Test chromatyny dostępnej dla transpozy w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) to metoda odkrywania dostępnej chromatyny obejmująca cały genom. Jest to protokół sekwencyjny ATAC-seq krok po kroku, od analizy molekularnej do końcowej analizy obliczeniowej, zoptymalizowany pod kątem ludzkich limfocytów (Th1/Th2). Protokół ten może zostać przyjęty przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia w metodach sekwencjonowania nowej generacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie chromatyny dostępnej w całym genomie w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą ATAC-Seq
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) jest metodą używaną do identyfikacji otwartych (dostępnych) regionów chromatyny. Regiony te reprezentują regulatorowe elementy DNA (np. promotory, wzmacniacze, regiony kontroli locus, izolatory), z którymi wiążą się czynniki transkrypcyjne. Mapowanie dostępnego krajobrazu chromatyny jest skutecznym podejściem do odkrywania aktywnych elementów regulatorowych w całym genomie. Informacje te służą jako bezstronne podejście do odkrywania sieci odpowiednich czynników transkrypcyjnych i mechanizmów struktury chromatyny, które rządzą programami ekspresji genów. ATAC-seq jest solidną i czułą alternatywą dla analizy nadwrażliwości na DNazę I w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (DNase-seq) i izolacją elementów regulatorowych wspomaganą formaldehydem (FAIRE-seq) do analizy dostępności chromatyny w całym genomie oraz dla sekwencjonowania miejsc wrażliwych na nukleazę mikrokokową (MNase-seq) w celu określenia pozycjonowania nukleosomów. Przedstawiamy szczegółowy protokół ATAC-seq zoptymalizowany pod kątem pierwotnych komórek odpornościowych człowieka, tj. limfocytów CD4+ (limfocyty T helper 1 (Th1) i Th2). Ten kompleksowy protokół rozpoczyna się od pobrania komórek, następnie opisuje molekularną procedurę znakowania chromatyny, przygotowanie próbki do sekwencjonowania nowej generacji, a także zawiera metody i rozważania dotyczące analiz obliczeniowych stosowanych do interpretacji wyników. Ponadto, aby zaoszczędzić czas i pieniądze, wprowadziliśmy środki kontroli jakości w celu oceny biblioteki ATAC-seq przed sekwencjonowaniem. Co ważne, zasady przedstawione w tym protokole pozwalają na jego adaptację do innych ludzkich immunologicznych i nieimmunologicznych komórek pierwotnych i linii komórkowych. Wytyczne te będą również przydatne dla laboratoriów, które nie są biegłe w metodach sekwencjonowania nowej generacji.
Wprowadzenie
ATAC-seq1,2 to solidna metoda, która umożliwia identyfikację regulatory3 otwartych regionów chromatyny i pozycjonowania nukleosomów. Informacje te są wykorzystywane do wnioskowania o lokalizacji, tożsamości i aktywności czynników transkrypcyjnych. Czułość metody do pomiaru ilościowych zmian w strukturze chromatyny pozwala na badanie aktywności czynników chromatyny, w tym remodelerów i modyfikatorów chromatyny, a także aktywności transkrypcyjnej polimerazy RNA II1. W ten sposób ATAC-seq zapewnia potężne i bezstronne podejście do rozszyfrowywania mechanizmów, które rządzą regulacją transkrypcji w każdym typie komórki. Opisujemy adaptację ATAC-seq do pierwotnych ludzkich komórek Th1 i Th2.
W sekwencji ATAC, hiperaktywna transpozaza Tn5 wyposażona w adaptery do sekwencjonowania nowej generacji (NGS) łączy fragmentację DNA z tagowaniem DNA za pomocą adaptorów (tj. proces "tagowania")1. Po amplifikacji PCR powstałe biblioteki DNA są gotowe do sekwencjonowania nowej generacji (Figura 1). Preferencyjne znakowanie dostępnej chromatyny jest wykrywane przez analizę lokalnego wzbogacenia odczytów sekwencjonowania ATAC-seq.
Krótka procedura eksperymentalna i wymóg mniejszej ilości materiału wyjściowego, w porównaniu z innymi metodami pomiaru dostępności chromatyny i pozycjonowania nukleosomów, takimi jak DNase-seq4, FAIRE-seq5, oraz MNase-seq6, promują stosowanie ATAC-seq w wielu systemach biologicznych, w tym w ludzkich komórkach pierwotnych1,7 i próbkach klinicznych8, a także organizmy jednokomórkowe9, plants10, muszki owocowe11, oraz różne ssaki12.
Tożsamość czynników transkrypcyjnych, które są związane z dostępnymi loci, może być odkryta poprzez analizę wzbogacenia ich motywów sekwencji wiązania lub połączenie ATAC-seq z immunoprecypitacją chromatyny (ChIP), a następnie sekwencjonowaniem DNA o wysokiej przepustowości (ChIP-seq). Podejście to umożliwiło identyfikację specyficznych dla linii czynników transkrypcyjnych ważnych dla hematopoezy w mouse13. Bezstronny i globalny charakter ATAC-seq pozwala na badanie regulacji genów w organizmach, dla których odczynniki, takie jak przeciwciała do analizy ChIP, nie są dostępne. Na przykład, ewolucyjne różnice w regionach cis-regulatorowych zostały zidentyfikowane poprzez badanie komórek grzebienia nerwowego czaszki u ludzi i szympansów14, rozwojowe różnice w elementach regulatorowych podczas wczesnej embriogenezy myszy15, zmiany w krajobrazie regulacyjnym podczas cyklu życia jednokomórkowego C. owzarzaki9, oraz ewolucja promotorów i wzmacniaczy u 20 gatunków ssaków12.
ATAC-seq odegrał również kluczową rolę w pomiarze dostępności chromatyny w pojedynczych komórkach, ujawniając w ten sposób zmienność w obrębie populacji komórek, która zwykle unika badań całego genomu7,16. Ponadto ATAC-seq może być stosowany do badania zmian zachodzących w regionach regulatorowych DNA w stanach chorobowych, w których próbki są rzadkie. Na przykład ATAC-seq może być używany do badania zmian w krajobrazie regulacyjnym podczas wystąpienia ostrej białaczki szpikowej (AML)17 lub Ras-driven oncogenesis11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu Bar Ilan, a protokół jest zgodny z wytycznymi dostarczonymi przez komitet zatwierdzający eksperymenty.
1. Oczyszczanie naiwnych ludzkich komórek CD4+ i polaryzacja do komórek T Helper 1 (Th1) i Th2
Uwaga: Tutaj opisujemy procedurę, zaczynając od zamrożonych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Pierwszy krok polega na wyizolowaniu komórek CD4+ za pomocą mikrogranulek i kolumn, które zwykle dają nam ponad 95% komórek CD4+. Jednak ten krok może się różnić w zależności od preferowanego protokołu w każdym laboratorium. Protokół aktywacji i polaryzacji limfocytów T został zmodyfikowany na podstawie Jenner et al. (2009)18. Izolacja komórek CD4+ z 10 milionów PBMC daje początek 4 - 6 milionom komórek CD4+. Są one dzielone na dwie kolby i hodowane w warunkach polaryzacji Th1 i Th2, dając 3-5 milionów komórek Th1 i Th2 w ciągu zaledwie tygodnia.
Uwaga: Schłodź wirówkę do 4 °C przed rozpoczęciem.
- Rozmrozić 1 ml ludzkich PBMC (107 komórek) w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki RPMI uzupełnionej 1% penicyliną-streptomycyną, 2 mM L-glutaminą i 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą. Wirować przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą sterylnej pipety o pojemności 25 ml w 15 ml uzupełnionej pożywki RPMI. Przenieść komórki (za pomocą sterylnej pipety o pojemności 25 ml) do kolby hodowlanej T75.
- Pozostaw komórki na noc w nawilżonym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
- Przenieść pływające komórki za pomocą sterylnej pipety o pojemności 25 ml do probówki o pojemności 50 ml. Określ liczbę komórek i żywotność przez wykluczenie błękitu trypanowego.
- Wyizoluj komórki CD4 + z 10 milionów żywych, nieprzylegających PBMC poprzez pozytywną selekcję przy użyciu mikrokulek i kolumn CD4 + zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Tabela materiałów/sprzętu) z następującymi modyfikacjami: 107 PBMC jest znakowanych 30 μl mikrokulek CD4 w 120 μL 0,5% BSA w PBS.
- Aktywuj limfocyty T CD4 + przez 72 godziny za pomocą rhIL-2 (10 ng / ml), anty-CD3 związanego z płytką (5 μg / ml) i rozpuszczalnego anty-CD28 (2 μg / ml). Aby uzyskać polaryzację Th1, dodaj rhIL-12 (20 ng/ml) i anty-IL-4 (10 μg/ml). W przypadku polaryzacji Th2 dodaj rhIL-4 (40 ng/ml) i anty-IFN-γ (10 μg/ml).
- Hoduj komórki przez dodatkowe 7 dni w obecności rhIL-2 (10 ng / ml) i tych samych cytokin polaryzujących (rhIL-12 dla Th1 i rhIL-4 dla Th2).
2. Izolacja jąder
UWAGA: ATAC-seq jest wykonywany z nienaruszonymi jądrami. Bufor do lizy zawierający 0,05% glikolu nonylofenylopolietylenowego (patrz Tabela materiałów/wyposażenia) został skalibrowany do izolowania jąder od pierwotnych ludzkich komórek Th1 i Th2. Zalecamy kalibrację tego kroku z odczynnikami i komórkami laboratoryjnymi. Nadmiar nienaruszonych komórek spowodowany niewystarczającą ilością detergentu zmniejsza wydajność reakcji transpozycji. Wydajność lizy komórek zależy od liczby jąder (komórek trypanowo-dodatnich) w stosunku do całkowitej liczby komórek.
UWAGA: Przygotować bufor do lizy (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2). Schłodzić wirówkę z wirnikiem z obracanym wiadrem do temperatury 4 °C. Granulowanie komórek w wirówce z odchylanym kubełkiem zamiast w wirówce o stałym kącie zmniejsza straty komórek/jąder. Aby uniknąć utraty jąder lub komórek, należy ostrożnie pipetować podczas wyrzucania supernatantu.
- Bezpośrednio przed użyciem dodać świeży glikol polietylenowo-nonylofenylowy (do końcowego stężenia 0,05%) i 100x inhibitory proteazy (do końcowego stężenia 1x) do buforu do lizy na zimno. Utrzymuj bufor na lodzie.
- Policz limfocyty T, aby określić ich ilość i żywotność za pomocą metody błękitu trypanowego. Żywotność niższa niż 90% skutkuje wyższym trawieniem nieswoistym.
- Przenieś 0,5 x 106 limfocytów T (Th1 lub Th2) do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy na zimno (zawierającego glikol nonylofenylopolietylenowy i inhibitory proteazy). Trzymaj probówkę na lodzie. Delikatnie odpipetować, aby uniknąć uszkodzenia jąder.
- Szybko weź 10 μl i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, podczas gdy mikroprobówka z lizowanymi komórkami znajduje się na lodzie. Ten krok nie powinien trwać dłużej niż pięć minut, aby uniknąć uszkodzenia jąder. Co najmniej 80% komórek powinno zostać poddanych lizie.
- Natychmiast kontynuować reakcję transpozycji. Przygotowane jądra należy trzymać na lodzie.
3. Reakcja transpozycji
UWAGA: Na tym etapie, izolowane jądra są inkubowane z prokariotyczną transpozazą Tn5 (TDE1) załadowaną adapterami do sekwencjonowania NGS. Nadpobudliwy Tn5 jednocześnie fragmentuje DNA i liguje adaptery do dostępnych regionów genomu (proces tagowania). Stosunek jąder komórkowych do transpozazy Tn5 ma kluczowe znaczenie dla preferencyjnego rozszczepienia przy dostępnej chromatynie. Protokół ten jest kalibrowany dla 100 000 jąder w objętości reakcyjnej 100 μl. Jednak reakcję można zmniejszyć w dół.
- Ustawić temperaturę w wytrząsarce termicznej na 37 °C.
- Przenieś 100 000 jąder do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
- Wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie usunąć supernatant.
- Dodać składniki reakcji transpozycji do jąder, jak określono w tabeli 1.
- Zawiesić przez delikatne pipetowanie.
- Inkubować reakcję transpozycji w wytrząsarce termicznej w temperaturze 37 °C przez 30 minut, delikatnie wstrząsając (500 obr./min).
Uwaga: Oczyszczanie DNA odbywa się za pomocą odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej19 (patrz Tabela materiałów/sprzętu) lub kolumn oczyszczających PCR. Pod koniec oczyszczania eluować fragmenty DNA w 20 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8. Unikać EDTA w buforze elucji.
4. Wzbogacanie PCR bibliotek ATAC-seq
UWAGA: Ten krok ma na celu wzmocnienie biblioteki ATAC-seq, tj. fragmentów DNA z wstawionymi adapterami. Aby umożliwić mieszanie kilku bibliotek ATAC-seq w tym samym torze sekwencjonowania nowej generacji ("multipleksowanie"), należy użyć nieindeksowanego Primera 1 (Ad1_noMx)1 dla wszystkich próbek i innego indeksowanego (oznaczonego kodem kreskowym) Primera 2 (Ad 2.1 - 2.24)1 dla każdej próbki. Sekwencje starterów znajdują się w uzupełnionej Tabeli Materiałów/Wyposażenia.
- Wstępna amplifikacja PCR
UWAGA: Stężenie robocze Primeru 1 (Ad1_noMx) i Primera 2 wynosi 25 μM. Wszystkie podkłady rozcieńcza się z oryginalnego zapasu od 100 μM do 25 μM. We wszystkich reakcjach PCR należy stosować Primer 1 (Ad1_noMx) i tylko jeden z indeksowanych Primerów 2.- Dodać składniki reakcji PCR, jak określono w tabeli 2, do sterylnej probówki do PCR.
- Umieścić probówkę PCR w termocyklerze i przeprowadzić amplifikację PCR, stosując warunki cykliczne wyszczególnione w Tabeli 3.
- Ocena liczby dodatkowych cykli amplifikacji
UWAGA: Liczba dodatkowych cykli PCR powinna dać wystarczającą ilość fragmentów biblioteki do pomyślnego przebiegu sekwencjonowania nowej generacji, przy jednoczesnym zminimalizowaniu, aby uniknąć błędu GC i rozmiaru20. Określenie liczby cykli PCR (N) wymaganych do optymalnej amplifikacji fragmentów biblioteki odbywa się za pomocą ilościowego PCR (qPCR).- Rozcieńczyć startery 1 (Ad1_noMx) i 2 (używane do początkowego wzmocnienia biblioteki) od 25 μM do 6,25 μM.
- Dodać składniki do optycznych probówek PCR lub płytki, jak podano w Tabeli 4.
- Umieścić w aparacie qPCR i cykl zgodnie z tabelą 5.
- Aby oszacować wymaganą liczbę dodatkowych cykli amplifikacji (N), należy wykreślić numer cyklu na osi x i fluorescencję względną (RFU) na osi y.
- Liczba dodatkowych cykli amplifikacji (N) wynosi 1/3 liczby cykli, w których reakcja qPCR osiągnęła plateau. Rysunek 2 przedstawia przykłady dla trzech bibliotek ATAC-seq, które osiągnęły plateau na poziomie ~2,350 względnych jednostek fluorescencji, RFU (gruba zielona linia). Liczba cykli PCR, w których amplifikowana jest jedna trzecia maksymalnej ilości (783 RFU, oznaczona na osi y), odpowiada 8 cyklom dla dwóch bibliotek (czerwona i niebieska krzywa amplifikacji) i 9 cykli PCR dla trzeciej biblioteki (różowa).
- Końcowa amplifikacja PCR
- Amplifikować pozostałe 45 μl reakcji PCR. Umieścić probówkę PCR zawierającą reakcję amplifikacji z kroku 4.1.2 w termocyklerze. Uruchom program PCR opisany w Tabeli 6. Użyć wcześniej ustalonej (krok 4.2.5) liczby cykli amplifikacji (N).
5. Wybór rozmiaru bibliotek ATAC-Seq
UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że wybór rozmiaru wzmocnionych bibliotek ATAC-seq poprawia wyniki sekwencjonowania nowej generacji, ponieważ eliminuje fragmenty biblioteki o wysokiej masie cząsteczkowej z końcowej biblioteki ATAC-seq.
UWAGA: Pozwól kulkom magnetycznym ogrzać się do temperatury pokojowej na 30 minut przed użyciem.
Przygotuj świeży 70% etanol w wodzie wolnej od nukleaz.
- Zawieś ponownie koraliki magnetyczne przez mieszanie.
- Dodaj wodę wolną od nukleaz do bibliotek ATAC-seq (otrzymanych w kroku 4.3.1.) i doprowadź do 100 μl.
- Dodaj 50 μl (0,5x) zawieszonych kulek magnetycznych wiążących DNA do 100 μl amplifikowanych bibliotek. Mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby szybko odkręć mikrorurki.
- Umieść probówkę na odpowiednim stojaku magnetycznym na 2 minuty, aby oddzielić kulki magnetyczne od supernatantu. Po 2 minutach przenieść supernatant do nowej mikroprobówki.
- Zmierzyć objętość supernatantu przez pipetowanie i dodać 0,7x kulek magnetycznych. Mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
- Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej. Umieść na stojaku magnetycznym na 2 min.
- Po 2 minutach inkubacji odrzucić supernatant. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu, aby umyć koraliki, gdy probówki znajdują się na stojaku magnetycznym.
- Trzymaj mikrorurkę na magnesie przez 30 sekund, a następnie wyrzuć etanol. Powtórzyć krok 5.7 dla dwóch końcowych płukań etanolem.
- Całkowicie usuń pozostały etanol i pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut, gdy rurka znajduje się na magnesie. W razie potrzeby krótko zakręć mikroprobówką. Usuń ślady etanolu za pomocą końcówki pipety p10.
- Wyjmij mikrorurkę z magnesu i dodaj 22 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8. Nie należy eluować bibliotek ATAC-seq w buforze zawierającym EDTA.
- Inkubuj probówkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieść na stojaku magnetycznym.
- Gdy roztwór jest klarowny, przenieś 20 μl eluowanych bibliotek do nowej sterylnej mikroprobówki.
- Przechowuj wybrany rozmiar bibliotek ATAC-seq w temperaturze -20 °C.
6. Analiza jakości bibliotek ATAC-Seq
- Walidacja jakości bibliotek ATAC-seq za pomocą Real-Time PCR
UWAGA: Ważne jest, aby ocenić stosunek sygnału do szumu w bibliotekach ATAC-seq przed sekwencjonowaniem nowej generacji. Odbywa się to poprzez określenie względnej ilości fragmentów DNA z dostępnych i niedostępnych loci za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Niedostępne loci (kontrola ujemna, chr1:48,137,860-48,137,934 i chr1:193,093,748-193,093,827) są amplifikowane przez pary starterów 1 i 2. Dostępne loci (kontrola pozytywna, chr19:30,336,166-30,336,253 i chr19:11546154-11546237) są amplifikowane przez pary starterów 3 i 4. Dodatnie i ujemne loci zdefiniowano na podstawie profili dostępności chromatyny (DHS-seq) ludzkich komórek CD4+ (akcesje ENCODE ENCSR000EQE i ENCSR000EQG). Ujemny starter 1 znajduje się w dużym heterochromatycznym regionie międzygenowym (230 kb z TRADB2 i 88 kb z FOXD2). Region kontroli ujemnej 2 znajduje się w obrębie pierwszego intronu genu CDC73. Dodatnia para starterów 3 znajduje się w otwartym regionie chromatyny poniżej genu cykliny E (CCNE1), podczas gdy dodatnia para starterów 4 jest wyśrodkowana w promotorze substratu kinazy białkowej C 80K-H (PRKCSH). Co ważne, te loci kontrolne wykazują podobny wzorzec dostępności w innych typach komórek ludzkich z projektu ENCODE3, co sugeruje, że można je zastosować do monitorowania bibliotek ATAC-seq z szerokiego spektrum typów komórek ludzkich. Skuteczność i swoistość starterów wszystkich par starterów zweryfikowano metodą qPCR na seryjnym rozcieńczaniu genomowego DNA (z ludzkich komórek Th) i analizie krzywej topnienia otrzymanych amplifikowanych produktów.- Wyizolować genomowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu (patrz Tabela materiałów/wyposażenia).
- Rozcieńczyć amplifikowaną bibliotekę ATAC-seq w stosunku 1:10 (1 μl biblioteki + 9 μl wody wolnej od nukleaz) i genomowe DNA do ~5 ng / μL.
- Przygotować mieszaninę reakcyjną (tabela 7) dla każdej pary starterów kontroli dodatniej i ujemnej, biorąc pod uwagę, że reakcje przeprowadza się w trzech egzemplarzach.
- Inkubować w termocyklerze qPCR zgodnie z protokołem zalecanym przez dostawcę qPCR master mix.
- Przeanalizuj wyniki w oprogramowaniu urządzenia qPCR (patrz Tabela materiałów/sprzętu). Wybrać genomowe DNA jako próbkę kontrolną. Uzyskane wartości reprezentują wzbogacenie dostępnych regionów (amplifikowane starterami kontroli pozytywnej). Przykład przedstawiono w tabeli 8.
UWAGA: Oszacowanie średniej wielkości biblioteki i stężenia: rozkład wielkości fragmentów DNA z bibliotek ATAC-seq jest określany przez zautomatyzowane systemy elektroforezy o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta. Zaleca się pomiar stężenia próbki na fluorometrze przy użyciu zestawu do wysokiej czułości dsDNA i co najmniej 2 μl każdej próbki DNA.
UWAGA: Sekwencjonowanie nowej generacji - przed multipleksowaniem bibliotek należy obliczyć molowość każdej biblioteki ATAC-seq za pomocą wzoru: (ng/μL x 106)/(660 x średnia długość fragmentu biblioteki). Dąż do > 30 milionów odczytów każdej biblioteki ATAC-seq w celu oceny otwartych regionów chromatyny w próbkach ludzkich. Jeśli chcesz określić, czy biblioteka jest wystarczająco dobra do sekwencjonowania NGS, początkowo celuj w ~10 milionów odczytów (5% toru sekwencjonowania na instrumencie do sekwencjonowania DNA w trybie szybkiego uruchamiania). Należy pamiętać, że aby wywnioskować pozycjonowanie nukleosomów, potrzebne jest sekwencjonowanie sparowanych końców1.
7. Analiza uzyskanych wyników sekwencjonowania nowej generacji
- Określ jakość odczytów sekwencjonowania, sprawdzając pliki FastQC, oddzielnie dla każdej biblioteki.
- Dopasuj odczyty do ludzkiego genomu referencyjnego (zestaw hg19) za pomocą oprogramowania Bowtie21 w środowisku Unix/Linux. Polecenie to 'bowtie -m 1 -q -S genome directory reads.fastq output_aligned.sam'. Katalog genomu oznacza folder, w którym przechowywane są indeksy genomu Bowtie. Parametr -m 1 służy do niezezwalania na wyrównanie odczytów do więcej niż jednego locus w genomie, -q jest dla pliku wejściowego, który powinien być w formacie fastq, -S jest dla danych wyjściowych w formacie SAM.
- Usuń zduplikowane odczyty za pomocą opcji rmdup SAMtools22 w środowisku Unix/Linux. Polecenia to: 'samtools view -S output_aligned.sam -b | samtools sort -o -output_aligned > output_aligned.bam',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam'. Pierwsze polecenie, widok, zmienia format SAM na format BAM, który jest następnie sortowany. Opcja rmdup jest następnie stosowana do posortowanego pliku BAM. Opcjonalnie można dostosować odczyty dla miejsca wstawiania transpozonu, zgodnie z opisem w oryginalnym papierze ATAC-seq paper1. Odbywa się to za pomocą poleceń BEDtools class<="xref">23 w środowisku Unix/Linux. Polecenia to 'bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', 'shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed -p 4 -m -5 -g genome > output_aligned _rmdup_adjusted.bed'. Pierwsze polecenie, bamTobed, zmienia format BAM na format BED, który może być następnie użyty w poleceniu shiftBed. Plik genomu to plik rozdzielany tabulatorami, który zawiera długość każdego chromosomu w genomie. Plik jest zwykle dodawany do katalogu BEDtools. - Wykonuj wywołania szczytowe przy użyciu opartej na modelu analizy oprogramowania ChIP-seq (MACS2)24 w środowisku Unix/Linux na przesuniętym pliku BED o następujących parametrach: --nomodel --extsize 75 --shift -30. Parametry te służą do dostosowania odczytów tak, aby miejsce insercji transpozonu znajdowało się w środku każdego odczytu sekwencjonowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Końcowym wynikiem niniejszego protokołu jest biblioteka ATAC-seq o stężeniu zazwyczaj 3 - 20 ng/µL. Po analizie w systemie do badania integralności DNA (patrz Tabela materiałów/sprzętu) próbki wykazują obraz przypominający drabinę2 (Rysunek 3A). Średnia wielkość fragmentów DNA wynosi zazwyczaj ~450 - 530 bp.
Właściwa kontrola jakości bibliotek ATAC-seq przed ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół ATAC-seq został z powodzeniem zastosowany do analizy dostępnej chromatyny w komórkach pierwotnych (ludzkie komórki Th1, Th2 i limfocyty B), a także w hodowanych liniach komórkowych (ludzkie komórki raka piersi MCF10A i komórki glejaka U261). Zastosowanie sekwencji ATAC do innych typów komórek może wymagać pewnej optymalizacji protokołu, zwłaszcza na etapie lizy. Jeśli stężenie detergentu niejonowego jest zbyt wysokie, może wystąpić wyższy procent zanieczyszczenia mitochondrialnego DNA. Można to zmn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (grant 748/14), Marie Curie Integration Grant (CIG)- FP7-PEOPLE-20013-CIG-618763 oraz I-CORE Program Komitetu Planowania i Budżetu oraz grant Izraelskiej Fundacji Nauki nr 41/11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki 50 ml | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Mikrorurki | Axygen Inc | MCT-175-C | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Pipety serologiczne 25 ml | Corning Costar | 4489 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Kolba do hodowli tkankowych | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Countes Automatyczny licznik komórek | Invitrogen | C10227 | |
| Tkanka NucleoSpin | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej ( PBMC) | ATCC | PCS i nieśmiały; 800 i nieśmiały; 011 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Roztwór L-glutaminy (200 mM) | Przemysł biologiczny | 03-020-1B | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Penicylina-Streptomycyna | Przemysł biologiczny | 03-031-1B | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS), Inaktywowane termicznie, przemysł | biologiczny | 04-127-1 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Mikrokulki MACS CD4, ludzkie | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Kolumny MACS MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anty-ludzkie CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mysia kontrola izotypu IgG1 FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anty-ludzki CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anty-ludzki CD28 SAFIRE Oczyszczone | Bioklejnoty | 10311-25 | |
| Rekombinowany ludzki IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Rekombinowany ludzki IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Rekombinowany ludzki IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LIŚĆ Oczyszczony anty-ludzki IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, klasa analityczna | Carlo Erba | 479687 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Chlorek magnezu, sześciowodny, klasa biologii molekularnej | Calbiochem | 442611 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Tris, ultra czysty, 99,9% czysty | MP Biomedicals | 819620 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Alternatywa NP-40 (glikol nonylofenylopolietylenowy) | Calbiochem | 492016 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Inhibitory proteazy | Sigma | P2714 | ten koktajl inhibitora proteazy jest proszkiem. Aby przygotować 100 x roztwór, rozcieńczyć w 1 ml wody klasy molekularnej. |
| Magnetyczne kulki do odwróconej immobilizacji w fazie stałej: Koraliki AMPure XP | Beckman | 63881 | |
| Zestaw do oczyszczania PCR | HyLabs | EX-GP200 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera (transpozaza TDE1 i bufor TD) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Zielony I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect PCR w czasie rzeczywistym Wykrywanie System | Bio-rad | 185-5200 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Oprogramowanie CFX Manager | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix do qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnes do probówek eppendorf | Invitrogen | 12321D | Może pochodzić od innych dostawców. |
| Wirówka chłodząca z wiadrem obrotowym z wiadrami na probówki Falcon 15 ml i probówki eppendorf | Thermo Scientific | 75004527 | Może pochodzić od innych dostawców. Ważne jest, aby posiadał wiaderka na rurki eppendorf. |
| Wytrząsarka termiczna | MRC | Może pochodzić od innych dostawców. | |
| Taśma ekranowa D1000 o wysokiej czułości | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Odczynniki D1000 o wysokiej czułości | System Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 | TapeStation Agilent Technologies | G2991AA | Platforma taśmowa do elektroforezy |
| Zestaw DNA o wysokiej czułości | Agilent Technologies | 5067-4626 | Odczynnik do Analiza TapeStation o wysokiej czułości |
| Nazwa i sekwencja Podkład | firmy | ||
| : 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sekwencja transpozaz-3'Ad2.1_TAAGGCGA | ||
TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.1_expected odczytana sekwencja indeksu: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.2_CGTACTAG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.2_expected sekwencja indeksu odczytana: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3' | ||
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.3_expected sekwencja indeksu odczyt: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-transpozaza sekwencja-3'Ad2.4_TCCTGAGC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.4_expected sekwencji indeksu następuje: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.5_GGACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.5_expected sekwencja indeksu następuje: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.6_TAGGCATG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.6_expected sekwencji indeksu następuje: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.7_CTCTCTAC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.7_expected sekwencja indeksu następuje: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksu]-sekwencja transpozazy-3' | ||
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.8_expected sekwencja indeksu odczyt: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-transpozaza sekwencja-3'Ad2.9_GCTACGCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.9_expected odczyt sekwencji indeksu: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksu]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.10_CGAGGCTG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.10_expected sekwencja indeksu odczyt: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.11_AAGAGGCA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.11_expected sekwencji indeksu następuje: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.12_GTAGAGGA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.12_expected sekwencja indeksu odczyt: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksu]-sekwencja transpozazy-3' | ||
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.13_expected odczyt sekwencji indeksu: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-transpozaza sekwencja-3'Ad2.14_ACCACTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.14_expected sekwencja indeksu następuje: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-transpozaza sekwencja-3'Ad2.15_TGGATCTG | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.15_expected sekwencja indeksowa brzmi: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.16_CCGTTTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.16_expected sekwencja indeksu następuje: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksu]-sekwencja transpozazy-3' | ||
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.17_expected sekwencja indeksu odczyt: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3' | ||
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.18_expected odczyt sekwencji indeksu: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-transpozaza sekwencja-3'Ad2.19_AGGTTGGG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.19_expected sekwencji indeksu następuje: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3' | ||
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.20_expected sekwencja indeksowa odczyt: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-transpozaza-3' | ||
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.21_expected odczyt sekwencji indeksu: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-transpozaza sekwencja-3'Ad2.22_TGGTCACA | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.22_expected odczyt sekwencji indeksu: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.23_TTGACCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.23_expected sekwencja indeksu odczytuje: 5'-P7 sekwencja-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'Ad2.24_CCACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.24_expected sekwencja indeksu następuje: sekwencja 5'-P7-[sekwencja indeksowa]-sekwencja transpozazy-3'F1 | ||
| : 5'-CCTTTTTATGCCCATACACTC-3'IDT | |||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT | |||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT | |||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT | |||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT | |||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT | |||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT | |||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT |
Bibliografia
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030(2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18(2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284(2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
