Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Podsumowanie

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Streszczenie

W naszych wysiłkach zmierzających do określenia wzorców ekspresji i lokalizacji subkomórkowej RNA Drosophila na podstawie całego genomu oraz w różnych tkankach, opracowaliśmy liczne modyfikacje i ulepszenia do naszego oryginalnego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Aby zwiększyć przepustowość i efektywność kosztową, wszystkie etapy, od generowania sondy po wykrywanie sygnału, są wykonywane przy użyciu 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych. Antysensowne sondy RNA znakowane digoksygeniną (DIG) są produkowane przy użyciu klonów cDNA lub genomowego DNA jako matryc. Po utrwaleniu tkanki i przepuszczalności, sondy są hybrydyzowane z interesującymi transkryptami, a następnie wykrywane za pomocą szeregu przeciwciał anty-DIG sprzężonych z biotyną, streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP) i fluorescencyjnie sprzężonego tyramidu, który w obecności HRP wytwarza wysoce reaktywny półprodukt, który wiąże się z gęstymi elektronowo regionami bezpośrednio sąsiadujących białek. Te etapy amplifikacji i lokalizacji wytwarzają solidny i wysoce zlokalizowany sygnał, który ułatwia lokalizację transkryptu zarówno komórkowego, jak i subkomórkowego. Dostarczone protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem wytwarzania wysoce specyficznych sygnałów w różnych tkankach i na różnych etapach rozwoju. Podano również odniesienia do dodatkowych wariantów, które umożliwiają jednoczesne wykrywanie wielu transkryptów lub transkryptów i białek w tym samym czasie.

Wprowadzenie

Nowe metody wykrywania RNA w całym genomie, takie jak sekwencja RNA, znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat tego, kiedy i gdzie geny są wyrażane oraz na jakich poziomach¹. Zapewniają one jednak stosunkowo słabą rozdzielczość czasową i przestrzenną. Hybrydyzacja RNA in situ pozwala na wizualną obserwację przestrzennego rozkładu transkryptów w utrwalonych tkankach, ujawniając w ten sposób szczegóły lokalizacji komórkowej i subkomórkowej². Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) pozwala na jeszcze większą rozdzielczość przestrzenną, ponieważ pozwala na użycie potężnych technik mikroskopowych, takich jak mikroskopia konfokalna i mikroskopia arkuszowa³. Markery fluorescencyjne, takie jak DAPI, mogą być również używane do ustanawiania relacji subkomórkowych⁴. FISH ułatwia również obserwację wielu RNA i białek jednocześnie, z wyraźnymi wskazaniami na nakładanie się na poziomie subkomórkowym. Unikalne odczynniki i kroki wymagane do podwójnego znakowania można znaleźć w następujących odnośnikach^3,5.

Opisane tutaj procedury wykorzystują 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe do wszystkich etapów, w tym produkcji matrycy cDNA (PCR kolonii), produkcji sondy RNA (przy użyciu zależnej od polimerazy T7, T3 lub SP6 transkrypcji odpływowej), hybrydyzacji in situ i rozwoju sygnału fluorescencyjnego. Do każdego dołka z 96-dołkowej płytki dodaje się wystarczającą liczbę zarodków lub tkanek, aby umożliwić ocenę konsystencji i zmienności. Każda studnia otrzymuje następnie inną sondę. Po opracowaniu sygnału, zarodki lub tkanki z każdej studzienki są umieszczane na indywidualnych szkiełkach mikroskopowych w celu analizy mikroskopowej.

Użycie tyramide signal amplification (TSA) do wykrywania sondy daje solidne sygnały o wyjątkowej rozdzielczości subkomórkowej 5^,6,7,8. Subkomórkowa lokalizacja RNA jest ważnym mechanizmem regulacyjnym ⁹, który wydaje się występować w przypadku praktycznie wszystkich RNA ^4,10,11. Analizy te wykazały również, że wiele transkryptów, które nie są wykrywane przez sekwencję RNA, jest łatwo wykrywanych przez FISH ⁸. Adaptacja hybrydyzacji RNA in situ do płytek 96-dołkowych umożliwia analizę do 96 genów jednocześnie (więcej, jeśli stosuje się dodatkowe płytki), umożliwiając analizę dużych zbiorów danych. Dzięki cięciu płytek na mniejsze sekcje, metodę można również łatwo dostosować do zaledwie kilku próbek. Dostarczony protokół jest odpowiedni do analizy rozkładu RNA w większości typów tkanek. Chociaż nie pokazano, można go również przystosować do tkanek innych niż Drosophila.

Protokół

1. Amplifikacja PCR matryc cDNA z plazmidów

UWAGA: Używaj wysokiej jakości plazmidowych lub generowanych metodą PCR matryc DNA do syntezy RNA. Biblioteki Drosophila Gene Collection (DGC) wygenerowane w ramach projektu Berkeley Drosophila genome project obejmują większość genów kodujących znajdujących się w genomie Drosophila (patrz Tabela 1a). Pozwalają one również na stosowanie uniwersalnych starterów do amplifikacji dowolnej insercji cDNA. Te amplifikacje PCR są wykonywane na plazmidowych DNA obecnych w lizatach kultur bakteryjnych zawierających plazmid. Produkty DNA są następnie wykorzystywane jako matryce do transkrypcji in vitro w celu wygenerowania antysensownych sond RNA (patrz Tabela 1b).

1. Zaprojektuj startery do amplifikacji określonego regionu eksonu genu będącego przedmiotem zainteresowania metodą PCR (np. z genomowego DNA), najlepiej z miejscem rozpoznawania polimerazy T7 na końcu antysensownym.
2. W przypadku eksperymentów z mniej niż 96 próbkami należy odciąć niepotrzebne porcje 96-dołkowych płytek. Przykryj płyty taśmą uszczelniającą (patrz Materiały) do wszystkich inkubacji i przechowywania. Jeśli używane są probówki do mikrowirówek, odpowiednio dostosuj objętość.
   UWAGA: Płytki 96-dołkowe umożliwiają stosowanie pipet wielokanałowych w celu zwiększenia przepustowości, a także mniejszych objętości w celu obniżenia kosztów.

powiedział: powiedział:

Tabela 1a
wektor	Antybiotyk stężenie robocze 1:1000	Podkłady	Polimeraza RNA dla antysens	Polimeraza RNA. dla zmysł
pFLC-I	Amp	pBst_SK(-)_F/R	Klasa T3	Zobacz materiał T7
pBSt(-)	Amp	pBSt_SK(-)	Zobacz materiał T7	Klasa T3
pOT2	Chlor	pOT2_F/R	Dodatek SP6	Zobacz materiał T7
pOTB7	Chlor	pOT2_F/R	Zobacz materiał T7	Dodatek SP6
Tabela 1b
podkład	kolejność
pOT2_Forward	5'-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3'
pOT2_Reverse	5'-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3'
pBst_SK(-)_Forward	5'-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3'
pBst_SK(-)_Reverse	5'-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3'

Tabela 1: A) Ogólne informacje o klonach DGC do amplifikacji insercji cDNA w plazmidach. b) Sekwencje uniwersalnych starterów dla plazmidów DGC.

3. Hoduj 250 μl kultury bakteryjnej zawierającej plazmid na 96-dołkowych płytkach hodowlanych, dodając 240 μl pożywki LB na studzienkę przy odpowiednim doborze antybiotyków (rozcieńczenie 1:1000 1000 X antybiotyku) i 10 μl oryginalnych bakterii zawierających plazmid (z zapasu glicerolu). Uszczelnić taśmą uszczelniającą.
4. Inkubować przez wytrząsanie z prędkością 215 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc (O/N).
   UWAGA: Wykonaj nową kopię klonu plazmidu cDNA glicerolu bakteryjnego, aby zastąpić oryginał. Nie zamrażaj ponownie oryginalnego materiału bakteryjnego, ponieważ może to zabić bakterie.
5. Aby wytworzyć matryce do PCR, należy rozcieńczyć 10 μl kultury bakteryjnej O/N w 90 μl autoklawizowanego ddH₂O w każdym dołku nowej 96-dołkowej płytki do PCR. Denaturacja DNA przez 5 minut w temperaturze 95 °C w termocyklerze. Natychmiast umieść talerz na lodzie na co najmniej 5 minut.
6. Przygotować reakcje PCR przy użyciu odpowiednich uniwersalnych starterów zgodnie z tabelą 2.

Odczynniki	50 μl reakcji próbki	96 Dobrze wymieszać (112x reakcja)	Końcowe stężenie
2 X Mieszanka polimerazy PCR	25 μl	2800 μl	1 X
Primer_For (25 pmol/μl)	0,5 μl	56 μl	0,25 pmol/μl
Primer_Rev (25 pmol/μl)	0,5 μl	56 μl	0,25 pmol/μl
ddH2O	22 μl	2464 μl
łączny	48 μl	5376 μl

Tabela 2: PCR Master Mix.

7. Za pomocą pipety podamy 48 μl wzorca do PCR do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki PCR. Dodać 2 μl każdej zdenaturowanej matrycy DNA plazmidu na studzienkę.
   UWAGA: Użyj od 1 pikograma (pg) do 1 nanograma (ng) plazmidowego DNA. Nadmierna matryca DNA zmniejsza wydajność i swoistość PCR.
8. Zaprogramuj 96-dołkową maszynę do PCR zgodnie z tabelą 3 i wykonaj amplifikację.
   UWAGA: Czas przedłużenia w temperaturze 72°C zależy od wielkości produktu PCR (45 s dla ≤2,0 kb, 1,5 min dla ≤3,0 kb, 3 min dla ≤4,0 kb i 3,5 min dla 4,0-5,0 kb). Temperatura wyżarzania (Tm) jest określana przez sekwencję starterów. Gdy starter jest równy lub dłuższy niż 20 nt, Tm oblicza się jako:
   Tm (°C ) = (4 X liczba CG) + (2 X liczba AT) -4.

krok	temperatura	Godzina	Cykl(e)
Początkowa denaturacja	95 °C	Czas trwania: 3 min	1 cykl
Amplifikacja Denaturacja, wyżarzanie i wydłużanie	95 °C	45 sekund	30 cykli
	54-58 °C	45 sekund
	72 °C	45 sekund-3,5 min
Końcowe przedłużenie	72 °C	Czas trwania: 7 min	1 cykl
składowanie	4 °C	trzymać

Tabela 3: Zalecany program PCR.

9. Wytrącanie produktu PCR etanolem (EtOH) i octanem sodu (NaOAC) (patrz tabela 4).
   UWAGA: Jeśli objętość reakcji PCR jest mniejsza niż 50 μL, napełnij do 50 μL ddH₂O.
   1. W celu wytrącenia DNA należy zmieszać składniki z tabeli 4 i przechowywać próbki O/N w temperaturze -20 °C lub przez 30 minut w temperaturze -80 °C. Odwirować 96-dołkową płytkę przez 45-60 minut w temperaturze 2,250 x g w temperaturze 4 °C. Użyć 8-kanałowej pipety dozyłkowej, aby ostrożnie usunąć supernatant. Przemyć raz 160 μl zimnego 70% EtOH (bez RNazy) przez 30 minut w temperaturze 2 250 x g w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wytrącone DNA można zobaczyć na dnie studzienek. Krótsze produkty PCR wymagają dłuższego wirowania.
   2. Delikatnie odwróć 96-dołkową płytkę na ręczniku papierowym, aby usunąć ostatnie krople płynu z każdej studzienki (tak bardzo, jak to możliwe). Suchy na powietrzu granulat DNA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Ponownie zawiesić wytrącone DNA w 25 μl wody wolnej od RNazy.
      UWAGA: 1 godzina suszenia na powietrzu pozwoli na odparowanie wszystkich śladów EtOH. Jednak w każdym studzience powinna pozostać bardzo mała objętość płynu (około 1 μl), aby zapobiec całkowitemu wyschnięciu osadu DNA. Użyj 25 μl do 50 μl reakcji PCR. Na tym etapie nie należy używać wody uzdatnionej DEPC, aby uniknąć zakłóceń transkrypcji in vitro w kolejnych krokach.

składnik	głośność	część
Metoda PCR	50 μl
100 % etanolu	125 μl	2,5 x objętość PCR
3M NaOAc (pH = 5,2, bez RNazy)	5 μl	10% objętości PCR
łączny	180 μl

Tabela 4: Przykład reakcji PCR 50 μL.

10. Sprawdź wielkość i wydajność produktów PCR, przeprowadzając 5 μl zawieszonego roztworu DNA na 1 % żelu agarozowym w 1 X buforze TAE.
    UWAGA: Do reakcji transkrypcji in vitro wymagane jest łącznie 250-500 ng matrycy DNA. Próbki o wyższej wydajności można dodatkowo rozcieńczać. Wydajność RNA zależy również od sekwencji i długości matrycy DNA. Zgodnie z ogólnym przewodnikiem dotyczącym znakowania DIG-RNA polimerazą RNA T7, około 10 μg RNA znakowanego DIG jest wytwarzane z 1 μg zlinearyzowanej matrycy.

2. Transkrypcja in vitro w celu wygenerowania sond antysensownych.

UWAGA: Praca w środowisku wolnym od RNaz jest bardzo ważna. Wszystkie odczynniki i sprzęt laboratoryjny muszą być wolne od RNaz (takie jak certyfikowane plastikowe wyroby wolne od DNaz/RNaz).

(

składnik	Koncentracja zapasów	głośność	Końcowe stężenie
Atp	100 mM	7 μl	10 mM
Informacja o zgodności z umową	100 mM	7 μl	10 mM
GTP (GTP)	100 mM	7 μl	10 mM
Utp	100 mM	4,5 μl	6,5 mM
Dig-11-UTP	10 mM	25 μl	3,5 mM
Woda wolna od RNaz		19,5 μl
łączny		70 μl

Tabela 5: Przygotowanie mieszanki DIG-NTP.

składnik	15 μl reakcji	96 Dobrze wymieszać (112x reakcja)	Końcowa konc.
5-krotny bufor transkrypcyjny	3,00 μl	3,00 μl	1 x
Mieszanka Dig-NTP (10 mM)	0,75 μl	0,75 μl	0,5 mM
Inhibitor RNazy	0,25 μl	0,25 μl	0,67 U/ μl
Polimeraza RNA (T7 lub T3 lub SP6)	2,00 μl	2,00 μl	2,67 U/ μl
Woda wolna od RNaz	1,50 μl	1,50 μl
łączny	7,50 μl	7,50 μl

Tabela 6: 2X transkrypcja Master Mix.

1. Przygotuj mieszankę DIG-NTP zgodnie z tabelą 5.
   UWAGA: Aby uniknąć błędów, zawsze wyrównuj tabliczkę tak, aby A1 znajdował się w lewym górnym rogu tabliczki.
2. Dodać składniki opisane w Tabeli 6 do każdego dołka na nowej 96-dołkowej płytce do PCR (płytce sondy). Dodać 7,5 μl produktu PCR (matryca DNA) do każdego odpowiedniego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj płytkę taśmą uszczelniającą.
   UWAGA: Optymalna ilość produktu PCR dodawanego na reakcję transkrypcji powinna wynosić od 0,5 do 1 μg. Jeśli prążki na żelu są znacznie słabsze lub bardziej intensywne, objętość DNA dodanego do reakcji można odpowiednio dostosować. Dokładna ilość nie jest krytyczna.
3. Inkubować płytkę sondy w temperaturze 37 °C przez 3,5-4 godziny. Wymieszać 15 μl zsyntetyzowanej sondy z 35 μl ddH₂O poddanego działaniu DEPC, 125 μl 100 % EtOH i 5 μl 3 M NaOAC (pH = 5,2, bez RNazy). Przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 30 minut. Odwirować i przepłukać zgodnie z opisem w krokach 1.10.2 i 1.10.3.
4. Ponownie zawiesić wytrąconą sondę w 25 μl ddH₂O. Uruchom 5 μl na 1% żelu agarozowym (czas pracy < 20 minut), aby sprawdzić integralność i wydajność sondy (Rysunek 2).
   UWAGA: Żel agarozowy musi być wykonany z buforem ddH₂O i TAE poddanym działaniu DEPC. Aparatura do elektroforezy żelowej powinna być przeznaczona wyłącznie do pracy z RNA. Dłuższy czas pracy żelu przy niskiej prędkości może prowadzić do degradacji RNA podczas elektroforezy.
5. Zmieszać pozostałe 20 μl zsyntetyzowanej sondy ze 100 μl roztworu hybrydyzacyjnego (Tabela 7) i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebny.
   UWAGA: Stężenie sondy może być bardziej rozcieńczone, jeśli pasma są szczególnie wytrzymałe (patrz Rysunek 2 dla przykładów). Roztwór hybrydyzacyjny jest bardzo skuteczny w zapobieganiu zanieczyszczeniu RNazą. Natychmiast dodaj roztwór hybrydyzacyjny do ponownie zawieszonej sondy, aby uniknąć degradacji RNA. Roztwór hybrydyzacyjny należy przefiltrować przez filtr 0,2 μm. W przypadku próbek tkanek należy zwiększyć stężenie detergentu w roztworze hybrydyzacyjnym, dodając Triton-X-100 do końcowego stężenia 0,3 %.

składnik	głośność	Końcowe stężenie
DDH2O poddane działaniu DEPC	11,85 ml	23,7 %
20 x SSC	Pojemność 12,5 ml	25 % (5 X)
Formamid	Pojemność 25 ml	50 %
Heparyna (50 mg/ml)	Pojemność 0,1 ml	0,2 % (0,1 mg/ml)
Jednoniciowe DNA plemników łososia	Pojemność 0,5 ml	1.0 %
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Pojemność 0,05 ml	0.1 %
łączny	Pojemność 50,00 ml	100 %

Tabela 7: Rozwiązanie hybrydyzacyjne.

3. Hodowla i pobieranie zarodków, larw i tkanek dorosłych.

UWAGA: Zarówno dla hodowli much na małą skalę (butelki), jak i masowo (skrzynki), należy stosować standardowe protokoły laboratoryjne na żywności na bazie mąki kukurydzianej w temperaturze 25 °C. Utrzymuj odpowiednią gęstość dorosłych i larw oraz dostarczaj dodatkowe aktywne drożdże w proszku na powierzchni żywności.

1. Pobieraj zarodki zgodnie ze standardowymi protokołami. Główne etapy pobierania zarodków są zilustrowane w Rysunek 3.
   UWAGA: Po wypłukaniu zarodków dewitylizowanych w metanolu, utrwalone zarodki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku. Permeabilizację zarodka i postfiksację przeprowadza się w 1. dniu protokołu FISH.
2. Przygotować świeży 40 % roztwór podstawowy PFA.
   1. Przygotować świeżo przygotowany roztwór podstawowy 40% paraformaldehydu (PFA), mieszając 10 ml ddH₂O poddanego działaniu DEPC z 3,68 g PFA i 70 μl 2N KOH w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej małe mieszadło.
      Uwaga: PFA jest wysoce toksyczny z potencjalnymi ostrymi i przewlekłymi skutkami zdrowotnymi. Przeczytaj MSDS (Karty Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej) i używaj z odpowiednią ochroną oczu, skóry i dróg oddechowych.
   2. W dygestorii podgrzać i mieszać fiolkę przez 3-5 minut na płycie grzewczej w temperaturze 200 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia PFA. Usuń roztwór podstawowy PFA z ognia, gdy tylko PFA się rozpuści (nie przegrzewaj).
   3. Schłodzić rozpuszczony 40 % roztwór podstawowy PFA na lodzie przez 5 minut i przefiltrować za pomocą filtra 0,2 μm i strzykawki o pojemności 10 ml.
3. Larwy w trzecim stadium rozwojowym (L3) lub utrwalanie, hartowanie i przepuszczalność tkanek dorosłych
   UWAGA: Ten protokół powinien być gotowy w ciągu jednego dnia. Obejmuje rozwarstwienie tkanek, utrwalenie, wygaszanie endogennego HRP, przepuszczalność i po utrwaleniu.
   1. Przygotować roztwory mocujące (Fix-I i Fix-II) zgodnie z tabelą 8.
      UWAGA: Kwas pikrynowy jest stosowany jako dodatkowy utrwalacz, gdy tkanka ma delikatną strukturę, którą należy zachować. Nie jest dobrym utrwalaczem, gdy ultrastruktura tkanek musi być zachowana do mikroskopii elektronowej (EM).
      Ostrzeżenie: Kwas pikrynowy jest niestabilny i ma zdolność reagowania z innymi materiałami i tworzenia związków wybuchowych. Używaj i przechowuj zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa.
   2. Umieść larwy lub dorosłe muchy w plastikowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml zimnego 1 X PBS i 100 μL roztworu Fix-I. Schładzaj na lodzie przez 2 minuty, aby zmniejszyć ruchliwość larw lub dorosłych much.
   3. Odetnij końcówkę plastikowej końcówki o pojemności 1 ml, aby utworzyć otwór o średnicy 2-3 mm. Przenieść 10-30 larw lub dorosłych much za pomocą końcówki o pojemności 1 ml na szalkę Petriego (o średnicy 9 cm) z płytką warstwą 1 X PBS z probówki o pojemności 50 ml (krok 3.3.2). Dodanie odrobiny PBTT może zmniejszyć napięcie powierzchniowe. Ostrożnie wypreparować larwy (otwarte od przodu i ściskać tkanki od tyłu do przodu) lub dorosłe tkanki za pomocą pary ostrych kleszczy pod lunetą sekcyjną.
      UWAGA: Około 200-300 larw lub dorosłych jąder może zostać wypreparowanych i utrwalonych w ciągu jednego dnia przez doświadczone osoby.
   4. Wypreparowane tkanki należy przenieść za pomocą pipety o pojemności 200 μl (z odciętą końcówką w celu utworzenia otworu o średnicy 2 mm) do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie. Zakończ każdą rundę sekcji w ciągu 10-15 minut, zanim przejdziesz do następnego kroku.
      UWAGA: Kontynuuj z dodatkowymi rundami (w ciągu 2 godzin) zgodnie z wymaganiami, aby wytworzyć wystarczającą ilość materiału.
   5. Utrwal chusteczki za pomocą 800 μl roztworu Fix-I przez 30 minut na mikserze stołowym. Raz wypłukać chusteczki za pomocą 800 μl 1 X PBTT i trzymać probówki na lodzie maksymalnie przez 2,5 godziny. Ze względu na limit 30 minut, należy to robić partiami, aż do pobrania wystarczającej ilości tkanki.
   6. Zbierz wszystkie wypreparowane i utrwalone tkanki w jednej plastikowej tubie o pojemności 15 ml zawierającej siatkę w pokrywie (patrz Rysunek 4 dla projektu probówki). Odessać nadmiar płynu przez siatkę w pokrywie tuby. Przemyć 3 X 5 min każdy 10 ml 1 X PBTT. Spłucz dwukrotnie 10 ml 1 X PBS, aby usunąć detergent. Zapobiega to nadmiarowi pęcherzyków w następnym kroku.
      UWAGA: Jeśli wypreparowane tkanki opadają na dno probówki, czynności można wykonać na zwykłych płytkach do mikromiareczkowania lub probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5-1,5 ml (objętość 300-800 μl na probówkę).
   7. Stłumić endogenną aktywność HRP za pomocą 5 ml 0,3 % H₂O₂ w PBS przez 15 minut w RT. Powtórzyć jeszcze raz. Na tym etapie pozostaw pokrywę otwartą bez mieszania. Spłucz dwukrotnie 10 ml 1 X PBTT. Umyć dwukrotnie przez 5 minut 10 ml 1 X PBTT.
   8. Przepuszczalne tkanki należy przepuścić 10 ml 80% acetonu (-20 °C, wstępnie schłodzonego) w temperaturze -20 °C przez 10 minut. Odwrócić probówkę dwukrotnie w okresie inkubacji. Umyj dwukrotnie przez 10 minut 10 ml 1 X PBTT, aby nawodnić tkanki.
   9. Przepłukać 10 ml mieszaniną 5 ml PBTT i 5 ml roztworu hybrydyzacyjnego (1:1). Wyrzucić mieszaninę i zastąpić 10 ml roztworu hybrydyzacyjnego. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie przechowuj próbek dłużej niż tydzień.

)

składnik	Poprawka I (10 ml)	Fix II (10 ml)
40 % zapasu PFA	Pojemność 1 ml	Pojemność 1 ml
Certyfikat PBTT (PBTT	8,99 ml	Pojemność 9 ml
Roztwór kwasu pikrynowego	10 μl	-

Tabela 8: Roztwory mocujące do tkanek.

4. Hybrydyzacja in situ

UWAGA: Ta część protokołu wymaga minimum 2 dni, przy czym przygotowanie próbki, wstępna hybrydyzacja i hybrydyzacja mają miejsce w dniu 1 i wykrycie sondy w dniu 2. Jeśli liczba próbek jest stosunkowo duża, jeśli nie jest zaznajomiony z protokołem lub cały dzień nie jest możliwy, protokół należy wykonać w ciągu 3 dni z etapami wykrywania sondy i wzmocnienia sygnału podzielonymi na 2 dni. Duża liczba zarodków lub wypreparowanych próbek tkanek może również wymagać dodatkowych dni na przetworzenie. W przypadku wypreparowanych próbek tkanek należy zastąpić 1 X PBT 1 X PBTT na wszystkich etapach, chyba że wskazano inaczej. Dodatkowy detergent jest niezbędny do penetracji wielu larw i dorosłych tkanek, takich jak mózg i jądra. Chociaż nie jest to testowane, 1 X PBTT może być również stosowany w przypadku zarodków. Użyj 100 μl na studzienkę dla płytek 96-dołkowych i 800 μl dla probówek 1.5 ml.

1. Wstępna hybrydyzacja i hybrydyzacja
   UWAGA: Kroki 4.1.1-4.1.6.2 dotyczą hybrydyzacji zarodków in situ. W przypadku hybrydyzacji in situ larw lub tkanek dorosłych pomiń te kroki.
   1. Usunąć 2 ml utrwalonych zarodków (przechowywanych w metanolu w temperaturze -20 °C) do nowej probówki o pojemności 15 ml. Myj zarodki dwa razy przez 7 minut 10 ml metanolu w każdym płukaniu. Myć zarodki przez 7 minut 10 ml mieszaniny metanolu i 1 X PBTT (1:1). Umyj zarodki dwukrotnie przez 7 minut 10 ml 1 X PBTT w celu nawodnienia.
   2. W celu przenikania zarodków należy przygotować pośredni roztwór proteinazy K (40 μl/ml), rozcieńczając 1:500 z roztworu podstawowego (20 mg/ml). Przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować roboczy roztwór proteinazy K, rozcieńczając pośredni roztwór proteinazy K 1/15 w 1 X PBTT do końcowego stężenia roboczego 2,667 ug/ml.
   3. Przepuszczalność zarodków za pomocą 10 ml roboczego roztworu proteinazy K (mniej stosować w przypadku mniejszej liczby zarodków). Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 13 minut. Delikatnie odwróć probówkę 4 razy podczas inkubacji. Próbki inkubować w roztworze proteinazy K na lodzie przez 1 godzinę bez mieszania.
      UWAGA: Ta stosunkowo długa inkubacja z rozcieńczoną proteinazą K zapewnia powtarzalnie równomierną przepuszczalność i późniejsze barwienie.
   4. Podczas gdy zarodki przenikają, przygotuj 2 mg/ml roztworu glicyny z 10 X Stock (20 mg / ml) w 1 X PBTT o całkowitej objętości 30 ml.
   5. Usunąć roztwór proteinazy K, spłukać 10 ml roztworu glicyny (2 mg/ml) i przemyć dwukrotnie przez 2 minuty każdy. Spłucz trzy razy 10 ml 1 X PBTT w celu usunięcia glicyny.
   6. Po utrwaleniu zarodków.
      1. Przygotuj 10 ml 4% PFA (1 ml 40% PFA w 9 ml PBTT, przefiltrowane przez filtr 0,45 μm).
      2. Próbki inkubować w 4% PFA przez 20 minut. Przemyć 3 razy przez 2 minuty za pomocą PBTT.
      3. Aby przygotować zdenaturowany roztwór hybrydyzacyjny, gotuj roztwór hybrydyzacyjny przez 5 minut. Aby uzyskać pełną 96-dołkową płytkę, użyj trzech probówek po 12 ml. Schłodzić na lodzie natychmiast przez 5 minut.
      4. Przepłukać zarodki raz 10 ml 1 X PBTT: roztwór hybrydyzacyjny (1:1). Przepłukać dwukrotnie 5 ml roztworu hybrydyzacyjnego. Podwielokrotność ~ 20 μL na studzienkę osiadłych zarodków (30-40 zarodków) lub utrwalonych tkanek na 96-dołkowej płytce PCR na lodzie. Usunąć roztwór hybrydyzacyjny z tkanek lub zarodków za pomocą 8-kanałowej pipety kolektorowej (Rysunek 1/wideo).
         UWAGA: Pipeta kolektora jest wyposażona w "ogranicznik", który zapobiega opadaniu końcówek na dno studzienek i usuwaniu próbki. W przypadku eksperymentów z użyciem chusteczek, które unoszą się na wodzie, ostrożnie usuń płyn pipetą o pojemności 100 μl od góry.
   7. Dodać 100 μl zdenaturowanego roztworu hybrydyzacyjnego do każdego dołka. Wstępną hybrydyzację zarodków przez minimum 2,5-3 godziny w temperaturze 56 °C przy użyciu urządzenia grzewczego do suchej kąpieli zawierającego metalowe kulki (patrz materiały i Rysunek 1).
   8. Denaturować 100 μl przygotowanej sondy na 96-dołkowej płytce PCR za pomocą termocyklera przez 5 minut w temperaturze 80 °C. Natychmiast schłodzić na lodzie przez 5 minut. Usuń roztwór przed hybrydyzacją z zarodków lub tkanek. Do każdej próbki dodać denaturowane sondy specyficzne dla genu, przykryć taśmą uszczelniającą i hybrydyzować w temperaturze 56 °C przez 16-18 godzin O/N, pod metalowymi kulkami w urządzeniu grzewczym do suchej kąpieli.

5. Wykrywanie sondy

1. Roztwory z tabeli 9 podgrzać wstępnie w urządzeniu grzewczym o temperaturze 56 °C. Wyjmij sondy z płyty.
   UWAGA: Sondy mogą być ponownie użyte od 2 do 3 razy, jeśli są przechowywane w temperaturze -80 °C (nigdy nie przechowuj żadnych próbek RNA w temperaturze -20 °C). Po hybrydyzacji dwuniciowy RNA jest bardziej stabilny niż jednoniciowy RNA i jest mniej podatny na degradację spowodowaną zanieczyszczeniem RNazą.
   W przypadku korzystania z wielodołkowego systemu filtracji próżniowej do tkanek, pod płytką filtracyjną powinna znajdować się płytka zbiorcza w celu zebrania sond (szczegóły montażu można znaleźć na filmie). Zhybrydyzowane tkanki będą musiały zostać przeniesione ze zwykłej 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej używanej do hybrydyzacji do takiej z membranami PVDF o wielkości porów 1,2 μm na dnie każdej studzienki.

krok	Wstępnie podgrzany roztwór (56 °C)	Godzina	Objętość na studzienkę
1	Rozwiązanie hybrydyzacyjne:PBTT (3:1)	Czas trwania: 15 min	100 μl
cyfra arabska	Rozwiązanie hybrydyzacyjne:PBTT (3:1)	Czas trwania: 15 min	100 μl
3	Rozwiązanie hybrydyzacyjne:PBTT (1:1)	Czas trwania: 15 min	100 μl
4	Rozwiązanie hybrydyzacyjne:PBTT (1:3)	Czas trwania: 15 min	100 μl
5	PBTT 3 prania	Czas trwania: 5 min	100 μl

Tabela 9: Mycie sond po hybrydyzacji.

2. W przypadku stosowania normalnych płytek należy umyć próbki zgodnie z tabelą 9 w urządzeniu grzewczym w temperaturze 56 °C. W przypadku korzystania z systemu rozdzielacza próżniowego należy użyć podgrzanych roztworów z systemem próżniowym na stole i usunąć roztwory bezpośrednio od dołu za pomocą podciśnienia. Po 3 umyciu 1 X PBTT normalną płytkę można wyjąć z urządzenia grzewczego.
3. Przygotuj przeciwciała.
   1. Przygotować 11 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (2,5 μg/ml) z zapasu (1 mg/ml), rozcieńczając mysie przeciwciało monoklonalne anty-DIG sprzężone z biotyną (patrz lista materiałów) w PBTTB (1:400). W przypadku przetwarzania mniejszej liczby próbek należy odpowiednio dostosować objętości.
   2. Przygotować 11 ml roztworu streptawidyny-HRP (1 μg/ml) z zapasu (1 mg/ml), rozcieńczając 1:1000 koniugatu streptawidyna-HRP (patrz lista materiałów) w PBTTB. Jeśli używasz mniejszej liczby próbek, odpowiednio dostosuj objętość.
4. Zablokować zarodki lub tkanki za pomocą PBTTB (1 % odtłuszczonego mleka w 1 X PBTT) przez 20 minut na mieszalniku stołowym w temperaturze RT.
   UWAGA: Przefiltruj PBTTB za pomocą bibuły filtracyjnej (klasa 3, 6 μm) przed użyciem jej na 96-dołkowych płytach filtracyjnych, aby uniknąć zatkania filtrów. Zamiast PBTB, PBTTB (PBTB z dodatkowym 0,3% Triton-X-100) jest stosowany dla wszystkich tkanek podczas protokołu.
5. Inkubować zarodki lub tkanki w roztworze przeciwciał (100 μl/basenik) przez 2 godziny na laboratoryjnym mieszalniku próbek. Spłukać dwukrotnie 1x PBTTB. Myć 3 X przez 5 min i 5 X przez 10 min z PBTTB. Inkubować zarodki lub tkanki w roztworze streptawidyny-HRP (100 μl/basenik) przez 1,5 godziny przy użyciu laboratoryjnego mieszalnika próbek. Myć 2 X przez 5 min z PBTTB. Od tego momentu należy przechowywać próbki w ciemności.
   Uwaga: podczas wszystkich płukania przeciwciałami, jeśli tkanka jest tracona z powodu zmętnienia wytwarzanego przez mleko, spróbuj umyć bez mleka (PBTT zamiast PBTTB).
6. Przygotować roztwór DAPI, rozcieńczając 100 X DAPI w PBTTB (1:100).
7. Inkubować zarodki lub tkanki w roztworze DAPI (100 μl/basenik) przez 15 minut w laboratoryjnym mieszalniku próbek. Myć 4 X przez 10 minut z PBTT. Przechowywać 96-dołkową płytkę z próbkami O/N w temperaturze 4 °C lub przejść do następnego etapu.
   UWAGA: W tym miejscu procedurę można wstrzymać.

6. Wykrywanie przeciwciał za pomocą tyramide (zobacz Rysunek 5)

UWAGA: Tutaj użyto domowej roboty cyjaniny 3-sprzężonej tyramide, która została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w ¹². W przypadku wykonywania wielu eksperymentów lub testowania wielu próbek pozwala to zaoszczędzić znaczną ilość pieniędzy i jest skuteczne w porównaniu z odczynnikami komercyjnymi (z doświadczenia). W przypadku mniejszej liczby eksperymentów i próbek można użyć dostępnego na rynku cyjaniny 3-tyramidu (patrz Materiały).

1. Umyć płytki próbek 3 X przez 5 minut za pomocą 1 X PBTT.
2. Przygotować bufor aktywacyjny tyramidu (bufor aktywacyjny) zawierający 0,006 %_H2O2w PBTT (rozcieńczony 30% (m/m)_H2O2podstawa 1:5000).
3. Przepłukać płytki buforem aktywacyjnym.
4. Przygotować roztwór cyjaniny 3-tyramide, rozcieńczając go w buforze aktywacyjnym w probówce o pojemności 15 ml.
   1. W przypadku zarodków należy zastosować rozcieńczenie 1:80 (137 μl cyjaniny 3-tyramidu w 11 ml buforu aktywacyjnego). W przypadku tkanek larwalnych należy zastosować rozcieńczenie 1:150 (73 μl cyjaniny3-tyramidu w 11 ml buforu aktywacyjnego). W przypadku dorosłych jąder należy zastosować rozcieńczenie 1:200 (55 μl cyjaniny3-tyramidu w 11 ml buforu aktywacyjnego). W przypadku dorosłych jajników należy zastosować rozcieńczenie 1:300 (36 μl cyjaniny3-tyramidu w 11 ml buforu aktywacyjnego).
5. Próbki inkubować w roztworze cyjaniny-3-tyramidu przez 2 godziny w laboratoryjnym mieszalniku próbek. Spłucz cztery razy PBTT. Myć 6 X przez 10 min z PBTT. Umyj 3 X przez 5 minut za pomocą PBS, aby usunąć detergent.
6. Dodaj 150 μl/studzienkę środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Utrzymywać próbki O/N w temperaturze 4 °C, aby umożliwić tkankom lub zarodkom opadnięcie na dno probówki. Umieścić próbki na szkiełkach mikroskopowych (pod zakresem preparacji tkanek) i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
7. Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
   Uwaga: najpierw przeanalizuj kontrolę negatywną, aby zorientować się, jakie jest "niespecyficzne" tło.
    

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia przykłady wyników uzyskanych przy użyciu tej procedury. Górne 3 panele pokazują przykłady wczesnych embrionów Drosophila (Rysunek 6, panele A-C), kolejne 3 panele przedstawiają przykłady późnych embrionów Drosophila z sygnałami w różnych tkankach (odpowiednio: amnioserosa, mięśnie i ośrodkowy układ nerwowy (Rysunek 6, panele D-F). Następnie zaprezentowano przykłady z tkanek larw trzeciego stadium (Rysunek 6, panele G-J). Panele K i L przedstawiają reprezentatywne obrazy z gonad osobników dorosłych (odpowiednio jajnika i jądra). Setki obrazów zostały przesłane i opisane w naszej przeszukiwalnej „bazie danych fluorescencyjnej in situ muszki owocowej” (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

Rysunek 1. Schemat protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz kluczowy sprzęt. (A) Amplifikacja cDNA metodą PCR. (B) Transkrypcja in vitro w celu wytworzenia specyficznych dla genu sond RNA antysensownych znakowanych DIG na płytce 96-dołkowej (na zdjęciu b pokazano płytkę). (C) oraz (D): Dorosłe muchy (stosunek samic do samców 2:1, 300-400 much na butelkę) są pozostawiane do kopulacji przez 3-4 dni. Zarodki zebrane przez noc na standardowej pożywce kukurydzianej w temperaturze 25 °C są przenoszone do dobrze wentylowanego plastikowego pudełka (1 L pożywki kukurydzianej w pojemniku o wymiarach 8" x 8" x 3" DłxSzerxWys) lub do nowych butelek z zachowaniem odpowiedniej gęstości larw. W celu pobrania tkanek, 24 lub 48 h po złożeniu jaj (AEL), na wierzch pożywki należy posypać aktywny proszek drożdżowy. (E do H): Eksperymenty fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ przeprowadzone w ciągu 3 kolejnych dni. W przypadku zarodków lub tkanek, które nie pływają, należy użyć płytki PCR 96-dołkowej, jak pokazano na zdjęciu b, z aspiratorem 8-kanałowym (zdjęcie c). W przypadku tkanek pływających, takich jak większość tkanek larwalnych, należy użyć płytki z filtrem na dnie (zdjęcie w d) i usunąć ciecz z dna za pomocą aspiratora wielokanałowego przy niskim ciśnieniu (zdjęcie w e). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Wyznaczenie wydajności sondy RNA. Nowo zsyntetyzowane antysensowne sondy RNA obserwowane na żelu agarozowym 1 % (5 µL/ścieżka). Wydajność można sklasyfikować (na podstawie intensywności prążka) jako „niską” w ścieżkach 3 i 10, „typową” w ścieżkach 1, 4, 5, 6 i 8 lub „wysoką” w ścieżkach 2, 7, 9, 11 i 12. W przypadku próbek o „typowym wydajności”, należy użyć 10-15 µL sondy rozcieńczonej w 100 µL roztworu do hybrydyzacji dla każdego eksperymentu in situ. Próbki o „wysokiej wydajności” sondy należy rozcieńczyć dodatkowym roztworem do hybrydyzacji, zależnie od intensywności prążka w stosunku do intensywności „typowej sondy”. Należy dążyć do uzyskania w przybliżeniu równych końcowych stężeń sondy w każdym dołku. Strzałka wskazuje jedną z „sond RNA”, wyższy prążek na każdej ścieżce to oryginalna matryca DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 3. Główne etapy masowego pobierania i utrwalania embrionów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Samodzielnie wykonana probówka do usuwania cieczy z tkanek larwalnych lub pływających. Niektóre tkanki larwalne i dorosłe pływają w roztworze podczas fiksacji. To proste narzędzie składa się z nylonowej siatki utrzymywanej przez odciętą końcówkę o pojemności 200 µL, a następnie końcówkę o pojemności 1 mL służącą jako adapter do połączenia z aspiratorem. Ciecz można bezpiecznie usunąć bez utraty tkanki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA). (1) Sonda RNA antysensowna znakowana DIG hybrydyzuje z endogennym RNA sensownym. (2) Wiązanie immunoafinitywne pomiędzy przeciwciałem pierwszorzędowym koniugowanym z biotyną a DIG-UTP. (3) Streptawidyna koniugowana z HRP wiąże biotynę. (4) HRP katalizuje reakcję cyjaniny 3-tyramidu i nadtlenku wodoru, tworząc krótkotrwałe rodniki cyjaniny 3-tyramidu. (5) Rodniki cyjaniny 3-tyramidu wiążą się z resztami tyrozyny w pobliskich białkach. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 6. Reprezentatywne obrazy hybrydyzacji in situ. Każdy panel przedstawia przykład innego RNA (kolor cyjan) oraz jądra zabarwione DAPI (kolor czerwony). (A-C) Przykłady wczesnych embrionów Drosophila. (D, F) Przykłady późnych embrionów Drosophila. (G-J) Przykłady tkanek larwalnych Drosophila trzeciego przyrzutu (odpowiednio cewki Malpighiego, jelito środkowe, gruczoł ślinowy i mięsień). (K) Jajnik dorosłej osobniczki. (L) Jądro dorosłego osobnika. Każdy panel zawiera nazwę genu, z którym hybrydyzuje sonda. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisany protokół zapewnia wysoce powtarzalną, czułą i ekonomiczną metodę wykrywania większości RNA w utrwalonych zarodkach lub tkankach Drosophila. Chociaż jest nieco bardziej skomplikowana niż bardziej tradycyjnie stosowana metoda wykrywania sondy za pomocą fosfatazy alkalicznej, rozdzielczość uzyskana przez FISH jest znacznie większa, a czułość porównywalna lub lepsza ^7,8. Dzięki zastosowaniu całych lub częściowych płytek mikromiareczkowych, protokoły mogą być wykorzystywane do analiz genów na dużą skalę lub w ograniczonym zakresie. Należy zauważyć, że wygenerowane sondy mogą wykrywać wszystkie lub wiele form splicingu transkryptu, chyba że sondy są bardziej szczegółowo zaprojektowane (tj. Pojedyncze eksony). Chociaż testowaliśmy sondy tak małe, jak 200 nukleotydów z rozsądnym powodzeniem, mniejsze sondy są zwykle mniej skuteczne i mogą być mniej specyficzne. Oczywiste jest, że protokół ten nie jest odpowiedni do wykrywania małych intronów, eksonów lub przetworzonych mikroRNA.

Chociaż podejście to wykorzystuje etap enzymatyczny w celu zwiększenia siły sygnałów, intensywność sygnału wydaje się być proporcjonalna do ekspresji genu docelowego w stosunkowo liniowym i szerokim zakresie poziomów ekspresji. Przy większym powiększeniu sygnał jest postrzegany jako puncta lub plamki w komórkach i tkankach. W przypadku stosunkowo rzadkich transkryptów widocznych jest tylko kilka maleńkich puncta. Wraz ze wzrostem obfitości transkryptów rosną one pod względem liczby i wielkości. Podobnie jak w przypadku jednocząsteczkowych FISH (smFISH), pojedyncze małe puncta mogą również odpowiadać pojedynczym RNA i powinny być również łatwo oznaczone ilościowo za pomocą oprogramowania do obrazowania i informatyki. Porównania opublikowanych obrazów uzyskanych za pomocą smFISH z obrazami, które wyselekcjonowaliśmy dla tych samych celów, sugerują, że ogólna, czułość i rozdzielczość obu metod są stosunkowo podobne, chociaż powinno to zostać przetestowane za pomocą bardziej rygorystycznych porównań. Biorąc pod uwagę znacznie wyższy koszt smFISH, przedstawiona tutaj metoda powinna dać podobne wyniki za ułamek kosztów. Jeśli jednak celem jest wykrycie małych transkryptów lub odrębnych części transkryptów, zaleca się smFISH.

Ze względu na mniejszy rozmiar niektórych sond FISH, metoda ta może być również lepsza w penetracji tkanek, które są duże lub mają znaczne bariery. Jednak wydaje się, że nasze użycie wyższych poziomów detergentów oraz poprawki utrwalania tkanek i przepuszczalności rozwiązały ten problem. Wreszcie, chociaż opracowane dla tkanek Drosophila , opisane tutaj o wysokiej zawartości detergentów dla wypreparowanych tkanek powinny również działać w przypadku zarodków Drosophila , a także większości innych organizmów i tkanek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml Polipropylenowe stożkowe probówki	wirówkowe Frogga Bio	TB15-500	Certyfikat bez DNaz i RNaz
2x PCR Master Mix z barwnikiem (Ambiogen)	Biomart (Kanada)	141106-1K	Certyfikowany bez DNaz i RNaz
50 ml Polipropylenowe stożkowe probówki	Frogga Bio	TB50-500	bez DNaz i RNaz
(1,2 μm, hydrofilowa PVDF membrana	EMD MILLIPORE	MSBVS1210	Służy do usuwania języczka z dna płytki za pomocą tkanek flotujących
96-dołkowa płytka do PCR (200 μ l)	Denville	C18096-10
Filtr strzykawkowy Acrodisc (0,2 u)	PALL	PN4612
Filtr strzykawkowy Acrodisc (0,45 u)	PALL	PN4614
Agarose	Bioshop	AGA002.500
Płytki do przechowywania testów AXYGEN 96-well	UltiDent Scientific	24-P96-450V-C	Do przechowywania zapasów glicerolu bakteryjnego
AXYGEN Aluminium Uszczelki płytowe	UltiDent Scientific	24-PCR-AS-200	Do uszczelniania płyt
AXYGEN Końcówki o szerokim otworze (200 ul)	UltiDent Scientific	24-T205-WB-C	Do przenoszenia próbek
Biotin-SP (long spacer) Frakcja IgG Monoklonalna mysia anty-digoksyna	Jackson ImmunoResearch Lab	200062156	Przeciwciało pierwszorzędowe do in situ (stężenie zapasowe 1 mg/ml, stężenie robocze 2,5 μ g/ml lub rozcieńczenie 1:400.
MARKA 8-kanałowa kolektor (autoklawowalna)	BrandTech Scientific Inc.	704526	Aby usunąć płyny z wierzchu 96-dołkowych płytek PCR
Chloramfenikol	Sigma-aldrich	C1919	Stężenie podstawowe 34 mg / ml rozpuszczone i 0,2μ m przefiltrowany w 100 % EtOH (stosować jako 1/1000)
Cyjanina 3 Tyramid (Cy3-TSA)	Domowa produkcja		Można zamówić w Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan)	Sigma-aldrich	D2522	Odczynnik zapobiegający blaknięciu w podłożu montażowym
Digoxigenin-11-urydyno-5'-trifosforan	Roche	11-209-256-910
Klatka do pobierania zarodków	Strona główna wykonane	Nie dotyczy	Rozmiar: 75 cm X 75 cm X 75 cm wykonane z Wirówka z polimetakrylanu metylu
Eppendorf 5804	Eppendorf	Model 5804	Wirówka do płytek 96-dołkowych na wirniku A-Z-DWP Formamid
	Bioshop	FOR001.500
Glicerol	Bioshop	GLY002.4
Glicyna	Bioshop	GLN001.500
Heparyna	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Zapas: 50 mg / ml. Stężenie robocze 1 mg / ml w roztworze hybrydyzacyjnym
Lab Armor Beads	DiaMed	LAA42370-001	Wypełnij jednostkę grzewczą
Labnet Gyro M Mini mikser nutacyjny Fisher	Scientific	50-998-347	Mieszanie próbek
Siatka - 100 mikrokonów	FlyStuff	57-103	Do pobierania zarodków
Siatka - 800 mikronów	SEFAR - Nytex	06-780/53	Do wyłapywania luźnych tkanek / może być stosowany do specjalnej rurki na rysunku 4.
Okulary Micro Cover	VWR	48366-067	Rozmiar: 22 X 22 mm
Mikroszkiełka, frstd	VWR	48312-003	Rozmiar: 25 X 75 mm
Multi-Well Plate Vacuum Manifold	Pall Corporation	P/N 5017	Usuń płyn z dna 96-dołkowej płytki filtracyjnej
Paraformaldehyd (PFA)	Bioshop	PAR070.500	Maszyna do PCR do utrwalania
	Bio-Rad	Model: Silnik DNA PTC-200	96-dołkowa płytka PCR i denaturacja sondy
Roztwór kwasu pikrynowego	Sigma-aldrich	80456	Do utrwalania tkanek I roztwór
Chlorek potasu (KCL)	Bioshop	POC308
Pokrywka PP do płytek 96-dołkowych, 100 sztuk w opakowaniu	UltiDent Scientific	24-P-LID-PP	Pokrywka do przechowywania płytek
Jednorazowe zbiorniki na odczynniki Progene (50 ml, sterylne)	UltiDent Scientific	825-1-50-5S	Obsługa cieczy
Folia aluminiowa do przekłuwania progenów	UltiDent Scientific	87-CFILM-AL	Seal 96-dołkowa płytka, proteinaza wolna od DNaz i RNaz
K	Sigma-aldrich	P2308-5MG	Permeabilizacja zarodków
Inhibitor rybonukleazy RiboLock	Thermo Scientific	EO0381	40 Unit/ul
Zestaw trifosforanu rybonukleozydu (NTP)	Roche	11277057001	Syteza sondy RNA
Woda wolna od RNaz	GIBCO	10977015-500ml	Synteza sondy
RNA RNaseZap	Ambion	AM9780	Usuń zanieczyszczenie RNazą
Jednoniciowe DNA z jąder łososia	Sigma-aldrich	D9156	Do roztworu hybrydyzacyjnego
Mleko odtłuszczone (beztłuszczowe)	Bioshop	SKI400.500	Stężenie robocze wynosi 1 % w 1 X PBT lub PBTT jako odczynnik blokujący
Octan sodu (NaOAc) 3 M, pH = 5,2 (bez RNazy)	Bioshop	SAA333	Stężenie robocze wynosi 10 % (v/v) dla wytrącania DNA lub RNA
SP6 Polimeraza RNA	Thermo Scientific	EP0131	20 Jednostka/ul
Śrut ze stali nierdzewnej do kąpieli piaskowej	VWR	13259-274.	Aby napełnić urządzenie grzewcze
Mikroskop stereoskopowy i źródło światła na gęsiej szyi	Leica	: MZ6	Sekcja i montaż tkanek
Streptawidyna, koniugat peroksydazy chrzanowej (HRP)	Sondy molekularne	S911	Zapas przeciwciał drugorzędowych: 1 mg / ml, użyj rozcieńczenia 1/1000 (1 μ g/ml) dla in situ.
Polimeraza RNA T3	Thermo Scientific	EP0101	20 Jednostka/ul
Polimeraza RNA T7	Thermo Scientific	EP0111	20 Jednostka/ul
Stacja końcówek (10 ul)	Axygen	T-300-STK-S	wolna od DNaz i RNaz
(200 ul)	Certyfikat Sorbio	27770T	Końcówki wolne od DNaz i RNaz
(1 ml)	Certyfikat Sorbio	10200	Bez DNaz i RNaz
TRITON X-100	Bioshop	TRX506	Stężenie robocze wynosi 0,3% w 1 X PBT dla tkanek in situ
Tween 20	Bioshop	TWN510	Stężenie robocze wynosi 0,1% w 1 X PBT dla zarodków in situ
Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman, klasa 3	Sigma-aldrich	WHA1003917
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Uwagi
Solutions			Preparat
DABCO (1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan) glicerol antyblakowy nośnik montażowy			DABCO (1,25 g), glicerol (35 ml lub v/v 70 %) i 1 X PBS (15 ml lub v/v 30 %). Trzymaj ciemność i skały w chłodnym pomieszczeniu. Przechowywać w temperaturze -20 & C
1 X PBT (1L)			1 X PBS z 1 ml Tween 20 (0,1 %)
1 X PBTT (1L)			1 X PBS z 1 ml Tween 20 (0,1 %) i 3 ml Triton-X-100 (0,3 %)
1 X PBTB (1L)			1 % Mleko odtłuszczone w 1 X PBT
1 X PBTTB (1L)			1 % Mleko odtłuszczone w 1 X PBTT

wirówkowe Certyfikowana 96-dołkowa płytka filtracyjna Model Certyfikowana stacja końcówek