Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Podsumowanie

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Streszczenie

Mózg ssaków wykazuje wyraźną symetrię w płaszczyźnie strzałkowej. Jednak szczegółowy opis dynamiki neuronalnej w symetrycznych obszarach mózgu u dorosłych ssaków pozostaje nieuchwytny. W tym badaniu opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru dynamiki wapnia przez podwójne okna optyczne nad obustronną pierwotną korą somatosensoryczną (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P). Metoda ta umożliwia rejestrację i kwantyfikację aktywności neuronalnej w obustronnych obszarach mózgu myszy pojedynczo w tym samym eksperymencie przez dłuższy czas in vivo. Kluczowe aspekty tej metody, które można wykonać w ciągu godziny, obejmują minimalnie inwazyjne procedury chirurgiczne w celu stworzenia podwójnych okien optycznych oraz zastosowanie obrazowania 2P. Chociaż demonstrujemy technikę tylko w obszarze S1, metoda może być zastosowana do innych obszarów żywego mózgu, ułatwiając wyjaśnienie strukturalnej i funkcjonalnej złożoności sieci neuronowych mózgu.

Wprowadzenie

Wapń i jego regulacja są niezbędne w pośredniczeniu w wielu procesach fizjologicznych. Monitorowanie dynamiki wapnia jest przydatne do zrozumienia prawidłowego funkcjonowania mózgu, a także patologicznych stanów zaburzeń mózgu ^1,2,3,4,5,6,7^,8. Obrazowanie fluorescencji GCaMP6s jest potężnym narzędziem do ilościowego określania liczby skoków, czasu i częstotliwości, a także poziomów danych synaptycznych zarówno in vitro, jak i in vivo 9^,10,11.

Mózg ssaków wykazuje wyraźną symetrię w płaszczyźnie strzałkowej. Chociaż ostatnie badania neurologiczne rzuciły światło na przebudowę kory mózgowej i aktywność neuronalną wywołaną przez uraz mózgu lub rdzenia kręgowego ^6,7, role, jakie w powrocie do zdrowia odgrywają nienaruszone tkanki symetrycznie odpowiadających sobie regionów, są nadal niejasne.

W tym badaniu opisujemy eksperymentalne procedury tworzenia dwustronnych symetrycznych okien optycznych do obrazowania in vivo. Korzystając z tych okien optycznych, opisujemy pomiar dynamiki wapnia z pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) u transgenicznych myszy GCaMP6s za pomocą mikroskopii 2P. W sekcji wyników pokazujemy również morfologię dendrytyczną in vivo w różnych punktach czasowych w regionie S1 u myszy transgenicznych EGFP za pomocą obrazowania 2P. Metoda obserwacji dynamiki sieci w obustronnych obszarach S1 jest tylko wstępnym przykładem tego, jak podwójnie otwarte okna czaszkowe pomogą neurobiologom badać lokalne i symetryczne przetwarzanie informacji w mózgu dorosłych ssaków w normalnych warunkach lub w różnych modelach choroby in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury chirurgiczne i związane ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (Krajowa Rada ds. Badań) oraz wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Indiana University School of Medicine. Schematyczna ilustracja układu obrazowania 2-fotonowego jest pokazana na Rysunek 1.

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania

1. Umieść sterylną gazę, waciki i autoklawowane narzędzia chirurgiczne w polu operacyjnym (Tabela 1). Włącz sterylizator Micro Bead do sterylizacji międzyoperacyjnej narzędzi chirurgicznych.
2. Znieczulić mysz (samiec lub samica, 1,5–2,5 miesiąca, 20–25 g) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie (i.p.) mieszaniny ketaminy (17,2 mg/ml), ksylazyny (0,475 mg/ml) i acepromazyny (0,238 mg/ml) (6 μl/g masy ciała). Poczekaj, aż zostanie osiągnięta odpowiednia głębokość znieczulenia, gdy zwierzę przestanie reagować na bodziec szczypania palca u nogi i nie będzie miało odruchu rogówkowego. Podczas zabiegu należy podać dawkę przypominającą 1/3 pierwotnej dawki koktajlu znieczulającego, w zależności od potrzeb utrzymania pierwotnego stanu znieczulającego.
3. Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie (s.c.; 0,05–0,10 mg/kg) jako środek przeciwbólowy przed zabiegiem chirurgicznym. Nałóż maść ochronną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i powstawaniu zaćmy.
4. Umieść transgeniczną mysz GCaMP6s na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii i przykryj ją sterylną obłożeniem chirurgiczną. Ustabilizuj głowę zwierzęcia za pomocą adaptera do trzymania głowy dla myszy.
5. Ogol głowę na większości skóry głowy za pomocą żyletki z dwoma krawędziami. Oczyścić obszar operacyjny sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie roztworem jodu powidonu.

2. Przygotowanie przewlekłego okna czaszkowego

1. Wykonaj prostokątne cięcie skóry głowy (2 mm x 3 mm) nożyczkami po jednej (prawej) stronie czaszki. Odsuń skórę na bok bawełnianym wacikiem, aby utworzyć obszar ekspozycji o średnicy >3 mm (Rysunek 3A). Usuń tkankę łączną przyczepioną do czaszki, delikatnie zeskrobując czaszkę ostrzem mikrochirurgicznym (Ostrze skalpela #10; Rysunek 3C).
2. Zaznacz obszar S1, delikatnie rysując okrąg (3 mm średnicy, współrzędna środkowa: -1,5 mm od bregmy i 2,5 mm od linii środkowej) na czaszce za pomocą wiertła dentystycznego (Rysunek 2B).
3. Wykonaj tę samą procedurę na lewej czaszce (Rysunek 2B).
4. Nałóż cienką warstwę kleju Cyjanoakrylan Super Glue na kość, aby zapewnić bazę do aplikacji cementu dentystycznego.
5. Pod mikroskopem preparacyjnym rozcieńczyć okrągły rowek w czaszce wokół obszaru S1 za pomocą szybkoobrotowego mikrowiertła (Rysunek 3D). Celem jest stworzenie gładkiej krawędzi do umieszczenia na nim okna optycznego.
6. Wielokrotnie nakładaj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF, temperatura pokojowa) na czaszkę okresowo podczas procesu rozrzedzania, aby ułatwić wiercenie i rozproszyć ciepło. Wykonuj wiercenie z przerwami, aby uniknąć przegrzania spowodowanego tarciem. Odessać resztki kości za pomocą domowej linii próżniowej lub pompy próżniowej.
7. Po wywierceniu około 2/3 głębokości kości, powoli i ostrożnie rozrzedź pozostałą 1/3 kości, aż okrągły kawałek czaszki (płat kostny) zostanie całkowicie wolny od otaczającej czaszki.
8. Powoli i ostrożnie usuń okrągły płat kostny za pomocą pary kleszczy # 5/45 i odsłoń oponę twardą (Rysunek 2C; Rysunek 3E).
9. Utrzymuj odsłonięty obszar mózgu wilgotny za pomocą ACSF (Rysunek 3E). Unikaj uszkodzeń naczyń krwionośnych, ponieważ krwotok zmieni przepływ krwi w mózgu, przyspieszy obrzęk mózgu i poważnie pogorszy jakość obrazowania.
10. Wykonaj tę samą procedurę po lewej (przeciwległej) stronie czaszki.
11. Do montażu okienka optycznego użyj kleju optycznego, aby skleić i utwardzić między warstwami szkła nakrywkowego pojedynczo. W razie potrzeby ogrzej okienko optyczne (50 °C przez 12 godzin) w inkubatorze, aby wzmocnić wiązanie klejowe. Okienko optyczne składa się z 2 części: górna część zawiera pojedynczą okrągłą szklankę nakrywkową o średnicy 5 mm, a dolna część zawiera 1–3 okrągłe szkła nakrywkowe o średnicy 3 mm (Rysunek 2D).
12. Przechowuj okienko optyczne w etanolu (70%, obj./obj.) i przed użyciem spłucz je sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Przed montażem okna optycznego należy sprawdzić okienko optyczne pod kątem niedoskonałości, w tym nieprawidłowej ilości kleju optycznego lub niedokładnego wyrównania pod stereoskopem.
13. Zamontuj okno optyczne nad obszarem kraniotomii (Rysunek 2D). Górna część okienka optycznego spoczywa na czaszce, a dolna część okienka optycznego mieści się w kraniotomicznym otworze i spoczywa na oponie twardej w obecności płynu mózgowo-rdzeniowego (Rysunek 2D, E).
14. Uszczelnij górną część krawędzi okna optycznego do czaszki za pomocą kleju Cyjanoakrylowy Super Glue (Rysunek 2F; Rysunek 3F).
15. Gdy klej Cyanoacrylate Super Glue wyschnie, nałóż cement dentystyczny (Dentsply), aby pokryć krawędź szkła. Nałóż cement dentystyczny na wszystkie odsłonięte brzegi czaszki i rany, aby zablokować światło (Rysunek 2G-H; Rysunek 3B).
16. Wykonaj tę samą procedurę po lewej stronie.
17. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej i wróć do klatki domowej w celu odzyskania zdrowia pod odpowiednim nadzorem. Zapewnij mokrą karmę, aby ułatwić żucie i nawodnienie. W celu zmniejszenia dolegliwości bólowych należy podawać buprenorfinę s.c. (0,05–2,0 mg/kg) co 8–12 godzin po urazie przez 2 dni. Pozwól myszy dojść do siebie przez dodatkowe 7–10 dni przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie dwufotonowe

1. W dniu eksperymentu znieczulić zwierzę ketaminą i ksylazyną (dawki i utrzymanie znieczulenia jak opisano powyżej). Oczyść okno czaszki 75% (obj./obj.) etanolem.
2. Umieść mysz w zestawie do obrazowania składającym się z mikroskopu 2P i adaptera do trzymania głowy, spoczywając na poduszce grzewczej z głową unieruchomioną przez nauszniki przymocowane do uchwytu na głowę myszy.
3. Obrazuj jedną stronę okna optycznego na raz. Aby zminimalizować aberracje optyczne, upewnij się, że okienko optyczne i prawa czaszka są ustawione prostopadle do osi optycznej mikroskopu.
4. Zrób wstępne zdjęcie okna czaszki z jasnym oświetleniem pola przy 4-krotnym powiększeniu jako mapę referencyjną do rejestracji z angiografiami 2P o większym powiększeniu (Rysunek 4A1).
5. Powiększ obszar zainteresowania za pomocą 10-krotnego powiększenia (Rysunek 4A2).
6. Wybierz obszar zainteresowania w obszarze S1 w warstwach korowych I lub II (do 150 μm poniżej powierzchni pial). Jeśli pożądane jest większe powiększenie, użyj obiektywu 20X.
7. Wyszukaj pole widzenia z wieloma neuronami. Uzyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopu 2P (Rysunek 4B). Określ czas ekspozycji i poziom światła wzbudzenia (≈910 nm) na podstawie głębokości i poziomu ekspresji GCaMP6s, przy czym słabsze sygnały wymagają dłuższych czasów naświetlania i odpowiednio mniejszej rozdzielczości czasowej. Zazwyczaj używamy czasów naświetlania ~4 μs na piksel. Rejestruj obrazy z częstotliwością odświeżania 3–5 Hz w rozdzielczości 512 × 512 pikseli.
8. Rozpocznij rejestrowanie szeregów czasowych. Przechowuj współrzędne każdego obszaru zainteresowania (ROI) względem wzorca naczyniowego lub punktów odniesienia na obrazach o małym powiększeniu. Wyobraź sobie ten sam zwrot z inwestycji w czasie. Wykonaj tę samą procedurę, aby obserwować dynamikę wapnia w obszarze S1 w lewej półkuli. Oblicz zmiany fluorescencji na podstawie każdego zwrotu z inwestycji.
9. Zdobywaj obrazy pojedynczo lub jako film poklatkowy (Rysunek 4C1-C3, D, E).
10. Zbadaj dynamikę przepływu krwi w korze mózgowej in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzyknięte do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii 2P. Używaj naczyń krwionośnych jako punktów orientacyjnych, aby rozpoznać i zobrazować ten sam zwrot z inwestycji w sesjach obrazowania przez długi czas.

4. Przetwarzanie danych

1. Użyj ImageJ i Origin do analizy obrazu. Importuj sekwencje obrazów za pomocą ImageJ (Rysunek 5A-B). W przypadku pojedynczych obrazów (lub filmów z serii t) wybierz ROI w obrazowanym neuronie i 2 oddzielne pobliskie regiony do pomiaru tła (Rysunek 5C). Uzyskaj całkowitą intensywność za pomocą menedżera zwrotu z inwestycji (Rysunek 5C).
   UWAGA: Rysunek 6 pokazuje reprezentatywne obrazy wapnia. Stan przejściowy wapnia (zielony) i naczynie krwionośne (czerwony) pojawiają się w różnych punktach czasowych w ciągu kilku sekund (Rysunek 6A-D) u myszy po 7 dniach po początkowej instalacji okna. Pokazana jest również projekcja z 3-minutowego okresu nagrywania dla kanałów czerwonego i zielonego (Rysunek 6E) lub kanału zielonego (Rysunek 6F). Projekcja z wyświetla skompresowany obraz wszystkich obrazów w filmie, z którego ręcznie wybierana jest granica zgrubna i okrągła (obejmująca neuron obiektu będący przedmiotem zainteresowania we wszystkich klatkach), a także wybór 2 niezależnych pobliskich obszarów tła (Rysunek 6G).
2. Z każdego ROI oblicz średnie tło fluorescencji FB, FB = (FB1+FB2)/2 oraz zmiany fluorescencji somy (F) wyrażone jako ΔF/F, ΔF/F = (F-FB)/FB.
3. Wykonuj analizę pików krok po kroku, korzystając z funkcji ImageJ, takich jak korekcja linii bazowej, znajdowanie/oznaczanie pików, integracja pików, dopasowywanie pików i/lub funkcje analizy pików oszczędzających czas.

Wyniki

Korzystając z dwustronnego okna optycznego, uzyskaliśmy wyniki z 2 oddzielnych eksperymentów. W pierwszym eksperymencie wykorzystano myszy z ekspresją EGFP do zobrazowania żylaków dendrytycznych. Rysunek 4C1-3 pokazuje przykłady obrazów uchwyconych w różnych punktach czasowych po implantacji okna optycznego. Zauważ, że liczba i położenie gałęzi dendrytycznych i kolców są niezwykle stabilne między 2 widokami (Rysunek 4D, E, projekcja z).

W drugim eksperymencie wykorzystano transgeniczne myszy Thy1-GCaMP6s do pomiaru wewnątrzkomórkowego przejściowego wapnia, ilustrując w ten sposób, jak fizjologia wapnia może być mierzona w pojedynczym neuronie in vivo (Rysunek 6). Technika ta może być wykorzystana do rejestrowania i ilościowego określania spontanicznej aktywności w populacjach neuronów piramidowych warstwy V zlokalizowanych na głębokości nawet >500 μm poniżej pia. Średnie spontaniczne odpowiedzi w czasie (obliczone jako średnie odpowiedzi w każdym punkcie czasowym) można obliczyć w wielu badaniach. Technika 2P ma tę zaletę, że wykrywa aktywność jednocześnie w dużych lub rozproszonych populacjach neuronów przez dłuższy czas przy niewielkich zakłóceniach mechanicznych mózgu w porównaniu z zapisami wieloelektrodowymi.

Aby uzyskać akceptowalny średni pomiar, zaleca się przeprowadzenie 5–10 prób. Liczba prób będzie zależała od spontanicznych reakcji lub wrodzonej zmienności reakcji na określoną stymulację. Jeśli wszystkie kroki są ściśle przestrzegane, jak opisano powyżej, badacz przeszkolony zarówno w technice okienka czaszkowego z cieńszą czaszką, jak i obrazowaniu wapnia 2P in vivo, powinien być w stanie uzyskać zapisy 100-200 neuronów po obu stronach od 1-2 zwierząt dziennie.

Po analizie piku można uzyskać zbiór wyników, takich jak rzeczywiste położenie szczytu, rzeczywista amplituda, obszar i pełna szerokość przy połowie maksimum (FWHM) dla każdego szczytu.

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja elementów czaszkowego okna optycznego do obrazowania 2-fotonowego (2P). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schematyczny rysunek pokazuje kluczowe kroki do przygotowania okna czaszkowego. (A) Pod mikroskopem preparacyjnym usuń skórę nad obszarem operacyjnym za pomocą nożyczek chirurgicznych. (B) Użyj szybkoobrotowego mikrowiertła, aby wykonać okrągły rowek (o średnicy 3 mm) na czaszce w obszarze S1, aż płat kostny w rowku zostanie oderwany od otaczającej kości. (C) Powoli usuń płat kostny, aby odsłonić leżącą pod spodem oponę twardą. (D) Zamontuj okienko optyczne z okularami nakrywkowymi o 2 różnych średnicach. Górne szkło nakrywkowe ma większą średnicę (5 mm), a dolne szkła nakrywkowe (zwykle 1-3) mają mniejszą średnicę (3 mm). Grubość okularów nakrywkowych, które mają zostać zainstalowane, będzie zależała od grubości czaszki. (E) Umieść szkiełko nakrywkowe na okrągłym otworze czaszki, aby utworzyć okno optyczne. Dolna część szkieł nakrywkowych powinna mieścić się w otworze czaszki. Dolna część okularów nakrywkowych powinna delikatnie stykać się z oponą twardą. (F) Uszczelnij krawędzie okien do czaszki za pomocą kleju cyjanoakrylowego. (G) Gdy cyjanoakrylan wyschnie, nałóż cement dentystyczny bocznie na ścianę kleju. (H) Napełnij okienko czaszki ddH₂O i użyj obiektywów zanurzonych w wodzie do obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Tworzenie obustronnych okien na czaszce. (A) Zdjęcie pokazuje 2 optyczne okna czaszki po każdej stronie czaszki pokrywające obszar S1. (B) Duże powiększenie pudełkowego obszaru obrazu (A) pokazujące obustronne okna optyczne odsłaniające leżącą pod spodem oponę twardą i naczynia krwionośne. Podziałka = 680 μm. (C) Odsłonięta czaszka. (D) Stworzenie okrągłego rowka, w którym widoczny jest centralny płat kostny. Podziałka = 900 μm. (E) Po usunięciu płata kostnego otwór czaszki wypełniono sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF). Podziałka = 720 μm. (F) Montaż okienka optycznego nad otworem czaszki i uszczelnienie krawędzi okna za pomocą super kleju. Opona twarda i naczynia krwionośne są widoczne przez okienko optyczne. Podziałka = 600 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazowanie wapnia i dendrytyki. (A1) Zidentyfikuj obszary zainteresowania za pomocą naczyń krwionośnych (BV) jako punktów orientacyjnych u myszy Thy1-GCaMP6s. (A2) Zidentyfikuj te same oznaczone komórki (czerwone strzałki) w czasie, używając tych samych punktów orientacyjnych i rekordu. (B) Reprezentatywna projekcja Z sygnałów wapniowych w neuronach (czerwone strzałki) pierwszorzędowej kory somatosensorycznej (S1). Podziałka = 10 μm. (C1-3) Wizualizacja dendrytów (zielony) i naczynia krwionośnego (czerwony) w B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J na różnych głębokościach w warstwie II obszaru S1 po 1 dniu od zainstalowania okna optycznego. (D) Projekcja Z wielu obrazów w tym samym regionie w ciągu 1 dnia. (E) Projekcja Z wielu obrazów w tym samym regionie po 7 dniach od zainstalowania okna optycznego. Zwróć uwagę na niezwykłą stabilność liczby i lokalizacji dorosłych kolców i gałęzi dendrytycznych między 1 dniem a 7 dniami po zainstalowaniu okna optycznego. Podziałka = C-E 5 μm (CE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Śledzenie sygnału wapniowego. (A, B) Przykłady zaimportowanych filmów z serii t z ImageJ do analizy danych 2 neuronów (odpowiednio neuronu 1 i neuronu 2). (C) Arkusz kalkulacyjny pokazuje dane dotyczące intensywności oświetlenia z obszaru zainteresowania (ROI; w obrębie neuronu i 2 oddzielnych pobliskich regionów jako miary tła). (D) Obliczanie piku: ΔF/F= (F-FB)/FB, FB = (FB1+FB2)/2 (średnie tło fluorescencji [FB] i zmiany fluorescencji somy [F] wyrażone jako ΔF/F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Reprezentatywne obrazy wapnia. (A-D) Stan przejściowy wapnia (zielony) i naczynia krwionośne (czerwony) w różnych punktach czasowych w ciągu sekund u myszy po 7 dniach od instalacji okna optycznego. Żółta strzałka: stosunkowo mniej aktywny neuron. Biała strzałka: wystrzeliwujący neuron. (E, F) Projekcja Z 3-minutowego okresu rejestracji dla kanału czerwonego (naczynia krwionośne) i zielonego (wapń) oraz tylko kanału zielonego (F). (G) Zaznaczone są wybrane neurony i przyległe do nich obszary tła. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Obrazowanie dwufotonowe umożliwia jednoczesny pomiar aktywności wielu komórek w rozsądnej rozdzielczości do około 800 μm poniżej powierzchni mózgu. Zintegrowaliśmy 2P i technikę podwójnego okna optycznego z genetycznie kodowanymi GCaMP6, aby obserwować dynamikę wapnia w populacjach somatów neuronalnych warstwy V znajdujących się >500 μm poniżej pia. Dzięki otwartemu oknu optycznemu po obu stronach czaszki, metoda umożliwia rejestrację aktywności neuronalnej w symetrycznych obszarach mózgu ssaków w celu przedłużonego i stabilnego obrazowania wapnia in vivo. Kluczowe aspekty tej metody obejmują wykonywanie minimalnie inwazyjnej chirurgii w celu stworzenia podwójnych otwartych okien optycznych czaszki oraz obrazowanie 2P aktywności neuronalnej w symetrycznych regionach S1.

Badanie aktywności sieci w obustronnych regionach S1 jest przykładem tego, jak podwójne okna czaszkowe mogą być wykorzystane do badania lokalnego i symetrycznego przetwarzania informacji w dorosłym mózgu in vivo. Metoda ta może być również wykorzystana do badania aktywności neuronalnej (np. przy użyciu myszy Thy1-GCaMP6s) i plastyczności kory mózgowej B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J z nienaruszonej tkanki odpowiednich symetrycznych regionów w trakcie rekonwalescencji po deaferentacji spowodowanej jednostronnym uszkodzeniem OUN. Metoda może być również stosowana do badania aktywności kory mózgowej w odpowiedzi na strategie stymulacji obwodowej, takie jak stymulacje optyczne, elektryczne lub chemiczne. Chociaż demonstrujemy tę technikę tylko w obszarze S1, podejście to można zastosować do zbadania aktywności w innych symetrycznych obszarach żywego mózgu, takich jak neurony warstwy V pierwotnej kory ruchowej (M1). Obserwacje dotyczące reorganizacji regionów mózgu mogą stanowić neuronalne podłoże dla adaptacyjnych zachowań motorycznych, które odgrywają kluczową rolę w odzyskiwaniu funkcji po urazie. Pozwala również na przewlekły pomiar symetrycznej aktywności genetycznie zidentyfikowanych komórek podczas zachowania u myszy z unieruchomioną głową.

Z technicznego punktu widzenia badacze powinni zwrócić szczególną uwagę na jakość i spójność podwójnych okien czaszkowych. Technika okienka czaszkowego z przerzedzoną czaszką ¹² jest wysoce zalecana dla początkujących do praktyki. Kolce są przedziałami wapniowymi ze względu na ich morfologię oraz lokalne mechanizmy napływu i wytłaczania. W tym badaniu użyliśmy witaminy B6. Myszy Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J jako przykład demonstrujący dynamikę kolców dendrytycznych in vivo (Figura 4). Instalacja szklanego okna z otwartą czaszką może powodować dużą rotację kręgosłupa i reaktywne reakcje glejowe po operacji ¹². W przeciwieństwie do tego, dzięki technice okien z przerzedzoną czaszką, kolce i dendryty mogą być dobrze zachowane.

Wybór wymiarów i grubości okien optycznych będzie zależał od pożądanego pola widzenia, krzywizny czaszki, grubości czaszki i rodzaju obrazowania ¹³. Niewystarczający nacisk optycznych szkieł ochronnych na oponę twardą może powodować pogrubienie opony twardej, odrastanie czaszki i wzmożony ruch mózgu. Natomiast nadmierny nacisk na optyczne okulary ochronne może utrudniać przepływ krwi w korze mózgowej.

W przypadku montażu okien optycznych należy przykleić i utwardzić dodatkowe warstwy szkieł nakrywkowych pojedynczo za pomocą kleju optycznego i światła UV o dużej długości fali. Aby wzmocnić wiązanie klejowe, należy ogrzać wykonane okno (50 °C przez 12 godzin) w inkubatorze. Szklaną nakrywkę okienną należy przechowywać w 70% etanolu (obj./obj.), a przed zabiegiem spłukać jałową solą fizjologiczną. Okienko optyczne należy przed użyciem sprawdzić pod kątem niedoskonałości (takich jak nieprawidłowa ilość kleju optycznego lub niedokładne wyrównanie) pod stereoskopem, aby uniknąć awarii. Jeśli klej optyczny jest zbyt cienki, przestrzenie powietrzne mogą być pofałdowane, co może powodować aberracje optyczne lub odklejanie się szkła osłonowego podczas implantacji. Natomiast zbyt duża ilość kleju optycznego może spowodować przelanie się poza krawędzie okna czaszki.

Podsumowując, tutaj opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru dynamiki wapnia lub morfologii dendrytycznej przez okna czaszkowe z 2 symetrycznych pierwotnych somatosensorycznych regionów korowych u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6 i Thy1-YFP, odpowiednio, przy użyciu mikroskopii 2P. Technika ta może znacznie ułatwić analizę złożonych strukturalnych i funkcjonalnych relacji sieci neuronowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Mogą to być dowolne szczepy wytwarzane przez genetycznie kodowany wskaźnik neuronalny i efektor wyrażający zielony fluorescencyjny wskaźnik wapnia, GCaMP, w podzbiorach neuronów pobudzających w korze
Klasa B6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Mogą to być dowolne szczepy wyrażające EGFP w podzbiorach neuronów w określonych populacjach w korze mózgowej; zapewniając jasną, życiową plamę podobną do Golgiego.
Kleszcze Dumont nr 5, standardowe, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Może być dowolnej marki.
Kleszcze Dumont nr 5SF	Fine Science Tools	11252-00	Może być dowolną marką.
Sterylizator Micro Bead Southern	Labware	B1201	Może być dowolną marką.
Harishige' powiedział: s SG-4N Adapter do trzymania głowicy	Tritech Research	SG-4N	Może być dowolną marką.
Idealny kompletny zestaw do mikrowierteł	Aparat Harvard	72-6065	Może być dowolną marką.
Frezy do Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Może być dowolną marką.
Okrągłe szkło nakrywkowe, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Może być dowolnej marki.
Okrągłe szkło nakrywkowe, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Może być dowolną marką.
Klej optyczny Norland	Produkty Norland	7106	Może być dowolną marką.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Może być dowolną marką.
Zestaw cementu do chwytania, proszek i rozpuszczalnik	Dentsply	675570	Może być dowolnej marki. Wymieszaj 5 części białego proszku cementu dentystycznego (Grip Cement) z jedną częścią czarnej farby proszkowej Tempera (aby chronić przed światłem; niektórzy użytkownicy wolą proporcje 10:1).
Pianka żelowa	Moore Medical	2928	Może być dowolnej marki.
Nożyczki do mikro preparacji	Roboz	RS-5841	Może być dowolną marką.
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ASF) -			ACSF zawiera 125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO / sub>, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 20 mM glukozy. Przelej ACSF tlenem (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) i dostosuj pH do 7,4. Przygotuj świeży roztwór ACSF przed każdym eksperymentem.