Obecny protokół opisuje metodę, dzięki której użytkownicy mogą utrzymać żywotność ostrych preparatów wycinków hipokampa i kory mózgowej podczas zbierania danych z mikroskopii rezonansu magnetycznego.
Artykuł metodologiczny
Wspomaganie metaboliczne wyciętych, żywych tkanek mózgowych podczas akwizycji pod mikroskopią rezonansu magnetycznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje procedury niezbędne do wspierania normalnych funkcji metabolicznych preparatów do ostrego wycinka mózgu podczas zbierania danych z mikroskopii rezonansu magnetycznego (MR). Chociaż możliwe jest wykonanie badań MR na żywych, wyciętych tkankach ssaków, takie eksperymenty są tradycyjnie ograniczone limitami rozdzielczości i dlatego nie są w stanie uwidocznić mikrostruktury tkanki. I odwrotnie, protokoły MR, które osiągnęły mikroskopijną rozdzielczość obrazu, wymagały użycia utrwalonych próbek, aby zaspokoić potrzebę statycznych, niezmiennych warunków przez długi czas skanowania. Obecny protokół opisuje pierwszą dostępną technikę rezonansu magnetycznego, która umożliwia obrazowanie żywych próbek tkanek ssaków w rozdzielczości mikroskopowej. Takie dane mają ogromne znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób zmiany kontrastu na podstawie patologii zachodzące na poziomie mikroskopowym wpływają na treść makroskopowych skanów MR, takich jak te stosowane w klinice. Gdy takie zrozumienie zostanie zrealizowane, można opracować metody diagnostyczne o większej czułości i dokładności, co przełoży się bezpośrednio na wcześniejsze leczenie choroby, dokładniejsze monitorowanie terapii i lepsze wyniki pacjentów.
Podczas gdy opisana metodologia skupia się na przygotowaniach do wycinków mózgu, protokół można dostosować do każdego wyciętego wycinka tkanki, biorąc pod uwagę, że zmiany są wprowadzane do preparatów gazowych i perfuzyjnych, aby dostosować się do specyficznych potrzeb metabolicznych tkanki. Pomyślne wykonanie protokołu powinno zaowocować żywymi, ostrymi preparatami plastrowymi, które wykazują stabilność sygnału dyfuzji MR przez okres do 15,5 godziny. Głównymi zaletami obecnego systemu w porównaniu z innymi aparatami perfuzyjnymi kompatybilnymi z MR są jego kompatybilność ze sprzętem do mikroskopii MR wymaganym do uzyskania obrazów o wyższej rozdzielczości oraz zdolność do zapewnienia stałego, nieprzerwanego przepływu przy starannie regulowanych warunkach perfuzyjnych. W przypadku tego projektu należy wziąć pod uwagę zmniejszoną przepustowość próbki, ponieważ w danym momencie można obrazować tylko jeden wycinek tkanki.
Wprowadzenie
W miarę jak systemy rezonansu magnetycznego (MRI) stale rozwijały się do coraz wyższych natężeń pola, coraz więcej szczegółów na temat składu i statusu żywych tkanek stało się dostrzegalnych. Pomimo takiego postępu sprzętowego, obrazowanie MR w rozdzielczościach wystarczających do wizualizacji struktur komórkowych tkanek nadal nie jest dostępne w klinice. W związku z tym należy wywnioskować charakterystykę tkanek na poziomie komórkowym przy rozważaniu treści skanów klinicznych. Takie wnioskowanie wymaga znajomości równoważnych procesów zebranych z danych pobranych w systemach modelowych, które można obserwować bezpośrednio. Tradycyjnie, modele te obejmowały komórki organizmów wodnych, takich jak oocyt Xenopus laevis i Aplysia californica L7 neuron1,2. Były to jedne z pierwszych komórek zwierzęcych dostępnych do obserwacji metodami MR ze względu na ich nietypowo duże rozmiary: odpowiednio około 1000 μm i 300 μm średnicy. Ostatnio postępy w projektowaniu sprzętu pozwoliły na zobrazowanie jednego z największych przykładów komórek ssaków - neuronu ruchowego α - za pomocą technik mikroskopii MR na utrwalonej tkance3,4. Podczas gdy badania te wykazały bezpośrednią wizualizację materiału komórkowego ssaków za pomocą MR, zastosowane próbki stałe różnią się znacznie pod względem właściwości MR od żywej tkanki, a zatem nie mogą służyć jako równoważny reprezentatywny model5,6. Co ważniejsze, obserwacja zmian kontrastu MR, które zachodzą w połączeniu ze złożonymi procesami biologicznymi, wymaga żywych próbek, które można zaburzyć i zmierzyć w trakcie eksperymentu obrazowego.
Aby ułatwić badania mikroskopowe MR na żywych tkankach, przedstawiono protokół, który zawiera komercyjny sprzęt do mikroobrazowania7 połączony z specjalnie zbudowanym, kompatybilnym z MR, wbudowanym w otwór natleniaczem i urządzeniem perfuzyjnym, wcześniej opisanym8. Unikalne zalety tej konstrukcji obejmują możliwość rozwiązywania na poziomie komórkowym w tkankach ssaków oraz precyzyjną kontrolę zawartości rozpuszczonego gazu i pH w miejscu perfuzji tkanek. Ponadto, w przeciwieństwie do większości badań MR eksplantacji, które przerywają perfuzję podczas akwizycji obrazu, aby uniknąć artefaktów przepływu, ten projekt wspiera stosowanie ciągłej perfuzji podczas zbierania danych, co jak wykazano, poprawia stan fizjologiczny izolowanych tkanek9,10. Wreszcie, zamknięta komora zapisu i sprzęt do przechowywania warstw pomagają zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia artefaktów ruchu, które w przeciwnym razie mogłyby wystąpić podczas długotrwałego zbierania obrazów.
Podczas gdy obecny protokół opisuje procedury odpowiednie do stosowania z ostrymi wycinkami hipokampa i kory mózgowej, precyzyjna kontrola nad metabolitami perfuzyjnymi umożliwia temu systemowi dostosowanie się do szerokiej gamy różnych typów tkanek i warunków eksperymentalnych. Ograniczenia tej konstrukcji obejmują zmniejszenie przepustowości próbki w porównaniu z wielowarstwową komorą perfuzyjną11; Jednak to ograniczenie może zostać przezwyciężone w przyszłości za pomocą układów wielocewkowych.
Ponadto, podczas gdy opisany system może być stosowany zarówno w konfiguracji poziomej, jak i pionowej, obecny protokół oferuje jego zastosowanie w pionowo zorientowanym spektrometrze 600 MHz. Każdy system zdolny do badań mikroobrazowych MR - zwykle spektrometry o wąskim otworze (≤6 cm) i wysokim polu (≥500 MHz) - będzie przystosowany do opisanego natleniacza i sprzętu perfuzyjnego. Jednak zmiany w cewce obrazowej, gradientzie, systemie sondy lub innym niezbędnym sprzęcie do obrazowania mogą wymagać zmian w sprzęcie perfuzyjnym i parametrach skanowania MR.
Protokół
Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach są zgodne z wytycznymi zawartymi w Przewodniku Narodowej Akademii Nauk dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Florydy (IACUC). Przestrzegaj wszystkich obowiązujących zasad i przepisów podczas angażowania się w badania na zwierzętach.
1. Przygotowanie perfuzatu do konserwacji tkanek ośrodkowego układu nerwowego
- Wykonaj świeży sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF).
- Aby wytworzyć 2 litry buforowanego wodorowęglanem perfuzatu aCSF, odmierz 1,500 ml wody oczyszczonej przez podwójną destylację lub odwróconą osmozę do kolby o pojemności 4 l. Umieścić mieszadło magnetyczne w kolbie i wymieszać płyn za pomocą płytki mieszającej.
- W oczyszczonej wodzie rozpuścić następujące ilości soli: 14,03 g (120 mM) chlorku sodu, 4,37 g (26 mM) wodorowęglanu sodu, 0,41 g (1,5 mM) jednozasadowego fosforanu potasu, 0,69 g (1,4 mM) siedmiowodnego siarczanu magnezu, 0,59 g (2 mM) dwuwodnego chlorku wapnia, 0,45 g (3 mM) chlorku potasu i 3,6 g (10 mM) glukozy.
UWAGA: Zawartość chemiczna perfuzatu będzie się różnić w zależności od specyficznych wymagań metabolicznych tkanki i pożądanych warunków eksperymentu. - Dokładnie wymieszaj ten roztwór, aż wszystkie sole się rozpuszczą. Dostosuj objętość do 2 l, używając dodatkowej oczyszczonej wody.
- Zbadaj osmolalność aCSF za pomocą osmometru obniżającego temperaturę zamarzania. Dostosuj do 300 mOsm/kg za pomocą sorbitolu. Dodanie 324 mg sorbitolu do 2 l perfuzatu 299 mOsm/kg aCSF zwiększy osmolalność do 300 mOsm/kg (około 1 mOsm na 324 mg).
UWAGA: aCSF może być przechowywany w temperaturze 4 °C w szczelnej, szczelnie zamkniętej butelce przez okres nieprzekraczający 24 godzin.
2. Konfiguracja systemu perfuzji
- Przygotować perfuzat aCSF.
- Zrównoważyć aCSF do temperatury otoczenia (~23 °C) podczas gazowania 95% karbogenu (95% O2, 5% CO2; 1/16 l/min) poprzez bezpośrednie bulgotanie przez nie mniej niż 1 h.
UWAGA: Różne typy tkanek lub pożądane warunki eksperymentalne mogą wymagać dostosowania temperatury perfuzatu lub zawartości gazu. Pożądane warunki zawartości rozpuszczonego gazu w perfuzacie można precyzyjnie kontrolować poprzez zmianę stężeń procentowych poszczególnych składników gazu zasilającego (Rysunek 1). - Gdy aCSF osiągnie wymaganą temperaturę i nasycenie karbogenem, upewnij się, że pH mieści się w zakresie fizjologicznym (7,3 - 7,4). Kontynuuj wprowadzanie gazu bezpośrednio do zbiornika perfuzatu (1/16 l/min) przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać odpowiednią zawartość rozpuszczonego tlenu i warunki pH sprzyjające zdrowemu metabolizmowi tkanek.
- Zrównoważyć aCSF do temperatury otoczenia (~23 °C) podczas gazowania 95% karbogenu (95% O2, 5% CO2; 1/16 l/min) poprzez bezpośrednie bulgotanie przez nie mniej niż 1 h.
- Zagruntować linie perfuzyjne.
- Zanurzyć rurkę wlotową podłączoną do mikropompy perystaltycznej w przygotowanym aCSF (300 mOsm, pH 7,3 - 7,4, stale gazowany).
- Przełóż urządzenie natleniające (Rysunek 2) i linie perfuzyjne zarówno przez otwór magnesu, jak i stos cewek gradientowych (od góry do dołu) i odłóż cewki na bok do momentu montażu sondy. Zawieś natleniacz nad zlewką, aby złapać ścieki aCSF.
UWAGA: W zależności od konstrukcji systemu MRI, przed zalaniem systemu za pomocą CSF może być konieczne przepuszczenie linii perfuzyjnych przez otwór magnesu i cewki gradientowe lub podstawę korpusu sondy. Upewnij się, że umieszczenie linii perfuzyjnej nie będzie kolidować z montażem korpusu sondy lub włożeniem sondy do otworu przed rozpoczęciem procedury zalewania. - Upewnij się, że wybrano zamierzone natężenie przepływu (2 ml/min) i rozpocznij napełnianie przewodów perfuzyjnych, włączając pompę.
- Odwróć pustą, wbudowaną pułapkę bąbelkową tak, aby CSF wyparł powietrze zawarte w środku.
- Podłącz port gazowy natleniacza do drugiego źródła karbogenu (kolektora lub wtórnej butli z karbogenem) i ustaw natężenie przepływu na 1/16 l/min.
- Upewnij się, że karbogen przepływa przez membranę wymiany gazowej oksygenatora, zanurzając otwór wylotowy na górze oksygenatora w wodzie.
- Po wykryciu kapania płynu CSF z komory perfuzyjnej, należy usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki gazu z przewodów doprowadzających poprzez ręczne mieszanie.
- Upewnij się, że natleniacz działa prawidłowo, zanurzając elektrodę tlenową w aCSF wypływającym z komory perfuzyjnej.
UWAGA: Odczyt na tlenomierzu powinien być zbliżony do procentowej zawartości tlenu w dostarczonym gazie.
3. Przygotowanie tkanek
- eutanazja
- Umieścić szczura (125 - 150 g) w komorze indukcyjnej aparatu do znieczulenia i wystawić na działanie 4% izofluranu w gazie nośnym tlenu w ilości 1 l/min przez 4 minuty.
- Usuń nieprzytomnego szczura z komory anestezjologicznej.
- Wykonaj test odruchu prostującego, umieszczając szczura w pozycji leżącej. Sprawdź, czy nie ma żadnych ruchów – obracania głowy, podnoszenia nóg, zginania kręgosłupa itp. – wskazujących, że zwierzę przewraca się na brzuch.
- Wykonaj test odruchowy mrugania oczami, dotykając otwartego oka zwierzęcia za pomocą bawełnianego wacika. Sprawdź, czy nie ma żadnej reakcji - zamknięcie pokrywy, drżenie mięśni itp. - na ten bodziec sensoryczny.
- Na koniec wykonaj test odruchu wycofania kończyny, ściskając skórę między palcami wyciągniętej tylnej nogi szczura za pomocą pęsety lub hemostatów. Sprawdź, czy noga jest zgięta.
UWAGA: W przypadku pozytywnego wyniku testu odruchowego nie należy przystępować do eutanazji. - W przypadku, gdy którykolwiek z trzech testów odruchowych wywoła reakcję, należy natychmiast zwrócić szczura do komory anestezjologicznej i pozostawić dodatkowe 2 minuty ekspozycji na 4% izofluranu.
- Wykonaj wszystkie trzy testy refleksyjne w całości. W razie potrzeby powtórz 2-minutową ekspozycję na znieczulenie i kontynuuj dopiero wtedy, gdy zaobserwujesz całkowity brak odpowiedzi na wszystkie trzy testy odruchowe.
- Poddaj szczura eutanazji za pomocą gilotyny.
- Resekcja mózgu
- Usuń mózg szczura przez grubą sekcję. Zacznij z głową w pozycji leżącej. Za pomocą nożyczek przetnij skórę od tyłu szyi do nosa i odsłoń czaszkę.
- Usuń tkanki miękkie z powierzchni czaszki za pomocą sondy.
- Pracując od końca ogonowego, usuń kości potyliczne, ciemieniowe i czołowe czaszki za pomocą rongeurs.
- Cofnij oponę twardą, przecinając wzdłuż podłużnej szczeliny mikronożyczkami i odrywając warstwę z obu półkul.
- Usuń mózg z czaszki, obracając głowę do pozycji leżącej na plecach i przecinając nerwy czaszkowe po stronie brzusznej.
- Izolacja plasterków
- Przywróć mózg do pozycji leżącej i odizoluj centralną część zawierającą hipokamp, usuwając wszystkie tkanki: ogonowe do szczeliny poprzecznej i rostralne do fimbrii. Wykonaj dwa nacięcia wzdłuż płaszczyzny poprzecznej (tj. plastry koronalne) brzytwą o prostych krawędziach.
- Przymocuj najbardziej ogonową płaszczyznę mózgu do środka kąpieli wibratomicznej za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
- Dodaj lodowaty, bąbelkowany karbogenem aCSF do kąpieli do cięcia wibratomu i umieść w nim nylonowy osprzęt mocujący.
- Pokrój plastry o grubości 300 μm, aby uzyskać od 3 do 4 użytecznych preparatów w postaci plastrów na półkulę (łącznie 6 do 8 ).
- Odizoluj hipokamp lub sekcję korową od jednej półkuli i przytnij plasterek tak, aby dobrze pasował do tkanki mikrocewki o średnicy 5 mm.
4. Pozycjonowanie próbki i montaż systemu perfuzyjnego
- Przygotowanie cewki
- Napełnij komorę tkankową mikrocewki natlenionym aCSF z kąpieli tnącej wibratomu za pomocą pipety transferowej.
- Weź przyciętą próbkę mózgu i umieść obszar zainteresowania (np. warstwę komórek piramidalnych) nad mikrocewką za pomocą lunety preparacyjnej.
- Włożyć urządzenie zatrzymujące tkankę (nylonową siatkę przymocowaną do nylonowej podkładki), aby utrzymać pozycję próbki przez cały czas trwania eksperymentu obrazowego.
UWAGA: Postępuj szybko przez procedurę pozycjonowania próbki, aby zminimalizować ekspozycję na intensywne światło. W razie potrzeby dostarczyć dodatkowy natleniony aCSF za pomocą pipety transferowej.
- Montaż natleniacza w otworze, mikrocewki i sondy
- Zabezpiecz zmodyfikowany zespół mikrocewki (Rysunek 3) w zacisku stołowym i przymocuj urządzenie natleniacza w otworze, wkładając kołek acetalowy do otworu na górze cewki.
- Uszczelnij system perfuzyjny, umieszczając komorę perfuzyjną nad tkanką mikrocewki i zaciskając je razem za pomocą miniaturowej opaski kablowej.
- Przyciąć nadmiar długości z opaski kablowej za pomocą nożyc do drutu.
UWAGA: Po pomyślnym uszczelnieniu należy zaobserwować perfuzat wychodzący przez przewody odpływowe i nie powinien być widoczny wyciek wokół silikonowej uszczelki komory perfuzyjnej. Brak potwierdzenia tych warunków przed montażem sondy może spowodować poważne uszkodzenie sprzętu do obrazowania. - Gdy będzie można zobaczyć, jak płyn CSF kapie do zbiornika na odpady, weź mikrocewkę i natleniacz i przymocuj zespół do górnej części korpusu sondy obrazującej.
- Nasuń stos gradientu na zespół i umieść gradient na górze sondy. Zamieszczono zdjęcia przedstawiające względne rozmieszczenie i prawidłowe połączenie elementów sprzętowych cewki, natleniacza i sondy (Rysunek 4).
5. Przeprowadzanie zbierania obrazów MR
- Wkładanie zmontowanej sondy do otworu magnesu
- Umieść korpus sondy w bliskiej odległości od otworu otworu spektrometru w dolnej części magnesu.
- Wciągnij nadmiar przewodów perfuzyjnych przez otwór w górnej części magnesu.
- Gdy cały dostępny luz zostanie usunięty z linii perfuzyjnych, wsuń korpus sondy do otworu magnesu u podstawy, jednocześnie usuwając więcej luzu z przewodów perfuzyjnych od góry otworu.
- Wkręć dwie mocujące u podstawy sondy w odpowiednie szczeliny w stosie podkładek.
- Przed kontynuowaniem sprawdź, czy przewody perfuzyjne nie zostały ściśnięte lub zagięte podczas wkładania sondy, potwierdzając odpływ płynu CSF do zbiornika na odpady.
UWAGA: Brak potwierdzenia odpływu perfuzatu może spowodować trwałe uszkodzenie linii perfuzyjnych i grozi katastrofalnym uszkodzeniem sprzętu do obrazowania MR. - W przypadku, gdy nie widać perfuzatu wychodzącego z przewodu powrotnego do zbiornika na odpady, należy zdjąć korpus sondy i potwierdzić, że przepływ perfuzatu został wznowiony przed próbą ponownego włożenia. Schematyczny układ zmontowanego systemu perfuzyjnego i spektrometru obrazowania został opisany wcześniej8.
- Podłączanie korpusu sondy
- Podłącz przewody wody doprowadzającej i odpływowej z gradientowego agregatu chłodniczego.
- Włączyć pompę gradientowego agregatu chłodniczego i potwierdzić ustawienie temperatury wody (19 °C).
- Podłącz wąż powietrzny z agregatu chłodniczego powietrza do korpusu sondy za pomocą węża clamp.
- Przekręć pokrętło przepływu na agregatie chłodniczym do pozycji "1".
- Podłącz przewód termopary do korpusu sondy.
- Podłącz koncentryczny od przedwzmacniacza do wejścia/wyjścia o częstotliwości radiowej (RF) w kanale protonowym (H) korpusu sondy.
- Podłącz zasilający od gradientu amplifiers do korpusu sondy.
- Wewnątrz szafy RF włącz zasilanie jednostki kompensacyjnej B0, wszystkich trzech gradientów amplifiers (x,y,z) i jednostka główna.
- Przygotowanie spektrometru
- Ustaw zamierzoną temperaturę otworu za pomocą modułu regulacji temperatury zmiennej na konsoli.
- Dopasuj (impedancja) i dostrój (częstotliwość) obwód RF, regulując zmienne kondensatory w sondzie. Osiąga się to poprzez manipulowanie różdżkami u podstawy korpusu sondy.
- Dostosuj bieżące ustawienia cewek podkładkowych spektrometru, aby zmaksymalizować jednorodność pola magnetycznego w próbce.
- Rozpocznij zbieranie obrazów
- Zbierz obrazy pilotażowe, aby określić położenie przestrzenne próbki w otworze magnesu. Typowe parametry dla dwuwymiarowego echa gradientowego są następujące (TR/TE = 100/4 ms, średnie = 1, kąt impulsu = 30o, czas = 6 sekund, matryca = 64 x 64, pole widzenia = 0,3 x 0,3 cm, rozdzielczość = 47 x 47 μm).
- Zbierz piloty ważone dyfuzją, aby potwierdzić prawidłową geometrię skanu i położenie tkanki, jeśli ma to zastosowanie. Typowe parametry dla dwuwymiarowego skanu pilotowego ważonego dyfuzją są następujące (TR/TE = 2000/11,6 ms, czas = 4,3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, średnie = 1, b = 1200 (1860 efektywny) s/mm2, matryca = 64 x 64, pole widzenia = 0,2 x 0,2 cm, rozdzielczość = 31 μm).
- Zebrać szeregi czasowe ważone dyfuzją, aby określić charakterystykę stabilności preparatu z ostrym plastrem. Typowe parametry dla dwuwymiarowego obrazu ważonego dyfuzją są następujące (TR/TE = 2000/11,6 ms, czas = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, średnie = 42, b = 1200 s/mm2, matryca = 64 x 64, pole widzenia = 0,2 x 0,2 cm, rozdzielczość = 31 μm). Uwaga: Charakterystyka stabilności w danym systemie będzie się różnić od opisanego protokołu w zależności od takich czynników, jak zastosowany kontrast MR (np. T1, T2, dyfuzja, podatność), badane zakłócenia fizyczne oraz zmiana sygnału MR w jednostce czasu wynikająca z tego zaburzenia.
Wyniki
Przygotowanie perfuzatu
Po prawidłowym zastosowaniu urządzenia do natleniania wewnątrzprzewodowego, gazy zawarte w dostarczanym karbogenie osiągną stan 100% nasycenia w perfuzacie aCSF. Można to zademonstrować poprzez zmianę stężenia tlenu w dostarczanym gazie i pomiar zmiany zawartości tlenu rozpuszczonego w perfuzacie aCSF wewnątrz komory perfuzyjnej za pomocą oksymetru (Rycina 1)8. Zgodnie z prawem Henry'ego, ilość gazu rozpuszczonego w równowadze z próbką cieczy jest wprost proporcjonalna do ciśnienia parcjalnego tego gazu, pod warunkiem zachowania stałej temperatury12. Wykorzystując tę wiedzę oraz precyzyjne wzorce gazowe, możliwe jest ilościowe określenie zawartości tlenu rozpuszczonego w próbce aCSF w opisany sposób. Osiąga się to poprzez kalibrację oksymetru przy użyciu nasyconych roztworów aCSF (napowietrzanych bezpośrednio przez 1 h lub dłużej), wystawionych na działanie gazów o znanym składzie: jednego gazu o wysokim stężeniu tlenu, takiego jak karbogen (95% O2), oraz drugiego o niskim stężeniu tlenu, takiego jak azot (0% O2). Następnie pomiary można wykonać, zanurzając końcówkę elektrody tlenowej w próbce. Potwierdzenie prawidłowego działania natleniacza wewnątrzprzewodowego można uzyskać poprzez pomiar odcieku z otworu perfuzyjnego. Procent tlenu rozpuszczonego zmierzony oksymetrem powinien odpowiadać procentowemu stężeniu tlenu dostarczanego w gazie zasilającym. Jeśli wartości zmierzone są niższe niż w gazie zasilającym, sugeruje to awarię sprzętową, która może prowadzić do niewydolności metabolicznej w skrawku tkanki.
Wygląd i właściwości próbki
Przygotowania ostrych przekrojów, które otrzymują perfuzję wystarczającą do dostarczenia niezbędnych metabolitów i odprowadzenia produktów przemiany materii, szybko osiągają stan względnej stabilności. Od tego momentu ostre przekroje mogą być poddawane zewnętrznym zaburzeniom, a ich reakcje na te zmiany mogą być mierzone w celach badań naukowych. W eksperymentach MR powszechną praktyką służącą do wykazania względnej stabilności przygotowań ostrych przekrojów jest śledzenie sygnału zainteresowania w czasie13. Sygnał ważony dyfuzją jest szczególnie czuły na zmiany w mobilności, zawartości i rozkładzie wody w tkance, co potwierdza wykorzystanie tego mechanizmu kontrastowego do wykrywania ognisk zawału w udarze niedokrwiennym14,15. Wykres znormalizowanego sygnału dyfuzji w czasie w ostrych przekrojach kory utrzymywanych w różnych warunkach perfuzji wykazuje względną stabilność (2 ± 3% przez 15,5 h) po uzyskaniu izolacji tkanki (Rycina 5). Stabilność sygnału dyfuzji była utrzymana niezależnie od warunków perfuzji (przerywana lub ciągła) lub długości skanowania MRI (krótkie [4 min] lub długie [1,5 h])8. Jeśli przekroje nie wykazują stabilności sygnału w czasie, jak w przypadku gwałtownego wzrostu sygnału dyfuzji obserwowanego w żywej korze niepoddanej perfuzji, sugeruje to nieoptymalne warunki eksperymentalne. Eksperymentów z zaburzeniami nie należy podejmować przed potwierdzeniem stabilnych warunków sygnału w przygotowaniach przekrojów.
Oprócz stabilności sygnału, w momencie zbierania obrazów należy potwierdzić prawidłowe ustawienie próbki. Mimo że pozycja próbki jest kontrolowana podczas umieszczania tkanki pod mikroskopem sekcyjnym, przesunięcia mogą wystąpić podczas montażu aparatury perfuzyjnej lub w wyniku gwałtownego obchodzenia się z cewką lub sondą przed włożeniem ich do magnesu. Potwierdzenie prawidłowego umieszczenia hipokampa można uzyskać poprzez wykonanie krótkich (2 min) skanów pilotażowych z kontrastem dyfuzyjnym (Rysunek 6). Ponieważ warstwa komórek piramidowych jest bardziej wrażliwa na ważenie dyfuzyjne niż sąsiednie blaszki hipokampa, struktura ta pojawi się jako ciemniejszy pas na obrazach ważonych dyfuzyjnie. Ustawienia, w których nie występuje ta charakterystyczna cecha, wskazują na próbki przesunięte poza centrum i prawdopodobnie będą wymagały powtórzenia.
Rycina 1: Zawartość tlenu rozpuszczonego w perfuzacie aCSF w funkcji procentowej zawartości O2 w gazie zasilającym. Jako gaz zasilający wykorzystano mieszaniny karbogenowe o zmiennych stężeniach tlenu (95%, 60% i 19%). Następnie dokonano pomiarów procentowej zawartości rozpuszczonego tlenu w studni perfuzyjnej i porównano je z dwoma znanymi kontrolami: rezerwuarem perfuzatu bezpośrednio napowietrzanego karbogenem (95% O2) oraz rezerwuarem perfuzatu wystawionym na warunki atmosferyczne (23% O2). W każdym przypadku procentowe nasycenie tlenem w miejscu perfuzji tkanki zbliżało się do 100% stężenia O2 w zastosowanej mieszaninie karbogenowej. Słupki błędów odpowiadają odchyleniu standardowemu średnich z próbek. Rycina reprodukowana za zgodą autora oryginalnego artykułu8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Schemat natleniacza wewnątrzborego i komory perfuzyjnej. Schemat ten przedstawia szczegółowe elementy konstrukcyjne odpowiedzialne za działanie tych kluczowych urządzeń. Świeży perfuzat, który został przepompowany przez pułapkę pęcherzykową, wprowadzany jest do natleniacza przez górną część probówki NMR 10 mm. Następnie przechodzi on do silikonowej rurki o wysokiej przepuszczalności gazów (segment niebieski), która jest zwinięta wokół umieszczonej wewnątrz, otwartej z obu stron probówki NMR 5 mm. Gaz carbogen doprowadzany przez górną część probówki 5 mm wnika do komory przez otwarty dół i przepływa nad zwiniętą rurką silikonową, zanim opuści natleniacz przez otwór wentylacyjny w zakrętce probówki 10 mm. Podczas tej ekspozycji perfuzat przepływający przez rurkę silikonową nasyca się chemicznymi składnikami doprowadzanej mieszaniny gazów. Po opuszczeniu natleniacza perfuzat trafia bezpośrednio do komory perfuzyjnej, a następnie do linii powrotnej prowadzącej do zbiornika na odpady. Pozostałe komponenty istotne dla tej konstrukcji to acetalowy kołek wsporczy, który umożliwia pionowe ustawienie natleniacza na zmodyfikowanej mikcewce RF, uszczelka silikonowa (czerwony pierścień), która tworzy szczelną barierę dla cieczy między komorą perfuzyjną natleniacza a wgłębieniem na tkankę w mikcewce, oraz wcięcie na opaskę zaciskową, umożliwiające zamocowanie opaski służącej do utworzenia tej odwracalnej uszczelnienia. Rysunek został zmodyfikowany i powielony za zgodą autora oryginalnego artykułu8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Modyfikacje zespołu mikrocewki umożliwiające interfejs z oksygenatorem wewnątrz otworu magnesu. W bocznej części zespołu wycięto dwa rowki o wymiarach 3,0 mm x 1,5 mm (czarne strzałki), które mieszczą szerokość opaski zaciskowej używanej do uszczelnienia komory perfuzyjnej. Kanał (15 mm x 3 mm x 4 mm) łączy rowki na tylnej ścianie cewki. Dwie nylonowe przekładki umieszczone po bokach kanału (czerwone strzałki) pełnią funkcję zatrzasku dla głowicy opaski zaciskowej, co ułatwia procedurę uszczelniania. Otwór (2 mm x 14 mm) wywiercony w górnej części zespołu cewki (żółta strzałka) łączy się z acetalowym kołkiem wsporczym w celu zamocowania oksygenatora. Rycina ta została zmodyfikowana i przedrukowana za zgodą z oryginalnego artykułu8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Fotomontaż przedstawiający względne rozmieszczenie i prawidłowy montaż mikrocewki, oksygenatora oraz elementów sondy. Zdjęcia te przedstawiają kluczowe komponenty sprzętowe oksygenatora wewnątrz otworu oraz urządzenia do mikroperfuzji i ilustrują, w jaki sposób poszczególne części łączą się ze sobą. (A) Zdjęcie w widoku rozbitym pokazujące względne rozmieszczenie wszystkich elementów przed uszczelnieniem otworu na tkankę lub montażem korpusu sondy. Dołożono starań, aby dokładnie przedstawić względne położenie części; jednak w tej serii fragment linii perfuzyjnych został zagięty, aby wszystkie komponenty zmieściły się w ramie obrazu. (1 = głowica sondy, 2 = zespół mikrocewki, 3 = nylonowy pierścień mocujący tkankę, 4 = otwór perfuzyjny, 5 = opaska zaciskowa, 6 = oksygenator wewnątrz otworu, 7 = cewki gradientowe, 8 = pułapka pęcherzyków powietrza). (B) Komponenty po montażu cewki i oksygenatora. Na tym zdjęciu nylonowy pierścień mocujący został umieszczony w otworze na tkankę mikrocewki w celu zabezpieczenia próbki. Acetalowy kołek wsporczy u podstawy oksygenatora został zabezpieczony w odpowiadającym mu otworze na górze mikrocewki. Silikonowa uszczelka na otwartym końcu otworu perfuzyjnego została nałożona na otwór na tkankę, a opaska zaciskowa została zaciśnięta wokół tych elementów w celu uszczelnienia komory perfuzyjnej. Na koniec podstawa mikrocewki została połączona z górną częścią głowicy sondy. (C) Komponenty po montażu sondy. Na ostatnim panelu nadmiar długości opaski zaciskowej został przycięty na równo z mikrocewką. Następnie stos cewek gradientowych jest wsuwany na miejsce poprzez ostrożne przesuwanie cylindra w stronę sondy, przeprowadzając nadmiar linii perfuzyjnych, oksygenator i mikrocewkę przez jego pusty środek. Po połączeniu gradientów z głowicą sondy są one utrzymywane na miejscu poprzez przykręcenie pierścienia zabezpieczającego sondy do gwintowanej podstawy gradientów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 5: Stabilność sygnału dyfuzji w świeżych skrawkach kory poddanych superfuzji. (A) Znormalizowane wartości sygnału dyfuzji w czterech świeżych skrawkach poddanych różnym paradygmatom superfuzji przedstawiono w funkcji czasu przez okres do 21,5 h po eutanazji. Skrawki utrzymują wartości sygnału dyfuzji w zakresie ± 5% pomiaru początkowego przez okres 15,5 h po eutanazji, niezależnie od tego, czy superfuzja była ciągła czy przerywana, oraz niezależnie od długości skanowania MR (1,5 h lub 4 min). Rejestracje sygnału pobrane z kory utrwalonej w formaldehydzie służą jako kontrola pozytywna (n = 1) stabilności ze względu na statyczny, niezmienny charakter utrwalonych próbek tkanek. Z kolei sygnał dyfuzji zmierzony w żywym skrawku bez wsparcia superfuzji (n = 1) służy jako kontrola niedoborów metabolicznych. Parametry eksperymentalne różnych prób superfuzji są następujące: ciągła (superfuzja zawsze włączona, czas skanowania = 1,5 h), przerywana (superfuzja włączona w 10-minutowym odstępie między skanowaniami, czas skanowania = 1,5 h), długi odstęp, długie skanowanie (superfuzja włączona podczas skanowania, ale przerwana na 10 min między skanowaniami, czas skanowania = 1,5 h), długi odstęp, krótkie skanowanie (superfuzja włączona w 1,5-godzinnym odstępie między skanowaniami, czas skanowania = 4 min). (B) Przeanalizowane dane przedstawiające średnie grupowe z czterech eksperymentów superfuzji żywych skrawków z panelu (A). Profil sygnału dyfuzji z pogrupowanych, perfundowanych skrawków kory wykazuje niewielkie zmienności w czasie (2 ± 3% przez 15,5 h), podczas gdy kontrola nieperfundowana (n = 1) wykazuje gwałtowną niestabilność sygnału na wczesnym etapie eksperymentu (15% do 6,5 h). Rycina została zmodyfikowana i powielona za zgodą autorów oryginalnego artykułu8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Potwierdzenie rozmieszczenia skrawka hipokampa podczas obrazowania pilotażowego. Przed rozpoczęciem rozszerzonej sesji mikroskopii MR, prawidłowe rozmieszczenie próbki jest krytyczne, aby uniknąć marnowania zasobów, takich jak czas pracy skanera i kosztowne dodatki do perfuzatu. Warstwę komórek piramidowych w obszarze CA1 hipokampa można zwizualizować w szybszych (4,3 min), niższych rozdzielczo (31 μm x 31 μm w płaszczyźnie) skanach pilotażowych, aby upewnić się, że interesująca tkanka jest prawidłowo rozmieszczona względem mikrocewki. Parametry skanowania wspólne dla obu obrazów są następujące: TR/TE = 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, średnie = 1. (A) b = 0 (227 efektywne) s/mm2. W tym wstępnym skanie stratum pyramidale jest ledwie widoczne jako szary, ukośny pas wyśrodkowany w profilu wzbudzenia cewki. (B) b = 1,200 (1,860 efektywne) s/mm2. Przy wyższym ważeniu dyfuzyjnym kontrast międzywarstwowy wzrasta, ponieważ warstwa komórek piramidowych staje się ciemniejsza od tkanek w sąsiednich warstwach (powyżej: stratum oriens; poniżej: stratum radiatum). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Obecny protokół opisuje procedury niezbędne do standardowego utrzymania metabolizmu preparatów z ostrym wycinkiem mózgu poddawanych mikroskopii rezonansu magnetycznego. Procedura ta jest jedyną obecnie dostępną metodą, która pozwala na wizualizację tkanek żywych ssaków za pomocą rezonansu magnetycznego w rozdzielczościach zdolnych do rozdzielania komórek. Podczas gdy opisane warunki perfuzjatu są dostosowane specjalnie do tkanek ośrodkowego układu nerwowego, protokół można w dużym stopniu dostosować do każdego sposobu przygotowania żywych tkanek poprzez dostosowanie składników perfuzatu i gazów, a także szybkości przepływu i temperatury perfuzji.
Do najczęstszych problemów, które mogą wystąpić podczas opisywanych procedur, należą te związane z awariami w dostarczaniu metabolitów. Wytrącanie się soli wapnia może wystąpić wewnątrz aCSF podczas niedoboru gazu w wyniku awarii systemu buforowania wodorowęglanów. Takie osady mogą zatkać linie perfuzyjne i spowodować poważne uszkodzenie sprzętu. Jeśli po zmontowaniu sondy zaobserwuje się wytrącanie się soli w perfuzacie, należy natychmiast przerwać przepływ perfuzyjny, wyłączając pompę perystaltyczną. Potwierdzić obecność wystarczającego poziomu wodorowęglanu sodu (4,37 g / 2 l) w perfuzacie, poziomu CO2 (5,0%) w gazie zasilającym i przepływu gazu karbonowego (1/16 l / min) zarówno do zbiornika, jak i natleniacza. Na koniec upewnij się, że poziom pH jest ustabilizowany w zakresie fizjologicznym (7,3 - 7,4). W przypadku, gdy poziom tlenu gazowego i pH nadal nie jest odpowiednio regulowany, membranę wymiany gazowej należy wymienić.
Jeżeli warstwy nie wykazują stabilności sygnału w zamierzonym przebiegu doświadczalnym w czasie, należy potwierdzić, że w mieszaninie aCSF obecne są właściwe składniki chemiczne i że zachowana jest prawidłowa osmolalność (300 mOsm) i pH (7,3 - 7,4). Upewnij się również, że gaz karbonowy jest dostarczany do zbiornika perfuzatu i natleniacza z prędkością 1/16 l/min. Jeśli te kroki nie poprawią warunków perfuzacji, zaleca się wymianę membrany wymiany gazu. Jeśli stabilność tkanek nie zostanie osiągnięta po rozwiązaniu problemów z warunkami perfuzacji, należy rozważyć udoskonalenie protokołu chirurgicznego, koncentrując się na zminimalizowaniu odstępu czasu między pobraniem tkanki a zastosowaniem perfuzji.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637) oraz National Science Foundation (umowa o współpracy nr. DMR-1157490) za pośrednictwem Narodowego Laboratorium Wysokiego Pola Magnetycznego (NHMFL) Zaawansowanego Obrazowania i Spektroskopii Rezonansu Magnetycznego (AMRIS) w UF i stanie Floryda.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Preparat perfuzyjny | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | osmometr z depresją punktu zamarzania |
| Płytka mieszająca Typ 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetyczna płyta mieszająca z elementem grzejnym |
| Miernik pH Accumet Basic | Miernik pH | Fisher Scientific | AB15 |
| Sonda pH | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | do pomiaru pH |
| Mikroelektrody miernika tlenu | Inc. | Miernik OM-4 | do pobierania próbek zawartości tlenu w gazach lub zawartości tlenu rozpuszczonego w cieczy perfuzatorów |
| Electrode Oxygen | Microelectrodes Inc. | Mikrosonda MI-730 | do miernika tlenu |
| Scale | Denver Instrument Co. | Mikrowaga A-160 | do ważenia składników chemicznych |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Przygotowanie plastrów | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Krajalnica wibracyjna do tkanek | serii 1000 |
| Mikroskop preparacyjny | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | blat, lornetka mikroskopowa dysekcyjnego |
| < silny>Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| System perfuzyjny | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | perystaltyczna pompa mikroperfuzyjna |
| Reduktory tlenu x 2 | Urządzenie Victor Medical | VMG-05LY | do regulacji przepływu gazu |
| Butle karbogeniczne w rozmiarze e x 2 | powietrznego | do pomiaru gazu karbonowego | |
| opracowany w domu | urządzenie odpowiedzialne za regulację pH i tlenu w perfuzacie | ||
| Nazwa | >Company | Numer katalogowy< | strong>Komentarze |
| MR Sprzęt do obrazowania | |||
| Micro Surface Coil (średnica 200 mm, zmodyfikowana) | Bruker Biospin | B6371/0001 | czteroobrotowa mikro (średnica 200 mm) cewka o częstotliwości radiowej |
| Korpus sondy Micro 5 Sonda | Bruker Biospin | Z3395 | stosowana w paśmie 600 MHz spektrometr |
| Cewki gradientowe Micro 5 Stos | Bruker Biospin | M81111 | używany z korpusem sondy micro 5 |
| Spektrometr 600 MHz Magnes | nadprzewodzący Oxford Instruments (14,1 T) używany do generowania obrazów MR | ||
| generacja | |||
| Dmuchawa powietrza | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Agregat wody lodowej używany w połączeniu z wężownicą grzewczą sondy do regulacji temperatury wewnątrz otworu magnesu |
| Gradientowy agregat chłodniczy | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Agregat wody lodowej służący do odprowadzania ciepła wytwarzanego przez cewki gradientowe |
Bibliografia
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095(2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
Przedruki i uprawnienia
