Wtórne zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) występuje często w jaskrze. W pracy opisano innowacyjne podejście operacyjne do częściowej transsekcji nerwu wzrokowego. Zastosowanie tego oszczędzającego miejsce podejścia operacyjnego rozszerza zakres zastosowań modelu i umożliwia eksplorację mechanizmów wtórnych uszkodzeń w RGC w nowy sposób.
Artykuł metodologiczny
Częściowa transsekcja nerwu wzrokowego u szczurów: model ustalony z nowym podejściem operacyjnym do oceny wtórnego zwyrodnienia komórek zwojowych siatkówki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poprzednie badania wykazały, że wtórne zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) występuje powszechnie w jaskrze. Częściowa transsekcja nerwu wzrokowego jest uważana za użyteczny i powtarzalny model. W porównaniu z innymi modelami uszkodzenia nerwu wzrokowego powszechnie stosowanymi do oceny zwyrodnienia wtórnego, np. modelami całkowitej transsekcji nerwu wzrokowego i zmiażdżenia nerwu wzrokowego, model częściowej transsekcji nerwu wzrokowego jest lepszy, ponieważ odróżnia zwyrodnienie pierwotne od wtórnego in situ. Dlatego służy jako doskonałe narzędzie do oceny wtórnego zwyrodnienia. W badaniu tym opisano nowatorskie podejście operacyjne polegające na częściowym przecięciu nerwu wzrokowego poprzez bezpośredni dostęp do obszaru zagałkowego nerwu wzrokowego przez boczną ścianę oczodołu gałki ocznej. Ponadto prezentujemy nowo zaprojektowany, niedrogi instrument chirurgiczny wspomagający przekrój. Jak wykazały reprezentatywne wyniki w zakresie rozróżnienia granic obszarów pierwotnego i wtórnego urazu, nowe podejście i instrument zapewniają wysoką wydajność i stabilność modelu, zapewniając odpowiednią przestrzeń do operacji chirurgicznej. To z kolei ułatwia oddzielenie osłonki oponowej i naczyń ocznych od nerwu wzrokowego przed przecięciem. Dodatkową korzyścią jest to, że to oszczędzające miejsce podejście operacyjne poprawia zdolność badaczy do podawania leków, nośników lub selektywnych znaczników RGC do kikuta częściowo przeciętego nerwu wzrokowego, umożliwiając eksplorację mechanizmów stojących za wtórnym uszkodzeniem w RGC w nowy sposób.
Wprowadzenie
Wtórne zwyrodnienie występuje często w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) po urazach oraz po ostrych i przewlekłych chorobach neurodegeneracyjnych. 1,2,3,4,5 Śmierć neuronów i komórek glejowych jako wczesna konsekwencja pierwotnych zdarzeń patologicznych jest określana jako zwyrodnienie pierwotne, podczas gdy wtórne zwyrodnienie odnosi się do śmierci neuronów i komórek glejowych, które nie są lub są tylko częściowo dotknięte pierwotnym uszkodzeniem. Uważa się, że wtórne zwyrodnienie RGC występuje również w jaskrze. 6 Yoles et al.7 potwierdził, że wtórne uszkodzenie RGC występuje w modelu uszkodzenia nerwu wzrokowego. Wykazali, że neurony, których aksony nie zostały uszkodzone po ostrym uszkodzeniu, ostatecznie ulegną degeneracji z powodu zwyrodnieniowego środowiska wytworzonego przez uraz otaczający te aksony. To wtórne zwyrodnienie wpływa na neurony w sposób postępujący, związany z ciężkością wyrządzonych szkód. Jak dotąd mechanizmy leżące u podstaw uszkodzenia RGC w jaskrze pozostają niejasne, zwłaszcza te związane z urazem wtórnym, co skutkuje niewystarczającym leczeniem klinicznym. 8,9,10 Dlatego konieczne jest zbadanie mechanizmów leżących u podstaw wtórnej degeneracji RGC podczas rozwoju jaskry. 11 Stworzenie zwierzęcych modeli wtórnych uszkodzeń, które mogą ilościowo ocenić wielkość, rozkład i mechanizm wtórnej degeneracji RGC, przyciąga coraz większą uwagę naukowców badających wtórne uszkodzenia RGC.
Aby wyjaśnić tę kwestię, Levkovitch-Verbin et al. stworzyli model PONT szczura.12 do oceny zwyrodnienia i śmierci RGC wywołanych uszkodzeniem aksonów. Uważa się, że model ten stanowi dobre narzędzie do badania mechanizmów wtórnej degeneracji i identyfikacji potencjalnych czynników neuroprotekcyjnych. Instrumentem używanym do generowania tego modelu wtórnego urazu jest diamentowy nóż ze skalą do ilościowego transektu poprzez ustawienie głębokości odcięcia za pomocą pokrętła tarczy, w celu zakończenia ilościowego przecięcia nerwu wzrokowego. Ścieżka chirurgiczna zbliża się od gałki ocznej w górę lub spojówki skroniowej. Podczas procesu operacyjnego siatkówka i nerwy wzrokowe mogą zostać dotknięte siłą kleszczy, co z kolei może spowodować pierwotne uszkodzenie. Co ważniejsze, ze względu na ograniczoną przestrzeń odsłoniętego nerwu wzrokowego, trudno jest oddzielić osłonkę opony mózgowej przed nacięciem. W związku z tym możliwe jest uszkodzenie naczyń ocznych podczas częściowego przecięcia nerwu wzrokowego, co skutkuje niedokrwieniem siatkówki i awarią modelu. Ponadto nóż diamentowy jest kosztowny, a każde użycie zmniejsza ostrość końcówki. To z kolei może wpłynąć na głębokość i efekt modelowania.
Model wtórnego zwyrodnienia RGC opisany w tym badaniu został uzyskany dzięki nowemu podejściu operacyjnemu z bocznej ściany oczodołu gałki ocznej. To nowatorskie podejście operacyjne zapewnia bezpośredni dostęp do nerwu wzrokowego zagałkowego otoczonego stożkiem mięśnia oczodołu, unikając pierwotnego uszkodzenia gałki ocznej i nerwu wzrokowego podczas ciągnięcia w dół lub w kierunku bocznej strony nosa gałki ocznej. Zwiększa to również przestrzeń operacji chirurgicznej podczas zakładania modelu i umożliwia izolację osłonki opony mózgowej przed częściowym przecięciem nerwu wzrokowego. Ważne jest, aby zauważyć, że nieumyślne zaangażowanie i uszkodzenie naczyń ocznych może prowadzić do awarii modelu. Co więcej, model umożliwia dalszą ocenę transfekowanych komórek, leków i odczynników na kikutu częściowo przeciętego nerwu wzrokowego. Samodzielnie zaprojektowany instrument chirurgiczny jest tani i może być używany wielokrotnie, co obniża koszty modelowania. Wykazano, że wtórny model uszkodzeń RGC opracowany tą metodą charakteryzuje się dobrą odtwarzalnością i stabilnością.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami (IACUC) Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Wszystkie narzędzia i roztwory chirurgiczne zostały wysterylizowane przed operacją, aby ograniczyć infekcję bakteryjną.
UWAGA: Protokół chirurgiczny składał się z pięciu części, a mianowicie: znieczulenia, podejścia chirurgicznego, oceny nerwu wzrokowego, zamknięcia i rekonwalescencji. Aby pomóc w częściowym ilościowym przecięciu nerwu wzrokowego, zaprojektowano nowe, niedrogie narzędzie chirurgiczne. Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone z zachowaniem zasad etycznych i techniki operacyjnej.
1. Technika chirurgiczna
- Przeprowadzanie doświadczeń z zastosowaniem techniki aseptycznej; protokoły dotyczące stosowania zwierząt powinny być specyficzne dla danej instytucji.
- Wysterylizować narzędzia i materiały (roztwory, substancje badane, znaczniki, igły itp.) mające kontakt z żywymi tkankami w celu zapobieżenia zakażeniu i niekorzystnemu wpływowi na dobrostan zwierząt, jak również potencjalnemu negatywnemu wpływowi na badanie.
2. Znieczulenie
- Znieczulenie szczurów SD za pomocą weterynaryjnego systemu parowania izofluranu. Do odparowania izofluranu należy użyć tlenu medycznego o szybkości 1 l/min. Umieść zwierzę w dołączonym pudełku anestezjologicznym i podawaj izofluran w stężeniu 4,5% aż do spowolnienia oddechu i uspokojenia zwierzęcia.
- Przełącz przepływ gazu na nasadkę maski przeciwgazowej i umieść zwierzę na stole operacyjnym. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 2% i monitorować znieczulenie. Większe zwierzęta (>300 g) mogą wymagać wyższego stężenia izofluranu. Monitorować znieczulenie podczas zabiegu, odpowiednio dostosowując dawkę izofluranu. Stale oceniaj głębokość i tempo oddychania oraz wykonuj ocenę szczypania palców u nóg co 5 minut, aby upewnić się, że nie ma głębokiego bólu.
- Po zakończeniu operacji należy wyłączyć izofluran i pozwolić zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut przed usunięciem ze stołu operacyjnego. Utrzymuj temperaturę ciała, przykrywając zwierzę kocem chirurgicznym i/lub używając regulowanego koca grzewczego podczas operacji.
3. Samodzielnie zaprojektowany instrument asysty chirurgicznej (SSAI)
- Użyj SSAI wykonanego ze stali nierdzewnej i składa się głównie z ręcznego drążka (długość, 100 mm; średnica, 9 mm) i rowkowanej głowicy (Rysunek 1). Rowkowana powierzchnia rowkowanej głowicy jest półokrągła, o pionowej głębokości, szerokości i długości odpowiednio 200 μm, 500 μm i 1,000 μm. Pomiędzy dwiema częściami znajduje się sekcja łącząca o długości 50 mm. Krawędź rowkowanej głowicy ma szerokość 300 μm.
UWAGA: Rowkowana powierzchnia umożliwia stabilizację brzusznego nerwu wzrokowego do przecięcia. Grzbietowy nerw wzrokowy jest wystawiony na zewnątrz rowka, gdy brzuszna strona nerwu wzrokowego leży w nim; Tymczasem grzbietowy nerw wzrokowy wystawiony na rowkowaną krawędź może zostać przecięty podczas wykonywania cięcia pionowego. Brzuszny nerw wzrokowy ułożony w rowkowanej powierzchni jest chroniony przez rowkowaną krawędź głowy. - Osiągnij pierwotne uszkodzenie w RGC odpowiadające ilościowo przeciętym aksonom nerwu wzrokowego (strona grzbietowa), podczas gdy wtórne uszkodzenie zostanie wykonane w RGC odpowiadających nieprzeciętym aksonom nerwu wzrokowego (strona brzuszna) bez bezpośredniego uszkodzenia.
4. Podejście chirurgiczne
- Połóż prawą stronę szczura do góry na stole operacyjnym z głową skierowaną w stronę chirurga. Wyreguluj prawy orbit w środku chirurgicznego pola widzenia. Następnie należy kilkakrotnie oczyścić obszar nacięcia wzdłuż bocznego kantu do zewnętrznego otworu akustycznego prawej skóry oczodołu, stosując 0,5% chlorheksydyny w 75% etanolu. Usuń futro między bocznym kantem a zewnętrznym otworem akustycznym za pomocą nożyczek do tęczówki.
- Wykonaj nacięcie skóry za pomocą nożyczek tęczówkowych wzdłuż bocznego kantu do zewnętrznego otworu akustycznego o długości od 0,5 do 1 cm. Następnie ściśnij powięź i pociągnij w górę, aby utworzyć trójkątny klin z kleszczami zębatymi 0,12 mm. Włóż dolne ostrze nożyczek sprężynowych Vannas w obszar nacięcia i rozetnij powięź w tym samym kierunku ścinania.
- Przetnij powięź nożyczkami sprężynowymi Vannas i odsłoń żyłę oczodołu. Użyj kleszczy z ostrymi ząbkami, aby zacisnąć boki żyły oczodołowej i tępo obu stronach nacięcia. Umieść żyłę oczodołową w kierunku chirurgicznym powierzchni mięśnia oczodołu, która jest ustawiona tak, aby ułatwić dalszą operację i uniknąć krwawienia z żyły oczodołowej związanego z operacją.
- Użyj nożyczek do tęczówki, aby rozciąć prawą boczną kantę wzdłuż linii nacięcia, aby w pełni odsłonić pole widzenia w celu rozwarstwienia mięśni oczodołu podczas obserwacji.
- Kontynuuj zaciskanie foldera mięśnia podpowięziowego oczodołu i tępienie oddzielaj pionowo w kierunku nacięcia skóry i powięzi. Rozdzielaj wzdłuż boków stopniowo, aby osiągnąć głębokość oczodołu, aż do pojawienia się tkanki tłuszczowej oczodołu.
- Po odsłonięciu tkanki tłuszczowej oczodołu zmień kierunek głowy szczura z pionowo skierowanej do chirurga na prawą stronę chirurga. W międzyczasie utrzymuj obszar stale wilgotny za pomocą wacików chirurgicznych lub bawełnianych zawierających sterylny PBS. Zabieg ten zapewnia wyraźne widzenie pola operacyjnego, jednocześnie utrzymując tkanki wilgotne i miękkie.
5. Dostęp do nerwu wzrokowego
- Odetnij oczodołowe tkanki tłuszczowe pokrywające stożek mięśnia oczodołu wokół nerwu wzrokowego w jamie oczodołu. Zapewnia to lepszą ekspozycję odpowiedniego podejścia chirurgicznego. Ogranicz resekcję tkanki tłuszczowej, aby uniknąć utrzymującego się krwawienia.
- Przetnij tkankę tłuszczową, odsłaniając boczny odbytnicę. Zaciśnij boczny odbytnik na zewnątrz, a następnie przetnij go nożyczkami sprężynowymi Vannas. Jeśli tkanka tłuszczowa pozostaje pod mięśniem prostym bocznym, podciągnij tłuszcz pokrywający nerw wzrokowy za pomocą kleszczy zębatych 0,12 mm i przetnij go nożyczkami sprężynowymi Vannas.
UWAGA: W tym czasie osłonka tkankowa wokół nerwu wzrokowego powinna być widoczna .
- Kontynuuj oddzielanie osłonki tkankowej wzdłuż kierunku nerwu wzrokowego w głębokości oczodołu, aż do całkowitego odsłonięcia nerwu wzrokowego. Utrzymuj obszar w czystości, używając wacików chirurgicznych do czyszczenia niewielkich ilości krwi, które powstają w wyniku usuwania tkanek.
UWAGA: Teraz nerw wzrokowy powinien być widoczny .
- Aby uzyskać do niego dostęp, usuń osłonkę opony mózgowo-rdzeniowej, która otacza nerw, nie uszkadzając tętnicy ocznej. Delikatnie obróć osłonę, aby zbadać wzór naczyniowy opony twardej przy dużym powiększeniu pod mikroskopem operacyjnym.
- Zidentyfikuj obszar pozbawiony naczyń krwionośnych i wykonaj podłużne cięcie opony twardej. 13 Rozerwij osłonę równolegle do kierunku nerwu wzrokowego za pomocą końcówki igły 26G lub ostrza noża szafirowej sondy chirurgicznej, unikając uszkodzenia układu krwionośnego bocznymi cięciami.
UWAGA: Jedyną pozostałością pokrywającą nerw powinna być błona pajęczynówkowa, która jest bardzo cienka i przezroczysta.
- Zidentyfikuj obszar pozbawiony naczyń krwionośnych i wykonaj podłużne cięcie opony twardej. 13 Rozerwij osłonę równolegle do kierunku nerwu wzrokowego za pomocą końcówki igły 26G lub ostrza noża szafirowej sondy chirurgicznej, unikając uszkodzenia układu krwionośnego bocznymi cięciami.
- Podobnie jak w kroku 5.2, delikatnie rozerwij błonę pajęczynówki za pomocą końcówki igły 26G lub ostrza noża szafirowej sondy chirurgicznej, równolegle do kierunku nerwu wzrokowego. 13
- Ułóż nerw wzrokowy w rowku instrumentu miękko i ostrożnie, tak aby grzbietowy nerw wzrokowy znajdował się nieco wyżej niż rowkowana krawędź głowy. W tym czasie przeciąć grzbietowy nerw wzrokowy powyżej krawędzi rowkowanej platformy głowy za pomocą końcówki igły 26G lub ostrza noża szafirowej sondy chirurgicznej, aby zakończyć częściową transsekcję nerwu wzrokowego.
6. Zamknięcie i odzyskanie
- Przesuń instrument nieco głębiej w kierunku pionowym nerwu wzrokowego, aby uwolnić ten ostatni. Następnie delikatnie zdejmij rowkowaną główkę instrumentu. Staraj się nie drapać mięśni oka ani innych tkanek, aby uniknąć dodatkowych uszkodzeń. Można zaobserwować kikut częściowego przecięcia nerwu wzrokowego.
- Wymień boczny odbyt, powięź i inne otaczające tkanki oka na ich pierwotne pozycje. Następnie zszyj kolejno warstwy mięśnia i skóry oczodołu. Jeśli krwawienie utrzymuje się, delikatnie wypełnij go wacikiem medycznym przed zamknięciem rany i utrzymuj go przez pewien czas. Nałóż maść z antybiotykiem na ranę, aby zapobiec infekcji.
- Wyłącz źródło izofluranu i pozwól zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut. W procesie reanimacji szczurów przygotuj izolację termiczną za pomocą podgrzewanej maty lub przykryj powierzchnię klatki suchą wyściółką. Przykryj zwierzęta kocami, aby zapewnić drożność dróg oddechowych szczurów podczas procesu rekonwalescencji.
- Zwierzęta domowe indywidualnie po operacji. Podawaj pooperacyjne leki przeciwbólowe zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez instytucjonalne organy opieki nad zwierzętami. Uważnie monitoruj zwierzęta po operacji.
Wyniki
Aby zweryfikować sukces w zakresie stworzenia modelu wtórnego urazu przy zastosowaniu nowej metody operacyjnej z użyciem SSAI (Rysunek 2A), komórki zwojowe siatkówki (RGC) poddano znakowaniu retrogradnemu bezpośrednio po ustanowieniu modelu. Celem tej procedury było retrogradne znakowanie RGC poprzez wstrzyknięcie barwnika śledzącego neurony (3% fluorofor (np., Fluorogold) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z fosforanem) do kolliculus superior (Rysunek 2B)Podejście to pozwala na powtarzalne znakowanie żywotnych komórek zwojowych siatkówki przy niewielkiej zmienności.14,15,16,17,18 Barwnik zostanie pobrany drogą retrogradną przez komórki zwojowe siatkówki (RGC), stanowiąc marker dla żywych RGC z aksonami, które nie zostały przecięte w prawym oku. Jednocześnie komórki RGC odpowiadające częściowo przeciętym aksonom nerwu wzrokowego w prawym oku nie mogły zostać znakowane barwnikiem śledzącym. (Rycina 2C)Jako oko kontrolne, w lewym oku nieoperowanym, wszystkie komórki zwojowe siatkówki (RGCs) wzdłuż nerwu wzrokowego zostały oznakowane barwnikiem Gold fluorescencyjnym w sposób retrogradny z ciała górnego. (Rysunek 2D).
Siedem dni po częściowym przecięciu nerwu wzrokowego i znakowaniu wstecznym komórek zwojowych siatkówki (RGC), siatkówki zostały pobrane, utrwalone, spłaszczone i zamontowane. Znakowane RGC obrazowano pod mikroskopem fluorescencyjnym w określonych obszarach siatkówki. Wyniki obrazowania RGC znakowanych fluorescencyjnie z częściowym przecięciem nerwu wzrokowego lub bez niego przedstawiono na Rysunku 3. Tylko RGC w prawej siatkówce, odpowiadające nieprzeciętej części nerwu wzrokowego, zostały znakowane fluorescencyjnym złotem, a wyraźna granica między nieznakowanymi a znakowanymi RGC była widoczna (Rysunek 3A, Rysunek 3B), co potwierdziło częściowe przecięcie nerwu wzrokowego. W oku kontrolnym wszystkie RGC siatkówki lewego oka wykazywały fluorescencję (Rysunek 3C, Rysunek 3D).
Aby ocenić, czy naczynia krwionośne wokół głowy nerwu wzrokowego oraz tętnica oczna dostarczająca krew do siatkówki zostały uszkodzone lub zaburzone podczas operacji, wykonano obrazowanie dna oka prawego oka przed i po zabiegu. Obrazy przedstawiały ukrwienie prawego oka (oka operowanego) przed operacją oraz 1 godzinę po niej. Przepływ krwi w tętnicach był prawidłowy. Nie zaobserwowano niedrożności żył. Wyniki te wskazały, że podczas operacji nie doszło do uszkodzenia układu krwionośnego (Rycyna 4A, Rycyna 4B). W związku z tym pomyślnie opracowano model wtórnej degeneracji komórek zwojowych siatkówki (RGCs).
Rycina 1Fotografie autorskiego instrumentu wspomagającego chirurgicznie, SSAI. (A) Widok panoramiczny instrumentu chirurgicznego składającego się z dwóch głównych części: uchwytu oraz żłobionej głowicy. Pomiędzy nimi znajduje się sekcja przegubowa o długości 50 mm. Długość uchwytu wynosi 100 mm, a jego średnica 9 mm. (B) Cecha rowka SSAI. Powierzchnia rowkowana głowicy jest półkolista, co umożliwia umieszczenie w niej nerwu wzrokowego i jego stabilizację przed przecięciem. Powierzchnia rowkowana posiada głębokość pionową wynoszącą 200 µm o szerokości 500 µm i długość wynosząca 1,000 µmSzerokość krawędzi wyżłobionej głowicy wynosi 300 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie znakowania RGC w siatkówce po częściowym przecięciu prawego nerwu wzrokowego przy użyciu autorskiego instrumentu wspomagającego operację (SSAI) oraz wstecznego znakowania wzgórka górnego fluoroforem. (A) Widok chirurgiczny częściowego przecięcia prawego nerwu wzrokowego u szczurów z użyciem autorskiego instrumentu wspomagającego operację (SSAI). (B) Po stworzeniu modelu, RGC zostały znakowane wstecznie poprzez wstrzyknięcie barwnika śledzącego neurony (kolor żółty, 3% fluoroforu w sterylnym roztworze soli fosforanowej PBS) do wzgórka górnego w mózgu. Ponieważ aksony RGC znajdują się we wzgórku górnym, barwnik śledzący jest pobierany przez RGC w sposób wsteczny i stanowi marker dla żywych komórek. Przekrój poprzeczny na rycinie przedstawia przekrój nerwu wzrokowego. OD, oko operowane; OS, oko kontrolne bez operacji. W części (C) tylko RGC odpowiadające nieprzeciętej części nerwu wzrokowego zostały znakowane fluoroforem. Kolor niebieski reprezentuje nieprzecięte brzuszne nerwy wzrokowe i odpowiadające im RGC w siatkówce; kolor czerwony odzwierciedla częściowo przecięte grzbietowe nerwy wzrokowe i odpowiadające im RGC w siatkówce. (D) Wszystkie siatkówkowe RGC lewego oka (oka kontrolnego) bez procedury chirurgicznej zostały znakowane barwnikiem. Nerwy wzrokowe grzbietowe i brzuszne również zostały w całości znakowane barwnikiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Mikrofotografie epifluorescencyjne całej siatkówki z RGC znakowanymi fluorophorem 7 dni po ustanowieniu modelu częściowego przerwania nerwu wzrokowego oraz znakowanie wsteczne wzgórka górnego. Przedstawiono również odpowiadające im schematy obszarów RGC w siatkówce barwionych Fluorogold. (A) i (C) przedstawiają schematy RGC w siatkówce prawego (operowanego) i lewego (kontrolnego) oka po znakowaniu fluorophorem. Kolor żółty oznacza obszar znakowany fluorescencyjnym barwnikiem gold. Siatkówka jest podzielona na części grzbietową, brzuszną i centralną. (B) i (D) przedstawiają mikrofotografie epifluorescencyjne całej siatkówki uzyskane pod mikroskopem fluorescencyjnym; kolor żółty reprezentuje obszar RGC znakowanych fluorophorem. W oku operowanym (prawe oko) pokazanym w B, nieznakowany obszar odpowiada RGC powiązanym z częściowo przerwanym nerwem wzrokowym, głównie po stronie grzbietowej siatkówki. Obszar znakowany fluorescencyjnym barwnikiem gold to obszar RGC odpowiadający nieprzerwanemu nerwowi wzrokowemu, skoncentrowany głównie w częściach centralnej i brzusznej siatkówki. Granica między obszarami nieznakowanych i znakowanych RGC jest wyraźna. Pierwotna degeneracja ciał RGC byłaby ograniczona do grzbietowej części siatkówki, a całkowita utrata ciał RGC w częściach centralnej i brzusznej siatkówki mogłaby być przypisana degeneracji wtórnej. (D) Mikrofotografia całej siatkówki lewego oka po znakowaniu RGC fluorophorem. RGC lewego oka kontrolnego, w którym nie wykonano procedury chirurgicznej, zostały całkowicie zabarwione fluorophorem. Paski skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Przedoperacyjne i pooperacyjne obrazy dna oka prawego otrzymane za pomocą kamery dna oka. (A) Obraz dna oka przed operacją prawego oka u szczurów, wykazujący dobre ukrwienie dna oka, wypełnienie tętnicze oraz brak zastoju lub niedrożności żylnej, co wskazuje na sprawny system ukrwienia siatkówki. (B) Obraz dna oka prawego 1 godzinę po operacji. W porównaniu z przedoperacyjnym obrazem dna oka nie zaobserwowano istotnych zmian w ukrwieniu siatkówki, co wskazuje, że system ukrwienia gałki ocznej nie został naruszony podczas procesu modelowania. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Fotografie nerwu wzrokowego za gałką oczną oraz tętnicy ocznej zlokalizowanej na pochewce oponowej, wykonane podczas podejścia chirurgicznego. Po całkowitym usunięciu docelowego odcinka nerwu wzrokowego odsłonięto tętnicę oczną (grot strzałki), przebiegającą wraz z pochewką oponową nerwu wzrokowego i równolegle do niego. Paski skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Schemat lokalizacji degeneracji pierwotnej i wtórnej w nerwie wzrokowym. Częściowe nacięcie nerwu wzrokowego wykonano przy użyciu autorskiego instrumentu wspomagającego operację (grot strzałki). Aksony w miejscach bezpośrednio uszkodzonych (grzbietowa strona nacięcia nerwu wzrokowego w przekroju poprzecznym, kolor szary) ulegają degeneracji pierwotnej, natomiast te w miejscach uszkodzonych pośrednio (obszary centralne i brzuszne nerwu wzrokowego w przekroju poprzecznym, kolor żółty) ulegają degeneracji wtórnej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Procedura operacyjna
Jest kilka punktów, na które warto zwrócić uwagę w procesie budowy modelu. W kroku 4.2 ruch chirurgiczny powinien być wykonywany ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia układu krwionośnego powyżej mięśnia podpowięziowego. Szczególnie podczas przecinania powięzi podskórnej w zewnętrznej powięzi bocznej należy użyć kleszczyków z ostrymi ząbkami, aby podciągnąć w pionie powięź podskórną na powierzchni powięzi; powięź należy przeciąć nożyczkami sprężynowymi Vannas, aby uniknąć uszkodzenia żyły oczodołowej na zewnętrznym kancie, co może skutkować uszkodzeniem modelu przez nadmierne krwawienie. Krok 4.3 ma tę zaletę, że potencjalnie zapobiega krwawieniu podczas bezpośredniego usuwania z naczyń krwionośnych. Podczas oddzielania mięśni oczodołu w kroku 4.5 powodem, dla którego wybiera się kleszcze z ostrymi ząbkami, ale nie nożyczki sprężynowe Vannas, jest uniknięcie ciągłego krwawienia i krwotoku. Mięśnie są tępo oddzielone po obu stronach w kierunku prostopadłym do nacięcia powięzi skórnej; Tymczasem mięśnie głębokie oczodołu są rozciągnięte na zewnątrz i obwodowo. Zabieg ten ujawni głębsze części jamy oczodołu, zapewniając większe okno chirurgiczne i umożliwiając niezakłócony dostęp do tkanek pokrywających nerw wzrokowy. W powyższych zabiegach, jeśli dojdzie do krwawienia, należy zastosować ucisk za pomocą sterylnych wacików chirurgicznych lub bawełnianych. Dzięki tej procedurze niewielkie krwawienie ustanie po kilku sekundach. Celem kroku 4.6 jest ułatwienie dalszych operacji w celu łatwego usunięcia części tłuszczu i oddzielenia mięśni w stożku mięśnia oczodołu w celu odsłonięcia nerwu wzrokowego wzdłuż kierunku nerwu wzrokowego w głębokości oczodołu.
Najbardziej krytycznymi częściami obecnego protokołu są kroki 5.1-5.6. Ważne jest, aby nie uszkodzić układu krwionośnego wokół głowy nerwu wzrokowego. Nerw wzrokowy powinien być częściowo przecięty co najmniej 1,5-2,0 mm od tylnej części oka, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy ocznej, która przenika do nerwu w odległości 1 mm od oka i dostarcza krew do wewnętrznej siatkówki. Celem przecięcia odbytnicy bocznej jest uzyskanie lepszej ekspozycji nerwu wzrokowego, ponieważ boczny odbytnik prosty jest szeroki i oczywiście blokuje widok nerwu wzrokowego. Tymczasem, aby uniknąć usunięcia tętnicy ocznej, która jest związana z osłonką opony mózgowej (ryc. 5), konieczne jest oddzielenie i dysocjacja opony twardej wokół nerwu wzrokowego oraz zbadanie wzoru naczyniowego osłonki opony mózgowej, używając kleszczy do delikatnego obracania osłonki. Ponadto należy zidentyfikować obszar pozbawiony naczyń krwionośnych, umożliwiający podłużne nacięcie w osłonce opony mózgowej. Konieczne jest również zachowanie niewielkiej odległości roboczej od tylnej części oka, aby uniknąć części opony twardej, która jest ściśle związana z tętnicą oczną. Siatkówka jest normalnie przezroczysta, a naczynia krwionośne mogą być wyraźnie odgraniczone. W przypadku uszkodzonego ukrwienia siatkówki dochodzi do degeneracji, co prowadzi do mlecznobiałego wyglądu kłaczków. Komora ciała szklistego oka i soczewka zazwyczaj również stają się mętne, a z czasem zmniejsza się rozmiar oka. W tym badaniu zdjęcia przedoperacyjne i pooperacyjne dna oka nie potwierdziły uszkodzeń ukrwienia dna oka w modelu po zastosowaniu powyższych kroków.
Ponadto w kilku krokach tego modelu wymagana jest szczególna ostrożność. Używając kleszczyków z ostro zakrzywionymi ząbkami lub innych narzędzi chirurgicznych do odsłonięcia nerwu wzrokowego, chirurg powinien unikać nadmiernej siły, ponieważ może to uszkodzić nerw wzrokowy, gałkę oczną lub tętnicę oczną, powodując uraz pierwotny i niedokrwienie siatkówki. Ponadto naczynia krwionośne otaczające oko nie powinny być uszkodzone, aby uniknąć utrzymującego się krwawienia, które mogłoby doprowadzić do niepowodzenia modelowania. SSAI użyte w tym eksperymencie wymaga delikatnego użytkowania. Gdy nerw wzrokowy jest umieszczony w rowku instrumentu, nerw wzrokowy i rowkowana powierzchnia muszą być ściśle dopasowane, aby zapewnić dobrą spójność i powtarzalność każdego modelu zwierzęcego. Przy odrobinie wprawy pełny zabieg chirurgiczny można wykonać w ciągu 15-20 minut na oko, po wykonaniu wstępnych nacięć wejściowych.
Wang i wsp.19 opublikowało podobny model zwierzęcy częściowego przecięcia nerwu wzrokowego ustalonego przy użyciu amputatora ilościowego nerwu wzrokowego. Zabiegi chirurgiczne obejmują: 1) Rozcięcie zewnętrznej kantu, zawieszenie i zamocowanie powieki górnej; 2) Badanie nerwu wzrokowego i przecięcie górnej części nerwu wzrokowego za pomocą amputatora; oraz 3) Szycie spojówki i skóry. Chociaż zabieg chirurgiczny był stosunkowo prosty, podczas operacji napotkano następujące problemy. Chociaż boczne nacięcie kantu mogło odsłonić pewną przestrzeń do operacji, istniała nieunikniona potrzeba ciągłego rozciągania gałki ocznej w celu odsłonięcia osłonki nerwu wzrokowego zagałkowego, zwłaszcza gdy chirurdzy chcieli odsłonić dłuższą osłonkę nerwu wzrokowego zagałkowego, aby ułatwić dalszą izolację osłonki; Siła potrzebna do rozciągnięcia gałki ocznej była większa, co może spowodować bezpośrednie uszkodzenie trakcji gałki ocznej i nerwu wzrokowego. Nie zwrócono szczególnej uwagi na naczynia krwionośne, które mogą zostać przecięte razem z osłonką nerwu wzrokowego, a uszkodzenie naczyń krwionośnych może prowadzić do nieudanego ustanowienia modelu. Główne procedury modelu wtórnego urazu opisanego w tym artykule to: nowe podejście operacyjne od bocznej ściany oczodołu gałki ocznej w celu bezpośredniego dostępu do nerwu wzrokowego zagałkowego otoczonego stożkiem mięśnia oczodołu, unikając pierwotnego uszkodzenia gałki ocznej i nerwu wzrokowego, podczas ciągnięcia w dół lub w kierunku bocznej strony nosa gałki ocznej. To nowe podejście operacyjne zwiększa przestrzeń operacji chirurgicznej podczas modelowania i umożliwia łatwą izolację osłonki opony mózgowej, która jest ściśle związana z tętnicą oczną, przed częściowym przecięciem nerwu wzrokowego. Częściową transsekcję nerwu wzrokowego wykonano za pomocą samodzielnie zaprojektowanego narzędzia chirurgicznego, które jest opłacalne i wielokrotnego użytku, co obniża całkowity koszt modelowania. Struktura oczodołu szczura różni się od budowy innych ssaków, z orbitą najbliższą kantu i bez struktury kostnej, ale pokrytą mięśniami. Dostęp chirurgiczny mógłby dotrzeć do tylnej części gałki ocznej bez konieczności niszczenia kości oczodołu i okostnej. Dzięki ścisłej dezynfekcji przedoperacyjnej i pooperacyjnej profilaktyce antybiotykowej infekcje, stany zapalne i obrzęki zostały znacznie zmniejszone.
Samodzielnie zaprojektowany instrument asystenta chirurgicznego
Szczurzy model częściowego przecięcia nerwu wzrokowego został ustalony przy użyciu samodzielnie zaprojektowanego instrumentu asystenta chirurgicznego, którego główne cechy są następujące. Może pomóc w częściowym ilościowym przecięciu nerwu wzrokowego wystawionego na rowkowaną krawędź, zapewniając również spójność transsekcji między różnymi zwierzętami. Przetestowaliśmy i zweryfikowaliśmy powtarzalność ustalania modeli za pomocą SSAI. Maksymalny współczynnik zmienności wynosił 1,85%, przy średniej wartości 0,67%±0,44%. 20 Wyniki te wskazują, że SSAI może być wykorzystany do ustanowienia modeli częściowej transsekcji nerwu wzrokowego, z zadowalającą odtwarzalnością i jednorodnością.
Szerokość rowkowanej powierzchni i konstrukcja półkola wewnętrznej powierzchni rowka mogą mieć bardziej stały wpływ na nerw wzrokowy i sprawić, że rowkowana powierzchnia i nerw wzrokowy przylegają mocniej, zmniejszając również błędy eksperymentalne i działania niepożądane. Rowkowana krawędź pozwala na lepszą ochronę nerwu wzrokowego w rowku podczas operacji, co nie uszkodzi nerwu wzrokowego w rowku, niezależnie od ostrości frezu. Kolejną zaletą rowkowanej krawędzi jest zapobieganie urazom zgnieceń podczas przecięcia nerwu wzrokowego.
Nadaje się do pracy w głębokiej i wąskiej przestrzeni. Chociaż nowe podejście operacyjne zostało rozszerzone, ścieżka pozostaje głęboka, a ręczny drążek i sekcja stawowa mogą być używane do łatwego umieszczenia rowkowanej głowy pod osłonką nerwu wzrokowego w celu wykonania dalszych operacji. Gdy przyrząd jest używany do pracy, do przecięcia można użyć szerokiej gamy frezów, np. końcówki igły 26 G. Można wybrać nawet szafirowy nóż do sondy chirurgicznej, aby uniknąć kontuzji i zmiażdżeń spowodowanych nożyczkami. Powierzchnie rowków mogą być wykonane na różnych głębokościach pionowych, aby wykonać różne stopnie cięcia nerwu wzrokowego.
W porównaniu z amputatorem Wanga i wsp., SSAI ma prostszą strukturę. Ponadto etap cięcia jest wygodniejszy przy użyciu SSAI, z lepszą spójnością i powtarzalnością modelu zwierzęcego. Wreszcie, zakres narzędzi mających zastosowanie do cięcia za pomocą SSAI jest również szerszy. Podsumowując, SSAI, który wykonuje ilościowe i jednolite nacięcia nerwu, może służyć jako skuteczny instrument do tworzenia modeli szczurzych do oceny przecięcia nerwu wzrokowego.
Charakterystyka modelu częściowej transsekcji nerwu wzrokowego szczura
Model częściowej transsekcji nerwu wzrokowego jest przydatny do oceny wtórnego zwyrodnienia w RGC. Potencjalną zaletą tego modelu jest możliwość dokładnego oddzielenia zwyrodnienia pierwotnego od wtórnego in situ, zarówno w nerwie wzrokowym, jak i siatkówce. Centralny i brzuszny nerw wzrokowy były bardziej podatne na wtórne uszkodzenie po częściowym przecięciu (około 1/3 do 1/2) grzbietowego nerwu wzrokowego (ryc. 6). W siatkówce regionalne umiejscowienie pierwotnych i wtórnych uszkodzeń RGC powinno być oparte na topografii nerwu wzrokowego odpowiadającego RGC siatkówki po częściowym przecięciu. Jeśli cała siatkówka szczura jest podzielona na część grzbietową (górną) i brzuszną (dolną), urazy wtórne i pierwotne są obecne w obu częściach. Jednak w oparciu o związek między RGC na siatkówce a aksonem nerwu wzrokowego, śmierć RGC w brzusznej siatkówce powinna być głównie przypisywana wtórnemu uszkodzeniu (ryc. 3). 12,22,23 Do zalet tego modelu należą: prosty i łatwy w obsłudze instrument ze standardowymi procedurami; brak wpływu na naczynia oczne; dobra odtwarzalność i stabilność. Technika ta może być wykorzystana do transfekcji RGC z tego oszczędzającego miejsce podejścia operacyjnego poprzez zastosowanie krótkich interferujących RNA (siRNA), plazmidów i wektorów wirusowych do częściowego kikuta nerwu wzrokowego; Ponadto odczynniki można umieścić na częściowym kikutu nerwu wzrokowego w celu selektywnego leczenia lub znakowania RGC.
Ogólnie rzecz biorąc, pierwotne i wtórne uszkodzenia RGC współistniały po częściowym przecięciu nerwu wzrokowego w tym modelu zwierzęcym, z wyraźną granicą w siatkówce między tymi dwoma typami urazów. Chociaż związek aksonów nerwu wzrokowego z lokalizacją RGC na siatkówce wymaga dalszych badań w celu dokładniejszego rozróżnienia, to oszczędzające miejsce podejście operacyjne rozszerza zakres zastosowania modelu i pozwala naukowcom badać mechanizmy wtórnego uszkodzenia w RGC w nowy sposób.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (7152038), Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Uniwersytetów Uniwersytetu Środkowo-Południowego (2016zzts162) oraz Fundację Badań Naukowych Aier Eye Hospital Group (Grant No. AF156D11). Na koniec Fancheng Yan dziękuje Yiping Xu za nieocenione wsparcie przez te wszystkie lata.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System respiratora do znieczulenia zwierząt | MIDMARK | Matrx VMR | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
| Mikroskop chirurgiczny | Leica AG, Heerbrugg, Szwajcaria | M620 F20 | |
| Tobramycyna Maść do oczu | Alcon | H20110312 | |
| Fluorogold | Biotium | 80014 | |
| Nożyczki do irysa | 66vision Co. | 54026 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannas | 66vision Co. | 54137B | |
| Kleszcze ząbkowane ostro/Kleszczyki zębate 0,12mm | 66vision Sp. z o.o. | 53329A | |
| Kleszcze o ostrym łuku | 66vision Co. | 53324A Szafirowa sonda | |
| chirurgiczna | 66vision Co. | 50205TA | |
| 26G końcówka igły | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | ||
| 10 μ l Strzykawka Hamiltona | Hamilton Co. | 80030 | |
| 5-0 szew niewchłanialny | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
| Chlorheksydyna | Sigma-Aldrich | 282227 | |
| Aparat do stereotaksji | RWD Life Science Co. | 68026 | |
| System obrazowania siatkówki | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
| System obrazowania szerokokątnego RetCamII | Clarity Medical Systems, Inc. | RetCamII | |
| Leica Microsystems Inc. | Zobacz materiał DM6000 |
Bibliografia
- Stoica, B. A., Faden, A. I. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 7 (1), 3-12 (2010).
- Hausmann, O. N. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord. 41 (7), 369-378 (2003).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guimaraes, J. S., et al. Mechanisms of secondary degeneration in the central nervous system during acute neural disorders and white matter damage. Rev Neurol. 48 (6), 304-310 (2009).
- Stewart, S. S., Appel, S. H. Trophic factors in neurologic disease. Annu Rev Med. 39, 193-201 (1988).
- Brubaker, R. F. Delayed functional loss in glaucoma. LII Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol. 121 (5), 473-483 (1996).
- Yoles, E., Schwartz, M. Degeneration of spared axons following partial white matter lesion: implications for optic nerve neuropathies. Exp Neurol. 153 (1), 1-7 (1998).
- Nickells, R. W. From ocular hypertension to ganglion cell death: a theoretical sequence of events leading to glaucoma. Can J Ophthalmol. 42 (2), 278-287 (2007).
- Doucette, L. P., Rasnitsyn, A., Seifi, M., Walter, M. A. The interactions of genes, age, and environment in glaucoma pathogenesis. Surv Ophthalmol. 60 (4), 310-326 (2015).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Rokicki, W., Dorecka, M., Romaniuk, W. Retinal ganglion cells death in glaucoma--mechanism and potential treatment. Part II. Klin Oczna. 109 (7-9), 353-355 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. A model to study differences between primary and secondary degeneration of retinal ganglion cells in rats by partial optic nerve transection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (8), 3388-3393 (2003).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. J Vis Exp. (51), (2011).
- Yoles, E., et al. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (13), 3586-3591 (1992).
- Fisher, J., et al. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21 (1), 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
- Li, Y., et al. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. J Clin Invest. 118 (3), 913-923 (2008).
- Tang, Z., et al. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. J Exp Med. 207 (4), 867-880 (2010).
- Wang, X., Li, Y., He, Y., Liang, H. S., Liu, E. Z. A novel animal model of partial optic nerve transection established using an optic nerve quantitative amputator. PLoS One. 7 (9), e44360(2012).
- Yan, F. C., Li, S. N., Liu, K. G., Lu, Q. J., Wang, N. L. The establishment of a rat partial optic nerve transection model and assessment of its reproducibility. Ophthalmology in China. 22 (1), 34-37 (2013).
- Fitzgerald, M., et al. Secondary degeneration of the optic nerve following partial transection: the benefits of lomerizine. Exp Neurol. 216 (1), 219-230 (2009).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. J Neurotrauma. 27 (11), 2107-2119 (2010).
- Li, H., et al. Lycium barbarum (wolfberry) reduces secondary degeneration and oxidative stress, and inhibits JNK pathway in retina after partial optic nerve transection. PLoS One. 8 (7), 68881(2013).
Przedruki i uprawnienia
