość wody. Upewnij się, że pelety są w końcu całkowicie zawieszone.
13. Wirować przez 15 minut przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C.
14. Powtórz pranie dwa razy (kroki 9.12. i 9.13). Usunąć supernatant. Zachowaj ostrożność podczas dekantacji, ponieważ po umyciu granulki bakteryjne stają się coraz bardziej luźne.
15. Zawiesić osad w 50 ml sterylnego, lodowatego 10% glicerolu i przenieść go do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
16. Odwirowywać komórki przez 15 minut w temperaturze ~4 000 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant.
17. Delikatnie zawieś bakterie w 2 ml lodowatego sterylnego 10% glicerolu.
18. Przechowywać na lodzie, jeśli ogniwa mają być natychmiast użyte do elektroporacji.
    UWAGA: Komórki można zamrozić w porcjach 50 μl w probówkach o pojemności 0,5 ml w kąpieli etanolowej z suchym lodem i przechowywać w temperaturze -80 °C, ale nie jest to zalecane.

10. Elektroporacja elektrokompetentnych komórek E. coli TG1

UWAGA: Elektroporacja jest jednym z wąskich gardeł w generowaniu kompleksowych bibliotek. Aby zachować reprezentację biblioteki, zaleca się przeprowadzenie tylu indywidualnych reakcji elektroporacji, ile jest to konieczne/wykonalne, oraz przeprowadzenie kroków kontroli jakości opisanych poniżej (10.6. i 10.8.).

1. Podwielokrotność oczyszczonych reakcji (z kroku 8.8) przelać do sterylnych i wstępnie schłodzonych probówek do PCR i umieścić je na lodzie (1 μl na probówkę). Schłodzić kuwety do elektroporacji o szczelinie 1 mm na lodzie.
2. Dodać 25 μl świeżo przygotowanych komórek TG1 bezpośrednio do jednej porcji DNA i natychmiast przenieść mieszaninę do kuwety elektroporacyjnej. Przesuń lub postukaj w kuwetę, aby upewnić się, że mieszanina komórek/DNA jest rozprowadzona na całej długości komory kuwety (bez uwięzionego powietrza lub pęcherzyków).
3. Umieścić kuwetę w komorze szkiełka i uruchomić odpowiedni program elektroporacji (np. 1 impuls 1,8 kV (EC1)).
   UWAGA: Stała czasowa powinna mieścić się w przedziale od 5,7 do 6,0 ms. W przypadku, gdy elektroporator wygina się w łuk, przesuń kuwetę, upewnij się, że w komorze nie ma pęcherzyków powietrza i spróbuj ponownie.
4. Natychmiast dodaj 975 μl pożywki 2TY o temperaturze pokojowej do kuwety.
5. Za pomocą pipety transferowej przenieś elektroporowane bakterie do probówki o pojemności 50 ml. Powtórz czynności od kroku 10.2. i zbierz wszystkie komórki przekształcone za pomocą jednej biblioteki w jednej probówce o pojemności 50 ml.
6. Udokumentuj całkowitą objętość.
7. Krok kontroli jakości
   1. Aby określić ilościowo kompetencje świeżo wygenerowanych elektrokompetentnych komórek, należy przeprowadzić oddzielną reakcję elektroporacji przy użyciu określonej ilości nieoszlifowanego plazmidowego DNA (np. 10 pg plazmidu kontrolnego pUC19). Przenieś to do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Kompetencja powinna wynosić co najmniej 10¹⁰ jednostek tworzących kolonie (cfu) na μg DNA. Świeżo przygotowane komórki zwykle działają lepiej.
8. Inkubować przekształcone bakterie w temperaturze 37 °C przez 60 minut, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
9. Krok kontroli jakości:
   1. Umieść określoną niewielką ilość bakterii przekształconych za pomocą biblioteki (np. 10 μl 10-100-krotnego rozcieńczenia) na 10 cm płytce agarowej z odpowiednim doborem antybiotyków.
      UWAGA: Znając całkowitą objętość hodowli (z kroku 10.6.), uzyskaną liczbę kolonii można wykorzystać do oszacowania całkowitej liczby kolonii dla całej biblioteki. Idealnie powinno być zachowana 20-30-krotna reprezentacja biblioteki.
10. Pozostałą część bakterii rozprowadzić na szalkach do testów biologicznych pokrytych agarem 2TY zawierających odpowiedni wybór antybiotyków.
    UWAGA: Objętość kultury można zmniejszyć przez odwirowanie przy ~ 4 000 x g przez 10 minut (lub do momentu, gdy utworzy się widoczny osad i supernatant okaże się klarowny). Skraca to czas schnięcia płytek po rozprowadzeniu kultury. Użycie płytek zamiast płynnych kultur minimalizuje nieproporcjonalny wzrost poszczególnych rodzin. ¹³
11. Rozprowadzić odpowiednią objętość kontrolnej reakcji elektroporacji pUC19 na dodatkowym naczyniu agarowym o średnicy 10 cm, odpowiednio dobierając antybiotyki.
12. Inkubować płytki agarowe przez noc (16 godzin) w temperaturze 37 °C.
13. Policz uzyskane kolonie na płytkach kontrolnych (pUC19 i płytka biblioteki kontrolnej), aby oszacować CFU/μg DNA dla bakterii, a także złożoność biblioteki.

11. Ekstrakcja plazmidowego DNA

1. Dodać 10 ml pożywki 2-TY do płytek na noc, zeskrobać warstwę bakteryjną z płytki za pomocą jednorazowego rozsiewacza i zebrać ją do probówki o pojemności 50 ml. Powtórz kilka razy, aż cała płytka będzie czysta.
2. Ekstrahuj DNA za pomocą zestawu Plasmid Maxi (potrzebne 2-3 kolumny na płytkę do testu biologicznego).

Wyniki

Korzystając z dostępnego protokołu, biblioteki gRNA CORALINA zostały wygenerowane z genomowego DNA ludzkiego i mysiego⁹ i DNA BAC (Rysunek 1). Aby wytworzyć fragmenty wejściowego DNA nadające się do klonowania do wektorów ekspresyjnych gRNA, należy określić optymalne warunki kontrolowanego trawienia nukleazy. Typowy wynik optymalizacji trawienia nukleazy mikrokokowej jest przedstawiony w Rysunek 2A. Niewystarczająca ilość nukleazy (0,1, 2, 3, 4, 4,5 lub 5 jednostek) nie daje zauważalnych produktów w wymaganym zakresie wielkości (10-100 pz), a 5,5-7,5 jednostek nadal wytwarza fragmenty, które są średnio zbyt długie. Większe ilości enzymu (50 jednostek) prowadzą do nadmiernej degradacji wejściowego DNA po 10 minutach. W związku z tym wybrano ilość pośrednią (10 sztuk). Skrót został przeskalowany w górę, aby wytworzyć wystarczającą ilość strawionych fragmentów do późniejszego oczyszczenia i klonowania (Rysunek 2B). Chociaż zaleca się ślepe wybieranie fragmentów DNA według wielkości i poleganie tylko na drabinie DNA w celu orientacji, aby zminimalizować narażenie fragmentów DNA na światło UV, żele można następnie barwić w celu kontroli jakości trawienia i cięcia. Rysunek 2B pokazuje reprezentatywny przykład żelu PAGE, z którego wycięto fragmenty DNA o grubości od 20 do 30 pz. Oczyszczone w żelu fragmenty MNazy załadowano do 20% żelu PAGE, aby sprawdzić pomyślny wybór rozmiaru i oczyszczenie fragmentów trawionych przez MNazę (Rysunek 2C). Dostępny protokół jest kompatybilny z użyciem niestandardowych sekwencji łącznikowych, co pozwala na klonowanie fragmentów trawionych przez MNazę do wybranych wektorów ekspresyjnych gRNA. W tym przypadku gRNA-PLKO⁹ został użyty jako szkielet. Łączniki są amplifikowane z wektora ekspresji gRNA za pomocą standardowego PCR. Rysunek 2D przedstawia reprezentatywny przykład wzmocnionych sekwencji linkerów pozbawionych dodatkowych, nieprawidłowych lub żadnych amplikonów szablonowych. Następnie amplikony łącznikowe są trawione enzymami restrykcyjnymi, aby zapewnić, że łączniki są ligowane na fragmentach trawionych przez MNazę we właściwej orientacji. Rysunek 2D pokazuje żele agarozowe 5' i 3' przed i po trawieniu odpowiednio z HindIII i SacII, co wskazuje na całkowite trawienie łączników do przewidywanych 637 i 295 pz. Prawa część obrazu żelu dokumentuje wycięcie strawionych fragmentów łącznika. Po ekstrakcji żelowej strawionych łączników, kolejnym krokiem w protokole jest ligacja łączników do naprawionych na końcu fragmentów trawionych przez MNazę. Ponieważ sekwencje łącznikowe są generowane przez PCR przy użyciu niefosforylowanych starterów, samoligatacja łączników nie powinna zachodzić. Tylko naprawione końcowo fragmenty DNA trawione przez MNazę dostarczają grup fosforanowych niezbędnych do ligacji. Po translacji nacięcia produkt ligacji jest amplifikowany metodą PCR. Aby uniknąć nadmiernego błędu amplifikacji PCR, który mógłby zniekształcić reprezentację sekwencji gRNA w bibliotece, amplifikacja jest ograniczona do mniej niż 20 cykli w sumie. Po PCR produkty amplifikacji są trudne do uwidocznienia na żelach agarozowych. W związku z tym wykonuje się oddzielne kontrolne PCR z 32 cyklami w celu wykrycia produktów (ale nie są one wykorzystywane do przygotowania biblioteki). Wyniki tego kontrolnego PCR są pokazane w Rysunek 2E. Pozwala to zoptymalizować reakcje ligacji i zapewnić, że reakcje są pozbawione artefaktów PCR, które czasami występują w kontrolach "bez fragmentów" (NFC). Rysunek 2E pokazuje pożądany amplikon (łącznik 5' + fragment DNA + łącznik 3', długość: 869 pz) po amplifikacji reakcji ligacji przy użyciu równomolowych (1:1) proporcji między fragmentami a sekwencjami łącznikowymi.

Rysunek 1: Sugerowany harmonogram przygotowania biblioteki gRNA. CORALINA oferuje prostą i opłacalną strategię generowania kompleksowych bibliotek gRNA z wielu różnych źródeł DNA pochodzących z dowolnego organizmu. Dostępny protokół może zostać zrealizowany w ciągu jednego tygodnia roboczego. Generowanie łączników może odbywać się równolegle z naprawą końca DNA. Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych trwa dwa dni i obejmuje etap wzrostu przez noc, dlatego należy je rozpocząć przed rozpoczęciem reakcji montażu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kluczowe kroki podczas protokołu. (A) Kontrolowane trawienie DNA BAC umożliwia generowanie fragmentów o różnych rozmiarach. Pokazano tutaj optymalizację trawienia MNazy. Oczyszczone DNA BAC traktowano różnymi ilościami MNazy przez 10 minut. 10 U MNazy generowało fragmenty DNA o pożądanej długości (20-30 pz). (B) Dobór wielkości fragmentów między 20 a 30 pz przy użyciu wyciskania z żeli poliakrylamidowych. Oczyszczone DNA BAC traktowano 10 j. MNazy przez 10 minut. Obraz został zarejestrowany po wycięciu. (C) Kontrola jakości fragmentów oczyszczonych żelem. Po oczyszczeniu żelu 1/6 oczyszczonych fragmentów MNazy załadowano na 20% żel PAGE w celu sprawdzenia pomyślnego wyboru rozmiaru i oczyszczenia. (D) Amplifikacja sekwencji łączników w celu składania i trawienia enzymów restrykcyjnych łączników w celu zapewnienia klonowania kierunkowego. Łączniki 5' i 3' zostały wzmocnione i przecięte odpowiednio za pomocą HindIII i SacII. Do kontroli artefaktów PCR i zanieczyszczenia DNA włączono kontrole bez matrycy (NTC). Po lewej: aplikacja próbki analitycznej; Po prawej: Aplikacja próbki preparatywnej. Obraz został zarejestrowany po wycięciu żelu. (E) Pomyślna ligacja łączników z fragmentami DNA może być analizowana za pomocą PCR ze zwiększoną liczbą cykli PCR (32) i kontrolowana przez wykonywanie kontroli bez matrycy z_H2O(NTC) lub przy użyciu NTC z poprzedniego etapu translacji nick jako dane wejściowe (NTC NT)). Ważne jest, aby uwzględnić kontrolę bez fragmentów (NFC), która jest amplifikacją z reakcji ligacji i translacji nacięcia, w której fragmenty MNazy zostały pominięte. Tylko próbki, w których fragmenty MNazy zostały połączone z DNA łącznikowym, dają oczekiwany amplikon (869 pz). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Teleskop CORALINA może być wykorzystany do generowania bibliotek gRNA na dużą skalę poprzez kontrolowane trawienie docelowego DNA przez nukleazy i masowe klonowanie powstałych dwuniciowych fragmentów. Wnioskowanie statystyczne wskazuje, że znacznie więcej niż 10⁷ pojedynczych sekwencji gRNA zostało już pomyślnie sklonowanych przy użyciu dostępnego protokołu⁹. CORALINA może być dostosowana na wiele sposobów. Wybór matrycowego DNA określa region docelowy i maksymalną złożoność generowanej biblioteki. Korzystając z tego protokołu, biblioteki CORALINA zostały wcześniej wygenerowane z ludzkiego i mysiego genomowego DNA⁹. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki przedstawiają generowanie biblioteki CORALINA z oczyszczonego DNA BAC. Dalszą personalizację można osiągnąć poprzez wybór wektora ekspresji gRNA i sekwencji łącznikowych. Wcześniej testowaliśmy trzy różne pary długości łączników do montażu Gibsona z niewielkimi różnicami w wydajności⁹.

Ze względu na pochodzenie z DNA trawionego masowo, protospacery gRNA CORALINA zwykle nie mają dokładnie 20 pz długości, ale wykazują rozkład długości ze średnią, która zależy zarówno od parametrów trawienia MNazy, jak i od wielkości wycięcia wykonanego z żeli PAGE. Reprezentatywny przykład pokazany na rysunkach 2B i C przedstawia fragmenty o medianie długości między 19 a 27 pz. Z naszego doświadczenia wynika, że długość fragmentów jest wiernie zachowywana przez generowany protospacer^{gRNA 9}. Podczas gdy fragmenty krótsze niż 20 pz powinny być unikane ze względu na wyższy wskaźnik powstających gRNA poza celem, dłuższe fragmenty są prawdopodobnie znacznie mniejszym problemem dla dalszych zastosowań, ponieważ wykazano, że gRNA z protospacerami o długości do 45 pz są nadal funkcjonalne⁹.

Dwa najbardziej krytyczne etapy w protokole CORALINA to wybór wielkości fragmentów trawionych przez MNazę i etapy klonowania. Generowanie zbyt krótkich fragmentów (np. średnia poniżej 18 pz) lub włączenie zbyt wielu pustych wektorów ekspresji gRNA sprawi, że biblioteka stanie się bezużyteczna. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować etap trawienia MNazy (Figura 2A), monitorować wycinanie (Figura 2B, C), sprawdzić całkowite trawienie szkieletu wektora gRNA i nie uwzględniać kontroli fragmentów w całym protokole. Należy również zwrócić szczególną uwagę na zachowanie reprezentacji biblioteki gRNA. Jednym z powszechnych wąskich gardeł w generowaniu bibliotek w ogóle jest wydajny transfer plazmidów do bakterii w celu amplifikacji. W związku z tym do uzyskania dużej liczby klonów gRNA niezbędne są duże ilości bakterii o doskonałych kompetencjach i duża liczba indywidualnych zdarzeń elektroporacji.

Nowe strategie produkcji bibliotek gRNA będą konieczne, aby w ciągu najbliższych dziesięcioleci w pełni wykorzystać potencjał podejść do badań przesiewowych opartych na CRISPR. Istnieje znaczne zapotrzebowanie na opłacalne, proste i konfigurowalne metody generowania bibliotek na dużą skalę, co jest warunkiem wstępnym, aby badania przesiewowe były dostępne dla większej liczby systemów modelowych i różnych podejść inżynieryjnych opartych na CRISPR. CORALINA stanowi pierwszy krok w tym kierunku. Potencjalne zastosowania są wielorakie, zwłaszcza do tworzenia obszernych bibliotek genomów, bibliotek pochodnych cDNA mniej popularnych systemów modelowych, wysoce ukierunkowanych bibliotek i zestawów eksperymentalnych, w których różne białka CRISPR (o różnych wymaganiach PAM) są używane w połączeniu.

W przeciwieństwie do innych metod, CORALINA generuje wszystkie możliwe gRNA z wejściowego DNA. Jednak jedną z wad tej metody jest to, że gRNA pozbawione wymaganej sekwencji PAM są również zawarte w bibliotece, co jest cechą wspólną z drugą enzymatyczną metodą generowania biblioteki gRNA, CRISPR-EATING (Tabela 1). Wybór idealnej metody generowania biblioteki gRNA zależy od specyfikacji planowanego eksperymentu przesiewowego, a zwłaszcza od charakteru (geniczny, regulatorowy, międzygenowy) i wielkości regionu docelowego (pojedynczy locus, wiele regionów, cały genom). Dostrzegamy szczególne korzyści z zastosowania CORALINA, gdy ma być analizowana duża liczba regionów niekodujących lub regulatorowych, jeśli istnieją niekompletne lub niewiarygodne informacje o sekwencji (egzotyczne systemy modelowe, mieszaniny gatunków (np. mikrobiomy) lub eksperymentalnie uzyskane dane wejściowe), jeśli łączą się różne endonukleazy CRISPR lub jeśli przeprowadza się analizę nasycenia na krótkim i zdefiniowanym locus (np . reprezentowanym przez BAC).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
500 mM EGTA	Sigma Aldrich	03777-10G	1.4., Inaktywacja
bufora próbki TBE Mnase Novex o wysokiej gęstości	Thermo Fisher Scientific	LC6678	2.1.
Novex® Żele TBE, 20%, 10-dołkowe	Thermo Fisher Scientific	EC6315BOX	2.1., gotowe 20% żel PAGE
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder,	Thermo Fisher Scientific	SM1303	2.1.
Novex® TBE Bufor do biegania	Thermo Fisher Scientific	LC6675	2.1., PAGE żelowy bufor do biegania
Jednorazowy skalpel, sterylny	VWR	233-5363	2.3. Można stosować inne równoważne odczynniki
Barwienie kwasem nukleinowym SYBR Green I (1000x koncentrat w DMSO)	Sigma Aldrich	S9430	2.3. +2.5., dostępne również w Thermo Fisher Scientific (S7563)
UltraPure Phenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1)	Thermo Fisher Scientific	15593-031	3.6.1. + 4.3., można stosować inne równoważne odczynniki
Glikogen	Sigma	10901393001	3.6.4., można stosować inne równoważne odczynniki
Octan sodu 3M, pH5,2	Thermo Fisher Scientific	R1181	3.6.4., można stosować inne równoważne odczynniki
Etanol			3.6.4. + 9.1.8., klasa biologii molekularnej
Zestaw do szybkiego tępienia	New England Biolabs	E1201	4.1.
octan amomu	Sigma	A1542	3.1., można stosować inne równoważne odczynniki
octan magnezu	Sigma	M5661	3.1., można stosować inne równoważne odczynniki
0,5 M EDTA (pH 8,0)	VWR&	nbsp; MOLEM37465520 (lub Promega V4231)	2.2. + 3.1., można stosować inne równoważne odczynniki
Agencourt AMPure XP	redlica Beckman Coulter	A63881	5.3. + 6.5.
Zestaw do ekstrakcji żelu	QIAGEN	28704	5.7.+ 7.1. +8.4., można stosować inne równoważne odczynniki
skoncentrowane ligazy DNA T4	New England Biolabs	M0202T	6.1.+ 8.1.2.
Długi wzmacniacz Taq 2X Master Mix	New England Biolabs	M0287S	6.3.
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF	New England Biolabs	M0531S	5.1. + 6.6., można stosować inne równoważne odczynniki
HindIII	New England Biolabs	R0104S	5.4.1.
SacII	New England Biolabs	R0157S	5.4.2.
AgeI	Nowa Anglia Biolabs	R0552S	8.2.1.
Podstawa Tris	Sigma	93362	8.1.1.
2M MgCl	Sigma	93362	8.1.1.
dGTP,dATP, dCTP, dTTP	New England Biolabs	N0446S	8.1.1.
Naziemna Telewizja	Cyfrowa S.A	DTT-RO	8.1.1.
PEG-8000	Sigma	P5413	8.1.1.
NAD	Sigma	N6522	8.1.1.
Egzonukleaza T5	New England Biolabs	M0363S	8.1.2.
Polimeraza DNA Phusion	New England Biolabs	M0530S	8.1.2.
Ligaza DNA Taq	New England Biolabs	M0208L	8.1.2.
rSAP	New England Biolabs	M0371S	8.3.1.
Kompetentne komórki TG1	Lucigen	60502-1	9.1.
Kuwety elektroporacyjne o szczelinie 1 mm	VWR	732-2267	10.2.
Naczynie do testów biologicznych (polistyren, 245 mm x 245 mm x 25 mm)	Fisher Scientific	DIS-988-010M	9.4.NaCl
	Sigma	S7653
	BD	211705	9.3.
Ekstrakt drożdżowy	BD	212750	9.3.
Agar	Sigma	A1296	9.4.
Glicerol	Sigma	G5516	9.17.
MNAse	New England Biolabs	M0247S	1.1.
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	w
całym Micropulserze	Biorad	165-2100	10.2.
Kuwety do elektroporacji	Biorad	732-2267	10.2.250
ml probówki wirówkowe	Corning	430776	9.1-9.9.