Artykuł metodologiczny

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56265

⸱

5 września 2017

 ,  , 
1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Streszczenie

Istnieją wysoce skoordynowane szlaki naprawy DNA, które wykrywają, wycinają i zastępują uszkodzone zasady DNA, a także koordynują naprawę pęknięć nici DNA. Podczas gdy techniki biologii molekularnej wyjaśniły strukturę, funkcje enzymatyczne i kinetykę białek naprawczych, nadal istnieje potrzeba zrozumienia, w jaki sposób naprawa jest koordynowana w jądrze. Mikronapromienianie laserowe stanowi potężne narzędzie do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania rekrutacji białek naprawczych. Indukcja uszkodzeń DNA przez mikropromieniowanie laserowe może zachodzić przy różnych długościach fal, a użytkownicy mogą niezawodnie indukować pęknięcia pojedynczej nici, uszkodzenia zasad i pęknięcia podwójnej nici za pomocą różnych dawek. W tym przypadku mikropromieniowanie laserowe jest wykorzystywane do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych indukowanych przez dwie popularne konfokalne długości fal laserowych, 355 nm i 405 nm. Ponadto opisano właściwą charakterystykę zastosowanej dawki lasera do indukowania określonych mieszanin uszkodzeń, dzięki czemu użytkownicy mogą w sposób powtarzalny wykonywać akwizycję i analizę danych dotyczących mikronapromieniowania laserowego.

Wprowadzenie

Mikroskopia fluorescencyjna stała się potężną techniką do wizualizacji architektury komórkowej, badania lokalizacji białek i monitorowania interakcji białko-białko i białko-DNA. Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania reakcji na uszkodzenia DNA po zastosowaniu globalnych czynników uszkadzających DNA, takich jak światło ultrafioletowe (UV), promieniowanie jonizujące, chemiczne środki utleniające lub alkilujące i/lub chemioterapeutyki, dostarczyło nowych informacji na temat inicjacji, sygnalizacji i rekrutacji białek naprawczych DNA do miejsc uszkodzenia DNA1,2. Jednak te globalne i asynchroniczne szkodliwe zdarzenia ograniczają, jeśli poszukuje się szczegółowych informacji na temat kolejności rekrutacji, kinetyki asocjacji lub dysocjacji oraz relacji między kluczowymi białkami naprawy DNA. Na szczęście postępy w laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych, szersza dostępność fal laserowych wywołujących uszkodzenia oraz ulepszenia białek fluorescencyjnych w ciągu ostatnich 25 lat dostarczyły naukowcom ulepszonych narzędzi do badania tych aspektów naprawy DNA poprzez ukierunkowaną indukcję uszkodzeń DNA.

Naświetlanie komórek mikropromieniami laserowymi w celu badania funkcji komórkowych i subkomórkowych jest dobrze znanym narzędziem w biologii komórkowej i radiacyjnej3. Zastosowanie tej techniki do badania naprawy DNA pojawiło się, gdy Cremer i współpracownicy użyli wysoce skoncentrowanego systemu mikrowiązek laserowych UV (257 nm) do wywołania uszkodzenia DNA w plamce 0,5 μm w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO)4 i ustalili indukcję fotouszkodzeń DNA przez ten system5. Chociaż w tamtym czasie oferował on znaczne ulepszenia w stosunku do metod mikrowiązki UV, przyjęcie tego szkodliwego systemu było ograniczone ze względu na jego wyspecjalizowaną konfigurację i niezdolność do generowania podwójnych pęknięć nici (DSB)6. Późniejsze badania różnych długości fal UV-B (290 - 320 nm) i UV-A (320 - 400 nm) przez wiele grup wykazały, że fotoprodukty UV, zmiany w zasadach oksydacyjnych, pęknięcia pojedynczej nici (SSB) i DSB mogą być indukowane w zależności od długości fali i mocy zastosowanej lasera4,7,8,9,10 (recenzja w 3). Co więcej, stwierdzono również, że kombinacje tych długości fal UV-B i UV-A ze środkami uczulającymi, takimi jak psoralen, bromodeoksyurydyna (BrdU) i barwniki Hoechsta, indukują uszkodzenia DNA w zależności od długości fali, mocy i czasu trwania ekspozycji, chociaż moc potrzebna do wywołania uszkodzenia jest często obniżona w obecności tych czynników11,12,13,14,15. Postępy te rozszerzyły zastosowanie mikronapromieniowania, chociaż nadal istniały przeszkody techniczne, które należało rozwiązać, aby można było je pokonać w celu szerszego zastosowania tych metod.

Cremer i współpracownicy znacznie rozwinęli dziedzinę mikro-napromieniowania poprzez precyzyjne skupienie mikrowiązki UV w celu zastosowania znacznej szkodliwej energii na wysoce zlokalizowanym obszarze komórki. Wraz z rozwojem mikroskopów konfokalnych i systemów mikrodysekcji laserowej, ściśle skupione światło stało się szerzej dostępne; jednak sprzężenie źródeł UV z oscyloskopami i radzenie sobie z wywoływanymi przez nie aberracjami chromatycznymi nadal stanowiło poważne wyzwanie dla większości użytkowników3,6,16. Wraz ze wzrostem popularności barwników UV w latach dziewięćdziesiątych, optyka zdolna do ustawiania ostrości i rejestrowania fluorescencji wzbudzonej promieniowaniem UV stała się szerzej dostępna16, a ulepszenia w skanowaniu laserowym dały użytkownikom możliwość tworzenia wysoce skoncentrowanych punktów wzbudzenia UV w komórkach6,17. Jednak dopiero na początku 2000 roku prawdziwy wpływ tej kombinacji ściśle skoncentrowanych wiązek z laserami o większej intensywności był odczuwalny, kiedy pojawiły się liczne raporty pokazujące, że pęknięcia nici DNA mogą być indukowane z i bez uczulaczy w zakresie UV-A6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24,25,26, a nawet na dłuższych falach widzialnych, takich jak 488 nm27. Postępy te pozwoliły na szersze zastosowanie techniki mikronapromieniania w wielu systemach komercyjnych. Równolegle z tymi osiągnięciami pojawiły się również techniki dwufotonowe, które umożliwiły precyzyjną indukcję uszkodzeń DNA; Chociaż te postępy nie będą tutaj omawiane, istnieje wiele artykułów przeglądowych omawiających te metodologie9,28,29,30.

Dzięki obecnej dostępności mikroskopów konfokalnych zdolnych do dostarczania wysoce skupionego światła UV i powszechnej dostępności białek fluorescencyjnych, które umożliwiają śledzenie w czasie rzeczywistym białek naprawczych DNA, techniki mikronapromieniania przekształciły się w potężne narzędzia do badania odpowiedzi na uszkodzenia DNA i ścieżek naprawy. Jednak użytkownicy muszą mieć świadomość, że generowanie uszkodzeń DNA jest w dużym stopniu zależne od długości fali lasera i mocy przyłożonej do regionu subjądrowego. Zastosowanie długości fal UV-C (~260 nm) umożliwia bezpośrednie wzbudzenie DNA i wysoką selektywność do indukcji fotoproduktów UV7,8. Długości fal UV-B i UV-A wytwarzają mieszaniny uszkodzeń DNA (uszkodzenia zasadowe, SSB i DSB), w zależności od przyłożonej mocy i użytego tła komórkowego7. Endogenne fotouczulacze i poziomy przeciwutleniaczy w docelowych komórkach mogą wpływać na mieszaniny uszkodzeń DNA wytwarzane przez te długości fal. Dodatkowo stosowanie egzogennych fotouczulaczy (BrdU itp.) może pomóc w obniżeniu energii potrzebnej do indukcji uszkodzenia DNA. Jednak środki te mogą same w sobie indukować uszkodzenie DNA i mogą zmieniać cykl komórkowy i strukturę chromatyny, więc ich stosowanie może powodować niepożądane skutki, które muszą być brane pod uwagę przez użytkownika. Dlatego przed zastosowaniem mikronapromieniania do badania odpowiedzi i naprawy uszkodzeń DNA, konieczne jest dokładne rozważenie interesującego szlaku naprawy DNA, długości fal dostępnych do użycia oraz utworzonej mieszaniny uszkodzeń DNA.

Tutaj mikropromieniowanie laserowe jest wykonywane na dwóch powszechnie używanych długościach fal, 355 nm i 405 nm, bez uczulaczy, aby zademonstrować mieszaniny uszkodzeń DNA wywołanych przez te długości fal i wpływ, jaki te mieszaniny uszkodzeń mają na badanie naprawy SSB i DSB. Użytkownicy powinni być świadomi, że te długości fal nie tworzą pojedynczego rodzaju pęknięć nici lub uszkodzeń podstawowych. Aby rozróżnić szlaki naprawy DNA, użytkownicy muszą dokładnie kontrolować zastosowaną moc w określonym regionie jądra i scharakteryzować indukowane uszkodzenia za pomocą markerów pęknięcia wielu nici i przeciwciał przeciwko zmianom w DNA. Odpowiednio zastosowane i scharakteryzowane mikropromieniowanie laserowe może wzbogacić niektóre rodzaje uszkodzeń DNA, umożliwiając użytkownikom ocenę naprawy uszkodzeń podstawy i SSB lub DSB, z pewną specyficznością. W związku z tym udostępniliśmy metodę pozwalającą użytkownikom na powtarzalne wykonanie mikronaświetlania laserowego, scharakteryzowanie mieszanin uszkodzeń DNA wywołanych zastosowaną dawką lasera oraz przeprowadzenie analizy danych.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i wytwarzanie stabilnych komórek

  1. Hoduj komórki CHO-K1 w minimalnej niezbędnej pożywce uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Transfekcja komórek CHO-K1 z 1 μg plazmidowego DNA zawierającego ludzki XRCC1 ze znacznikiem C-końcowego białka zielonej fluorescencji (GFP) przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Wybierz komórki CHO-K1 stabilnie eksprymujące ludzką fuzję XRCC1-GFP przy użyciu genetycyny 800 μg / ml i wzbogac populację eksprymującą XRCC1-GFP za pomocą sortowania komórek wspomaganego fluorescencją (FACS).
  4. Komórki płytki należy poddać mikronapromienianiu w naczyniach hodowlanych z dnem ze szkła nakrywkowego, tak aby następnego dnia osiągnęły około 75% lub więcej konfluencji. Pewne odstępy między komórkami są pożądane, szczególnie w przypadku korzystania z rejestracji w celu powrotu do tego samego pola obrazu (opisanego w sekcji 3.2).

2. Ustawienie mikroskopu

  1. Wybierz laserowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w odpowiednie lasery i optykę oraz oprogramowanie sterujące do mikronapromieniania/fotostymulacji. W prezentowanych eksperymentach wykorzystano laserowy skaningowy mikroskop konfokalny, który został zmodyfikowany tak, aby zawierał laser o długości fali 355 nm, sprzężony światłowodu z galwanometrycznym miniskanerem fotoaktywacyjnym i sterowany za pomocą oprogramowania kontrolno-analitycznego producenta. System ten może wykonywać mikronaświetlanie w wyznaczonym przez użytkownika obszarze zainteresowania (ROI) za pomocą miniskanera fotoaktywacyjnego (laser 355 nm) lub standardowego galwanometru konfokalnego (laser 405 nm).
  2. Wybierz długość fali, która ma być użyta do mikronapromieniowania, upewniając się, że wszystkie elementy optyczne w ścieżce światła mikronapromieniowania są odpowiednie dla wybranej długości fali.
    UWAGA: Prezentowany system wykorzystuje 40× C-Apochromat (apertura numeryczna (NA) 1.2) obiektyw immersyjny z olejkiem wraz z kostką filtra UV do mikronaświetlania 355 nm oraz suchy obiektyw 20× C-Apochromat (NA 0,75) wykorzystujący standardową konfokalną ścieżkę światła do mikronaświetlania 405 nm. Obiektyw 20× zastosowany w konfiguracji nie jest kompatybilny z długością fali 355 nm; Dlatego użyliśmy 40× tylko dla 355 nm. Użycie suchego obiektywu do uszkadzania pozwala na zastosowanie protokołów immunofluorescencyjnych bez usuwania olejku immersyjnego, dlatego wykorzystujemy ten obiektyw, gdy tylko jest to możliwe.
  3. Skonfiguruj mikroskop do eksperymentu z mikronapromieniowaniem. Aby zachować spójność między eksperymentami, należy wyznaczyć znormalizowaną konfigurację elementów mikroskopu, które mają być używane dla każdego rodzaju mikronapromieniowania. Jeśli to możliwe, zapisz te ustawienia jako ustawienia wstępne w oprogramowaniu operacyjnym mikroskopu.
    UWAGA: W prezentowanym systemie komórki są mikronaświetlane i obrazowane za pomocą skanowania jednokierunkowego, rozdzielczość skanowania 1024x1024 pikseli z 1-krotnym zoomem skanowania, przy liczbie klatek na sekundę 8 klatek na sekundę (fps), a otworek jest ustawiony na około 4 jednostki Airy'ego (AU), jak określono dla lasera 488 nm (69 μm). To ustawienie otworkowe zostało wybrane, aby zmaksymalizować ilość światła uchwyconego na każdym obrazie, umożliwiając użycie niższych mocy lasera obrazowania i ograniczenie fotowybielania.

3. Mikronaświetlanie laserowe

  1. Umieść przygotowane naczynie hodowlane, zawierające interesujące nas komórki, na stoliku mikroskopu i bezpiecznie zablokuj na miejscu.
    1. Jeśli to możliwe, umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze ze stopniem i utrzymywać w temperaturze 37 °C z 5% CO2 podczas indukcji uszkodzenia. Ten krok jest najważniejszy w przypadku obrazowania poklatkowego z żywymi komórkami lub długich sesji obrazowania. W przeciwnym razie umieścić komórki na stoliku mikroskopu i przeprowadzić naświetlanie w temperaturze pokojowej (~ 25 °C), a następnie szybko zwrócić komórki do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Zarejestruj pola obrazu, aby umożliwić badaczowi powrót do tego samego miejsca po wykonaniu utrwalenia, barwienia lub innych procedur. Przeprowadzić rejestrację uszkodzonych pól za pomocą zakodowanego, zautomatyzowanego stolika mikroskopowego lub szklanych naczyń do hodowli komórkowych z wytrawioną lub opisaną siatką lokalizacji XY.
    1. W przypadku korzystania z programowej rejestracji obrazu, należy wybrać rozpoznawalną cechę naczynia hodowlanego (np. róg szkła nakrywkowego lub przegrodę między studzienkami), zebrać obraz i zapisać lokalizację XY. Pozwoli to na wyrównanie i rejestrację lokalizacji XY wybranych pól po przygotowaniu próbki.
    2. Jeśli korzystasz z rejestracji ręcznej, zapisz ręcznie siatkę lub wytrawione lokalizacje dla każdego pola, uważając, aby zapisać orientację i położenie potrawy na scenie.
    3. Jeśli nie są dostępne żadne cechy identyfikujące naczynia do hodowli komórkowych, należy zidentyfikować uszkodzone pola poprzez wzrokową kontrolę morfologii i gęstości komórek. Zwróć uwagę, aby wybrać pola o wystarczająco wyraźnych cechach, aby były rozpoznawalne podczas późniejszego obrazowania.
      UWAGA: Może to być czasochłonne, chyba że orientacja i obszar naczynia hodowlanego są ściśle ograniczone.
  3. Wybierz pole do mikronapromieniowania i skoncentruj próbkę. W przypadku komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie należy wybrać płaszczyznę ogniskową z maksymalnym przekrojem jądrowym w interesującym nas kanale fluorescencyjnym. W przypadku komórek, w których nie występuje ekspresja znakowanych białek lub w przypadku komórek bez wyraźnej lokalizacji jądrowej, można zastosować obrazowanie kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) w celu znalezienia właściwej płaszczyzny ogniskowej.
    UWAGA: Przydatną cechą obrazowania z kontrastem fazowym i DIC jest fakt, że gdy płaszczyzna ogniskowej przesuwa się przez próbkę, ta sama cecha może wydawać się jasna lub ciemna w zależności od względnej płaszczyzny ogniskowej.
    1. Wybierz wyraźną cechę w jądrze, taką jak jąderko, i przesuwaj płaszczyznę ogniskową w górę i w dół, obserwując tę zmianę wyglądu. Prawdziwa płaszczyzna ogniskowa będzie leżeć w przejściu od światła do ciemności. Aby ustawić ostrość próbki, wybierz płaszczyznę ogniskowej, w której wybrany element ma najostrzejszy kontrast.
  4. Zarejestruj pozycję pola zainteresowania. Utwórz kwadratowy zwrot z inwestycji o wymiarach 3x3 piksele w oprogramowaniu mikroskopu, umieść ten zwrot z inwestycji nad jądrem komórki, która ma zostać uszkodzona, i ustaw ten zwrot z inwestycji jako zwrot z inwestycji w uszkodzenie.
  5. Zbierz obraz przed uszkodzeniem, w tym położenie zwrotu z inwestycji w uszkodzenia.
    1. W przypadku eksperymentów, w których nie wykorzystuje się białek fluorescencyjnych, należy uzyskać obraz jasnego pola z kontrastem fazowym lub kontrastem interferencji różnicowej (DIC), aby zidentyfikować i zarejestrować jądra pod kątem uszkodzenia.
    2. W przypadku eksperymentów z żywymi komórkami przy użyciu białek fluorescencyjnych należy uzyskać obraz zawierający jasne pole i kanał fluorescencyjny dla białka będącego przedmiotem zainteresowania (tj. linia laserowa 488 nm do wzbudzenia GFP, linia laserowa 561 nm do wzbudzenia RFP). W eksperymentach z użyciem CHO-K1 XRCC1-GFP fluorescencja wzbudzona przez linię lasera o długości fali 488 nm była jednocześnie zbierana z transmitowanym kanałem jasnego pola DIC.
  6. Zainicjuj uszkodzenie lasera.
    1. W prezentowanym systemie kontroluj dawkę lasera przez całkowity czas spędzony na skanowaniu zwrotu z inwestycji w uszkodzenia. Ponieważ galwanometr do lasera 355 nm działa ze stałą szybkością skanowania, dawka lasera jest kontrolowana przez czas spędzony na wielokrotnym skanowaniu wybranego zwrotu z inwestycji w uszkodzenie: w przedstawionych tutaj danych mikronaświetlanie przy 355 nm jest wykonywane przez 2 i 10 sekund.
    2. Natomiast kontroluj dawkę lasera 405 nm, modulując szybkość skanowania i wykonaj jeden skan wybranego zwrotu z inwestycji w uszkodzenia. W przedstawionych tutaj danych przyjęto 8 i 0,5 kl./s dla mikronaświetlania przy długości fali 405 nm. Szybkość skanowania wynosząca 8 kl./s zapewnia niższą dawkę lasera niż 0,5 kl./s, ponieważ laser spędza mniej czasu na każdym pikselu podczas skanowania. Oba lasery pracują ze 100% mocą. Patrz rozdział 3.7, aby uzyskać instrukcje dotyczące bezpośredniego pomiaru mocy lasera.
      UWAGA: Każdy pojedynczy system mikroskopowy może różnić się sposobem dostarczania mocy lasera do wyznaczonego zwrotu z inwestycji, podobnie jak różnią się 355 nm i 405 nm w prezentowanym systemie. Użytkownicy będą musieli określić tę procedurę dla swojego systemu mikroskopowego i zgłosić te parametry w sekcjach dotyczących metod.
    3. W przypadku obrazowania na żywo komórek należy wykonać akwizycję obrazu poklatkowego kanałów jasnego pola i fluorescencji. Dostosuj czas trwania i częstotliwość timelapse, aby zoptymalizować gromadzenie danych, idealnie rejestrując akumulację białka fluorescencyjnego przy zwrocie z inwestycji w uszkodzenie i jego dysocjację w czasie trwania eksperymentu. Eksperymenty z wykorzystaniem XRCC1-GFP zbierały obrazy co 30 sekund przez 20 minut.
      UWAGA: Częstotliwość obrazowania poklatkowego może być ograniczona przez fotowybielanie fluoroforu, co komplikuje analizę akumulacji i dysocjacji. Fotowybielanie można ocenić, obserwując nieuszkodzone komórki podczas timelapse i dostosowując warunki akwizycji, aby zminimalizować utratę sygnału fluorescencyjnego w tych nieuszkodzonych komórkach. Niektóre fotowybielacze mogą być nieuniknione, więc użytkownicy mogą zrekompensować utratę sygnału, normalizując intensywność fluorescencji uszkodzonych komórek do intensywności nieuszkodzonych komórek w każdej klatce timelapse.
      1. Po zakończeniu przebiegu czasu wybierz nowe pole komórek do uszkodzenia lub napraw uszkodzone komórki do dalszej analizy, jak opisano w sekcji 4.
      2. Kontynuuj mikronapromienianie i obrazowanie poklatkowe, aż do osiągnięcia pożądanej liczby uszkodzonych komórek.
        UWAGA: Zalecamy uszkodzenie łącznie 10-25 komórek na wybrany stan, aby ocenić niejednorodność między komórkami w odpowiedzi na wywołane uszkodzenie. Chociaż większość systemów konfokalnych pozwala użytkownikom na uszkodzenie więcej niż jednej komórki podczas każdego mikronapromieniowania, wprowadza to rozłożone w czasie czasy inicjacji uszkodzenia, co może skomplikować analizę szczytowego czasu rekrutacji w dużej liczbie komórek lub czasu dysocjacji w przypadku szybkich zdarzeń. W niektórych systemach jednoczesna indukcja uszkodzeń przez kilka ROI może zmniejszyć dawkę lasera otrzymywaną przez każdy niezależny ROI. Dlatego, o ile te problemy z taktowaniem/zasilaniem nie zostaną bezpośrednio rozwiązane przez użytkownika, zaleca się indywidualne uszkodzenie ogniw.
    4. W przypadku analizy metodą immunofluorescencji (IF) należy wykonać uszkodzenie i albo natychmiast naprawić komórki, jak opisano w sekcji 4, albo pozwolić komórkom na naprawę w wybranych odstępach czasu (tj. 1, 5, 10 lub 20 minut). Po upływie żądanego czasu napraw i wybarwij komórki, jak opisano w sekcji 4.
      1. Aby zwiększyć ogólną liczbę komórek do analizy IF, należy uszkodzić dodatkowe pola w naczyniu hodowlanym, aby wygenerować wielopolowy przebieg czasowy odpowiedzi po uszkodzeniu. Zapisz położenie XY każdego pola i czas wystąpienia uszkodzenia. Po upływie żądanego całkowitego czasu naprawy napraw i zabarwij ogniwa zgodnie z opisem poniżej.
  7. Po zaobserwowaniu rekrutacji białek w wybranych dawkach, zmierz i podaj poziomy mocy lasera po światłowodzie i po celu, aby dokładnie scharakteryzować i zgłosić dawki lasera. Używamy kompaktowego cyfrowego miernika mocy i dwóch różnych głowic czujników fotodiodowych; Jeden sprzężony bezpośrednio ze światłowodem w celu pomiaru mocy wyjściowej po włóknie, a drugi umieszczony na stoliku mikroskopu w celu pomiaru mocy wyjściowej po obiektywie.
    1. Aby zmierzyć moc lasera, należy umieścić czujnik w żądanej konfiguracji (po światłowodzie lub po obiektywie) i wykonać mikronaświetlanie zgodnie z powyższym opisem, jednocześnie rejestrując pomiary wykonane przez miernik mocy. Należy pamiętać, że częstotliwość próbkowania miernika mocy może nie być wystarczająco szybka, aby uchwycić bardzo szybkie zdarzenia mikronapromieniowania, dlatego może być konieczne przeprowadzenie wielu iteracji eksperymentu, aby upewnić się, że miernik mocy dokładnie wykryje zastosowaną dawkę.
      UWAGA: W przypadku lasera 355 nm zmierzyliśmy średnią moc szczytową około 5 mW po światłowodzie i około 19 μW po obiektywie. W przypadku lasera 405 nm mikropromieniowanie przeprowadzono w pętlach po 30 iteracji, aby pokonać maksymalną częstotliwość próbkowania miernika mocy wynoszącą 0,01 s, a średnie moce szczytowe 1,5 mW i 2,4 mW zmierzono przy prędkościach skanowania wynoszących odpowiednio 8 i 0,5 klatki na sekundę. Każdy miernik mocy jest inny. Użytkownicy będą musieli określić operacyjne długości fal i częstotliwości próbkowania dla swojego indywidualnego miernika mocy.

4. Procedury barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Przeanalizuj indukcję pękania pasma przez barwienie IF.
    1. Napraw komórki 3,7% formaldehydem (UWAGA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 10 minut. Odessać roztwór formaldehydu i przemyć 3 razy PBS. W tym miejscu protokół można zatrzymać, umieszczając PBS z powrotem na komórkach, a komórki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
      UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i utylizować substancję toksyczną zgodnie z instrukcjami instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa i higieny pracy.
    2. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,25% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przemycie 3 razy PBS.
    3. Zablokuj nieswoiste wiązanie przeciwciał poprzez inkubację przez 30 minut w PBS zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze pokojowej.
    4. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko γH2AX i pierwszorzędowym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko 53BP-1, oba rozcieńczone w stosunku 1:750 w PBS zawierającym 1% BSA przez 1 godzinę w RT, a następnie przemyć 3 razy PBS.
    5. Inkubować komórki za pomocą koziego anty-mysiego Alexa 488 i koziego anty-królika Alexa 546 rozcieńczonego w stosunku 1:2000 w PBS zawierającym 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy PBS.
    6. Wybarwić jądrowe DNA roztworem DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, UWAGA) rozcieńczonym do 1:5000 w PBS przez 5 minut lub użyć porównywalnego barwnika jądrowego, a następnie przemyć 3 razy PBS.
      UWAGA: DAPI jest toksyczny i mutagenny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i utylizować substancję toksyczną zgodnie z instrukcjami instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa i higieny pracy.
    7. Umieść PBS lub PBS + 0,1% azydek sodu (UWAGA) z powrotem na wybarwionych komórkach. W tym miejscu można zatrzymać protokół i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub przejść do akwizycji obrazu w sekcji 5.
      UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i utylizować substancje toksyczne zgodnie z instrukcjami instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa i higieny pracy.
  2. Przeanalizuj indukcję zmian zasadowych lub adduktów DNA przez barwienie IF.
    1. Utrwalać i przepuszczalność komórek w lodowatym metanolu (UWAGA) przez 20 minut w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Metanol jest toksyczny i łatwopalny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i utylizować substancję toksyczną zgodnie z instrukcjami instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa i higieny pracy.
    2. Zassać metanol i pozostawić próbkę do całkowitego wyschnięcia na 15 minut. W tym miejscu można przerwać działanie protokołu i komórki przechowywane w temperaturze -20 °C schnąć przez okres do 3 dni.
    3. Nawadniaj komórki w PBS przez 15 minut.
    4. Denaturować DNA za pomocą 2 N HCl (UWAGA) przez 45 minut w temperaturze pokojowej i przemyć 3 razy PBS.
      UWAGA: HCl jest. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i utylizować substancję zgodnie z instrukcjami instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa i higieny pracy.
    5. Zneutralizować w 50 mM Tris-HCl pH 8,8 przez 5 minut, a następnie 3 przemycia PBS.
    6. Inkubować komórki w buforze blokującym wykonanym z 5% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko 8-okso-2'-deoksyguanozynie (8-oksodG, 1:400) lub dimerowi pirymidyny cyklobutanu (CPD, 1:1,000) w buforze blokującym surowicę kozią przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać 3 razy PBS.
    8. Inkubować komórki za pomocą koziego anty-mysiego preparatu Alexa 488 w stosunku 1:2000 w buforze blokującym surowicę kozią przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemywać 3 razy PBS.
    9. Wybarwić jądrowe DNA za pomocą 1:5000 DAPI (10 mg/ml) w PBS przez 5 minut i przemyć 3 razy PBS.
    10. Jeśli używasz szkła nakrywkowego z komorą, umieść PBS lub PBS + 0,1% azydek sodu z powrotem na wybarwionych komórkach. W tym miejscu można zatrzymać działanie protokołu i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub przejść do akwizycji obrazu w sekcji 5.
    11. Alternatywnie, zamontuj komórki w preferowanym podłożu montażowym, jeśli dodatkowe szkło nakrywkowe można umieścić na górze naczynia hodowlanego. Po utwardzeniu zamontowane ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez długi czas.

5. Akwizycja obrazu do eksperymentów immunofluorescencyjnych

  1. Oczyść szklane dno naczynia hodowlanego etanolem i umieść je z powrotem na stoliku mikroskopu konfokalnego. Należy dopilnować, aby orientacja i położenie naczynia na stoliku odpowiadały orientacji i położeniu zarejestrowanym w momencie wywołania uszkodzenia. Zabezpiecz naczynie hodowlane, aby zapewnić optymalną rejestrację i obrazowanie.
  2. Zlokalizuj poprzednio zobrazowane pola, korzystając z wybranej techniki rejestracji (opisanej w punkcie 3.2).
    1. W przypadku ręcznej rejestracji za pomocą szkła nakrywkowego z wytrawioną siatką, ustaw ostrość siatki i znajdź znaki identyfikacyjne. Następnie użyj zarejestrowanych współrzędnych XY, aby zlokalizować uszkodzone komórki.
    2. W przypadku automatycznej rejestracji opartej na obrazie zlokalizuj cechę konstrukcyjną użytą jako odniesienie w kroku 3.2.1, a następnie wyrównaj bieżący widok mikroskopu na żywo jak najbliżej zarejestrowanego obrazu. Po wyrównaniu zmierz bieżące położenie stolika mikroskopu XY i porównaj je z położeniem XY obrazu referencyjnego. Odległość liniowa między dwoma lokalizacjami definiuje odsunięcie X i Y. Zastosuj to przesunięcie do każdej zarejestrowanej lokalizacji XY, aby zidentyfikować pole (pola) obrazu zawierające napromieniowaną komórkę. Ta funkcja offsetu może być zautomatyzowana w oprogramowaniu sterującym mikroskopem lub wykonywana ręcznie.
    3. Jeśli nie można zidentyfikować odpowiednich punktów rejestracji, ręcznie zlokalizuj komórki, skanując szkiełko i lokalizując poprzednio zidentyfikowane cechy komórek.
  3. Uzyskuj obrazy przy użyciu odpowiednich ustawień mikroskopu, aby zebrać wszystkie zabarwione obiekty, w tym obraz w jasnym polu (ustawienie w sekcji 2.3 i ustawianie ostrości w sekcji 3.3). W prezentowanych eksperymentach uzyskano obrazy wielokanałowe za pomocą następujących linii lasera wzbudzającego i fluoroforów: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 i transmitowane jasne pole DIC) oraz 561 nm (Alexa 546). Wszystkie lasery przechodzą przez pojedynczy przestrajalny filtr akustyczno-optyczny, kontrolujący transmisję zarówno długości fali, jak i mocy lasera.

6. Analiza obrazu żywej komórki rekrutacji białek fluorescencyjnych do miejsc mikronapromieniowanych

  1. Otwórz pozyskane obrazy w aplikacji do analizy obrazów (np. NIS Elements lub ImageJ). W razie potrzeby połącz obraz przed napromieniowaniem z obrazami poklatkowymi, aby wygenerować pojedynczą sekwencję obrazu indukcji przed i po uszkodzeniu. Użytkownicy mogą pokazać rekrutację, mierząc zmiany intensywności fluorescencji na napromieniowanym obszarze w stosunku do intensywności fluorescencji mierzonej w całym jądrze (patrz Reprezentatywne Wyniki Rysunek 1B).
  2. Dla każdej komórki, która ma być mierzona, najpierw wygeneruj referencyjny zwrot z inwestycji, który reprezentuje jądro. Użyj algorytmu progowania na sygnale fluorescencyjnym, który zawiera piksele tworzące jądro, a następnie przekształć ten obszar w ROI. W razie potrzeby ROI można narysować ręcznie, używając jasnego pola jako odniesienia. Dostosuj ROI w ciągu czasu, aby upewnić się, że obszar jądrowy jest dokładnie pokryty ROI, i podaj średnią intensywność fluorescencji sygnału fluorescencyjnego w tym ROI dla każdej klatki.
  3. Dla każdej mierzonej komórki utwórz ROI o wymiarach 6x6 pikseli i umieść go nad ROI uszkodzeń dla każdej klatki przebiegu czasu. Ten większy zwrot z inwestycji jest teraz zwrotem z inwestycji w szkody do analizy. Podaj średnią intensywność fluorescencji ROI dla każdej klatki.
    UWAGA: Większość komercyjnych programów do analizy obrazów zawiera moduły do śledzenia obiektów 2D, a także istnieje wiele opracowanych przez użytkowników makr dla ImageJ lub FIJI, które ułatwiają szybszy przepływ pracy i większą przepustowość (patrz https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Znormalizuj średnią intensywność fluorescencji ROI obrażeń do odpowiadającej jej referencyjnej intensywności ROI w każdej klatce timelapse. W tym przypadku średnia intensywność fluorescencji jądrowej jest używana jako referencyjny zwrot z inwestycji (patrz Reprezentatywne wyniki Rysunek 1). Normalizację można przeprowadzić, odejmując średnią referencyjną intensywność fluorescencji ROI od średniej intensywności fluorescencji ROI uszkodzenia lub dzieląc średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia przez średnią referencyjną intensywność fluorescencji ROI.
    UWAGA: Normalizacja przez dzielenie może dawać nieprzewidywalne wyniki, jeśli jest stosowana w sytuacjach o bardzo niskich wartościach intensywności odniesienia.
  5. Powtórz tę czynność dla wszystkich uszkodzonych komórek, a także dla co najmniej dwóch kontrolnych, nieuszkodzonych komórek. W razie potrzeby wyniki komórek kontrolnych można wykorzystać do dalszej normalizacji.
  6. Wykres znormalizowanych wartości intensywności w czasie, aby pokazać zmiany w dynamice rekrutacji w funkcji leczenia eksperymentalnego.

7. Analiza obrazu rekrutacji białek wykrytych przez immunofluorescencję

  1. Otwieranie obrazów przed i po uszkodzeniu w aplikacji do analizy obrazu. Obrazy przed uszkodzeniem zawierają zwrot z inwestycji w uszkodzenia użyty do mikronapromieniowania. Skopiuj ROI i wklej do obrazów po uszkodzeniu, aby zidentyfikować docelowe komórki.
  2. Wygeneruj zwrot z inwestycji o wymiarach 6x6 pikseli do analizy rekrutacji białek i umieść ten zwrot z inwestycji w miejscu zwrotu z inwestycji. Ten większy zwrot z inwestycji jest teraz zwrotem z inwestycji w szkody do analizy. Podaj średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia.
  3. Znormalizuj średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia do odpowiedniej referencyjnej intensywności ROI. W tym przypadku średnia intensywność fluorescencji jądrowej uszkodzonego ogniwa jest używana jako referencyjny zwrot z inwestycji (patrz Reprezentatywne wyniki Rysunek 1). Wygeneruj referencyjny zwrot z inwestycji za pomocą algorytmu progowania na sygnale DAPI w celu zdefiniowania jądra, a następnie przekształć ten obszar w ROI. Należy podać średnią referencyjną intensywność fluorescencji ROI. Normalizację można przeprowadzić, odejmując średnią referencyjną intensywność fluorescencji ROI od średniej intensywności fluorescencji ROI uszkodzenia lub dzieląc średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia przez średnią referencyjną intensywność fluorescencji ROI.
    UWAGA: Normalizacja przez dzielenie może dawać nieprzewidywalne wyniki, jeśli jest stosowana w sytuacjach o bardzo niskich wartościach intensywności odniesienia.
  4. Powtórzyć dla wszystkich uszkodzonych komórek i przeprowadzić tę samą analizę na co najmniej dwóch komórkach kontrolnych, jak opisano powyżej.
  5. Wykres znormalizowanych wartości intensywności dla każdego zmierzonego zdarzenia mikronapromieniowania w czasie, aby pokazać zmiany w rekrutacji białek lub rodzaju uszkodzenia DNA w funkcji leczenia eksperymentalnego.

Wyniki

Charakteryzacja indukowanych uszkodzeń DNA
Indukcja uszkodzeń zasad oraz pęknięć nici zależy od dawki lasera zastosowanej do wybranego obszaru jądra oraz mikrośrodowiska komórkowego użytego modelu komórkowego7. Białka fluorescencyjne połączone z białkami naprawczymi, takimi jak XRCC1, 53BP1, Ku70 lub Rad51, stanowią przydatne markery pęknięć pojedynczych i podwójnych nici, umożliwiając ustalenie minimalnej energii wymaganej do zaobserwowania akumulacji białka fluorescencyjnego w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) uszkodzenia powyżej poziomu fluorescencji tła9,19,31. Po znalezieniu warunków indukujących odpowiedź, kluczowe jest scharakteryzowanie mieszaniny uszkodzeń wywołanych przez konkretną długość fali i dawkę. Zmniejszenie dawki i czasu ekspozycji przy danej długości fali może pozwolić użytkownikowi zminimalizować powstawanie złożonych mieszanin uszkodzeń. Wykazano, że niskie dawki lasera w zakresie UV-A powodują głównie pęknięcia pojedynczych nici (SSB) i niewielką ilość uszkodzeń zasad, co jest odpowiednie do badania szlaków SSBR i BER10,28. Zwiększenie dawki prowadzi do powstania bardziej złożonych uszkodzeń zasad (oksydacyjnych i indukowanych promieniami UV) oraz indukuje znacznie większą liczbę pęknięć podwójnych nici (DSB)7,10. Choć indukcja pojedynczego rodzaju uszkodzenia DNA jest pożądana przy badaniu konkretnych szlaków naprawy DNA, bardziej prawdopodobne jest, że użytkownicy indukują mieszaninę uszkodzeń DNA, w której konkretne uszkodzenie, takie jak SSB, występuje znacznie częściej niż uszkodzenia zasad czy DSB. Jest to podobne do mieszanin uszkodzeń DNA indukowanych przez czynniki chemiczne, takie jak nadtlenek wodoru (H2O2) lub metylometanosulfonian (MMS)32. Raportując wyniki, użytkownicy muszą mieć świadomość możliwości wystąpienia mieszanin uszkodzeń; staranna charakteryzacja dawki i rodzaju uszkodzeń w miejscu indukcji jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności i porównywalności uzyskanych wyników.

W badaniach nad mikroirradiation często stosuje się XRCC1-GFP jako marker indukcji uszkodzeń zasad oraz pęknięć jednoniciowych (SSB)9,28. XRCC1 jest białkiem rusztowaniowym, które odgrywa istotną rolę w naprawie SSB (SSBR) oraz naprawie przez wycinanie zasad (BER), a także uczestniczy w innych szlakach naprawczych, takich jak naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER)33,34,35. Pełni on ważną rolę koordynacyjną w naprawie DNA, oddziałując z szeregiem kluczowych białek, w tym z polimerazą poli(ADP-rybozową) 1 (PARP-1), polimerazą DNA β (Pol β) i ligazą DNA III. Wykorzystaliśmy XRCC1-GFP stabilnie ekspresowane w komórkach CHO-K1, aby określić dawki laserowe wymagane do generowania SSB i pęknięć dwuniciowych (DSB). Najpierw zidentyfikowano minimalną dawkę niezbędną do wywołania obserwowalnej rekrutacji XRCC1-GFP dla każdej długości fali (Rysunek 1). Dla długości fali 355 nm czas przebywania lasera 2 s nad zdefiniowanym obszarem zainteresowania (ROI) uszkodzenia spowodował wzrost sygnału fluorescencyjnego w tym ROI, co wskazało na indukcję uszkodzeń DNA wykrywalnych ponad tłem (Rysunek 1A). Dla 405 nm wymagana była prędkość skanowania 8 fps, aby wygenerować obserwowalną rekrutację do ROI uszkodzenia (Rysunek 1A). Następnie zwiększono dawkę (10 s dla 355 nm i 0,5 fps dla 405 nm), aby stworzyć bardziej intensywne ROI uszkodzenia (Rysunek 1A).

Rekrutację i retencję XRCC1-GFP w miejscu indukowanego uszkodzenia monitorowano następnie za pomocą obrazowania timelapse. Retencja białka w miejscu uszkodzenia DNA może wskazywać na trwającą naprawę DNA, podczas gdy dysocjacja białka z miejsca indukowanego uszkodzenia jest często uważana za marker zakończenia BER lub SSBR. Jednakże nie ma jednoznacznych dowodów wiążących dysocjację XRCC1 z miejsc uszkodzeń DNA wywołanych laserem z zakończeniem procesu naprawy. Rekrutację białka do miejsca uszkodzenia mierzy się, podając średnią intensywność sygnału fluorescencyjnego w obrębie uszkodzonego ROI w stosunku do średniego sygnału fluorescencyjnego zmierzonego dla całego jądra komórkowego (Rysunek 1B). Ten rodzaj normalizacji pomaga niwelować fluktuacje intensywności sygnału w jądrze, choć w zależności od dystrybucji komórkowej badanego białka można zastosować inne techniki normalizacji. W tym przypadku XRCC1 lokalizuje się w przedziale jądrowym, zatem normalizacja do obszaru jądra mierzy redystrybucję sygnału do ROI uszkodzenia. Średnia intensywność fluorescencji ROI jest następnie rejestrowana dla każdego obrazu w serii timelapse, w tym obrazu przed uszkodzeniem, i przedstawiana na wykresie jako funkcja czasu (Rysunek 1C).

Następnie dalej charakteryzowano uszkodzenia wywołane przez dwie wybrane dawki lasera, aby zbadać powstawanie uszkodzeń zasad DNA. Po pierwsze, za pomocą immunofluorescencji badano powstawanie CPD, czyli masywnych uszkodzeń indukowanych przez UV, jako markerów uszkodzeń typu NER (Rycyna 2A). Następnie badano indukowane oksydacyjnie uszkodzenie zasady 8-oxodG jako marker uszkodzeń typu BER (Rycyna 2B). Nie zaobserwowano istotnego wzrostu uszkodzeń CPD przy ekspozycji na niską dawkę dla obu długości fal (2 s dla 355 nm i 8 fps dla 405 nm), podczas gdy wysoka dawka przy obu długościach fal (10 s dla 355 nm i 0,5 fps dla 405 nm) wykazała istotny wzrost sygnału fluorescencyjnego w obrębie ROI uszkodzeń (Rycyna 2A). Wykres rozrzutu średniej intensywności CPD w ROI dla każdej uszkodzonej komórki wykazuje heterogeniczność w powstawaniu i wykrywaniu uszkodzeń przy obu długościach fal i dawkach, co wskazuje, że przy niższych dawkach może występować niski poziom uszkodzeń CPD, ale obciążenie może nie być istotnie wykrywane aż do zastosowania wyższej dawki. Wykres rozrzutu sugeruje również niewydajność detekcji przeciwciał, co może ograniczać dokładną kwantyfikację mieszanin uszkodzeń.

Zostało to dodatkowo podkreślone podczas wykrywania indukowanych oksydacyjnie uszkodzeń DNA za pomocą markera 8-oxodG. Nie zaobserwowano wyraźnego wzrostu sygnału fluorescencyjnego w obrębie ROI uszkodzenia dla 8-oxodG przy żadnej z zastosowanych długości fali lasera ani dawek (Rysunek 2B). Przeciwciało wykorzystane w tej pracy jest zgodne z wcześniejszymi publikacjami9,10,36; należy jednak zauważyć, że obserwacja tworzenia się 8-oxodG za pomocą przeciwciał może mieć pewne ograniczenia37,38. Potwierdzenie braku uszkodzeń indukowanych oksydacyjnie jest zalecane również przy użyciu drugiego markera, takiego jak rekrutacja 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzymu odpowiedzialnego za usuwanie 8-oxodG z DNA10. Nie zaobserwowaliśmy rekrutacji OGG1 do miejsc uszkodzeń DNA; jednak nie można całkowicie wykluczyć powstawania niskich poziomów indukowanych oksydacyjnie uszkodzeń DNA.

Na koniec, przy wybranych dawkach lasera, zbadaliśmy powstawanie DSBs za pomocą dwóch markerów, γH2AX oraz 53BP-1, wykorzystując immunofluorescencję (Rysunek 3 & 4). γH2AX jest powszechnie stosowany jako marker pęknięć nici, jednak jego swoistość w odniesieniu do DSBs była kwestionowana w wielu doniesieniach39,40. Ponadto jest to zdarzenie fosforylacji, które rozprzestrzenia się z miejsca pęknięcia nici, przez co lokalizacja sygnału w miejscu pęknięcia może być ograniczona ze względu na tę propagację. Dlatego połączenie γH2AX z 53BP-1 pozwala na dokładniejszą ocenę powstawania DSB w obrębie ROI uszkodzenia.

Odpowiedź γH2AX i 53BP-1 na mikroirradiację jest zależna zarówno od długości fali, jak i od dawki. Stymulacja niską dawką (2 s) przy 355 nm nie wywołuje odpowiedzi w 5. i 20. minucie, a w 10. minucie po irradiacji obserwuje się słabą i zmienną odpowiedź (Rysunek 3A) dla obu markerów. Wysoka dawka (10 s) mikroirradiacji przy 355 nm indukuje zwiększony sygnał fluorescencyjny w obrębie ROI uszkodzenia w 5., 10. i 20. minucie po irradiacji, który ulega zmniejszeniu w 40. minucie (Rysunek 3B). Wyniki te wskazują, że wymagane jest staranne miareczkowanie dawki 355 nm w celu zminimalizowania wzajemnej stymulacji szlaków naprawczych, co potwierdzono poprzez zmniejszone wykrywanie markera pęknięć dwuniciowych γH2AX w wczesnych punktach czasowych (< 20 min) przy zastosowaniu niskiej dawki.

Podobne eksperymenty przeprowadzono przy użyciu stymulacji laserowej 405 nm zarówno z niską (8 fps), jak i wysoką dawką (0,5 fps) (Rysunek 4). Przy tej długości fali zaobserwowano znaczną akumulację intensywności fluorescencji w obrębie ROI uszkodzenia zarówno dla 53BP-1, jak i γH2AX, niezależnie od zastosowanej dawki, co wskazuje, że dawki te generują złożoną mieszaninę pęknięć jednoniciowych i dwuniciowych niemal natychmiast po indukcji uszkodzeń DNA (Rysunek 4). Ponadto wysokie dawki 405 nm wywołują wzrost pan-jądrowego barwienia γH2AX w ciągu 10 min od indukcji uszkodzeń (Rysunek 4B, dół), co utrudnia raportowanie detekcji ROI uszkodzenia, podczas gdy akumulacja 53BP-1 jest bardziej ograniczona do obszaru ROI uszkodzenia.

Wyniki te wyraźnie pokazują, że mikroirradiacja o długości fali 405 nm nie jest odpowiednia do monitorowania SSBR lub BER i że w celu pełnej charakterystyki indukowanych uszkodzeń oraz odpowiedzi naprawczych DNA należy zastosować wiele markerów adduktów DNA i pęknięć nici.

Zależna od dawki zmiana w rekrutacji i retencji XRCC1-GFP
Po scharakteryzowaniu indukowanych uszkodzeń DNA, mikroirradiacja laserowa może stanowić idealną platformę do badania dynamiki białek naprawczych DNA. Kinetyka retencji i dysocjacji XRCC1-GFP wykazuje zależność od dawki (Rysunek 1), co nie jest zaskakujące, biorąc pod uwagę indukcję różnych mieszanek uszkodzeń przez każdą z długości fal. Najwyższe dawki naświetlania (10 s i 0,5 fps) wykazują silniejszą rekrutację XRCC1-GFP w porównaniu z niższymi dawkami oraz dłuższą retencję XRCC1-GFP w miejscu uszkodzenia w ciągu 20 min (Rysunek 1C). Wskazuje to, że uszkodzenia DNA powstałe przy wyższych dawkach zarówno dla 355 nm, jak i 405 nm, prawdopodobnie nie zostają naprawione w trakcie eksperymentu, co jest spójne z pojawieniem się i retencją markerów DSB, γH2AX oraz 53BP-1 (Rysunki 3 i 4).

Interesujące jest to, że niższe dawki uszkadzające (2 s i 8 fps) wykazują szybką rekrutację XRCC1-GFP do miejsc uszkodzeń oraz dysocjację XRCC1-GFP w czasie trwania eksperymentu do poziomów sprzed napromieniowania (Rysunek 1C). Bez pełnej charakterystyki mieszaniny uszkodzeń może to prowadzić do wniosku, że SSBs i uszkodzenia zasad są całkowicie naprawiane w tych warunkach uszkadzania. Jednak obecność γH2AX i 53BP-1 w 40 min dla 355 nm oraz w 5 min dla 405 nm może prowadzić do innych interpretacji. W przypadku dawki 355 nm 2 s mieszanina uszkodzeń może składać się głównie z SSBs, zatem pojawienie się markerów DSB w 40 min może wskazywać, że niektóre nienaprawione uszkodzenia mogą prowadzić do powstania DSBs lub że DSBs generowane przez tę energię są naprawiane w dłuższej skali czasowej. Różnice w skali czasowej między naprawą SSBR a DSB były wcześniej raportowane28,41,42. Podobnie, dysocjacja przy niskiej dawce 405 nm (8 fps) może wskazywać na niski poziom SSBs lub grupowanie się SSBs, które są szybko przekształcane w DSBs, co było wcześniej odnotowane dla mikro-napromieniowania o wysokim stopniu uszkadzania oraz innych czynników uszkadzających DNA43,44,45.

Wszystkie te wyniki podkreślają znaczenie charakteryzowania mieszanin indukowanych uszkodzeń oraz wykorzystania wielu białek naprawczych DNA i markerów w celu interpretacji rekrutacji i retencji białek naprawczych DNA w miejscach indukowanych uszkodzeń.

Analiza powrotu fluorescencji, XRCC1-GFP, schemat natężenia ROI po uszkodzeniu UV przy 355 nm, 405 nm.
Rysunek 1. Mikro-naświetlanie laserowe indukuje rekrutację XRCC1-GFP.
(A) Komórki CHO-K1 stabilnie eksponujące XRCC1-GFP zostały poddane naświetlaniu i obrazowaniu przed oraz bezpośrednio po indukcji uszkodzeń. Strzałki wskazują miejsce dawki mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm. (B) Rekrutację mierzy się poprzez wyznaczenie średniego natężenia fluorescencji w obrębie ROI uszkodzenia i normalizację do średniego natężenia fluorescencji całego jądra. (C) Dynamikę rekrutacji można mierzyć dla każdego obrazu z serii timelapse. Wykresy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów, a słupki błędów przedstawiają SEM (n=24). Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza uszkodzeń chromoforów; wykres fluorescencji, mikroskopia; naprawa DNA; eksperyment z użyciem światła UV.
Rysunek 2. Mikro-naświetlanie laserowe indukuje uszkodzenia nukleotydów.
Komórki CHO-K1 poddano mikro-naświetlaniu laserowemu i utrwalono bezpośrednio po indukcji uszkodzeń. Przeprowadzono immunofluorescencję w celu wykrycia adduktów CPD oraz 8-oxodG. (A) Góra: wykres punktowy średnich intensywności fluorescencji w ROI zaobserwowanych w uszkodzonych komórkach po barwieniu na CPD. Dół: reprezentatywne obrazy barwienia na CPD. Strzałki wskazują miejsce mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm (n=12). (B) Reprezentatywne obrazy barwienia na 8-oxodG. Strzałki wskazują miejsce mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; średnia fluorescencja 53BP1/γH2AX; badanie naświetlania; wykresy ROI.
Rycina 3. Markery pęknięć dwuniciowych DNA reagują na mikro-naświetlanie 355 nm w sposób zależny od dawki. 
Komórki CHO-K1 poddano mikro-naświetlaniu i utrwalono w określonych punktach czasowych po stymulacji. Wykonano immunofluorescencję dla markerów DSB γH2AX i 53BP-1. (A) Wykres rozproszenia znormalizowanych średnich intensywności fluorescencji w ROI uszkodzeń, zmierzonych dla komórek nieuszkodzonych i uszkodzonych. Słupki błędów reprezentują SEM (n=12). (B) Reprezentatywne obrazy dla barwienia γH2AX i 53BP-1. Strzałki wskazują miejsce mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Odpowiedź na uszkodzenia DNA, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykres, analiza białek 53BP1 i γH2AX.
Rysunek 4. Markery pęknięć dwuniciowych DNA wykazują silną odpowiedź na mikroirradiację 405 nm.
Komórki CHO-K1 poddano mikroirradiacji i utrwalono w określonych punktach czasowych po stymulacji. Immunofluorescencja dla markerów DSB γH2AX i 53BP-1. (A) Wykres rozrzutu znormalizowanych średnich intensywności fluorescencji ROI uszkodzeń zmierzonych dla komórek nieuszkodzonych i uszkodzonych. Słupki błędów reprezentują SEM (n=12). (B) Reprezentatywne obrazy dla barwienia γH2AX i 53BP-1. Strzałki wskazują miejsce mikroirradiacji, a pasek skali wynosi 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Korzystając z opisanych tutaj warunków, każdy mikroskop konfokalny z laserem UV-A lub 405 nm, zintegrowany przez producenta lub dodany przez użytkownika końcowego, może wywołać uszkodzenie DNA w jądrze komórki i umożliwić rekrutację białek naprawy DNA do miejsca indukowanego uszkodzenia DNA, które ma być monitorowane. Jednak, jak zauważono w protokole i reprezentatywnych wynikach, wybór długości fali, zastosowana moc i charakterystyka uszkodzeń są ważnymi kwestiami, które muszą być najpierw rozwiązane przez użytkownika w celu zbadania określonego szlaku naprawy DNA. Ponadto istnieją inne względy dotyczące projektowania eksperymentalnego, które również muszą być brane pod uwagę przez użytkowników.

Aby monitorować zachowanie białka w żywych komórkach po mikronapromieniowaniu, należy stworzyć białko znakowane fluorescencyjnie. Dostępność szerokiej gamy białek fluorescencyjnych, które można rozdzielić spektralnie, daje narzędzia do tworzenia fuzji białek, które można wykorzystać do scharakteryzowania odpowiedzi komórkowych na indukcję uszkodzenia DNA. Przejściowa transfekcja interesujących białek fluorescencyjnych pozwala na szybkie badanie przesiewowe szkodliwych warunków, mutacji, a nawet inhibitorów, podczas gdy stabilnie transfekowane komórki zapewniają większą kontrolę nad poziomami ekspresji i pozwalają na przeprowadzenie innych charakterystyk biochemicznych, potwierdzając wyniki mikronapromieniowania. Spektralnie odrębne białka fluorescencyjne mogą być również wykorzystywane w tej samej komórce do monitorowania interakcji między białkami w obrębie tego samego szlaku lub w różnych szlakach. Białka fluorescencyjne eliminują również potrzebę stosowania specyficznych przeciwciał dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania i umożliwiają monitorowanie zachowania białka przez żywe komórki przez długi czas po indukcji uszkodzenia.

Jednak stosowanie białek fluorescencyjnych ma również wady. Bez tła genetycznego z niedoborem białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania, białka endogenne będą konkurować z białkami znakowanymi fluorescencyjnie. Sprzężenie znacznika fluorescencyjnego z końcem N lub C białka może zmienić fałdowanie białka, utrudnić kluczowe interakcje białko-białko lub blokować sygnały translokacyjne; zmieniając funkcję i potencjalnie wpływając na dynamikę rekrutacji. Efekty te wykazano w wielu raportach, w których barwienie immunofluorescencyjne wykazało dramatycznie różne czasy rekrutacji i retencji dla endogennych białek w miejscu uszkodzenia28. Stosowanie transfekcji przejściowej lub stabilnych klonów może również zmienić zaobserwowaną odpowiedź, zazwyczaj poprzez zmiany w poziomach ekspresji białek. Co więcej, zastosowanie wielu białek fluorescencyjnych w jednym eksperymencie może również zmienić dynamikę rekrutacji, jeśli poziomy białek nie są dobrze zrównoważone lub jeśli rekrutacja większego białka znakowanego fluorescencyjnie blokuje rekrutację innych białek. Wreszcie, białka fluorescencyjne mogą działać jako słabe czynniki uczulające, zwiększając tworzenie reaktywnych form tlenu i potencjalnie zmieniając indukowane mieszaniny uszkodzeń DNA46,47. Pomimo tych wad, białka fluorescencyjne oferują szereg wyraźnych zalet w badaniu naprawy DNA za pomocą mikronapromieniowania, a jeśli użytkownicy włączą odpowiednie kontrole, takie jak opisana tutaj charakterystyka uszkodzeń, mogą dostarczyć nowego wglądu w reakcję na uszkodzenia i interakcje białko-białko3.

Jeśli obrazowanie żywych komórek nie jest wymagane, immunofluorescencja może być stosowana do monitorowania odpowiedzi na indukowane uszkodzenia. Poprzez utrwalanie komórek w określonych momentach po uszkodzeniu indukcji i barwienie przeciwciałami specyficznymi dla białek i zmian chorobowych, można zbudować statyczne migawki indukcji uszkodzeń oraz rekrutacji i zatrzymywania białek naprawczych. Przeciwciała mogą być stosowane do monitorowania rekrutacji wielu białek będących przedmiotem zainteresowania i/lub modyfikacji potranslacyjnych wywołanych odpowiedzią na uszkodzenie DNA. Zastosowanie immunofluorescencji eliminuje potrzebę stosowania białek fluorescencyjnych i pozwala na badanie endogennego zachowania białek. Jednak ta metoda również ma swoje wady. Konieczne są wysoce specyficzne przeciwciała, a procedury przenikania i blokowania muszą być zoptymalizowane, aby umożliwić wykrycie rekrutacji o wystarczającej intensywności sygnału. Procedury naprawcze nie są natychmiastowe, a to fizyczne ograniczenie ogranicza czasowe rozwiązanie tego podejścia. Mapowanie miejsca indukcji uszkodzeń, aby komórki mogły zostać ponownie zlokalizowane po barwieniu, może również stanowić poważne wyzwanie. Mikroskop konfokalny wykorzystany w tej pracy pozwala na rejestrację na podstawie obrazu, jak opisano powyżej, dzięki czemu uszkodzone komórki mogą być przemieszczane z dużą precyzją. Jeśli rejestracja etapu lub wytrawione szkło nakrywkowe nie jest dostępne, inwestycja czasu związana z przeniesieniem komórek bez rejestracji etapu, w połączeniu z nieodłącznym opóźnieniem między indukcją uszkodzenia a zobrazowaną rekrutacją, może sprawić, że immunofluorescencja stanie się nieatrakcyjna dla niektórych użytkowników. Jednak najdokładniejsze i najbardziej kompletne projekty eksperymentalne mikronapromieniania będą obejmowały tego typu podejścia równolegle z wykorzystaniem białek fluorescencyjnych, jak opisano w przedstawionym protokole.

W tym przypadku wykorzystuje się zarówno obrazowanie żywych komórek, jak i immunofluorescencję, aby zademonstrować użyteczność mikropromieniowania laserowego. Barwienie immunofluorescencyjne pozwala nam dokładnie zbadać mieszaninę powstałych uszkodzeń DNA i rekrutację białek indukowaną przez każdą moc lasera, co pozwala nam lepiej interpretować obserwowane zmiany w rekrutacji i retencji XRCC1-GFP. Na podstawie tych wyników należy ograniczyć stosowanie laserów o długości fali 405 nm do badania białek BER i SSBR. Co więcej, optymalny projekt eksperymentalny obejmowałby pomiary mocy po osiągnięciu celu, pełną charakterystykę mieszaniny uszkodzeń dla każdej użytej linii komórkowej oraz walidację rekrutacji i retencji obserwowanej w fluorescencyjnie znakowanych białkach za pomocą immunofluorescencji. Oczywiście względy sprzętowe, czasowe i kosztowe mogą sprawić, że te optymalne projekty eksperymentalne będą niemożliwe dla niektórych użytkowników. Jednak znaczenie każdego z tych elementów zostało tutaj pokazane, a użytkownicy powinni pamiętać o tych względach przy rozpoczynaniu eksperymentów z mikronapromieniowaniem.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Samuelowi H. Wilsonowi z National Institute of Environmental Health Sciences za linie komórkowe użyte w tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Nikon A1rsiOprogramowanie Nikon
NIS ElementsLaser Nikon
355 nmPicoQuant VisUVŹródło promieniowania
Galwanometr miniskaner fotoaktywacjiBruker
Szkiełko mikroskopowe czujnik mocy fotodiodyTHORLabsS170C
Światłowodowy czujnik mocy fotodiodyTHORLabsS150C
Cyfrowy ręczny miernik mocy optycznej i energiiTHORLabsPM100D
CHO-K1Od dr Samuela H. Wilsona, NIEHS
Minimalne niezbędne mediaHyklonSH3026501
Surowica bydlęcapłodu Atlanta biologiczneS11550
XRCC1-GFPOrigeneRG204952
JetprimePolyplus transfekcja11407
GeneticinThermoFisher10131035
4-komorowe szkło nakrywkoweThermoFisher155382
8-komorowe szkło nakrywkoweThermoFisher155409
Anti 53BP-1NovusNB100304
Antyfosfo-histon H2AX Millipore05-636-I
Dimer pirymidyny Antycyklobutanklon Cosmo BioCAC-NM-DND-001
Anty 8-okso-2´-deoksyguanozyna Trevigen4354-MC-050
Alexa 488 kozia anty-myszThermoFisherA11029
Alexa 546 koza anty-królikThermoFisherA11010
4',6-Diamidino-2-fenyloindol (DAPI)ThermoFisherR37606Uwaga toksyczny!
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher0780
Normalna surowica koziaThermoFisher31873
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Jackson Immuno Research001-000-162
37% FormaldehydThermoFisher9311Uwaga toksyczny!
EtanolDecon Labs2716
MetanolVWRBDH1135Uwaga toksyczny!
HClFisherSA49
Azydek soduSigma-AldrichS2002Uwaga toksyczny!
Chlorowodorek TrisAmrescoO234
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
, ,

Bibliografia

  1. Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
  2. Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
  3. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  4. Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
  5. Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
  6. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).
  7. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
  8. Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
  9. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).
  10. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  11. Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
  12. Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
  13. Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
  14. Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
  15. Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
  16. Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
  17. Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
  18. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  19. Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
  20. Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301(2012).
  21. Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
  22. Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
  23. Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
  24. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  25. Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
  26. Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
  27. Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
  28. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
  29. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
  30. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135(2013).
  31. Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).
  32. Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
  33. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
  34. London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
  35. Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
  36. Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
  37. Cooke, M. S., Lunec, J. Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , World Scientific. 275-293 (2003).
  38. Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
  39. Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
  40. Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
  41. Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
  42. Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
  43. Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
  44. Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).
  45. Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
  46. Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).
  47. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukcja uszkodzeń DNAbiałka naprawy DNAmikroskopia konfokalnapęknięcia jednoniciowepęknięcia dwuniciowerekrutacja XRCC1-GFPlaser 355 nanometrówlaser 405 nanometrówobrazowanie time-lapse
Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.