Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Podsumowanie

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Streszczenie

Mózg ssaków wykazuje wyraźną symetrię w płaszczyźnie strzałkowej. Jednak szczegółowy opis dynamiki neuronalnej w symetrycznych obszarach mózgu u dorosłych ssaków pozostaje nieuchwytny. W tym badaniu opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru dynamiki wapnia przez podwójne okna optyczne nad obustronną pierwotną korą somatosensoryczną (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P). Metoda ta umożliwia rejestrację i kwantyfikację aktywności neuronalnej w obustronnych obszarach mózgu myszy pojedynczo w tym samym eksperymencie przez dłuższy czas in vivo. Kluczowe aspekty tej metody, które można wykonać w ciągu godziny, obejmują minimalnie inwazyjne procedury chirurgiczne w celu stworzenia podwójnych okien optycznych oraz zastosowanie obrazowania 2P. Chociaż demonstrujemy technikę tylko w obszarze S1, metoda może być zastosowana do innych obszarów żywego mózgu, ułatwiając wyjaśnienie strukturalnej i funkcjonalnej złożoności sieci neuronowych mózgu.

Wprowadzenie

Wapń i jego regulacja są niezbędne w pośredniczeniu w wielu procesach fizjologicznych. Monitorowanie dynamiki wapnia jest przydatne do zrozumienia prawidłowego funkcjonowania mózgu, a także patologicznych stanów zaburzeń mózgu ^1,2,3,4,5,6,7^,8. Obrazowanie fluorescencji GCaMP6s jest potężnym narzędziem do ilościowego określania liczby skoków, czasu i częstotliwości, a także poziomów danych synaptycznych zarówno in vitro, jak i in vivo 9^,10,11.

Mózg ssaków wykazuje wyraźną symetrię w płaszczyźnie strzałkowej. Chociaż ostatnie badania neurologiczne rzuciły światło na przebudowę kory mózgowej i aktywność neuronalną wywołaną przez uraz mózgu lub rdzenia kręgowego ^6,7, role, jakie w powrocie do zdrowia odgrywają nienaruszone tkanki symetrycznie odpowiadających sobie regionów, są nadal niejasne.

W tym badaniu opisujemy eksperymentalne procedury tworzenia dwustronnych symetrycznych okien optycznych do obrazowania in vivo. Korzystając z tych okien optycznych, opisujemy pomiar dynamiki wapnia z pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) u transgenicznych myszy GCaMP6s za pomocą mikroskopii 2P. W sekcji wyników pokazujemy również morfologię dendrytyczną in vivo w różnych punktach czasowych w regionie S1 u myszy transgenicznych EGFP za pomocą obrazowania 2P. Metoda obserwacji dynamiki sieci w obustronnych obszarach S1 jest tylko wstępnym przykładem tego, jak podwójnie otwarte okna czaszkowe pomogą neurobiologom badać lokalne i symetryczne przetwarzanie informacji w mózgu dorosłych ssaków w normalnych warunkach lub w różnych modelach choroby in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury chirurgiczne i związane ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (Krajowa Rada ds. Badań) oraz wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Indiana University School of Medicine. Schematyczna ilustracja układu obrazowania 2-fotonowego jest pokazana na Rysunek 1.

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania

1. Umieść sterylną gazę, waciki i autoklawowane narzędzia chirurgiczne w polu operacyjnym (Tabela 1). Włącz sterylizator Micro Bead do sterylizacji międzyoperacyjnej narzędzi chirurgicznych.
2. Znieczulić mysz (samiec lub samica, 1,5–2,5 miesiąca, 20–25 g) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie (i.p.) mieszaniny ketaminy (17,2 mg/ml), ksylazyny (0,475 mg/ml) i acepromazyny (0,238 mg/ml) (6 μl/g masy ciała). Poczekaj, aż zostanie osiągnięta odpowiednia głębokość znieczulenia, gdy zwierzę przestanie reagować na bodziec szczypania palca u nogi i nie będzie miało odruchu rogówkowego. Podczas zabiegu należy podać dawkę przypominającą 1/3 pierwotnej dawki koktajlu znieczulającego, w zależności od potrzeb utrzymania pierwotnego stanu znieczulającego.
3. Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie (s.c.; 0,05–0,10 mg/kg) jako środek przeciwbólowy przed zabiegiem chirurgicznym. Nałóż maść ochronną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i powstawaniu zaćmy.
4. Umieść transgeniczną mysz GCaMP6s na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii i przykryj ją sterylną obłożeniem chirurgiczną. Ustabilizuj głowę zwierzęcia za pomocą adaptera do trzymania głowy dla myszy.
5. Ogol głowę na większości skóry głowy za pomocą żyletki z dwoma krawędziami. Oczyścić obszar operacyjny sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie roztworem jodu powidonu.

2. Przygotowanie przewlekłego okna czaszkowego

1. Wykonaj prostokątne cięcie skóry głowy (2 mm x 3 mm) nożyczkami po jednej (prawej) stronie czaszki. Odsuń skórę na bok bawełnianym wacikiem, aby utworzyć obszar ekspozycji o średnicy >3 mm (Rysunek 3A). Usuń tkankę łączną przyczepioną do czaszki, delikatnie zeskrobując czaszkę ostrzem mikrochirurgicznym (Ostrze skalpela #10; Rysunek 3C).
2. Zaznacz obszar S1, delikatnie rysując okrąg (3 mm średnicy, współrzędna środkowa: -1,5 mm od bregmy i 2,5 mm od linii środkowej) na czaszce za pomocą wiertła dentystycznego (Rysunek 2B).
3. Wykonaj tę samą procedurę na lewej czaszce (Rysunek 2B).
4. Nałóż cienką warstwę kleju Cyjanoakrylan Super Glue na kość, aby zapewnić bazę do aplikacji cementu dentystycznego.
5. Pod mikroskopem preparacyjnym rozcieńczyć okrągły rowek w czaszce wokół obszaru S1 za pomocą szybkoobrotowego mikrowiertła (Rysunek 3D). Celem jest stworzenie gładkiej krawędzi do umieszczenia na nim okna optycznego.
6. Wielokrotnie nakładaj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF, temperatura pokojowa) na czaszkę okresowo podczas procesu rozrzedzania, aby ułatwić wiercenie i rozproszyć ciepło. Wykonuj wiercenie z przerwami, aby uniknąć przegrzania spowodowanego tarciem. Odessać resztki kości za pomocą domowej linii próżniowej lub pompy próżniowej.
7. Po wywierceniu około 2/3 głębokości kości, powoli i ostrożnie rozrzedź pozostałą 1/3 kości, aż okrągły kawałek czaszki (płat kostny) zostanie całkowicie wolny od otaczającej czaszki.
8. Powoli i ostrożnie usuń okrągły płat kostny za pomocą pary kleszczy # 5/45 i odsłoń oponę twardą (Rysunek 2C; Rysunek 3E).
9. Utrzymuj odsłonięty obszar mózgu wilgotny za pomocą ACSF (Rysunek 3E). Unikaj uszkodzeń naczyń krwionośnych, ponieważ krwotok zmieni przepływ krwi w mózgu, przyspieszy obrzęk mózgu i poważnie pogorszy jakość obrazowania.
10. Wykonaj tę samą procedurę po lewej (przeciwległej) stronie czaszki.
11. Do montażu okienka optycznego użyj kleju optycznego, aby skleić i utwardzić między warstwami szkła nakrywkowego pojedynczo. W razie potrzeby ogrzej okienko optyczne (50 °C przez 12 godzin) w inkubatorze, aby wzmocnić wiązanie klejowe. Okienko optyczne składa się z 2 części: górna część zawiera pojedynczą okrągłą szklankę nakrywkową o średnicy 5 mm, a dolna część zawiera 1–3 okrągłe szkła nakrywkowe o średnicy 3 mm (Rysunek 2D).
12. Przechowuj okienko optyczne w etanolu (70%, obj./obj.) i przed użyciem spłucz je sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Przed montażem okna optycznego należy sprawdzić okienko optyczne pod kątem niedoskonałości, w tym nieprawidłowej ilości kleju optycznego lub niedokładnego wyrównania pod stereoskopem.
13. Zamontuj okno optyczne nad obszarem kraniotomii (Rysunek 2D). Górna część okienka optycznego spoczywa na czaszce, a dolna część okienka optycznego mieści się w kraniotomicznym otworze i spoczywa na oponie twardej w obecności płynu mózgowo-rdzeniowego (Rysunek 2D, E).
14. Uszczelnij górną część krawędzi okna optycznego do czaszki za pomocą kleju Cyjanoakrylowy Super Glue (Rysunek 2F; Rysunek 3F).
15. Gdy klej Cyanoacrylate Super Glue wyschnie, nałóż cement dentystyczny (Dentsply), aby pokryć krawędź szkła. Nałóż cement dentystyczny na wszystkie odsłonięte brzegi czaszki i rany, aby zablokować światło (Rysunek 2G-H; Rysunek 3B).
16. Wykonaj tę samą procedurę po lewej stronie.
17. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej i wróć do klatki domowej w celu odzyskania zdrowia pod odpowiednim nadzorem. Zapewnij mokrą karmę, aby ułatwić żucie i nawodnienie. W celu zmniejszenia dolegliwości bólowych należy podawać buprenorfinę s.c. (0,05–2,0 mg/kg) co 8–12 godzin po urazie przez 2 dni. Pozwól myszy dojść do siebie przez dodatkowe 7–10 dni przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie dwufotonowe

1. W dniu eksperymentu znieczulić zwierzę ketaminą i ksylazyną (dawki i utrzymanie znieczulenia jak opisano powyżej). Oczyść okno czaszki 75% (obj./obj.) etanolem.
2. Umieść mysz w zestawie do obrazowania składającym się z mikroskopu 2P i adaptera do trzymania głowy, spoczywając na poduszce grzewczej z głową unieruchomioną przez nauszniki przymocowane do uchwytu na głowę myszy.
3. Obrazuj jedną stronę okna optycznego na raz. Aby zminimalizować aberracje optyczne, upewnij się, że okienko optyczne i prawa czaszka są ustawione prostopadle do osi optycznej mikroskopu.
4. Zrób wstępne zdjęcie okna czaszki z jasnym oświetleniem pola przy 4-krotnym powiększeniu jako mapę referencyjną do rejestracji z angiografiami 2P o większym powiększeniu (Rysunek 4A1).
5. Powiększ obszar zainteresowania za pomocą 10-krotnego powiększenia (Rysunek 4A2).
6. Wybierz obszar zainteresowania w obszarze S1 w warstwach korowych I lub II (do 150 μm poniżej powierzchni pial). Jeśli pożądane jest większe powiększenie, użyj obiektywu 20X.
7. Wyszukaj pole widzenia z wieloma neuronami. Uzyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopu 2P (Rysunek 4B). Określ czas ekspozycji i poziom światła wzbudzenia (≈910 nm) na podstawie głębokości i poziomu ekspresji GCaMP6s, przy czym słabsze sygnały wymagają dłuższych czasów naświetlania i odpowiednio mniejszej rozdzielczości czasowej. Zazwyczaj używamy czasów naświetlania ~4 μs na piksel. Rejestruj obrazy z częstotliwością odświeżania 3–5 Hz w rozdzielczości 512 × 512 pikseli.
8. Rozpocznij rejestrowanie szeregów czasowych. Przechowuj współrzędne każdego obszaru zainteresowania (ROI) względem wzorca naczyniowego lub punktów odniesienia na obrazach o małym powiększeniu. Wyobraź sobie ten sam zwrot z inwestycji w czasie. Wykonaj tę samą procedurę, aby obserwować dynamikę wapnia w obszarze S1 w lewej półkuli. Oblicz zmiany fluorescencji na podstawie każdego zwrotu z inwestycji.
9. Zdobywaj obrazy pojedynczo lub jako film poklatkowy (Rysunek 4C1-C3, D, E).
10. Zbadaj dynamikę przepływu krwi w korze mózgowej in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzyknięte do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii 2P. Używaj naczyń krwionośnych jako punktów orientacyjnych, aby rozpoznać i zobrazować ten sam zwrot z inwestycji w sesjach obrazowania przez długi czas.

4. Przetwarzanie danych

1. Użyj ImageJ i Origin do analizy obrazu. Importuj sekwencje obrazów za pomocą ImageJ (Rysunek 5A-B). W przypadku pojedynczych obrazów (lub filmów z serii t) wybierz ROI w obrazowanym neuronie i 2 oddzielne pobliskie regiony do pomiaru tła (Rysunek 5C). Uzyskaj całkowitą intensywność za pomocą menedżera zwrotu z inwestycji (Rysunek 5C).
   UWAGA: Rysunek 6 pokazuje reprezentatywne obrazy wapnia. Stan przejściowy wapnia (zielony) i naczynie krwionośne (czerwony) pojawiają się w różnych punktach czasowych w ciągu kilku sekund (Rysunek 6A-D) u myszy po 7 dniach po początkowej instalacji okna. Pokazana jest również projekcja z 3-minutowego okresu nagrywania dla kanałów czerwonego i zielonego (Rysunek 6E) lub kanału zielonego (Rysunek 6F). Projekcja z wyświetla skompresowany obraz wszystkich obrazów w filmie, z którego ręcznie wybierana jest granica zgrubna i okrągła (obejmująca neuron obiektu będący przedmiotem zainteresowania we wszystkich klatkach), a także wybór 2 niezależnych pobliskich obszarów tła (Rysunek 6G).
2. Z każdego ROI oblicz średnie tło fluorescencji FB, FB = (FB1+FB2)/2 oraz zmiany fluorescencji somy (F) wyrażone jako ΔF/F, ΔF/F = (F-FB)/FB.
3. Wykonuj analizę pików krok po kroku, korzystając z funkcji ImageJ, takich jak korekcja linii bazowej, znajdowanie/oznaczanie pików, integracja pików, dopasowywanie pików i/lub funkcje analizy pików oszczędzających czas.

Wyniki

Wykorzystując bilateralne okno optyczne, uzyskaliśmy wyniki z 2 oddzielnych eksperymentów. W pierwszym eksperymencie zastosowano myszy wykazujące ekspresję EGFP w celu obrazowania zgrubień dendrytycznych. Rysunek 4C1-3 przedstawia przykłady obrazów zarejestrowanych w różnych punktach czasowych po implantacji okna optycznego. Należy zauważyć, że liczba i rozmieszczenie gałęzi dendrytycznych oraz kolców są niezwykle stabilne pomiędzy 2 widokami (Rysunek 4D, E, projekcja z).

W drugim eksperymencie zastosowano Thy1-transgeniczne myszy GCaMP6s do pomiaru wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia, co obrazuje sposób pomiaru fizjologii wapnia w pojedynczym neuronie in vivo (Rycina 6). Technikę tę można wykorzystać do rejestracji i kwantyfikacji spontanicznej aktywności w populacjach neuronów piramidowych warstwy V, znajdujących się na głębokości do >500 µm poniżej opony miękkiej. Średnie odpowiedzi spontaniczne w czasie (obliczone jako średnie odpowiedzi w każdym punkcie czasowym) można wyznaczyć na podstawie licznych prób. Technika 2P ma tę zaletę, że pozwala na jednoczesną detekcję aktywności w dużych lub rozproszonych populacjach neuronalnych przez dłuższy czas, powodując niewielkie zaburzenia mechaniczne mózgu w porównaniu z rejestracjami wieloelektrodowymi.

Aby uzyskać akceptowalną średnią pomiaru, zaleca się przeprowadzenie od 5 do 10 prób. Liczba prób będzie zależeć od odpowiedzi spontanicznych lub wrodzonej zmienności odpowiedzi na konkretną stymulację. Jeśli wszystkie etapy zostaną ściśle wykonane zgodnie z powyższym opisem, badacz przeszkolony zarówno w technice cienienia czaszki (thinned-skull cranial window), jak i w obrazowaniu wapnia 2P in vivo, powinien być w stanie uzyskać zapisy z 100–200 neuronów po obu stronach u 1–2 zwierząt dziennie.

Po analizie piku można uzyskać zestaw wyników, takich jak rzeczywiste położenie piku, rzeczywista amplituda, pole powierzchni oraz pełna szerokość połówkowa (FWHM) dla każdego piku.

Rycina 1: Schematyczny rysunek komponentów optycznego okna czaszkowego do obrazowania dwufotonowego (2P). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Rysunek schematyczny przedstawiający kluczowe kroki przygotowania okna czaszkowego. (A) Pod mikroskopem stereoskopowym usunąć skórę nad obszarem operacyjnym za pomocą nożyczek chirurgicznych. (B) Użyć wysokobiegowego mikrowiertła do wykonania kolistego rowka (średnica 3 mm) na czaszce nad obszarem S1, aż fragment kości wewnątrz rowka oddzieli się od kości otaczającej. (C) Powoli usunąć fragment kości, aby odsłonić leżącą poniżej oponę twardą. (D) Złożyć okno optyczne z szkiełek podstawkowych o dwóch różnych średnicach. Górne szkiełko ma większą średnicę (5 mm), a szkiełka dolne (zazwyczaj 1-3) mają mniejszą średnicę (3 mm). Grubość instalowanych szkiełek zależy od grubości czaszki. (E) Umieścić szkiełko na kolistym otworze w czaszce, aby stworzyć okno optyczne. Dolna część szkiełek powinna pasować do otworu czaszkowego. Dół szkiełek powinien delikatnie stykać się z oponą twardą. (F) Uszczelnić krawędzie okna z czaszką za pomocą kleju cyjanoakrylowego. (G) Po wyschnięciu kleju cyjanoakrylowego nałożyć czarny cement stomatologiczny bocznie od ściany z kleju. (H) Wypełnić okno czaszkowe ddH₂O i użyć obiektywów immersyjnych w wodzie do obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Tworzenie obustronnych okien w czaszce. (A) Zdjęcie fotograficzne przedstawiające 2 okna optyczne w czaszce po każdej stronie, nad obszarem S1. (B) Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką na zdjęciu (A), pokazujące obustronne okna optyczne odsłaniające leżącą poniżej oponę twardą i naczynia krwionośne. Pasek skali = 680 µm. (C) Odsłonięta czaszka. (D) Tworzenie okrągłego rowka, wewnątrz którego widoczny jest centralny fragment kości. Pasek skali = 900 µm. (E) Po usunięciu fragmentu kości otwór czaszkowy został wypełniony sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF). Pasek skali = 720 µm. (F) Montaż okna optycznego nad otworem czaszkowym i uszczelnienie krawędzi okna superglue. Opona twarda i naczynia krwionośne są widoczne przez okno optyczne. Pasek skali = 600 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazowanie wapnia i dendrytów. (A1) Identyfikacja obszarów zainteresowania z wykorzystaniem naczyń krwionośnych (BV) jako punktów orientacyjnych u myszy Thy1-GCaMP6s. (A2) Identyfikacja tych samych oznakowanych komórek (czerwone strzałki) w czasie przy użyciu tych samych punktów orientacyjnych i rejestracja. (B) Reprezentatywna projekcja Z sygnałów wapniowych w neuronach (czerwone strzałki) pierwotnej kory somatosensorycznej (S1). Pasek skali = 10 µm. (C1-3) Wizualizacja dendrytów (zielone) i naczynia krwionośnego (czerwone) u B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J na różnych głębokościach w warstwie II regionu S1 1 dzień po instalacji okna optycznego. (D) Projekcja Z wielu obrazów tego samego obszaru w 1. dniu. (E) Projekcja Z wielu obrazów tego samego obszaru 7 dni po instalacji okna optycznego. Zwróć uwagę na niezwykłą stabilność liczby i lokalizacji kolców dorosłych oraz odgałęzień dendrytycznych między 1. a 7. dniem po instalacji okna optycznego. Pasek skali = C-E 5 µm (C-E). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Śledzenie sygnału wapniowego. (A, B) Przykłady zaimportowanych do ImageJ filmów z serii t do analizy danych 2 neuronów (odpowiednio neuron 1 i neuron 2). (C) Arkusz kalkulacyjny przedstawiający dane dotyczące natężenia oświetlenia z obszaru zainteresowania (ROI; w obrębie neuronu oraz 2 oddzielnych pobliskich obszarów jako pomiary tła). (D) Obliczanie szczytu: ΔF/F= (F-FB)/FB, FB = (FB1+FB2)/2 (średnie tło fluorescencji [FB] oraz zmiany fluorescencji somy [F] wyrażone jako ΔF/F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 6. Reprezentatywne obrazy wapnia. (A-D) Przejściowe zmiany stężenia wapnia (zielony) i naczynia krwionośne (czerwony) w różnych punktach czasowych wyrażonych w sekundach u myszy w 7. dniu po instalacji okna optycznego. Żółta strzałka: neuron stosunkowo mniej aktywny. Biała strzałka: neuron wykazujący aktywność typu spiking. (E, F) Projekcja Z z 3-minutowego okresu rejestracji dla kanału czerwonego (naczynia krwionośne) i zielonego (wapń) (E) oraz samego kanału zielonego (F). (G) Zaznaczono wybrane neurony oraz przylegające do nich obszary tła. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Obrazowanie dwufotonowe umożliwia jednoczesny pomiar aktywności wielu komórek w rozsądnej rozdzielczości do około 800 μm poniżej powierzchni mózgu. Zintegrowaliśmy 2P i technikę podwójnego okna optycznego z genetycznie kodowanymi GCaMP6, aby obserwować dynamikę wapnia w populacjach somatów neuronalnych warstwy V znajdujących się >500 μm poniżej pia. Dzięki otwartemu oknu optycznemu po obu stronach czaszki, metoda umożliwia rejestrację aktywności neuronalnej w symetrycznych obszarach mózgu ssaków w celu przedłużonego i stabilnego obrazowania wapnia in vivo. Kluczowe aspekty tej metody obejmują wykonywanie minimalnie inwazyjnej chirurgii w celu stworzenia podwójnych otwartych okien optycznych czaszki oraz obrazowanie 2P aktywności neuronalnej w symetrycznych regionach S1.

Badanie aktywności sieci w obustronnych regionach S1 jest przykładem tego, jak podwójne okna czaszkowe mogą być wykorzystane do badania lokalnego i symetrycznego przetwarzania informacji w dorosłym mózgu in vivo. Metoda ta może być również wykorzystana do badania aktywności neuronalnej (np. przy użyciu myszy Thy1-GCaMP6s) i plastyczności kory mózgowej B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J z nienaruszonej tkanki odpowiednich symetrycznych regionów w trakcie rekonwalescencji po deaferentacji spowodowanej jednostronnym uszkodzeniem OUN. Metoda może być również stosowana do badania aktywności kory mózgowej w odpowiedzi na strategie stymulacji obwodowej, takie jak stymulacje optyczne, elektryczne lub chemiczne. Chociaż demonstrujemy tę technikę tylko w obszarze S1, podejście to można zastosować do zbadania aktywności w innych symetrycznych obszarach żywego mózgu, takich jak neurony warstwy V pierwotnej kory ruchowej (M1). Obserwacje dotyczące reorganizacji regionów mózgu mogą stanowić neuronalne podłoże dla adaptacyjnych zachowań motorycznych, które odgrywają kluczową rolę w odzyskiwaniu funkcji po urazie. Pozwala również na przewlekły pomiar symetrycznej aktywności genetycznie zidentyfikowanych komórek podczas zachowania u myszy z unieruchomioną głową.

Z technicznego punktu widzenia badacze powinni zwrócić szczególną uwagę na jakość i spójność podwójnych okien czaszkowych. Technika okienka czaszkowego z przerzedzoną czaszką ¹² jest wysoce zalecana dla początkujących do praktyki. Kolce są przedziałami wapniowymi ze względu na ich morfologię oraz lokalne mechanizmy napływu i wytłaczania. W tym badaniu użyliśmy witaminy B6. Myszy Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J jako przykład demonstrujący dynamikę kolców dendrytycznych in vivo (Figura 4). Instalacja szklanego okna z otwartą czaszką może powodować dużą rotację kręgosłupa i reaktywne reakcje glejowe po operacji ¹². W przeciwieństwie do tego, dzięki technice okien z przerzedzoną czaszką, kolce i dendryty mogą być dobrze zachowane.

Wybór wymiarów i grubości okien optycznych będzie zależał od pożądanego pola widzenia, krzywizny czaszki, grubości czaszki i rodzaju obrazowania ¹³. Niewystarczający nacisk optycznych szkieł ochronnych na oponę twardą może powodować pogrubienie opony twardej, odrastanie czaszki i wzmożony ruch mózgu. Natomiast nadmierny nacisk na optyczne okulary ochronne może utrudniać przepływ krwi w korze mózgowej.

W przypadku montażu okien optycznych należy przykleić i utwardzić dodatkowe warstwy szkieł nakrywkowych pojedynczo za pomocą kleju optycznego i światła UV o dużej długości fali. Aby wzmocnić wiązanie klejowe, należy ogrzać wykonane okno (50 °C przez 12 godzin) w inkubatorze. Szklaną nakrywkę okienną należy przechowywać w 70% etanolu (obj./obj.), a przed zabiegiem spłukać jałową solą fizjologiczną. Okienko optyczne należy przed użyciem sprawdzić pod kątem niedoskonałości (takich jak nieprawidłowa ilość kleju optycznego lub niedokładne wyrównanie) pod stereoskopem, aby uniknąć awarii. Jeśli klej optyczny jest zbyt cienki, przestrzenie powietrzne mogą być pofałdowane, co może powodować aberracje optyczne lub odklejanie się szkła osłonowego podczas implantacji. Natomiast zbyt duża ilość kleju optycznego może spowodować przelanie się poza krawędzie okna czaszki.

Podsumowując, tutaj opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru dynamiki wapnia lub morfologii dendrytycznej przez okna czaszkowe z 2 symetrycznych pierwotnych somatosensorycznych regionów korowych u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6 i Thy1-YFP, odpowiednio, przy użyciu mikroskopii 2P. Technika ta może znacznie ułatwić analizę złożonych strukturalnych i funkcjonalnych relacji sieci neuronowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Mogą to być dowolne szczepy wytwarzane przez genetycznie kodowany wskaźnik neuronalny i efektor wyrażający zielony fluorescencyjny wskaźnik wapnia, GCaMP, w podzbiorach neuronów pobudzających w korze
Klasa B6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Mogą to być dowolne szczepy wyrażające EGFP w podzbiorach neuronów w określonych populacjach w korze mózgowej; zapewniając jasną, życiową plamę podobną do Golgiego.
Kleszcze Dumont nr 5, standardowe, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Może być dowolnej marki.
Kleszcze Dumont nr 5SF	Fine Science Tools	11252-00	Może być dowolną marką.
Sterylizator Micro Bead Southern	Labware	B1201	Może być dowolną marką.
Harishige' powiedział: s SG-4N Adapter do trzymania głowicy	Tritech Research	SG-4N	Może być dowolną marką.
Idealny kompletny zestaw do mikrowierteł	Aparat Harvard	72-6065	Może być dowolną marką.
Frezy do Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Może być dowolną marką.
Okrągłe szkło nakrywkowe, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Może być dowolnej marki.
Okrągłe szkło nakrywkowe, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Może być dowolną marką.
Klej optyczny Norland	Produkty Norland	7106	Może być dowolną marką.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Może być dowolną marką.
Zestaw cementu do chwytania, proszek i rozpuszczalnik	Dentsply	675570	Może być dowolnej marki. Wymieszaj 5 części białego proszku cementu dentystycznego (Grip Cement) z jedną częścią czarnej farby proszkowej Tempera (aby chronić przed światłem; niektórzy użytkownicy wolą proporcje 10:1).
Pianka żelowa	Moore Medical	2928	Może być dowolnej marki.
Nożyczki do mikro preparacji	Roboz	RS-5841	Może być dowolną marką.
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ASF) -			ACSF zawiera 125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO / sub>, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 20 mM glukozy. Przelej ACSF tlenem (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) i dostosuj pH do 7,4. Przygotuj świeży roztwór ACSF przed każdym eksperymentem.

mózgowej.