Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56278

⸱

6 września 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, and the Center for Kidney Research and Therapeutics at the Feinberg Cardiovascular Research Institute, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Surgery-Organ Transplantation, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3School of Biological Sciences and Medical Engineering, Southeast University

W tym artykule

Podsumowanie

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Streszczenie

W transplantacji narządów, funkcja i długowieczność przeszczepu są w decydującym stopniu uzależnione od skuteczności kontrolowania immunologicznej reaktywności odrzucenia przeciwko ludzkim antygenom leukocytarnym (HLA). Wytyczne dotyczące zgodności tkankowej opierają się na testach laboratoryjnych odporności anty-HLA, która objawia się istniejącymi wcześniej lub wytworzonymi de novo przeciwciałami HLA, które stanowią główną barierę po przeszczepie. Obecne testy są zbudowane na platformie z pojedynczymi kulkami antygenowymi (SAB) przy użyciu stałego zestawu ~100 wstępnie wybranych rekombinowanych antygenów HLA do sondowania surowic transplantacyjnych. Jednak u ludzi istnieje znacznie większa różnorodność typów HLA, przy czym nie ma dwóch osobników poza bliźniętami jednojajowymi, które mogą dzielić tę samą kombinację sekwencji HLA. Podczas gdy zaawansowane technologie typowania HLA i sekwencjonowania bezpośredniego mogą precyzyjnie uchwycić wszelkie niezgodności w sekwencji DNA między HLA dawcy i biorcy, test SAB, ze względu na ograniczoną różnorodność reprezentacji sekwencji, nie jest w stanie precyzyjnie wykryć alloprzeciwciał specyficznie przeciwko niedopasowaniom HLA dawcy. Staraliśmy się opracować komplementarną metodę wykorzystującą inną technologię do wykrywania i charakteryzowania przeciwciał HLA przeciwko donorom w sposób spersonalizowany. Narzędzie do badań przesiewowych to niestandardowa matryca peptydowa sekwencji pochodzących z HLA dawcy do sondowania surowicy biorcy narządu po przeszczepie w celu oceny ryzyka odrzucenia za pośrednictwem przeciwciał. Na pojedynczej macierzy dla jednej pary dawca-biorca wytwarza się do 600 unikalnych peptydów w oparciu o sekwencje białka HLA dawcy, przy czym każdy peptyd zawiera co najmniej jedną niedopasowaną resztę w sekwencji 15-aminokwasowej. W naszych eksperymentach pilotażowych mających na celu porównanie wzorców antygenowych dla surowic przed i po przeszczepie na tych matrycach, byliśmy w stanie wykryć sygnały anty-HLA z rozdzielczością, która pozwoliła nam również wskazać zaangażowane epitopy immunologiczne. Te spersonalizowane macierze antygenowe umożliwiają wykrywanie w wysokiej rozdzielczości epitopów HLA specyficznych dla dawcy w przeszczepach narządów.

Wprowadzenie

Terapia wymiany narządów, która jest rutynowo przeprowadzana na całym świecie, uratowała miliony istnień ludzkich. Przeszczepy narządów litych dochodzi rocznie u około 100 pacjentów na milion mieszkańców w USA, podczas gdy większa liczba nadal znajduje się na listach oczekujących na przyjęcie narządów od dawców z powodu poważnego niedoboru dostaw (zgodnie z informacjami dostarczonymi przez Sieć Pozyskiwania i Przeszczepiania Narządów - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Przeszczepianie narządów podlega ścisłym regulacjom w celu ograniczenia marnotrawstwa narządów i ratowania życia, ale narzędzia naukowe wykorzystywane do informowania o tych przepisach są ograniczone pod względem skuteczności. Na przykład społeczność naukowa w pełni uznaje wysoce polimorficzne stany cząsteczek HLA, a dokładne testy genetyczne DNA wykorzystujące typowanie w wysokiej rozdzielczości i typowanie oparte na sekwencjach (SBT) zostały opracowane w ostatnich latach1,2. Jednak metody testowania alloprzeciwciał nie były jeszcze w stanie wytworzyć tak różnorodnych pojedynczych sekwencji HLA w postaci sond antygenowych. Standardowy test wykorzystuje obecnie niezmienny panel ~100 antygenów allelicznych, które składają się z powszechnych wariantów sekwencji HLA, A, B, C, DQ, DP i DR w populacjach ludzkich3,4,5,6. Często sekwencje HLA rzeczywistego dawcy nie są uwzględniane w panelu testowym, co zmusza lekarzy transplantologów i chirurgów do wnioskowania o reaktywności specyficznej dla dawcy na podstawie wspólnych podobieństw między rzeczywistymi sekwencjami dawcy a odpowiadającymi im "standardami" w zestawie testowym7,8. W związku z tym czasami trudno jest dokonać wiarygodnego oszacowania ryzyka odrzucenia na podstawie wyników testów na przeciwciała9,10,11,12. W związku z tym pilnie potrzebne są nowe, personalizowane testy na alloprzeciwciała13,14.

Geny HLA kodują receptory głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), które pełnią kluczową funkcję w odpowiedziach immunologicznych6. Geny HLA są znane jako najbardziej polimorficzne geny ludzkiego genomu6. Ze względu na szybki postęp w strategiach sekwencjonowania DNA dla genów HLA, nowe warianty alleli (lub po prostu określane jako allele) są odkrywane w gwałtownym tempie15,16. Do marca 2017 r. 16 755 zweryfikowanych alleli zostało zdeponowanych w bazie danych IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), z czego 12 351 należało do grupy I, a 4 404 do grupy II. W przeciwieństwie do tego, tylko nieco ponad 100 odrębnych alleli jest reprezentowanych w standardowym teście kulek pojedynczego antygenu (SAB), który jest rutynowo stosowany do wykrywania alloprzeciwciał w przeszczepach narządów. Metoda SAB zbudowana jest na platformie Luminex z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Ponieważ test wykorzystuje niezmienny zestaw antygenów, poza niewielkimi zmianami w produkcji między partiami, test surowicy antysurowicy może być solidnie ustandaryzowany wśród osób i laboratoriów5. Jednak ten test nie jest w stanie wychwycić wszystkich alloprzeciwciał opracowanych specjalnie przeciwko allelom dawcy, szczególnie gdy sekwencje dawcy są nieobecne w zestawie SAB. Chociaż pożądana jest niestandardowa produkcja antygenów dawców w oparciu o prawdziwe sekwencje, nadal istnieją wyzwania techniczne związane z usprawnieniem niezbędnych procedur produkcji i testowania.

Niedawno opisaliśmy alternatywną metodologię w studium wykonalności u osób po przeszczepie nerki17. W metodzie wykorzystano antygeny peptydowe w formacie matrycowym do sondowania surowic przed i po przeszczepie u poszczególnych osób. Każda tablica została zbudowana przy użyciu metody syntezy SPOT18,19,20,21,22,23, która wytwarza antygeny peptydowe, każdy o długości 15 aminokwasów, całkowicie oparte na allelach HLA odpowiedniego dawcy narządów A, B, C, DQA1, DQB1 i DRB1. Synteza SPOT odbywa się na membranie celulozowej przy użyciu standardu Fmoc-chemistry22 i może wytwarzać setki niestandardowych peptydów równolegle z w pełni zautomatyzowanym systemem robotycznym19,21. Układ membranowy może wytrzymać wiele rund cykli usuwania i ponownego sondowania. W naszym retrospektywnym badaniu17, wykryliśmy zmiany we wzorcach antygenów z przechowywanymi surowicami odpornościowymi przeszczepu zebranymi w szeregu czasowym (tj. przed i po przeszczepie). W niniejszym dokumencie opisujemy protokół techniczny dotyczący przepływu pracy, w tym projektowania matrycy, produkcji, sondowania surowicy i analizy wyników. Metoda ta jest przeznaczona do wykrywania alloprzeciwciał przeciwko specyficznym liniowym epitopom w cząsteczkach HLA dawców po przeszczepach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Northwestern University Institutional Review Board (protokół IRB#: STU00104680). Ogólny przebieg pracy protokołu jest zilustrowany na Rysunek 1.

1. Bioinformatyczna analiza sekwencji HLA dawcy i biorcy

  1. Pobierz sekwencje z bazy danych IMGT/HLA15.
    1. Uzyskaj raporty typowania HLA zarówno od dawcy narządu, jak i jego biorcy.
      UWAGA: Upewnij się, że stosowane są odpowiednie procedury ochrony poufnej dokumentacji medycznej. Zazwyczaj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej IRB wymagane jest zatwierdzenie protokołu badania lub testu eksperymentalnego przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB). Jeśli raporty HLA pochodziły z typowania opartego na PCR (o wysokiej lub niskiej rozdzielczości) lub typowania opartego na sekwencjonowaniu (SBT), przejdź bezpośrednio do kroku 1.1.3. Jeśli sekwencje uzyskano z sekwencjonowania genomowego/HLA i jeśli są one kompletne, należy użyć tych sekwencji bezpośrednio. Czasami, gdy dostępne są tylko niekompletne wyniki pisania na klawiaturze lub sekwencjonowania, wykonaj dodatkowy krok 1.1.2. , aby przypisać "brakujące" allele za pomocą narzędzia internetowego opisanego w kroku 1.1.2.
    2. Otwórz następujące kombinacje niejednoznacznych alleli - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html i wyszukaj za pomocą funkcji "Narzędzie do wyszukiwania niejednoznacznych kombinacji alleli", aby pobrać hipotetyczne allele. Następnie przejdź do kroku 1.1.3. , aby wprowadzić nazwę allelu.
    3. Otwórz formularz zapytania o allele IMGT/HLA pod następującym linkiem internetowym - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html, a następnie wprowadź nazwy alleli podmiotu (każdy z osobna, jak pokazano w Rysunek 2) w polu "Wyszukaj". Kliknij przycisk "Wyszukaj allele teraz". Nazwy alleli HLA powinny używać standardowych systemów nazewnictwa (tj. A*, A*01, A*01:01:01 i wszelkie wcześniejsze oznaczenia, takie jak A*01010101).
    4. Znajdź pasującą nazwę allelu wyświetlaną na ekranie. Kliknij przycisk alleli.
    5. Skopiuj "Sekwencję białka" i wklej ją do dokumentu tekstowego pod wierszem nagłówka ">nazwa allelu". W efekcie dokument tekstowy jest w formacie FASTA (FAST-ALL) nazwy i sekwencji alleli.
  2. Wykonaj oparte na genach wielokrotne dopasowania alleli dawcy i biorcy/pacjenta.
    1. Jeden gen (tj. DQB1*03:01:01:01) na raz, skopiuj i wklej wszystkie cztery allele sekwencji FASTA dawcy i pacjenta (dwa od dawcy i dwa od pacjenta) do połączonego dokumentu tekstowego. W tym momencie ważne jest, aby odróżnić nazwy alleli dawcy od nazw alleli pacjenta (opcje obejmują różnicowanie wielkich i małych liter; lub utworzenie wyróżniającego rozszerzenia przedrostka lub sufiksu do każdej nazwy allelu, aby oddzielnie oznaczyć allele dawcy i pacjenta). Kolejność wprowadzania sekwencji nie jest ważna, ponieważ po wyrównaniu kolejność zostanie przetasowana zgodnie z poziomami podobieństwa między dowolną parą sekwencji.
    2. Skopiuj i wklej sekwencje w formacie FASTA (jak pokazano na stronie Rysunek 3) z góry do pola "Wprowadź sekwencje wejściowe" na stronie internetowej Cluster Omega: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Kliknij na "Wyślij swoje zadanie" używając standardowych ustawień parametrów: takich jak "BIAŁKO" i "Clustal z liczbami". Wykonaj wyrównanie, klikając "Prześlij". Wyrównanie czterech sekwencji jest wyświetlane na ekranie (Rysunek 4).
  3. Zaznacz rozbieżności specyficzne dla darczyńcy.
    UWAGA: Należy szczególnie zauważyć, że podane tutaj sekwencje alleliczne zostały oparte na wynikach typowania HLA, a nie sekwencjonowania. W związku z tym istnieje ryzyko, że istotna zmiana sekwencji w danej parze dawca-biorca może zostać pominięta. Ten potencjalny problem zostanie złagodzony, ponieważ coraz więcej ośrodków transplantacyjnych stosuje dokładne typowanie w wysokiej rozdzielczości i bezpośrednie sekwencjonowanie DNA.
    1. Skopiuj i wklej tekst wyrównania do dokumentu tekstowego i utwórz nowy dokument. Jeśli format wyrównanego pliku jest zakłócony, popraw format, zmieniając styl i rozmiar czcionki: Zawsze używaj czcionki "Courier New" o małym rozmiarze, aby dopasować wiersze. Zapisz dokument po rozwiązaniu problemów z formatowaniem.
    2. Ręcznie sprawdź wyrównane sekwencje, aby zidentyfikować wszystkie niezgodne pozostałości, które należą wyłącznie do dawcy. Oznacz każdą z tych pozostałości specyficznych dla dawcy za pomocą wyróżniającego koloru czcionki.
    3. Podkreśl wszystkie litery w sekwencjach dawcy, które rozciągają się na 14 reszt zarówno przed, jak i za zaznaczonymi niezgodnościami specyficznymi dla dawcy (obliczonymi jako peptyd 15 aminokwasów minus 1 reszta niezgodności).
  4. Wyprowadź 15-merowe sekwencje peptydowe w nakładających się seriach.
    UWAGA: Powodem wyboru peptydów 15-merowych była ogólna wiedza na temat typowych epitopów o długości 4-9 aminokwasów. Dlatego, gdy zastosowaliśmy procedurę "ruchomego okna" z krokiem o wielkości 4 aminokwasów ( Rysunek 1), nasz wybór długości 15 aminokwasów pozostawił 15-4 = 11 aminokwasów nakładających się na siebie między dowolnymi sąsiednimi peptydami w serii. Teoretycznie to nakładanie się 11 aminokwasów jest wystarczające, aby pokryć wszystkie epitopy immunologiczne o długości do 9 aminokwasów, tak że żaden epitop nie zostanie przypadkowo "podzielony" na pół z tylko częściowymi sekwencjami na tablicy.
    1. Użyj podkreślonych sekwencji jako szablonów, aby sekwencyjnie wyprowadzić krótkie sekwencje 15 aminokwasów w serii, które nakładają się na 4 reszty między dowolnymi dwiema bezpośrednio sąsiadującymi sekwencjami w serii.
    2. Skopiuj i wklej te 15 sekwencji aminokwasów do arkusza kalkulacyjnego ( Rysunek 5) w formacie kolumny wraz z kolumnami notacji, które zawierają odpowiednie nazwy alleli dawcy. Przydatna może być dodatkowa kolumna zawierająca pozycje pozostałości aa.
  5. Powtórzyć kroki od 1.1.3. do 1.3. dla każdego allelu HLA (tj. A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 i DP) pary dawcy i biorcy, aby uzyskać 15 krótkich sekwencji dawcy
    6. .
  6. Skopiuj i wklej wszystkie kolumny do głównego arkusza kalkulacyjnego, aby utworzyć długą, ciągłą kolumnę ze wszystkimi 15 sekwencjami aa ze wszystkich alleli dawcy. Zapisz łączną liczbę wierszy (dla sekwencji peptydowych) w dokumencie.

2. Projektowanie i produkcja niestandardowego układu tablicy

  1. Wygeneruj arkusz kalkulacyjny sekwencji peptydowych z odpowiadającymi im wywołaniami alleli. Tablica ma 20 wierszy i 30 kolumn i może pomieścić do 20x30=600 miejsc na peptydy. W zależności od całkowitej liczby peptydów zarejestrowanych w kroku 1.5 od jednego konkretnego dawcy i oparliśmy nasze wcześniejsze doświadczenia na dwóch przykładach, które wypróbowaliśmy w Liu i wsp. 17, tablica 600 plamek może pomieścić wszystkie sekwencje wygenerowane z ~2 oddzielnych przypadków przeszczepów.
    1. Racjonalnie zaplanuj najbardziej efektywny sposób, aby dopasować zestawy peptydów do formatu 600 punktów tablicy.
    2. Jeśli więcej niż jeden temat może zmieścić się w jednej całej tablicy, wstaw puste wiersze po sekwencjach pierwszego dawcy, aby dopasować całkowitą liczbę wierszy, które można podzielić przez 30 (liczba miejsc w rzędzie w tablicy).
    3. Bezpośrednio po ostatnim pustym wierszu dla pierwszego zestawu sekwencji wklej całą kolumnę z zawartością sekwencji z drugiego przypadku przeszczepu.
    4. Powtarzaj te kroki, aż tablica zostanie wypełniona i nie będzie można dodać więcej obserwacji bez przekroczenia 600 miejsc. Jeśli na dole pozostały całe puste wiersze do wypełnienia, "przenieś" pusty wiersz tak, aby znalazł się między dwoma zestawami dawców. Ta duża przestrzeń pozostawiona między skrzynkami ułatwia cięcie membrany po zakończeniu syntezy - zgodnie z krokiem 3.2. poniżej.
  2. Zaprogramuj sekwencje peptydowe w kontekście układu tablicy. Program syntezatora SPOT przyjmuje format tekstowy sekwencji (jeden wiersz, jedna sekwencja peptydowa), który można uzyskać bezpośrednio, zapisując wynikowy arkusz kalkulacyjny z kroku 2.1.4 jako prosty dokument tekstowy (bez dodatkowych kolumn dla nazw alleli, pozycji aa itp.).
  3. Uruchom automatyczną syntezę macierzy peptydów za pomocą syntezatora SPOT. Cała operacja syntezy jest szczegółowo opisana w Kudithipudi et al.21. Zauważ, że synteza Fmoc dwóch tablic trwa ~4-5 dni.

3. Sonduj i ponownie badaj surowice odpornościowe z szeregu czasowego indywidualnego biorcy przeszczepu.

UWAGA: Tablica membranowa z 600 punktami ma wymiary ~7 cm x 13 cm. Po syntezie matryce mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej jako suche membrany przez co najmniej dwa lata, gdy są osłonięte przed bezpośrednim światłem. Unikaj nadmiernego fałdowania membrany, aby zachować jej długowieczność przy wielokrotnym użyciu.

  1. Ponownie uwodnić układ membranowy etanolem i uwidocznić plamki peptydowe wybarwione Ponceau S.
    1. Ponownie uwodnić układ błonowy przenoszący peptydy, postępując zgodnie z krokową procedurą zoptymalizowaną w Li i wsp.24.
      1. Zanurz membranę matrycy w 20 ml 100% etanolu.
      2. Dodać 20 ml wody destylowanej, aby rozcieńczyć roztwór do 50% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      3. Trzykrotnie zmienić roztwór zanurzeniowy na 40 ml 100% wody i za każdym razem inkubować przez 15 minut.
      4. Przemyć w odpowiednim buforze roboczym, np. 20 ml TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem z 0,1%), trzy razy po 5 minut.
    2. Barwienie matrycy metodą Puceau S w celu wizualizacji syntetycznych peptydów
      1. Dodaj 20 ml wstępnie sformułowanego roztworu Ponceau S bezpośrednio do uwodnionej matrycy i inkubuj przez ~30 s z wytrząsaniem.
      2. Przeprowadź wodę destylowaną w sposób ciągły po membranie, aby odplamić tło w kolorze Puceau S. Podczas tego procesu mogą stać się widoczne plamy peptydowe o czerwonym kolorze.
      3. Oddziel części tablicy dla każdego dawcy, ostrożnie przecinając sekcje matrycy dla poszczególnych przypadków. Zaznacz orientację każdej tablicy.
  2. Tablica wstępnie blokowa.
    1. Zablokuj membranę w 20 ml 5% beztłuszczowego mleka rozpuszczonego w buforze TBST. Ten roztwór na bazie mleka dodatkowo odbarwi kolor Pąsek S. Wymień bufor mleka kilka razy, aby uzyskać jak najwyraźniejsze obrazy peptydów.
    2. Dla celów archiwalnych, zrób zdjęcie obrazu tablicy Ponceau S za pomocą ręcznego aparatu fotograficznego (przykład w Rysunek 6).
    3. Kontynuować blokowanie błony w 5% mleku beztłuszczowym w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z kołysaniem.
  3. Inkubować matrycę z surowicą antytransplantacyjną.
    UWAGA: Należy zauważyć, że zjawisko znane jako prozon lub efekt Hooka może wynikać z zależnej od dopełniacza interferencji w analizie przeciwciał w surowicy. Aby obejść ten problem, można rozważyć opcjonalny etap wstępnej obróbki surowicy z EDTA lub inaktywacją termiczną próbek surowicy.
    1. Usunąć bufor blokujący i przemyć membranę 20 ml TBST trzy razy następnego dnia przez 5 minut za każdym razem.
    2. Dodać 20 μl surowej surowicy biorcy do 20 ml 2,5% mleka w buforze TBST i inkubować z membraną przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że w tej początkowej rundzie sondowania zaleca się, aby najpierw użyć ostatniej surowicy po przeszczepie (lub prawdopodobnie najbardziej uczulonej surowicy) w szeregu czasowym. Opiera się to na założeniu, że wcześniejsze próbki z tej serii, szczególnie z punktów czasowych przed przeszczepem, mają mniejszą różnorodność alloprzeciwciał, które mają tendencję do rozwijania się z czasem. W ten sposób można wyraźnie odróżnić każdą możliwość zakłóceń sygnału wynikających z "przeniesienia" między rundami sondowania od naprawdę rozwiniętej reaktywności alloprzeciwciał spowodowanej odpowiedzią immunologiczną przeciwko przeszczepowi.
  4. Przemyć matrycę za pomocą 20 ml TBST i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym.
    1. Umyj membranę trzy razy przez 10 minut za każdym razem.
    2. Inkubować z kozim przeciwciałem anty-ludzkim IgG-HRP (peroksydaza chrzanowa) w rozcieńczeniu 1:10 000 w buforze TBST uzupełnionym 1% mlekiem przez kolejne 2 godziny.
  5. Umyj i rozwiń plamę.
    1. Za każdym razem myć membranę trzykrotnie TBST przez 10 minut.
    2. Przeprowadzić wzmocnioną chemiluminescencję (ECL) przy użyciu 5 ml roztworu luminolu świeżo zmieszanego z 5 ml roztworu nadtlenku w celu rozwinięcia membrany (przez 1 min).
    3. Wizualizacja sygnałów ECL za pomocą odpowiedniego imagera (np. ChemiDoc Imaging Systems lub Azure C600).
  6. Zeskanuj i określ ilościowo plamę.
    1. Zapisz wywołane obrazy (Rysunek 7, dolny obraz) i przeprowadź kwantyfikację intensywności plamki.

4. Porównaj reaktywność surowicy w klinicznych szeregach czasowych.

  1. Rozebrać tablicę.
    1. W tym momencie membrana powinna być przez cały czas mokra.
    2. Usunąć membranę przez inkubację z 20 ml dostępnego w handlu buforu do oddzielania w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie przemyć membranę TBST trzy razy przez 10 minut każdy. Następnie powtórzyć kroki blokowania (krok 4.2) i sondowania (krok 4.3), używając innej surowicy pacjenta pobranej w innym punkcie czasowym.
  2. Membrana z izolacją blokową.
    Uwaga: Po usunięciu izolacji membrana może być ponownie wykorzystana do kolejnej rundy sondowania innej surowicy od tego samego pacjenta w szeregu czasowym.
    1. Zablokuj membranę za pomocą 5% buforu mleka, jak poprzednio (patrz krok 3.2).
  3. Ponownie zbadaj inną surowicę antywirusową z tego samego szeregu czasowego (powtórz kroki od 3.3-3.6; przykład w Rysunek 7, górny obraz).
    UWAGA: Usunięta matryca może być następnie użyta do ponownego zbadania innej próbki surowicy. Ponieważ peptydy są walencyjnie sprzężone z macierzyą nośną błony, wykazaliśmy, że matryca może być ponownie wykorzystana przez maksymalnie 20 rund cykli strippingu i ponownego sondowania bez utraty wydajności.
  4. Długoterminowe przechowywanie tablic.
    1. Przechowywać membranę w buforze TBS uzupełnionym 0,02% w/w azydkiem sodu jako środkiem konserwującym. Do długotrwałego przechowywania używaj szczelnie zamkniętej plastikowej torby. W temperaturze 4 °C, w warunkach ochrony przed bezpośrednim światłem, mokra membrana może być przechowywana przez co najmniej 2 lata.

5. Akwizycja i analiza danych

  1. Ręcznie adnotuj dodatnie peptydy antygenowe.
    1. Zlokalizuj miejsca wykazujące dodatnie sygnały przeciwciał i określ każdą z ich pozycji siatki.
    2. Zaznacz odpowiednie wiersze w głównym arkuszu roboczym dla peptydów dodatnich.
  2. Pobierz sekwencje peptydowe wymienione w głównym arkuszu roboczym ( Rysunek 7, dolna lista). Zgodnie z zasadą projektowania przedstawioną w kroku 1.4.1., sąsiednie plamki szeregowe mają znacznie nakładające się sekwencje (15-4 = 11), dlatego reaktywne epitopy mogą być wspólne dla peptydów w kolejnych seriach.
    1. Podkreśl wszelkie pozytywne punkty występujące kolejno.
  3. Określ minimalną długość epitopu dla każdego peptydu w serii.
    1. Podkreśl wszelkie potencjalnie współdzielone sekwencje epitopów oparte na nakładających się segmentach reaktywnych peptydów.
  4. Strukturalnie modelowane epitopy antygenów.
    1. Prototypowe struktury krystaliczne HLA można uzyskać z Banku Danych o Białkach, który można znaleźć pod następującym linkiem: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Wyświetl prototypową strukturę HLA w Pymol (do pobrania z www.pymol.org).
    3. Mapa" lub model odkrył epitopy anty-donorowe do struktur 3D prototypowych cząsteczek HLA, podkreślając reaktywne sekwencje peptydowe ( Rysunek 8). Kliknij "Wyświetlacz", a następnie "Tło" i wybierz "Białe". Aby zapisać obraz, przejdź do "Plik" i "Zapisz obraz jako" i wybierz format pliku "png".
  5. Raportuj wyniki i przypisz reaktywne epitopy do odpowiednich alleli.
  6. Porównaj wyniki tablicy z wynikami kulek pojedynczego antygenu (SAB), jeśli są dostępne.
    UWAGA: Test SAB z użyciem pojedynczych antygenów allelicznych mierzy reaktywność przeciwciał w stosunku do ustalonego panelu białek HLA. Poszczególne peptydy, które wykazują reaktywność przeciwciał, należą do pewnych alleli HLA, które, jeśli są również uwzględnione w panelu SAB, umożliwiają bezpośrednie porównanie wyników tablicy z SAB. Nasze poprzednie badanie17 wykazało wysoki poziom korelacji między wynikami, co sugeruje, że epitopy peptydowe znacząco przyczyniają się do ogólnej reaktywności SAB. Ponadto wyniki tablicy ujawniają również poziomy specyficzności aminokwasów.
    1. Uzyskaj wyniki SAB z laboratorium HLA, które dostarczają informacji o tym, czy i które allele dawcy są reaktywne na surowice po przeszczepie pacjenta. Wyniki z kroku 5.5. Na podstawie analizy macierzy należy również dostarczyć informacji o odpowiednich allelach dawcy dodatnich pod względem reaktywności alloprzeciwciał.
    2. Porównywanie wyników SAB i tablicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwotnym badaniu z wykorzystaniem metody przesiewowej opartej na matrycach17, do grupy włączono łącznie 5 pacjentów po przeszczepieniu nerki. Uzyskano wyniki typowania HLA kohorty oraz ich odpowiednich dawców. Dostępna była również historia medyczna oraz miana przeciwciał allelicznych z testów SAB. W naszym badaniu pilotażowym obejmującym tych 5 pacjentów opracowaliśmy dwie różne metodologie: standardową matrycę składającą się ze stałego panelu peptydów oraz ma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj matryca SPOT jest przeznaczona do eksperymentalnego badania swoistości alloprzeciwciał w przeszczepie przeciwko antygenom HLA dawcy narządu. W przeciwieństwie do istniejącego testu SAB szeroko stosowanego w klinice, metoda macierzy antygenowej ma główną zaletę w postaci elastycznej konstrukcji, która może pomieścić prawdziwe sekwencje HLA indywidualnego dawcy. Nowa platforma wykorzystuje potencjał szybko rozwijającej się technologii sekwencjonowania DNA, która wkrótce będzie w stanie zapewnić dokładne odczy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy doktorom Shawn Li i Xing Li z Western University w Kanadzie za ich życzliwą pomoc przy tworzeniu tablic SPOT. Jesteśmy wdzięczni pracownikom Centrum Zgodności Tkankowej oraz Centrum Kompleksowego Transplantacji Uniwersytetu Northwestern za świadczenie usług związanych z pobieraniem próbek. Praca ta była częściowo wspierana przez Radę Pomocniczą Northwestern Memorial Hospital oraz przez wydziałowy fundusz startowy zapewniony J.J. przez Northwestern University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tablica peptydowaINTAVIS Instrumenty
EtanolSigma-AldrichE7023
Ponceau S roztwórSigma-AldrichP7170
Mleko beztłuszczoweBio Rad Laboratories1706404
TBSTSanta Cruz Biotechnology10711454001
Koza anty-ludzka IgG– HRP ThermoFisher ScientificA18811
Clarity Western ECLSubstrate Bio Rad Laboratories1705061
Restore Western Blot Stripping BufferThermo Scientifics21059
System obrazowania żelu ChemiDocBio Rad Laboratories1708265 
bioanalityczne

Bibliografia

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570(2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203(2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396(2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie alloprzeciwciał HLAepitopy HLA swoiste dla dawcysynteza macierzy peptydowejanaliza niedopasowania HLAmapowanie epitopówniestandardowe zestawy antygenówbadanie surowicy po transplantacjiHLA-DQA1 DQB1
Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.