Artykuł metodologiczny

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

DOI:

10.3791/56308

⸱

24 stycznia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nowatorski trójwymiarowy model in vitro, w którym komórki zrębu rogówki i zróżnicowane komórki neuronalne są hodowane razem, aby pomóc w badaniu i zrozumieniu interakcji dwóch typów komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkankowa zyskała duże uznanie ze względu na duże zapotrzebowanie na zamienniki ludzkiej rogówki, a szacuje się, że 10 milionów ludzi na całym świecie cierpi na utratę wzroku rogówki1. Aby sprostać zapotrzebowaniu na żywotne ludzkie rogówki, poczyniono znaczne postępy w trójwymiarowej (3D) inżynierii tkankowej2,3,4. Te modele rogówki obejmują zarówno proste systemy jednowarstwowe, jak i modele wielowarstwowe, co prowadzi do pełnowymiarowych odpowiedników rogówki 3D2.

Jednak użycie 3D tkankowej rogówki w kontekście badanych do tej pory modeli chorób in vitro nie przypomina wielowarstwowej struktury tkanki rogówki 3D, funkcji i sieci różnych typów komórek (tj. nerwu, nabłonka, zrębu i śródbłonka)2,3. Ponadto wzrosło zapotrzebowanie na modele tkanek rogówki in vitro w celu ograniczenia testów na zwierzętach w przypadku produktów farmaceutycznych. W związku z tym potrzebne są bardziej wyrafinowane modele, aby lepiej dopasować systemy do wymagań fizjologicznych człowieka, a opracowanie modelu, który jest bardziej odpowiedni dla populacji pacjentów, jest absolutnie konieczne. Biorąc pod uwagę, że wiele typów komórek w rogówce jest dotkniętych chorobami i dystrofiami, takimi jak stożek rogówki, keratopatia cukrzycowa i Fuchs, model ten obejmuje model kohodowli 3D pierwotnych ludzkich fibroblastów rogówki (HCF) od zdrowych dawców i neuronów z linii komórkowej SH-SY5Y. Dzięki temu po raz pierwszy możemy zbadać interakcje między dwoma typami komórek w ludzkiej tkance rogówki. Uważamy, że ten model może potencjalnie przeanalizować mechanizmy leżące u podstaw interakcji zrębu i nerwów w chorobach rogówki, które wykazują uszkodzenia nerwów. Ten model 3D odzwierciedla podstawową anatomiczną i fizjologiczną naturę tkanki rogówki in vivo i może być wykorzystany w przyszłości jako narzędzie do badania wad rogówki, a także do badania przesiewowego skuteczności różnych środków przed testami na zwierzętach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ludzkim ciele rogówka jest najgęściej unerwioną tkanką. Nerwy są odpowiedzialne za różne odczucia, takie jak dotyk, ból, temperatura, a także odgrywają istotną rolę w gojeniu się ran, odruchach mrugania, produkcji łez i wydzielaniu5,6,7. W rogówce pnie nerwów zrębowych wyrastają ze splotu rąbka i promieniście wchodzą do obwodowego zrębu rogówki. Organizacja nerwów zrębowych jest równoległa do blaszek kolagenowych i dalej rozgałęziają się na mniejsze pęczki, gdy podążają w kierunku powierzchownego zrębu 5,8. Włókna nerwowe dalej wnikają w warstwę nabłonkową, a tym samym unerwienie jest szeroko rozprzestrzenione po nabłonku rogówki i zrębie. Dlatego unerwienie odgrywa zasadniczą rolę w zdrowym i chorobowym stanie rogówki. W tym protokole ujawniamy postęp w pracach nad nowatorskim modelem 3D in vitro, który jest pierwszym tego rodzaju naśladującym interakcje zrębu i nerwów in vivo. Do tego badania wykorzystano linię komórkową SH-SY5Y, ponieważ jest to jedna z najbardziej ugruntowanych, dobrze scharakteryzowanych linii wykorzystywanych do badania wzrostu neuronów. Linia komórkowa SH-SY5Y została opisana jako wytwarzająca zarówno komórki przylegające do substratu (typ S), jak i neuroblastyczne (typ N), które mogą ulegać transdyferencjacji9. W rezultacie, mimo że ta linia komórkowa pochodzi z potrójnej sekwencyjnej selekcji subklonów komórek typu N, zawiera również niewielką liczbę komórek typu S zdolnych do różnicowania się w neurony przy użyciu kwasu retinowego i czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego9. Stanowi to narzędzie, które może prowadzić do lepszego zrozumienia powikłań rogówkowych związanych z retinopatią cukrzycową (DM) i innymi chorobami oczu. Ze względu na trudności związane z pozyskiwaniem i hodowlą neuronów od pacjentów z chorobami oczu, ten model 3D in vitro zapewnia istotne implikacje w badaniu interakcji neuronalnych i sygnalizacji ze zrębem rogówki.

Choroby często wpływają na różne tkanki ciała na bardzo dużą skalę, prowadząc do pogorszenia jakości życia. Dystrofie oczne są częstymi powikłaniami, często związanymi z chorobami ogólnoustrojowymi i prowadzą do utraty ostrości wzroku, a nawet trwałej utraty wzroku. Kompleksowe badania są często niezbędne do lepszego zrozumienia stanu chorobowego, a także skutków na poziomie podstawnokomórkowym. Aby zbadać skutki takich chorób, opracowano różne modele in vivo i in vitro za pomocą zastosowań inżynierii tkankowej. Zastosowania inżynierii tkankowej rogówki cieszą się dużym zainteresowaniem w różnych dziedzinach nauki10,11,12,13,14, ale nadal istnieją poważne ograniczenia podczas faktycznego stosowania, w tym odrzucenie przeszczepu rogówki, infekcje i blizny10,11, 12,13,14. Istnieje kilka badań, w których z powodzeniem opracowano i ustanowiono różne modele in vitro3,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Modele 3D in vitro są najbardziej obiecujące i cieszą się dużym zainteresowaniem naukowym. Modele 3D są znane z tego, że lepiej odzwierciedlają zdarzenia komórkowe i fizjologiczne in vivo, które są krytyczne podczas zwłóknienia i gojenia się ran15,27,28,29. Te modele in vitro odgrywają integralną rolę w poszukiwaniu nowych podejść terapeutycznych do leczenia różnych schorzeń, w tym powikłań rogówkowych. Pomimo krytycznej roli unerwienia w funkcjach rogówki, niewiele wysiłku włożono w promowanie proliferacji nerwów obwodowych w konstruktach inżynierii tkankowej rogówki2,3. Jednak proponowane konstrukcje komórkowe 3D in vitro naśladują tkankę docelową w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalności tkanki.

Podczas gdy keratopatia cukrzycowa jest oczywistym zastosowaniem dla opisywanego tutaj modelu ze względu na defekty neuronalne, istnieje kilka innych chorób rogówki, które mogą skorzystać z ludzkiego modelu in vitro, w tym dystrofie stożka rogówki i Fuchsa. Nasz model 3D wyłania się z tej perspektywy i proponuje opracowanie reprezentacji tkanki rogówki in vitro w celu oceny dostarczania leków i bezpieczeństwa nowych leków okulistycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Centrum Nauk o Zdrowiu/Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu Oklahoma (IRB #4509). Wszystkie części protokołu były zgodne z założeniami Deklaracji Helsińskiej. Próbki rogówki uzyskano z Narodowego Instytutu Rozwoju i Badań (NDRI) oraz Oklahoma Lions Eye Bank.

1. Izolacja komórek pierwotnych

  1. Po otrzymaniu próbek ludzkiej tkanki rogówki przenieść tkanki na szalkę Petriego o średnicy 21,5cm2 zawierającą 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) (1x).
  2. Zeskrob i usuń nabłonek rogówki, ustawiając kopułę rogówki skierowaną do góry. Aby zapewnić całkowite usunięcie, dokładnie zeskrob warstwę nabłonka za pomocą żyletki pod kątem 45°. Następnie odwróć kopułę rogówki do dołu i dokładnie zeskrob śródbłonek ze zrębu żyletką pod kątem 45°, aby zapewnić całkowite usunięcie. Umyj tkankę zrębu za pomocą DPBS.
  3. Pokrój tkanki zrębu na małe kawałki za pomocą ostrza chirurgicznego numer 10, utrzymując kawałki zrębu mokre przez cały czas za pomocą DPBS. Zebrać kawałki zrębu za pomocą sterylnych kleszczy i umieścić w kolbie hodowlanej T25 bez pożywki (4 lub 5 kawałków tkanki 2 x 2 mm na kolbę).
  4. Pozostawić eksplantaty do przylegania do dna kolby w temperaturze 37 °C przez około 30-40 minut. Po przyklejeniu powoli dodawać do kolby minimalną niezbędną pożywkę Eagle'a (EMEM) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku/antybiotyku/antybiotyku, nie naruszając eksplantatów.
  5. Delikatnie umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Pozostawić eksplantaty w spokoju, aż komórki zaczną się izolować i migrować w kolbie. Po około 2 - 4 tygodniach komórki powinny osiągnąć 100% zbieżności. Po 100% konfluencji należy przejść przez komórki, usuwając pożywkę z hodowli tkankowej i przemyć komórki DPBS.
  6. Dodaj trypsynę do komórek, a następnie inkubuj je w temperaturze 37°C. Po około 5 minutach obejrzyj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że się odłączyły, a następnie zatrzymaj proteolizę, dodając świeże podłoże.
  7. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu odwirowania przy 1 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i zawiesić komórki w świeżym EMEM 10% FBS 1% antybiotyku. Policz komórki i zasiej około 1 x 106 komórek w kolbie hodowlanej T75 w celu dalszej ekspansji świeżym antybiotykiem EMEM 1% FBS 1%.

2. Podstawowa kultura HCF i montaż konstrukcji 3D

  1. Aby złożyć konstrukty 3D z eksplantacji wcześniej uprawianych w EMEM, 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk, pasaż i liczenie HCF.
  2. Wysiewaj około 1 x 106 komórek / studzienkę pierwotnych HCF na wkładkach membrany poliwęglanowej z porami 0,4 μm z konstruktów 3D, wraz z 1,5 ml świeżego EMEM 10% FBS 1% antybiotyku/antybiotyku / antybiotyku na wierzch konstruktu. Dodaj kolejne 1,5 ml tej samej pożywki na dno każdej konstrukcji.
  3. Po 24 godzinach wysiewu komórek hoduj komórki za pomocą EMEM 10% FBS 1% Antybiotyku/Antybiotyku, stymulowanego 0,5 mM kwasem 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowym (witamina C), dodając 1,5 ml na górze i 1,5 ml na dole każdego konstruktu.
  4. Utrzymywać kultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 przez 3 tygodnie i dostarczać świeże pożywki co drugi dzień przez cały okres badania. Nie jest potrzebne dalsze przejście.

3. Różnicowanie komórek i kokultury

  1. Po 3 tygodniach dodaj 8 x 103 komórki / studzienkę ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y na wierzchu wcześniej zmontowanych konstruktów 3D zawierających 1,5 ml EMEM zawierającego 10% FBS, 1% antybiotyku/antybiotyku i 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C).
    1. Pozwól komórkom nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y rosnąć na komórkach zrębu rogówki przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania komórek.
  2. Zainicjuj różnicowanie komórek SH-SY5Y poprzez stymulację komórek EMEM zawierającym 1% FBS i 1,5 ml 10 μM kwasu retinowego na wierzchu konstruktu. Dodaj 1,5 ml EMEM 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C) na dno konstruktu. Należy pamiętać, że etap kwasu retinowego powinien być wykonywany w ciemności.
    1. Kontynuuj hodowlę komórek w tej pożywce różnicującej przez 5 dni.
  3. Gdy komórki osiągną fazę różnicowania, należy przełączyć komórki na 1,5 ml pożywki wolnej od surowicy zawierającej 2 nM neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) i 1% antybiotyku/antybiotyku dodanego do EMEM, dodając do górnej części konstruktu. Dodać 1,5 ml EMEM 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C) na dno konstruktu. Należy pamiętać, że krok BDNF należy wykonywać w ciemności.
  4. Hodować komórki przez dodatkowe 2 dni przed przetworzeniem w celu przeprowadzenia dalszej analizy, jak wskazano w tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 to krok po kroku reprezentatywny obraz działającego modelu 3D in vitro. W pierwszym etapie komórki są izolowane z ludzkiej rogówki. Następnie są hodowane na membranie poliwęglanowej i stymulowane witaminą C w celu złożenia samowydzielającej się matrycy 3D. Ten system konstrukcji 3D indukuje syntezę wielowarstwowej komórkowej macierzy zrębu podobnego do vivo. Następnie komórki nerwiaka zarodkowego są wysiewane na komórkach zrębu, a ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka badań koncentrowało się na opracowaniu różnych modeli zwierzęcych, które mogą pomóc w lepszym zrozumieniu chorób rogówki, a także w odkryciu metod leczenia. Jednak istotna wartość tych badań dla ludzi nie została zweryfikowana. Do tej pory opracowano i szeroko zbadano różne modele in vitro ze względu na ich niezwykłe znaczenie kliniczne. Nasz wcześniej opracowany model 3D in vitro jest nowatorskim systemem, który znacząco przyczynia się do postępu nauk medycznych w badaniach nad wzrokiem i wykazuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy serdecznie podziękować Dr. Benowi Fowlerowi za jego pomoc techniczną przy eksperymentach TEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zdrowa tkanka rogówkiNDRIPróbki od dawców bez urazu oka lub choroby ogólnoustrojowej
Dulbecco' s Roztwór buforowany fosforanami (1X)Gibco firmy Life Technologies14190-144
Sterylne kleszczeFischer Scientific13-812-42Fisherbrand Preparujące ekstra drobno spiczaste szczypce odłamkowe
Jednokrawędziowe żyletkiPersonna270100
Sterylne ostrza do skalpela chirurgicznego No.10Feather Surgical Blade2976#10
Eagle' s Minimum Essential MediumATCC30-2003
Płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS1155010% FBS jest wymagane do przygotowania pożywki
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)Gibco firmy Life Technologies15240-0621% Antybiotyk-Antybiotyk jest wymagany do przygotowania pożywki
0,05% Trypsyna EDTA(1X)Gibco firmy Life Technologies25300062
Wkłady membranowe z poliwęglanu o grubości 0,4 μ m poryCorning Costar3412
Kwas 2-O-&alfa;-Dglukopiranozylo-L-askorbinowy (Witamina C)DoSMB00390należy zastosować stężenie 0,5 mM
Blok woskowyVWR50-949-027
SH-SY5Y Komórki nerwiaka zarodkowegoATCCSHSY5YATCC CRL-2266
Kwas retinowySigma-AldrichSRP3014-10UGNależy zastosować końcowe stężenie 10uM
BDNFSigma-AldrichR2625-100MGNależy zastosować końcowe stężenie 2nM
Sulfonek dimetylu (DMSO)VWR-Alfa Aesar67-68-5Ultra Pure Grade-Steryl DMSO do użycia
Thermo Scientific EasYFlasks (T25)Fisher Scientific12-565-351
Thermo Scientific Easy do hodowli komórek nunc (T75)Fisher Scientific12-565-349
badania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  3. Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
  4. Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
  5. Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
  6. Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
  7. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  8. Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
  9. Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
  10. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
  11. Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
  12. Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
  13. Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
  14. Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
  15. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  16. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
  17. Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).
  18. Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
  19. Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
  20. Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
  21. Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395(2016).
  22. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  23. Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
  24. Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
  25. Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
  26. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
  27. Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
  28. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
  29. Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
  30. Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie fibroblasty rog wkilinia kom rkowa SH SY5Y3D model kokulturysekrecja macierzy zewn trzkom rkowejtransmisyjna mikroskopia elektronowaprotok r nicowania kom reksuplementacja witamin Ctraktowanie kwasem retinowym

Powiązane artykuły