Artykuł metodologiczny

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

DOI:

10.3791/56294

⸱

2 października 2017

 ,  ,  , 
1Diamond Light Source, Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science & Innovation Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych i szczepionek przeciwko Streptococcus pneumoniae (pneumokokom) jest konieczne, aby zatrzymać szybki wzrost liczby wielu opornych szczepów. Białka wiążące substraty węglowodanowe (SBP) stanowią realne cele dla rozwoju szczepionek opartych na białkach i nowych środków przeciwdrobnoustrojowych ze względu na ich lokalizację zewnątrzkomórkową i kluczowe znaczenie importu węglowodanów dla metabolizmu pneumokoków. Opisano tutaj zracjonalizowany, zintegrowany protokół do przeprowadzenia kompleksowej charakterystyki SP0092, który można rozszerzyć na inne węglowodany SBP z pneumokoków i innych bakterii. Procedura ta może pomóc w projektowaniu inhibitorów tej klasy białek w oparciu o strukturę. W pierwszej części tego manuskryptu przedstawiono protokoły analizy biochemicznej za pomocą testu przesunięcia termicznego, wielokątowego rozpraszania światła (MALS) i chromatografii wykluczania wielkości (SEC), które optymalizują stabilność i jednorodność próbki kierowanej do prób krystalizacji, a tym samym zwiększają prawdopodobieństwo sukcesu. Druga część tej procedury opisuje charakterystykę kryształów SBP przy użyciu synchrotronowej linii badawczej o anomalnej dyfrakcji o regulowanej długości fali oraz protokoły gromadzenia danych do pomiaru danych, które można wykorzystać do rozdzielenia skrystalizowanej struktury białka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. pneumoniae (pneumokoki) to bakteria Gram-dodatnia występująca bezobjawowo w górnych drogach oddechowych człowieka ze zdolnością migracji do normalnie sterylnych nisz, powodując zapalenie ucha, zapalenie płuc, sepsę, posocznicę i zapalenie opon mózgowych1,2. Co więcej, zakażenie pneumokokowe jest główną przyczyną pozaszpitalnego zapalenia płuc, które przyczynia się do obciążenia klinicznego i ekonomicznego na całym świecie3,4. Oporne na antybiotyki szczepy S. pneumoniae rozprzestrzeniły się na całym świecie i chociaż siedmiowalentna i trzynastowalentna szczepionka skoniugowana z białkiem pneumokokowym pomogły zmniejszyć wskaźnik oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, pojawiły się szczepy zastępcze po zastosowaniu szczepionek, co doprowadziło do zwiększonego zapotrzebowania na badania nad opracowaniem nowych metod leczenia choroby pneumokokowej5,6, 7,8.

Pneumokoki są zależne od cukrów importowanych od gospodarza jako źródło węgla9,10; rzeczywiście poświęca 30% swojej maszynerii importowej na transport 32 różnych węglowodanów11,12,13. Wśród tych importerów znajduje się co najmniej osiem ABC-transporters13. W transporterach ABC zewnątrzkomórkowe SBP odgrywają zasadniczą rolę w określaniu swoistości liganda i przedstawianiu go integralnemu transporterowi błonowemu w celu wychwytu w komórce. SBP stanowią ważne cele dla projektowania nowych szczepionek i środków przeciwdrobnoustrojowych, ponieważ są białkami powierzchniowymi i odgrywają kluczową rolę w procesach komórkowych.

Charakterystyka docelowego białka i szczegółowy opis cech strukturalnych, takich jak kieszenie ligandowe i elastyczność międzydomenowa, stanowią użyteczne narzędzie do projektowania leków w oparciu o strukturę14,15. Krystalografia rentgenowska jest metodą z wyboru do charakterystyki strukturalnej białek w rozdzielczości bliskiej atomowej, ale proces krystalizacji jest nieprzewidywalny, czasochłonny i nie zawsze zakończony sukcesem. Systematyczne metody poprawiły wskaźnik sukcesu, a ważnymi czynnikami są jakość i stabilność próbki. Na wskaźnik powodzenia krystalizacji mają wpływ właściwości chemiczne białka i metodologia przygotowania próbki. Ich wpływ można ocenić i poinformować za pomocą charakterystyki biochemicznej16,17.

Kolejną komplikacją dla projektowania opartego na strukturze jest problem fazy krystalograficznej, który musi zostać rozwiązany. Ponieważ dostępnych jest coraz więcej struktur białkowych, wiele struktur można rozwiązać za pomocą metody zastępowania molekularnego, która wymaga struktury homologicznej18. Ponieważ SBP mają elastyczną strukturę domeny, wymiana molekularna może również okazać się wyzwaniem19. Jeśli model strukturalny, który jest wystarczająco podobny do białka docelowego, nie jest dostępny, można zastosować szereg technik w celu uzyskania eksperymentalnego phasing20. Wśród nich metoda anomalnej dyspersji na jednej długości fali (SAD) stała się podstawową techniką i jest szeroko stosowana do rozwiązywania problemu fazowego21. Wykorzystanie metody SAD zostało jeszcze bardziej rozwinięte dzięki ulepszeniom w sprzęcie i oprogramowaniu, a także strategiom gromadzenia danych, aby umożliwić wykrywanie i wykorzystywanie słabych sygnałów anomalnych do fazowania22,23,24. Co więcej, postęp w bezpośrednich metodach rozwiązywania struktur makromolekuł, które w przeszłości wymagały danych dyfrakcyjnych do rozdzielczości atomowej, może być teraz wykorzystany poprzez połączenie na przykład wiedzy stereochemicznej, jak zaimplementowano w programie ARCIMOLDO25. Przydatny przegląd metod rozwiązywania problemu fazowego w krystalografii znajduje się w Taylor26.

Tutaj prezentujemy zracjonalizowany protokół charakterystyki transportu węglowodanów SBP, SP0092 S. pneumoniae, integrujący techniki biochemiczne i strukturalne (Rysunek 1). Ten protokół krok po kroku stanowi użyteczny przykład przypadku testowego strategii mających na celu poprawę wskaźnika sukcesu badań strukturalnych nad SBP w ogóle, które można znaleźć we wszystkich królestwach życia. W szczególności protokół podkreśla znaczenie scharakteryzowania najbardziej stabilnego stanu oligomerycznego białka w roztworze w szybki i skuteczny sposób oraz umożliwia identyfikację najlepszych gatunków do dalszych działań w eksperymentach krystalizacji. Chociaż w Banku Danych Białek zgłoszono ponad 500 struktur SBP27, wymiana molekularna może być trudna ze względu na nieodłączną elastyczną naturę dwóch domen α/β, które są połączone regionem zawiasowym19. Tak więc druga część protokołu opisuje zastosowanie metody SAD do fazowania ze związanych jonów metali, która jest powszechna w SBP, a także włączenie selenometioniny i zastosowanie selenu (Se) w fazowaniu SAD.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Sekwencja kodująca, dla której usunięto peptyd sygnałowy, jest klonowana w wektorze pOPINF zgodnie ze standardowym protokołem infuzji; białko natywne jest wyrażone jako fuzja znacznika Hisa w komórkach Escherichia coli BL21 Rosetta28,29. Wariant znakowany selenometioniną jest wyrażany zgodnie ze standardowymi metodami zgodnie z manufacturer30. Rekombinowany SBP jest oczyszczany zgodnie z wcześniejszym opisem31,32.

1. Charakterystyka biochemiczna

  1. Test przesunięcia termicznego
    1. Przygotować 48 roztworów buforowych o pH w zakresie od 4,0 do 9,5 i stężeniu NaCl od 0 do 0,5 M i dozować 40 μl do płytki 96-dołkowej, jak opisano w Tabeli 133.
    2. Dodać do każdej studzienki 5 μl roztworu SBP o stężeniu 1 - 2 mg/ml.
    3. Dodać do każdej studzienki 5 μl 20-krotnego barwnika fluorescencyjnego na białka (patrz tabela materiałów).
    4. Wymieszać roztwory pipetując, uszczelnić płytkę przezroczystą folią samoprzylepną i wirować przez 2 minuty w temperaturze 112 x g w temperaturze pokojowej.
    5. Przeprowadź eksperyment na maszynie czasu rzeczywistego: ustaw rampę temperatury 3 °C/min od 4 do 99 °C z czasem podtrzymania 10 s i odczytuj fluorescencję co 0,5 °C ze wzbudzeniem przy 483 nm i emisją przy 568 nm.
    6. Przeanalizować krzywe emisji fluorescencji dla każdego stanu buforowego, określając temperaturę topnienia (Tm) jako minimum pochodnej.
      UWAGA: Ta procedura daje dobre wskazanie najlepszego roztworu buforowego, który pomaga w poprawie stabilności białka. Wybierz zakres pH i stężenie soli w oparciu o stan buforowy o najwyższym Tm i dodaj 2,5% (v/v) glicerolu i 0,5 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), aby określić roztwór buforowy dla kolejnych etapów (bufor SEC).
  2. MALS i analityczna SEC
    1. Przeprowadzić dwukolumnowe płukanie objętościowe wstępnie wypełnionej żelowej kolumny filtracyjnej odgazowaną przefiltrowaną wodą (użyć kolumny o masie cząsteczkowej 24 ml w szerokim zakresie).
    2. Podłączyć kolumnę do detektora rozpraszania światła i zrównoważyć kolumnę z wyznaczonym buforem SEC z testu przesunięcia termicznego.
    3. Wstrzyknąć 100 μl oczyszczonego SBP w stężeniu 5 mg/ml do zrównoważonej kolumny SEC i przelać jedną objętość buforu SEC w jednej kolumnie.
    4. Sprawdzić chromatogram elucji pod kątem pojedynczych lub wielokrotnych pików i zbadać dane dotyczące rozpraszania za pomocą oprogramowania analitycznego, uzyskując masę molową i wskaźnik polidyspersyjności dla wszystkich gatunków.
      UWAGA: Dla każdego piku odpowiadającego gatunkowi oligomerycznemu korzystne jest sprawdzenie wskaźnika polidyspersyjności obliczonego jako masa molowa ważona masą/masa molowa ważona liczbą cząsteczek (Mw/Mn). Wartość polidyspersyjności bliska 1 wskazuje na pik monorozproszony.
      UWAGA: Po zdefiniowaniu wszystkich gatunków oligomeryzacji przydatne jest zbadanie ich zależności od stężenia białka, ponieważ wyższe stężenia mogą sprzyjać tworzeniu się większych oligomerów.
    5. Wykonaj wiele analitycznych serii SEC; wstrzyknij 100 μl oczyszczonego SBP o rosnących stężeniach (0,1 - 10 mg / ml) do zrównoważonej kolumny filtracyjnej żelu (użyj kolumny o masie cząsteczkowej 5 ml o szerokim zakresie) i za każdym razem przepływaj jedną objętość buforu SEC w jednej kolumnie.
    6. Sprawdzić chromatogram elucji pod kątem pojedynczych lub wielokrotnych pików i przeanalizować intensywności absorbancji przy 280 nm krzywych odpowiadających różnym stężeniom białka wyjściowego. Jeśli względne intensywności różnych pików pozostają stałe, to nie występuje wzajemna konwersja między gatunkami oligomerycznymi. Zmienność względnej intensywności przy różnych stężeniach wskazuje na wzajemną konwersję między różnymi gatunkami oligomerycznymi, która jest zależna od stężenia białka.
      UWAGA: Ten etap charakterystyki ma zasadnicze znaczenie dla określenia, które gatunki są bardziej odpowiednie do krystalizacji. Rzeczywiście, odrębne gatunki monorozproszone są bardziej podatne na krystalizację, jeśli znajdują się w stałym stanie oligomerycznym w określonym stężeniu.

2. Przygotowanie i krystalizacja białek

  1. Przygotowawczy SEC
    1. Po przepłukaniu objętością jednej kolumny odgazowaną przefiltrowaną wodą, zrównoważyć buforem SEC preparatywną, wstępnie wypełnioną żelową kolumnę filtracyjną (kolumna o szerokim zakresie masy cząsteczkowej 120 ml).
    2. Wstrzyknąć 1 - 5 ml oczyszczonego SBP w stężeniu 5-50 mg/ml do zrównoważonej żelowej kolumny filtracyjnej i przepuścić jedną objętość buforu SEC w jednej kolumnie.
    3. Zebrać przepływ z kolumny we frakcjach o objętości 1 ml.
    4. Zebrać frakcje odpowiadające pojedynczemu pikowi monodyspersji; odwirować próbkę w 15 ml filtrów wirowych o stężeniu 1 500 g i określić ilościowo stężenie, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia (zazwyczaj 50 - 100 mg/ml dla SP0092).
  2. krystalizacja
    1. Określić optymalny zakres stężeń dla eksperymentu krystalizacji za pomocą testu przed krystalizacją zgodnie z opisem producenta:
      1. Dozować 0,5 - 1,0 ml każdego z czterech roztworów do badania krystalizacji do innego zbiornika 24-dołkowej płytki krystalizacyjnej z siedzącą kroplą.
      2. Przygotować krople krystalizacji, mieszając 1 μl roztworu białkowego z 1 μl roztworu rezerwuarowego, uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez nie mniej niż 1 godzinę (bardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się po inkubacji przez noc).
      3. Sprawdź jakość kropli dla każdego stężenia za pomocą mikroskopu z 10-krotnym powiększeniem.
        UWAGA: Przetestuj co najmniej trzy różne stężenia białka: (I) większość kropli pozostających przezroczystych wskazuje, że białko jest zbyt rozcieńczone do krystalizacji; (II) obecność ciężkiego osadu w większości kropli oznacza zbyt wysokie stężenie; oraz (III) zrównoważone występowanie zarówno klarownych kropli, jak i osadu (lepiej w przypadku światła) jest dobrym wskaźnikiem, że badane stężenie jest korzystne dla krystalizacji.
    2. Przygotuj 96-dołkowe płytki krystalizacyjne z kroplą do siedzenia; dozuj 100 μl różnych dostępnych na rynku roztworów krystalizacji do każdej studzienki zbiornika34,35,36,37.
    3. Dozować 100 nL próbki białka o wcześniej zdefiniowanym stężeniu (krok 1.1.6) do wszystkich studzienek kroplowych do krystalizacji za pomocą zrobotyzowanego systemu krystalizacji.
    4. Dozować 100 nl różnych roztworów zbiornikowych do odpowiednich studzienek kroplowych do krystalizacji w celu wymieszania z białkiem dozowanym w kroku 2.2.3. Uszczelnij płytkę krystalizacyjną, aby uniknąć parowania i umożliwić zrównoważenie kropli krystalizacji ze zbiornikiem.
    5. Sprawdzaj krople okresowo (początkowo co 1-2 dni, później co tydzień) za pomocą mikroskopu z 10-krotnym (co najmniej) powiększeniem, aby ocenić tworzenie się i wzrost kryształów.
      UWAGA: Zautomatyzowany system obrazowania do krystalizacji białek może być używany do wizualizacji i wychwytywania kropli.

3. Charakterystyka kryształów i zbieranie danych rentgenowskich

  1. Montaż kryształowy
    1. Przygotować roztwór krioprotektantu, dodając 25% (v/v) glicerolu (stężenie końcowe) do stanu krystalizacji (zastępując w ten sposób 25% wody w początkowej mieszaninie)38.
    2. Napełnij piankę Dewara ciekłym azotem i umieść próbkę część obudowy uni-krążka w dewarze. Pozwól mu ostygnąć do temperatury ciekłego azotu.
    3. Wytnij i usuń taśmę uszczelniającą z płytki krystalizacyjnej nad kroplą, w której tworzą się kryształy.
    4. Umieść kroplę 1 μl roztworu krioprotektantu na szkiełku nakrywkowym umieszczonym w bliskiej odległości od docelowej kropli.
    5. Przenieś wybrany kryształ z pierwotnej kropli do kropli roztworu krioprotektantu za pomocą nylonowej pętli kriograficznej na standardowej podstawie SPINE zamontowanej na różdżce magnetycznej39,40.
    6. Szybko przenieś kryształ z kropli krioprotektantu na ciekły azot, umieszczając pętlę w pierwszej pustej pozycji uchwytu na próbki uni-puck.
    7. Powtarzać tę czynność (od etapu cięcia taśmy uszczelniającej), aż wszystkie pożądane kryształy zostaną zebrane i przechowywane w uchwycie na próbki uni-puck.
    8. Umieść podstawę uni-puck na uni-puck za pomocą różdżki krążka i przenieś krążek na linię badawczą (w warunkach ciekłego azotu).
      UWAGA: Ekstremalnie niska temperatura!
    9. Użyj szczypiec kriogenicznych i narzędzia do ładowania krążka Dewara, aby załadować krążek uni-puck(s) do robota dewara do zmieniacza próbek linii badawczej. Uchwyt na próbkę uni-puck odczepia się od pokrywy podstawy, pozostawiając uchwyty pętli próbki pionowo w robocie dewara do próbek, a tym samym wystawiony na działanie ciekłego azotu i dostępny dla robota zmieniającego próbki.
  2. Charakterystyka kryształów
    UWAGA: Zebrane kryształy można następnie przebadać pod kątem jakości dyfrakcyjnej przy użyciu laboratoryjnego źródła promieniowania rentgenowskiego lub źródła promieniowania rentgenowskiego synchrotronowego (SR). Linie badawcze krystalografii makromolekularnej (MX) zapewniają przestrajalne źródło energii do wykorzystania anomalnej dyfrakcji w celu rozwiązania struktury. W poniższej sekcji zaproponowano szereg instrukcji roboczych zgodnych z możliwościami eksperymentalnymi linii badawczych MX Diamond Light Source, ale wytyczne te mogą być również dostosowane do linii badawczych MX w innych synchrotronach na całym świecie.
    1. W pierwszym kroku warto potwierdzić lub zidentyfikować anomalne rozpraszacze w krysztale. Można to wygodnie osiągnąć, mierząc widmo fluorescencji promieniowania rentgenowskiego od kryształu. Najpierw upewnij się, że energia promieniowania rentgenowskiego linii badawczej jest wystarczająco wysoka, aby wzbudzić wszystkie pierwiastki zwykle oczekiwane dla kryształów wielkocząsteczkowych (14 keV lub więcej).
    2. Użyj oprogramowania sterującego linią badawczą, aby wybrać próbkę, która ma być zamontowana przez robota zmieniacza próbek; pętla zostanie automatycznie wyśrodkowana w wiązce promieniowania rentgenowskiego, a centrowanie kryształów można potwierdzić ręcznie za pomocą oprogramowania sterującego linią.
    3. Rejestruj widmo fluorescencji promieniowania rentgenowskiego za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą: użytkownik wybiera czas ekspozycji i inicjuje pomiar (Fluorescencja/Ustawienie widma fluorescencji, → Run, Rysunek 2A). Oprogramowanie sterujące linią automatycznie ustawia detektor fluorescencji rentgenowskiej w miejscu i określa minimalny strumień padającego promieniowania rentgenowskiego, aby uzyskać czytelny sygnał na detektorze fluorescencji. Pozyskane widmo jest następnie analizowane w sposób zautomatyzowany z pikami emisji dopasowanymi do naturalnie występujących elementów biologicznych. Procedury te są dostępne w graficznym interfejsie użytkownika (GUI) oprogramowania sterującego linią badawczą - GDA (www.opengda.org) w naszej firmie oraz w synchrotronach w całej Europie41,42.
    4. Jeśli zostaną zidentyfikowane odpowiednie pierwiastki, które można wykorzystać do eksperymentu dyfrakcji anomalnej, należy wykonać skanowanie energii krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego w celu określenia optymalnej długości fali do zbierania anomalnych danych dyfrakcyjnych z kryształu: w oprogramowaniu sterującym linią badawczą wybierz element i rozpocznij skanowanie (Fluorescence/Fluorescence Scan Setting, → Nazwa atomu, → Run, Rysunek 2B).
      UWAGA: W przypadku pojedynczego eksperymentu z dyfrakcją anomalną, szczyt krawędzi absorpcyjnej jest używany do maksymalizacji anomalnego rozpraszania. Rozważania eksperymentalne dotyczące przeprowadzenia eksperymentu dyfrakcji anomalnej na wielu długościach fal zostały wcześniej szczegółowo opisane43.
    5. Aby określić parametry komórki krystalicznej, symetrię i granicę dyfrakcji, zmierz trzy wzorce dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w odstępach 45° przy użyciu metody oscylacji (Data Collection/Screening → Run current, Rysunek 2C). Oprogramowanie sterujące linią zapewnia użytkownikowi wybór kąta oscylacji i czasu naświetlania oraz możliwość ustawienia procentowej transmisji wiązki promieniowania rentgenowskiego. W przypadku standardowego ekranowania kryształów zalecany jest kąt oscylacji 0,5°, czas ekspozycji 0,5 s i 5% transmisja wiązki promieniowania rentgenowskiego. Zmierzone obrazy dyfrakcyjne są automatycznie analizowane przez potok EDNA i zwracają zestaw strategii do zbierania kompletnego zestawu danych22.
  3. Gromadzenie danych rentgenowskich
    UWAGA: Użytkownik może wybrać zbieranie danych w standardowym trybie oscylacji lub w trybie wiązki odwróconej, co umożliwia rejestrowanie wiązań Friedela w bliskim czasie i dawce promieniowania rentgenowskiego oraz przy mniej więcej takim samym zachowaniu absorpcji, co pozwala na dokładniejszy pomiar różnic anomalnych. To ostatnie jest przydatne zwłaszcza wtedy, gdy spodziewane są niewielkie różnice anomalne i/lub próbki są wrażliwe na promieniowanie podczas przeprowadzania eksperymentu dyfrakcji anomalnej. Rozważania na temat najlepszych strategii zbierania danych zostały kompleksowo przeanalizowane22,23,44,45,46,47.
    1. Za pomocą oprogramowania sterującego linią zaimportuj parametry zbierania danych zgodnie z sugestiami programu strategicznego, który dostarczy:
      ja. Pozycja początkowa osi obrotu ω
      ii. Szerokość oscylacji kąta obrotu osi ω dla każdego obrazu dyfrakcyjnego
      iii. Czas naświetlania dla każdego obrazu dyfrakcyjnego
      iv. Liczba obrazów w kompletnym zbiorze danych (pośrednio określająca całkowity kąt obrotu osi ω dla całego zbioru danych)
      v. Procent tłumienia wiązki promieniowania rentgenowskiego w celu uniknięcia nadmiernej ekspozycji i uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem
      UWAGA: W naszej instytucji, do prowadzenia zbierania danych, rurociągi oprogramowania do automatycznego przetwarzania zebranych danych są dobrze ugruntowane: (i) Dane dyfrakcyjne są redukowane (indeksowane, integrowane i skalowane) przez potok xia2, który generuje pliki odbicia mtz dla użytkownika jako dane wejściowe do fazowania i struktury rozwiązanie/udoskonalenie48. (ii) Gdy podczas analizy danych zostanie wykryty znaczący sygnał anomalny, pierwszy szybki potok rozwiązań do zautomatyzowanej struktury (fast_ep) przy użyciu SHELX próbuje rozwiązać podstrukturę ciężkich atomów poprzez eksperymentalne fazowanie, dostarczając fazową mapę gęstości elektronów tam, gdzie jest to możliwe. Drugi, bardziej kompleksowy potok rozwiązań strukturalnych automatycznie podejmuje próby rozwiązania i zbudowania struktury przy użyciu niezależnych pakietów oprogramowania49,50,51,52; W przypadkach, gdy to się powiedzie, użytkownik otrzyma wstępny model i mapę gęstości elektronów. Stanowi to podstawę dla użytkownika do całkowitego udoskonalenia i walidacji modelu za pomocą wybranych pakietów oprogramowania krystalograficznego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten zintegrowany protokół okazał się skuteczny dzięki czterem (dwóm opublikowanym i dwóm nieopublikowanym strukturom) sześciu docelowych białek wiążących węglowodany z pneumokoków przeanalizowanych do tej pory32,53. W tej sekcji przedstawiamy charakterystykę biochemiczną i strukturalną SP0092 jako reprezentatywny wynik, który ma pokierować badaniami strukturalnymi SBP w ogóle.

Po wyrażeniu i oczyszczeniu SBP SP0092 zgodnie z wcześniejszą definicją32, oczyszczone białko zostało przeanalizowane pod kątem stabilności buforu za pomocą testu przesunięcia termicznego: SP0092 wykazuje podwyższony Tm przy pH 6,5 i w obecności NaCl w zakresie stężeń 0 - 0,2 M (Rysunek 3A). W związku z tym roztwór buforowy dla następujących etapów zdefiniowano jako: 0,02 M MES pH 6,5, 0,2 M NaCl, 2,5% (v/v) glicerol, 0,5 mM TCEP. Bezwzględna masa molowa różnych stanów oligomeryzacji SP0092 została zmierzona za pomocą MALS sprzężonego z SEC mierzącego masę cząsteczkową 187,2, 140,8, 97,0 i 49,4 kDa, co odpowiada odpowiednio gatunkom tetramerycznym, trimerycznym, dimerycznym i monomerycznym (Rysunek 3B). Analiza profilu SEC przy różnych rozcieńczeniach białek wykazała, że oligomeryzacja jest wywoływana przez zwiększone stężenie białka, co sugeruje, że większe oligomery są bardziej stabilne przy wyższych stężeniach niż zwykle stosowane w krystalizacji. Rzeczywiście, oczyszczone, większe gatunki oligomeryczne skierowane do prób krystalizacji z powodzeniem wytworzyły kryształy białka, podczas gdy gatunki monomerów nie.

Zoptymalizowane kryształy uzyskane z natywnych i znakowanych Se-metioniną form SP0092 charakteryzowały się dyfrakcją promieniowania rentgenowskiego. Pomiar fluorescencji promieniowania rentgenowskiego z tych kryształów ujawnił w obu przypadkach piki emisji Zn związane z białkiem, podczas gdy Se wykryto tylko dla kryształów Se-metioniny, zgodnie z oczekiwaniami. Później przeprowadzono skany absorpcji promieniowania rentgenowskiego na krawędziach Se i Zn, które dostarczyły bezpośrednich danych eksperymentalnych w celu dostrojenia długości fali padającego promieniowania rentgenowskiego do odpowiednich krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego Zn lub Se obecnych w kryształach, aby zmaksymalizować anomalny sygnał możliwy do uzyskania z wynikowych danych (Rysunek 4A-B).

Po zmierzeniu trzech wzorców dyfrakcyjnych przy niskiej transmisji, uzyskano kompletny zestaw danych anomalnych przy użyciu strategii zbierania danych sugerowanej przez EDNA (Rysunek 4C). Obecny sygnał anomalny uruchamia zautomatyzowany rurociąg fazowy na linii badawczej w celu określenia podstruktury i na podstawie wyprowadzonych początkowych faz eksperymentalnych tworzy wstępne mapy i modele, które można następnie udoskonalić i zweryfikować (Rysunek 4D).

Podsumowując, potencjalne pułapki tej techniki koncentrują się przede wszystkim na dostępności i jakości kryształów. Optymalizacja warunków buforowych w celu poprawy stabilności białka, a także identyfikacja najbardziej odpowiedniego stanu oligomerycznego białka do użycia, gdy w roztworze zidentyfikowano więcej niż jeden oligomer, może zmniejszyć ryzyko niepowodzenia na etapie krystalizacji. Wykorzystanie związanych jonów metali zidentyfikowanych na wczesnym etapie może przyspieszyć tworzenie struktury i uniknąć niepotrzebnej produkcji białka znakowanego selenometioniną, gdy zawiodą metody zastępowania molekularnego.

figure-results-1
Rysunek 1. Diagram przebiegu pracy w biochemicznej i strukturalnej charakterystyce węglowodanowych SBP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Charakterystyka kryształów w GDA. (A) Zrzut ekranu przedstawiający zakładkę kontroli fluorescencji rentgenowskiej w oprogramowaniu sterującym linią badawczą GDA. (B) Zrzut ekranu karty kontroli skanowania krawędzi energii promieniowania rentgenowskiego w GDA. (C) Zrzut ekranu przedstawiający zakładkę "Kryształy przesiewowe" w GDA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Charakterystyka biochemiczna SP009239-491. (A) Wykres powierzchni 3D przedstawiający temperaturę topnienia SP009239-491 w funkcji pH i stężenia NaCl w roztworze buforowym. (B) Wyniki SEC i MALS dla SP009239-491. Absorpcja przy 280 nm jest pokazana na niebiesko. Masy molowe różnych stanów oligomeryzacji są pokazane na czerwono. Panel (B) został zmodyfikowany z32. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Charakterystyka strukturalna SP009239-491. (A) i (B) Skanowanie energii absorpcji promieniowania rentgenowskiego na krawędzi Zn i Se dla kryształów SP009239-491. Zmierzona fluorescencja z kryształów zawierających Zn i Se jest pokazana na niebiesko i niebiesko, obliczone anomalne frakcje rozpraszania f' i f" są odpowiednio w kolorze zielonym i czerwonym. (C) Przykłady wzorów dyfrakcji rentgenowskiej pobranych z kryształów SP009239-491. (D) Kreskówkowa reprezentacja struktury dimerów SP009239-491. Jeden protomer jest koloru białego, a drugi purpurowego (reszty 39 - 366) i fioletowego (reszty 367 - 491), a anomalne atomy rozpraszające są pokazane jako niebieskie i cyjanowe kulki odpowiednio dla Zn i Se. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

0,1 M Kwas cytrynowy pH 4,00,1 M Kwas cytrynowy pH 4,50,1 M Fosforan pH 5,00,1 M Cytrynian pH 5,50,1 M Bis-tris pH 60,1 M ADA pH 6,50,1 M MOPS pH 70,1 M HEPES pH 7,50,1 M Imidazol pH 8,00,1 M Tris pH 8,50,1 M CHES pH 90,1 M CHES pH 9,5
NaCl 0 mln40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL
NaCl 0,1 mln40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL
NaCl 0,2 mln40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL
NaCl 0,5 mln40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL

Tabela 1. Skład buforu do testu przesunięcia termicznego.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy i walidujemy zintegrowany protokół biochemicznej i strukturalnej charakterystyki węglowodanowych SBP ze szczególnym naciskiem na białka z S. pneumoniae. Niemniej jednak może to być stosowane jako standardowa procedura do analizy innych SBP z różnych organizmów, a nawet innych niepowiązanych rozpuszczalnych białek.

Pierwsza część protokołu koncentruje się na dostarczeniu informacji biochemicznych na temat stabilności białek i struktury czwartorzędowej, które mogą być wykorzystane w przygotowaniu próbek białek do krystalizacji. W sekcji dotyczącej testów przesunięcia termicznego opisujemy tylko zmiany stężenia pH i NaCl, aby zachować ogólny charakter tej procedury. Mimo to wiele innych warunków buforowych może być testowanych w podobny sposób, na przykład, w tym każdy związek chemiczny stosowany jako dodatek stabilizujący: w szczególności rzeczywiste ligandy (ligandy), które wiążą się z określonym SBP, są niezwykle skuteczne w zwiększaniu Tm o kilka stopni Celsjusza31. W niektórych przypadkach krzywe denaturacji mogą być słabo zdefiniowane z powodu słabego sygnału lub wysokiej fluorescencji tła, co jest spowodowane agregacją białek lub częściowym rozwijaniem. Aby tego uniknąć, można przeprowadzić miareczkowanie białko-barwnik w celu optymalizacji niejasnych krzywych denaturacji. Jeśli nie zostanie uzyskana poprawa, zaleca się badania przesiewowe różnych dodatków, które mogą poprawić stabilność białka, a odpowiednie badania przesiewowe zostały wcześniej opisane54.

Zazwyczaj większość SBP jest monomeryczna w swoim naturalnym środowisku, ale jak pokazano tutaj, multimeryzacja może zachodzić przy wyższych stężeniach stosowanych w eksperymentach krystalizacji, dlatego charakterystyka zachowania oligomeryzacji zapewniona przez MALS i SEC jest niezbędna do oceny najkorzystniejszego stabilnego stanu oligomeryzacji monodyspersji dla krystalizacji. Niemniej jednak trudno jest przewidzieć wpływ różnych substancji chemicznych zawartych w warunku krystalizacji na zachowanie oligomeryzacji białek. Jeśli badanie SEC i MALS wykaże rozległą agregację próbki białka, zalecamy następujące działania, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia takiej sytuacji: użyć świeżej próbki białka (nie zamrożonej i rozmrożonej) i rozszerzyć analizę stabilizacji wykonaną za pomocą testów przesunięcia termicznego, testując możliwe dodatki i łagodne detergenty jako ostatni środek, aby zminimalizować agregację. W tym artykule przedstawiamy podstawowe wytyczne dotyczące krystalizacji przy użyciu wysokoprzepustowego komercyjnego badania przesiewowego krystalizacji z rzadkimi matrycami, aby zachować ogólny charakter tego protokołu. Jednak uzyskanie kryształów białek dyfrakcyjnych promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości może wymagać iteracyjnego dostrajania w celu optymalizacji warunków krystalizacji w odniesieniu do stężenia strącacza, pH, dodatku dodatków chemicznych, różnych temperatur i innych czynników zmieniających dynamikę równowagi między kroplą kryształu a zbiornikiem 16,17.

Druga część protokołu opisuje charakterystykę kryształów białkowych w celu zdefiniowania optymalnej strategii zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej, ze szczególnym naciskiem na pozyskiwanie anomalnych danych dla fazowania SAD. Nawet jeśli SBP utrzymują podobną ogólną architekturę (i istnieje wiele zdeponowanych struktur 3D, które mogą być potencjalnie użyteczne jako modele wyjściowe), fazowanie tych białek metodą zastępowania molekularnego nie zawsze jest proste ze względu na zmienność drugorzędowych elementów struktury i wewnętrzną elastyczność tych białek. W związku z tym proponujemy metodę SAD i podkreślamy, że białka te mogą już mieć wewnętrznie związane metale lub rzeczywiście niespecyficzne wiązanie metali z warunków bufora krystalizacji, co może dostarczyć szereg anomalnych elementów dyfrakcyjnych jako standardowy krok w naszym ogólnym protokole.

Podsumowując, protokół ten definiuje standardowy sterowany przepływ procedur umożliwiający szczegółowy opis biochemicznych i strukturalnych cech SBP, które można wykorzystać do zwiększenia wskaźnika powodzenia określania struktury, a także przyspieszenia ogólnej charakterystyki strukturalnej SBP.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy OPPF-UK za pomoc w klonowaniu, Gemmie Harris za SEC-MALLS oraz naukowcom z linii badawczych I03 i I04 w Diamond Light Source.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SelenoMethionine Medium CompleteMolecular DimensionsMD12-500Oparty na syntetycznym minimalnym pożywce M9 uzupełnionej glukozą, witaminami i aminokwasami z wyjątkiem L-metioniny. Inne równoważne produkty są dostępne na rynku przez inne firmy.
Płytka optyczna 96-dołkowa MicroAmpApplied Biosystems4306737Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym firmy Applied Biosystems MicroAmp jest zoptymalizowana, aby zapewnić niezrównaną dokładność i jednorodność temperatury w celu szybkiej i wydajnej amplifikacji PCR. Płytka ta, wykonana z pojedynczego sztywnego kawałka polipropylenu w formacie 96-dołkowym, jest kompatybilna z Applied Biosystems® 96-dołkowe systemy PCR w czasie rzeczywistym i termocyklery.
SYPRO OrangeMolecular ProbesS6651SYPRO Orange Protein Gel Stain to czuły, gotowy do użycia barwnik fluorescencyjny do białek w żelach 1D. Dość uniwersalny i ugruntowany barwnik białkowy do regionów hydrofobowych.
Optyczna folia samoprzylepna MicroAmpApplied Biosystems4311971Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp firmy Applied Biosystems zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i odparowania próbki po nałożeniu na mikropłytkę. Idealnie nadaje się do pomiaru optycznego, ponieważ daje niskie tło.
7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems4362143Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System umożliwia standardowy, 96-dołkowy szybki cykl termiczny, znacznie skracając czas pracy w przypadku ilościowych aplikacji PCR w czasie rzeczywistym, dostarczając wyniki w około 30 minut. Zestaw aktualizacyjny jest dostępny w celu uaktualnienia standardowego systemu 7500 Real-Time PCR do szybkiej konfiguracji poprzez instalację w terenie. Można użyć innej maszyny RT-PCR. Eksport danych nie jest łatwy dla starego oprogramowania do analizy danych.
Kolumna Superdex 200 increase 10/300 GLGE Healthcare28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL to wszechstronna, fabrycznie wypełniona kolumna do chromatografii wykluczającej wielkość w oczyszczaniu preparatywnym na małą skalę (mg), a także do charakterystyki i analizy białek o masie cząsteczkowej od 10 000 do 600 000, takich jak przeciwciała. Optymalna separacja, idealna dla technik biofizycznych o wysokiej rozdzielczości.
DAWN HELEOS IIWyattDAWN HELEOS II to wiodący detektor wielokątowego statycznego rozpraszania światła (MALS) do absolutnej charakterystyki masy molowej i wielkości makrocząsteczek i nanocząstek w roztworze. DAWN oferuje najwyższą czułość, najszerszy zakres masy cząsteczkowej, wielkości i stężenia, a także największy wybór konfiguracji i opcjonalnych modułów zwiększających możliwości. Inne systemy wykrywania MALS innych firm poza Wyatt nie zostały przetestowane, więc nie można udzielić dodatkowych informacji zwrotnych.
Superdex 200 5/150 GLGE Healthcare28906561Superdex 200 to fabrycznie upakowane kolumny chromatograficzne do ekstrakcji biomolekuł o wysokiej rozdzielczości, preparatywnych i analitycznych na małą skalę. Superdex 200 ma zakres separacji dla cząsteczek o masie cząsteczkowej od 10 000 do 600 000. Separacja pików nie jest tak optymalna, jak w przypadku wersji "wzrostowej", ale ten model jest idealny do standardowego codziennego użytkowania.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade to fabrycznie upakowane kolumny XK przeznaczone do wysokorozdzielczej preparatywnej chromatografii filtracyjnej żelowej.
24-dołkowa "duża" płytka krystalizacyjna z siedzącą kropląMiTeGenXQ-P-24S-A24-dołkowa "duża" płytka krystalizacyjna jest używana głównie do przesiewania kryształów białek za pomocą technik dyfuzji pary w pozycji siedzącej oraz do optymalizacji warunków krystalizacji. Ma dość dużą studnię zbiornika i pojemnik na próbki, które sprzyjają ręcznej obsłudze i wzrostowi dużych kryształów białka. Ponadto jego płaskie powierzchnie można łatwo uszczelnić przezroczystą taśmą lub szkiełkami nakrywkowymi.
Test wstępnej krystalizacji PCTHamptonHR2-140Test wstępnej krystalizacji PCT służy do określenia odpowiedniego stężenia białka do badania przesiewowego krystalizacji.
96 dołków CrystalQuickGreiner bio-one6098xxPłytki kwadratowe posiadają trzy dołki krystalizacyjne na zbiornik, co umożliwia badanie 288 próbek na płytkę. Zazwyczaj używane tylko do wstępnego przesiewania, ponieważ ich kwadratowa krawędź utrudnia łowienie kryształów.
Uni-PuckMolecular DimensionsMD7-601Universal V1-Puck (Uni-puck) to pojemnik do przechowywania i transportu próbek do użytku z większością zautomatyzowanych systemów mocowania próbek na całym świecie - obejmuje między innymi systemy ACTOR, SAM i CATS (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI i w całym USA)
Standardowa pianka DewarMolecular DimensionsMD7-35Średnica 5,7" i głębokość 2,8" Pojemność 800 ml.
Zamontowany CryoLoop - 20 mikronówHamptonHR4-955Zamontowane pętle CryoLoop z nylonem o średnicy 20 mikronów. Te nylonowe pętle są połączone z pustymi mikrorurkami ze stali nierdzewnej i handlem; które są używane do montażu, zamrażania i zabezpieczania kryształu podczas procedur kriokrystalograficznych i zbierania danych rentgenowskich. Istnieją różne rozmiary i można je dostosować pod względem długości. Są to dość wszechstronne narzędzia.
CryoWandMolecular DimensionsMD7-411
Narzędzie do ładowania Puck DewarWymiary molekularneMD7-607To narzędzie służy do oddzielania krążków uni-pucks w celu załadowania ich do robota dewara. Składa się z dwóch części: części rurki teflonowej i części z metalowego pręta.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, Suppl 3. S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway? Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320(2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Bergfors, T. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357(2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45(2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777(2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Thermal Shift AssaySize Exclusion ChromatographyMulti Angle Light ScatteringX ray Anomalous DiffractionCrystallization TrialsStreptococcus pneumoniaeOligomerization StatesBuffer Stability

Powiązane artykuły