Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Podsumowanie

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Streszczenie

Białka, które odkładają się jako amyloid w tkankach w całym ciele, mogą być przyczyną lub konsekwencją wielu chorób. Wśród nich znajdują się choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona, dotykające przede wszystkim ośrodkowego układu nerwowego oraz amyloidoza układowa, w której amyloid A w surowicy, transtyretyna i łańcuchy lekkie IgG odkładają się w postaci amyloidu w wątrobie, cieśni nadgarstka, śledzionie, nerkach, sercu i innych tkankach obwodowych. Amyloid jest znany i badany od ponad wieku, często przy użyciu barwników specyficznych dla amyloidu, takich jak czerwień kongijska i tioflawina T (ThT) lub tioflawina (ThS). W niniejszej pracy przedstawiono kwas heptamerowo-formylodiofenooctowy (hFTAA) jako przykład niedawno opracowanych uzupełnień do tych barwników zwanych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami (LCO). hFTAA jest łatwy w użyciu i jest kompatybilny z kobarwieniem w immunofluorescencji lub z innymi markerami komórkowymi. Szeroko zakrojone badania dowiodły, że hFTAA wykrywa szerszy zakres agregatów białkowych związanych z chorobą niż konwencjonalne barwniki amyloidowe. Ponadto hFTAA może być również stosowany do optycznego przypisywania odrębnych zagregowanych morfotypów, aby umożliwić badania polimorfizmu włókienek amyloidowych. Chociaż zastosowana metodologia obrazowania jest opcjonalna, tutaj pokazujemy obrazowanie hiperspektralne (HIS), laserową skaningową mikroskopię konfokalną i obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM). Przykłady te pokazują niektóre techniki obrazowania, w których LCO mogą być wykorzystywane jako narzędzia do uzyskania bardziej szczegółowej wiedzy na temat powstawania i właściwości strukturalnych amyloidów. Istotnym ograniczeniem tej techniki jest, podobnie jak w przypadku wszystkich konwencjonalnych technik mikroskopii optycznej, wymóg mikroskopijnych rozmiarów agregatów w celu umożliwienia detekcji. Ponadto agregat powinien mieć powtarzalną strukturę β-arkuszową, aby umożliwić powiązanie hFTAA. Nadmierna fiksacja i/lub ekspozycja na epitopy, które modyfikują strukturę lub konformację agregatu, mogą powodować słabe wiązanie hFTAA, a tym samym stanowić ograniczenia dla dokładnego obrazowania.

Wprowadzenie

Odkładanie się amyloidu w tkance jest patologicznym znakiem rozpoznawczym wielu chorób, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, amyloidoza układowa i choroby prionowe. Pomimo rozpowszechnienia chorób związanych z amyloidem i faktu, że do tej pory blisko 40 różnych białek zostało sklasyfikowanych jako prekursory amyloidu w human¹, niewiele wiadomo na temat związku między odkładaniem się amyloidu a fenotypem choroby. Histologia próbek pobranych od ludzi została wykorzystana zarówno do celów diagnostycznych, jak i naukowych. Stworzono dużą liczbę modeli zwierzęcych w celu zbadania korelacji między obciążeniem amyloidem a zachowaniem, długością życia i wieloma innymi fenotypowymi odczytami progresji choroby^2,3. Podejmowane są również duże wysiłki w zakresie odkrywania i projektowania leków w celu zwalczania niektórych z najbardziej rozpowszechnionych chorób, których najbardziej się obawiamy. Jednak ocena związku między genotypem, fenotypem, obciążeniem blaszką amyloidową i podawaniem leku nie jest prosta. Narzędzia do barwienia i obrazowania amyloidu w tkance są często i dostarczają informacji o niskiej rozdzielczości na temat powstawania i struktury amyloidu.

Kongo czerwona dwójłomność, ThT i fluorescencja ThS są przykładami klasycznych metod wykrywania i analizy obciążenia amyloidem w próbkach tkanek z biopsji pacjenta i próbek pośmiertnych oraz zwierzęcych modelach choroby⁴. Techniki te są stosowane od kilkudziesięciu lat (czerwień kongijska od lat 20. XX wieku, a ThT i jej pochodne od lat 60. XX wieku) i chociaż oprzyrządowanie zostało dopracowane i pozwala na szczegółową analizę, procedury barwienia i analizy są nadal wykonywane w taki sam sposób, jak prawie sto lat temu.

W tym artykule opisujemy zastosowanie bardzo czułego nowego barwnika amyloidowego, hFTAA⁵, który pozwala na wykrywanie małych niedojrzałych depozytów białkowych z dużą dokładnością, jak również wykrywanie dojrzałego amyloidu. W porównaniu z konwencjonalnymi barwnikami, udowodniono, że hFTAA wykrywa szerszy zakres agregatów białkowych związanych z chorobą^5,6,7. Ponadto, hFTAA może być również stosowany do optycznego przypisywania odrębnych zagregowanych morfotypów⁸. W niniejszym artykule opisujemy barwienie hFTAA i analizę tkanek z uznanych modeli zwierzęcych choroby prionowej i transgenicznych myszy z białkiem prekursorowym amyloidu-β (APP), zaprojektowanych do naśladowania rozwoju płytki nazębnej w chorobie Alzheimera^9,10. Pokazujemy również analizę próbek diagnostycznych i pośmiertnych pobranych od pacjentów cierpiących na amyloidozę układową. LCO mają wewnętrzne właściwości, które umożliwiają im raportowanie różnic konformacyjnych w obrębie jednej płytki; a dzięki połączeniu dwóch LCO o różnych właściwościach dotyczących wiązania i fluorescencji, różnica jest jeszcze bardziej wyraźna¹¹. Mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w filtry długoprzepustowe i głowicę kamery hiperspektralnej umożliwia obiektywną klasyfikację właściwości spektralnych i rejestrację mikrofotografii do analizy spektralnej. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna z przestrajalnym laserem jako źródłem wzbudzenia służy do bardziej szczegółowej oceny trójwymiarowych właściwości płytki amyloidowej. Przestrajalny laser umożliwia zbieranie widma wzbudzenia, a bezstopniowy wybór długości fal emisyjnych na mikroskopie umożliwia jednoczesne obrazowanie fluorescencji LCO i immunofluorescencji w celu określenia kolokalizacji docelowego białka i amyloidu. FLIM oferuje bezprecedensową czułość na różnice konformacyjne nałożone na LCO i ujawnia różnice, które mogą nie być wykryte w widmach emisji fluorescencyjnej.

Głównym celem opisanej metody barwienia jest ułatwienie czułego wykrywania małych złogów amyloidu oraz scharakteryzowanie polimorfizmu konformacyjnego w obrębie złogów amyloidu. Wiedza ta jest ważna dla podstawowego zrozumienia chorób związanych z agregacją białek.

Protokół

UWAGA: Synteza LCO jest przeprowadzana w naszych laboratoriach od ponad dekady. Zasadniczo stosując protokoły do elektrofilowej substytucji aromatycznej, sprzęgania krzyżowego katalizowanego palladem, sprzęgania amidowego i hydrolizy estrów, syntetycznie dostosowujemy sondy do różnych celów^5,12. Po syntezie, charakterystyce i oczyszczeniu produkt LCO jest liofilizowany i przechowywany w temperaturze pokojowej. Niektóre z sond (w tym hFTAA) są już dostępne na rynku (patrz tabela materiałów).

1. Roztwór do barwienia LCO

UWAGA: Jeśli hFTAA jest kupowany od komercyjnego dostawcy, proszę postępować zgodnie z instrukcjami dostawcy zamiast sekcji 1.

1. Zawiesić liofilizowany hFTAA w 2 mM NaOH, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać bulion w szklanej fiolce w temperaturze 4 °C. Zapasy mogą być przechowywane przez jeden rok.
2. W dniu barwienia przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając bulion w stosunku 1:10 000 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

2. Przygotowanie próbek tkanek

UWAGA: Wiele typów tkanek można obrazować za pomocą hFTAA jako markera amyloidu. Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć przykłady. hFTAA jest wrażliwy na konformację agregatów. W związku z tym barwienie powinno być najlepiej przeprowadzane na nienaruszonych kruszywach bez ekspozycji epitopów. Optymalna jakość widmowa jest osiągana, jeśli utrwalenie tkanki jest ograniczone do minimum. Dlatego preferowany jest świeżo zamrożony materiał, delikatnie utrwalony w etanolu w czasie barwienia. Możliwe jest jednak wykrycie złogów amyloidu również w tkance, która została utrwalona np. formaliną. hFTAA na ogół dobrze przenika do tkanki. Wybierz grubość próbki, która jest zgodna z zamierzoną techniką obrazowania.

1. Jeśli stosuje się plastry z zamocowaną formaliną, osadzone w parafinie, deparafinizuj w ksylenie przez noc. Zanurz sekcje w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu,_dH2Oi PBS, po 10 minut w każdej. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
   Uwaga: Ksylen jest zawsze przenoszony w dygestorium chemicznym. Ksylen i inne rozpuszczalniki organiczne są szkodliwe.
   1. Rozmrozić kriosekcje w temperaturze pokojowej. Utrwal skrawki tkanek w 10% formalinie przez noc i nawodnij, zanurzając je w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu,_dH2Oi PBS, po 10 minut w każdej. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
2. Dodać kropelki roztworu roboczego hFTAA (około 200 μl) do skrawków tkanki, aby ją przykryć. Kropla powinna pozostać na miejscu dzięki napięciu powierzchniowemu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia.
3. Spłukać roztwór barwiący 500 μl PBS za pomocą pipety, a następnie zanurzyć szkiełko w kąpieli PBS na 10 minut. Pozostawić sekcję do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
4. Zamontuj za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Odczekać, aż podłoże montażowe osiada przez noc.
   UWAGA: barwienie hFTAA można przeprowadzić w połączeniu z innymi metodami barwienia, takimi jak immunofluorescencja, markery specyficzne dla komórek lub organelli itp. Aby przeprowadzić współbarwienie, uruchom kompletny wybrany protokół barwienia i dodaj barwienie hFTAA na końcu, zaczynając od kroku 2.2. Zobacz przykłady na Rysunek 2. W przypadku immunofluorescencji najlepiej wybrać przeciwciało drugorzędowe, które jest wzbudzone przy długości fali 640 nm lub wyższej. W tym zakresie długości fal hFTAA nie absorbuje, a zatem nie może być wzbudzony i nie ulega fluorescencji. Gwarantuje to, że nie widać krwawienia między hFTAA a przeciwciałem.

3. Mikroskopia

UWAGA: Użyj mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry długoprzepustowe. Wszystkie poniższe ustawienia zostały użyte do wygenerowania obrazów w Rysunek 4. Może być konieczne dokonanie korekt w zależności od rodzaju amyloidu i próbki tkanki. Chociaż hFTAA związany z amyloidem jest stabilny w kierunku bielenia, zaleca się wyłączenie źródła światła, gdy próbka nie jest badana ani obrazowana.

1. HIS
   UWAGA: Eksperyment przeprowadzono przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego z długoprzepustowymi filtrami emisyjnymi i głowicą kamery do HIS (patrz Tabela Materiałów).
   1. Użyj standardowego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry długoprzepustowe i kamerę hiperspektralną. Upewnij się, że kamera spektralna jest skalibrowana.
   2. W oprogramowaniu nazwij projekt, wybierz "obraz spektralny" i rozpocznij akwizycję.
   3. Wybierz interesujący Cię obiekt przez okular za pomocą filtra wzbudzenia 436 nm i przesuń ścieżkę światła do kamery.
   4. W Menedżerze danych przypadku (CDM) wybierz typ próbki Spectral, oznacz próbkę i naciśnij przycisk acquire. Otworzy się okno przejęcia.
   5. W oknie akwizycji "Obrazowanie spektralne" otwórz menu ustawień, wybierz właściwości akwizycji i ustaw zakres widmowy na 460 - 700, jakość prędkości przy maksymalnej prędkości oraz typ pomiaru przy filtrach gazowych/laserowych/wąskich. Zamknij okno dialogowe.
   6. W menu obrazu wybierz opcję na żywo w pełnej wersji. Na pasku ikon wyłącz otoczki. Wybierz lub zmień rozmiar regionu na obrazie, który ma szczytową wartość pamięci poniżej 800 MB. Ustaw czas ekspozycji na wartość, która daje całkowitą jasność obrazu w zakresie od 1 000 do 3 000. Na pasku ikon naciśnij kolorową kamerę. Rozpocznie się akwizycja. Po zakończeniu akwizycji obrazu naciśnij Zapisz w oknie dialogowym "Uzyskaj obraz spektralny" i "Nowa komórka" w oknie dialogowym menedżera danych przypadku.
   7. Z poziomu CDM otwórz zebrany obraz za pomocą przycisku rozpocznij analizę. Otworzy się okno analizy danych.
   8. Informacje spektralne można zbierać z każdego piksela obrazu, wybierając ROI za pomocą okna dialogowego Wyświetlanie spektralne. Wybierz "zdefiniuj" i wybierz ROI z odpowiednich obszarów obrazu.
   9. Zapisz dane spektralne jako plik tekstowy za pomocą przycisku Lib. Zapisany plik .txt można zaimportować do dowolnego oprogramowania analitycznego. Plik .slb może być używany do analizy w oprogramowaniu do analizy danych. Dane sześcianu hiperspektralnego z całego obrazu można również wyeksportować jako plik RAW, jako "warstwy jako tif" lub jako "warstwy w formacie tekstowym" do aplikacji do analizy danych i obrazów za pomocą zewnętrznego oprogramowania.
2. Mikroskopia konfokalna
   UWAGA: Mikroskop konfokalny jest wyposażony w przestrajalny laser jako źródło wzbudzenia. Dla wszystkich eksperymentów z emisją fluorescencji należy ustawić natężenie lasera na 0,2% (co odpowiada średniej mocy 3 μW), otworek na 1 jednostkę przewiewną, rozmiar klatki na 1 024 px x 1 024 px, prędkość skanowania na 7 i średnią z 16 skanów, a głębię bitową na 8 bitów (patrz Tabela materiałów). Ustawienia te należy dostosować do każdego indywidualnego systemu konfokalnego, źródła lasera i typu próbki.
   1. Dla widma emisyjnego należy zebrać dane w trybie lambda i wzbudzeniu za pomocą lasera argonowego ustawionego na 488 nm. Zbieraj emisję w zakresie od 503 do 687 nm za pomocą 22 kanałów w 32-kanałowym detektorze GASP. Ustaw wzmocnienie na 755.
   2. Aby uzyskać obrazy jednokanałowe, użyj opcji inteligentnej konfiguracji. Dla FITC (zielony filtr) ustaw wzmocnienie na 750, a dla Alexa 535 (czerwony filtr) ustaw wzmocnienie na 845.
   3. Aby zebrać widmo wzbudzenia za pomocą przestrajalnego lasera, należy użyć wzbudzenia z krokami co 1 nm w zakresie od 490 do 545 nm, jednocześnie zbierając emisję w zakresie od 551 do 586 nm. Ustaw intensywność lasera na 2% (co odpowiada średniej mocy 30 μW), a wzmocnienie na 774.
   4. Aby zebrać stos Z w trybie spektralnym, skanuj głębokość przekroju w krokach co 0,96 μm. Można użyć tych samych ustawień wzbudzenia i emisji, co w kroku 3.2.1, ale ustaw wzmocnienie na 730.
3. FLIM
   UWAGA: Mikroskop konfokalny jest wyposażony w jednostkę FLIM (patrz Tabela materiałów).
   1. Ustaw następujące parametry mikroskopu konfokalnego: Otworek, 20; długość fali wzbudzenia, 490 nm; natężenie lasera, 0,5% (co odpowiada średniej mocy 7,5 μW). Używaj laserów impulsowych na częstotliwości 40 MHz.
   2. W oprogramowaniu FLIM ustaw zliczanie fotonów powyżej 550 nm. W oknie Parametry wyświetlania postępuj zgodnie ze zliczaniem fotonów, aż maksymalna liczba fotonów wyniesie około 4 000 zliczeń.
   3. Zapisz plik i wyeksportuj go jako obraz SPC.
   4. Dopasuj dane do 2-składnikowego rozkładu wykładniczego w oprogramowaniu FLIM. Dopasowanie, które daje χ² < 2 jest dobre. Wartość na osi y to liczba zliczeń dla danego okresu istnienia.
   5. Wybierz próg, który ma zostać uwzględniony w liczbach, np. 100. Oznacz kolorem według T1 i wybierz zakres żywotności. Rozpad jest zależny od struktury amyloidu, w której związany jest hFTAA. Zaobserwowano czas życia fluorescencji od 300 do 1000 ps. Zapisz plik.
   6. Wyeksportuj nieprzetworzone dane za pomocą opcji eksportu i zapisz żądane dane w nowym folderze.

Wyniki

Wrażliwe i selektywne barwienie złogów amyloidu pochodzących od dużej liczby białek w różnych typach tkanek zarówno od pacjentów ludzkich, jak i od zwierząt doświadczalnych, ma kluczowe znaczenie zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i w badaniach naukowych. W tym artykule pokazujemy, jak można tego dokonać, wykorzystując LCO, na przykładzie hFTAA, do barwienia i wielomodalnego obrazowania amyloidu z wybranych typów tkanek. Od pierwszej publikacji ligandów amyloidu opartych na tiofenie, ponad dziesięć lat temu¹³, złogi amyloidu składające się z szerokiego zakresu białek w różnorodnych tkankach obrazowano za pomocą LCO^{6,7,11,14,15,16} (Rycina 1). W połączeniu z przeciwciałami lub innymi markerami histologicznymi, LCO stanowią doskonałe narzędzia zarówno do celów diagnostycznych, jak i naukowych (Rycina 1a, Rycina 2). Przy odpowiednim doborze znaczników fluorescencyjnych, na tym samym przekroju można obrazować kilka fluoroforów (Rycina 1a, hFTAA i DAPI, Rycina 2a hFTAA w układzie immunofluorescencji). Możliwe jest również stosowanie kolejnych przekrojów do barwienia metodą jasnego pola i fluorescencji (Rycina 2b, barwienie hFTAA i przeciwciałem DAB). Ostatnio hFTAA okazał się bardzo obiecującym uzupełnieniem barwienia czerwienią kongową w diagnostyce klinicznej^7,15 (Rycina 3).

Rozwój technik obrazowania w ostatnich dziesięcioleciach zwiększył zapotrzebowanie na barwniki amyloidowe, które potrafią ilościowo odróżniać niewielkie, lecz jednocześnie istotne różnice w odkładach amyloidu. Układ sprzężony wewnątrz LCO nadaje mu wyjątkową zdolność sygnalizowania zmian sposobu wiązania. Skręcenie cząsteczki może prowadzić do zniekształcenia kątów wiązania w układzie sprzężonym i utrudniać transport elektronów (Rycina 4a). Odbija się to z kolei na właściwościach fluorescencyjnych LCO zarówno w zakresie długości fali wzbudzenia i emisji, jak i czasu trwania emisji. Wykorzystujemy HIS w pionowym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtry przepuszczające długie fale dla emisji. Do pomiaru widm wzbudzenia i emisji w mikroskopii konfokalnej oraz FLIM stosujemy LSM780 z laserem impulsowym. Aby zilustrować różne techniki, wykonano obraz jednego obiektu (plamy beta-amyloidu (Aβ) u transgenicznego mysiego modelu APP) (Rycina 4b-e). Hiperspektralne widma fluorescencyjne (Rycina 4b) pozwalają na ocenę przesunięć spektralnych i zmienności intensywności w różnych regionach plamy. Widmo wzbudzenia w mikroskopii konfokalnej (Rycina 4c) może służyć do wyznaczenia optymalnej długości fali wzbudzenia w dalszych eksperymentach, n.p., podwójnego barwienia z użyciem kilku fluoroforów. Ta metoda może również okazać się przydatna w wykrywaniu różnic konformacyjnych w sposobie wiązania LCO. Widmo emisji w trybie konfokalnym może być wykorzystane do określenia właściwości emisji fluorescencyjnej hFTAA lub kombinacji kilku fluoroforów w celu oceny kolokalizacji w eksperymentach łączących wiele LCO lub LCO z immunofluorescencją. Czas życia fluorescencji hFTAA jest silnie wpływany przez niewielkie zmiany w sposobie wiązania hFTAA. Dlatego FLIM stanowi potężne narzędzie do rozróżniania różnic wprowadzanych w hFTAA przez jego cel wiązania (Rycina 4d). Może to być wykorzystane na przykład do rozróżniania różnych szczepów prionów⁸. Obrazowanie konfokalne i przetwarzanie zestawów Z na trójwymiarowe obrazy to przydatne narzędzie do badania ogólnej struktury agregatu amyloidowego (Rycina 4e). Ponownie, zastosowanie dodatkowych fluoroforów może pomóc w zrozumieniu składu odkładu.

Rycina 1: Różne typy tkanek i agregaty białkowe prezentujące barwienie h-FTAA: (a) ciała Mallory’ego-Denka złożone z agregatów keratyny w wątrobie (kontrastowane DAPI), (b) inkluzje dodatnie dla p62 w mięśniu przy sporadycznym zapaleniu mięśni typu zaawansowanego (s-IBM), (c) amyloid peptydu amyloidowego wysp trzustkowych w ludzkiej trzustce, (d) amyloid lekkich łańcuchów immunoglobulin w ludzkim jelitach, (e) scrapie owcy (priony) w mózgu myszy, (f) choroba wyczerpania organizmu (priony) w mózgu myszy, (g) płytki Aβ w mózgu myszy APP23, (h) patologia Aβ w mózgu myszy APP/PS1 oraz (i) preparaty z biopsji tłuszczu z próbek diagnostycznych amyloidu transtyretyny u ludzi, sklasyfikowane od 1 do 4 zgodnie ze standardową skalą oceny czerwienią kongową (CR). Żółte obszary pokazują odkładające się amyloid zbarwiony hFTAA, a niebieskie to autofluorescencja tkanki tłuszczowej. Długość szkalowalnej belki podano w każdym panelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykłady podwójnego barwienia przeciwciałami. (a) Podwójne barwienie surowicą przeciwbiałkową amyloidową A (AA) metodą immunofluorescencji oraz hFTAA ludzkich amyloidów AA na tym samym przekroju. Górny lewy panel: emisja przeciwciała przeciwko AA przy 640 nm; górny prawy panel: hFTAA przy 488 nm; dolny panel: obraz nakładki pokazujący kolokalizację w kolorze żółtym. (b) Barwienie przeciwciałami i fluorescencja hFTAA na kolejnych przekrojach. Górny panel: barwienie DAB przeciwciałem przeciwko AA, dolny panel: obraz hFTAA z zastosowaniem filtra długofalowego. Szerokość podziałki: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Porównanie fluorescencji z filtrami przepuszczającymi krótkie fale dla amyloidu transtyretynowego w ludzkim sercu barwionym hematoksyliną Mayersa/czerwienią Konga (a-d) oraz hematoksyliną Mayersa/hFTAA (e). (a) Obraz w polu jasnym, (b) Pole jasne + fluorescencja, (c) Pole jasne + skrzyżowane polaryzatory, (d) Pole jasne + fluorescencja + skrzyżowane polaryzatory, (e) Fluorescencja hFTAA przy wzbudzeniu 405 nm + 480 nm (przekroje kolejne do a-d). Szerokość sklali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ten sam obiekt wybarwiony za pomocą hFTAA i zobrazowany różnymi technikami, przedstawiony na przykładzie jednej plamy Aβ u starego mysza APP23. (a) Właściwości fluorescencyjne hFTAA zależą od jego stanu konformacyjnego. Pokazano strukturę hFTAA w stanie płaskim i skręconym. (b) Obrazowanie hiperspektralne służące do oceny ciągłego widma emisyjnego. Widma na dolnym panelu są zakodowane kolorami zgodnie z oznaczonymi prostokątnymi obszarami interesującymi na obrazie. (c) (i) Obrazowanie konfokalne w celu wzbudzenia oraz (ii i iii) obrazowanie widma i emisji w trybie filtrów lub (iv) w trybie spektralnym. (d) Obrazowanie czasu życia fluorescencji w celu wykrycia różnic konformacyjnych w amyloidzie, gdzie krótsze czasy życia występują na obwodzie plamy Aβ, a dłuższe w jej centrum. Histogram na dolnym panelu przedstawia rozkład czasów życia dla całej plamy. Obraz został pokolorowany zgodnie z skalą umieszczoną pod histogramem. (e) Z-stos konfokalny zebrany w trybie filtrów, pokazujący trójwymiarową strukturę obiektów. Długość szkalibry podano na każdym panelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Odkładanie się nieprawidłowo pofałdowanych białek w amyloid jest kluczowym zdarzeniem wielu procesów chorobowych. Zewnątrzkomórkowe blaszki amyloidowe zbudowane z peptydów Aβ i wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych utworzonych przez hiperfosforylowane tau znajdują się w mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera. Szereg różnych białek, np. transtyretyna (TTR), składnik amyloidu A w surowicy (SAA) i łańcuch lekki IgG, ulega nieprawidłowemu fałdowaniu i objawia się jako złogi amyloidu w tkankach poza OUN. Chociaż złogi amyloidu są znane i badane od ponad wieku, nadal brakuje nam szczegółowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób odkładanie się amyloidu jest inicjowane na poziomie molekularnym i co można zrobić, aby zapobiec temu procesowi. W przypadku choroby Alzheimera konieczne jest potwierdzenie, w jaki sposób proces amyloidozy jest związany z neurodegeneracją. Jednym z kluczowych zadań w misji leczenia amyloidozy jest opracowanie nowych, precyzyjnie dostrojonych narzędzi do monitorowania inicjacji, progresji i regresji amyloidu; Dlatego kluczowe znaczenie ma ukierunkowane wykrywanie amyloidu. W dłuższej perspektywie diagnostyka kliniczna skorzysta na zwiększeniu czułości i selektywności metod barwienia amyloidu ^7,15. Obecne wyzwania w tym zakresie są ogromne i jest to bardzo aktywny obszar badań. Jednym z głównych zagadnień związanych z rozwojem klinicznym i badaniami klinicznymi jest diagnoza prognostyczna. Choroby te prawdopodobnie zaczynają się na długo przed pojawieniem się objawów, ale aby rozpocząć leczenie, konieczna jest identyfikacja choroby. W tym przypadku wrażliwość jest kluczowym aspektem dla nowatorskich metodologii. Co więcej, kwestia ta jest jeszcze bardziej złożona, ponieważ niektóre agregaty białkowe są toksyczne, niektóre ochronne, a niektóre neutralne. W związku z tym możliwość monitorowania określonych zagregowanych morfotypów jest niezbędna, ponieważ zasugerowano istnienie odrębnych zagregowanych gatunków, aby wyjaśnić heterogeniczny fenotyp zgłaszany dla różnych chorób neurodegeneracyjnych agregacji białek. Na przykład białko prionowe jest klasycznym przykładem tego, jak identyczna pierwszorzędowa sekwencja aminokwasów może nieprawidłowo sfałdować się w odrębne morfotypy agregatów, które prowadzą do powstania określonych szczepów prionów. Podobny polimorfizm odnotowano również dla peptydu Aβ, α-synukleiny i tau. W związku z tym wykazano, że LCO są znakomitymi narzędziami do optycznego przypisywania odrębnych zagregowanych morfotypów. Specyficzne dla szczepu prionów agregaty białkowe, złogi białkowe występujące w kilku typach amyloidozy układowej, a także polimorficzne agregaty Aβ i tau zostały wyróżnione ze względu na konformacyjnie indukowane zjawisko optyczne obserwowane w LCO.

Odkładanie się amyloidu to zdarzenie, które ma miejsce w tkankach, które są trudne do penetracji metodami biochemicznymi lub biofizycznymi o precyzji molekularnej. Możliwość badania zdarzeń ex vivo, in vivo i in vitro przy użyciu tych samych cząsteczek LCO przygotowuje grunt pod rozwikłanie zdarzeń zachodzących in vivo przy użyciu technik, które są możliwe do zastosowania tylko na próbkach ex vivo lub in vitro ^11,17. Niedawno opisany model strukturalny o wysokiej rozdzielczości pokazuje, że pentameryczny FTAA LCO (pFTAA) wiąże się we wnęce utworzonej przez wyrównane łańcuchy boczne równoległe do osi włókienki obejmującej 6 równoległych nici beta w rejestrze¹⁸, co pokazuje, że możliwe jest uzyskanie wiedzy o rozdzielczości atomowej na temat jednostek celu LCO. W istocie, wnęka wiążąca i sposób wiązania pFTAA są podobne do czerwieni Kongo¹⁹, podyktowane rowkiem wyłożonym powtarzającymi się dodatnio naładowanymi łańcuchami bocznymi Lys. Powinowactwo LCO wydaje się być lepsze w porównaniu z czerwienią kongijską, prawdopodobnie ze względu na elastyczność łańcucha i silne oddziaływania van der Waalsa atomów siarki pierścieni tiofenowych w kierunku wnęki hydrofobowej. Wykrywanie gatunków prefibrylarnych (przed odpowiedzią ThT)^5,20 wydaje się zależne od powtarzających się arkuszy β, składających się z równoległych nici beta w rejestrze, które w przypadku hFTAA o dwie jednostki tiofenu dłuższe niż pFTAA obejmowałyby skrzyżowanie do 8 nici beta.

Protokół barwienia wymaga zwrócenia uwagi na rozwiązywanie problemów w następujących krokach: (i) Utrwalenie: Intensywne utrwalanie próbek tkanek może zakłócić strukturę amyloidu i ograniczyć możliwość wykrycia zmian w widmach fluorescencji wywołanych zniekształceniem konformacyjnym cząsteczki hFTAA. Preferowane jest łagodne utrwalanie kriosekcji ze świeżo mrożonego materiału w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości spektralnej. Jednak hFTAA będzie barwić i fluoryzować amyloid w utrwalonej tkance, ale ze zmniejszoną skutecznością i mniejszą zmiennością spektralną. (ii) Ekspozycja na epitopy: Wstępna obróbka tkanki w celu uzyskania ekspozycji na epitopy w celu wiązania przeciwciał może czasami zmniejszyć zdolność wiązania hFTAA z powodu zaburzonej struktury amyloidu. Jeśli jest to problem, a ekspozycja na epitopy jest kluczowym krokiem w protokole barwienia przeciwciał, można rozważyć użycie kolejnych sekcji odpowiednio dla przeciwciał i hFTAA. (iii) Nadmierne barwienie: hFTAA jest niezwykle wrażliwy. Roztwory robocze należy utrzymywać w niskim stężeniu nM. Zmniejsz stężenie hFTAA, jeśli problemem jest barwienie tła. Jeśli pierwiastki wiążące hFTAA są rzadkie w tkance, nadmiar hFTAA może agregować się i gromadzić w podłożu mocującym. Jest to rozpoznawane jako fluorescencja, która nie znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej samej tkanki. Jeśli tak się stanie, zanurz zamontowany suwak w PBS, aż będzie można zsunąć szkiełko nakrywkowe z sekcji, umyj PBS i ponownie zamontuj za pomocą świeżego podłoża montażowego i nowego szkiełka nakrywkowego. (iv) Obrazowanie oparte na filtrach: W tym artykule opisano głównie obrazowanie fluorescencyjne o rozdzielczości spektralnej przy użyciu filtrów długoprzepustowych lub wielu kanałów detekcji. hFTAA można również monitorować za pomocą filtrów krótkoprzepustowych. Należy pamiętać, że spowoduje to zmniejszenie kontrastu i zniesienie możliwości wykrywania wielu kolorów.

W ciągu ostatnich lat stało się oczywiste, że fluorescencyjne LCO, a w szczególności hFTAA, jako narzędzia badawcze, wykazują bardzo obiecujące właściwości. Wyniki wykazano dla szerokiej gamy białek i stanów chorobowych, począwszy od wykrywania hFTAA agregatów wewnątrz komórek (tau, zapalenie mięśni ciała inkluzyjnego), amyloidu układowego amyloidu A w surowicy, transtyretyny, łańcuchów lekkich immunoglobulin (kappa i lambda), seminogeliny 1, białka prionowego (w tym próbek klinicznych)²¹, polipeptydu amyloidu wysp trzustkowych i insuliny ^7,15. Czynnikiem ograniczającym wdrożenie hFTAA jako narzędzia diagnostycznego jest to, że mikroskopia fluorescencyjna nie jest szeroko stosowana w rutynowych laboratoriach patologii amyloidu. Co więcej, HIS nie jest łatwo dostępny w klinice. Jednak barwienie amyloidem hFTAA i mikroskopia fluorescencyjna były stosowane w laboratoriach klinicznych w mikroskopie fluorescencyjnym opartym na filtrze i powinny być traktowane jako uzupełniająca metoda diagnostyczna. Zostało to ostatnio wykazane w biopsjach cieśni nadgarstka z amyloidozą transtyretynową przy użyciu podstawowych ustawień fluorescencji w sposób zautomatyzowany²².

Ponadto, oprócz różnych białek, fluorescencja hFTAA rozpoznaje szeroką gamę typów włókienek i prefibrylarnych agregatów amyloidowych, np. wykryto i scharakteryzowano gatunki fibrylarne szlaku. W niniejszej publikacji zademonstrowaliśmy jeden LCO na różnych typach próbek przy użyciu trzech technik mikroskopowych. Zastosowanie kontrolowanej syntezy pozwoliło również na opracowanie LCO do wszechstronnego wykrywania celów biomolekularnych, np. rejestracji oddziaływań za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)²³ i znakowania radioaktywnego dla pozytonowej tomografii emisyjnej (PET)²⁴.

Do tej pory opublikowano ponad 25 różnych LCO z tymi badaniami. Zwiększone wykorzystanie LCO do obrazowania złogów amyloidu zwiększy wiedzę i zrozumienie, w jaki sposób te związane z chorobą agregaty gromadzą się, rozkładają i zakłócają narządy i osoby, w których się znajdują.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako medium do montażu fluorescencji	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000 Leica
Lumen 200	Wcześniejszy
system Spectraview	Obrazowanie
Oprogramowanie Spectraview	Obrazowanie	spektralne ASI
LSM780	Oprogramowanie Zeiss
Zen 2010b v6.0	System Zeiss
FLIM	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
w stroju	Zeiss

spektralne ASI Przestrajalny laser