Method Article

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

DOI:

10.3791/56318

⸱

September 7th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer and Stem Cells, School of Medicine, Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham, 2School of Life Sciences Imaging (SLIM), School of Life Sciences, University of Nottingham, 3Children's Brain Tumour Research Centre, School of Medicine, QMC, University of Nottingham

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez kilka dziesięcioleci uważano, że 5-metylocytozyna (5mC) jest jedyną modyfikacją DNA o znaczeniu funkcjonalnym u metazoanów. Odkrycie enzymatycznego utleniania 5mC do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC), a także wykrycie N6-metyladeniny (6mA) w DNA organizmów wielokomórkowych zapewniło dodatkowy stopień złożoności badań epigenetycznych. Zgodnie z rosnącą liczbą dowodów eksperymentalnych, te nowe modyfikacje DNA mogą odgrywać określone role w różnych procesach komórkowych i rozwojowych. Co ważne, ponieważ niektóre z tych znaczników (np. 5hmC, 5fC i 5caC) wykazują specyficzne dla tkanek i etapów rozwojowych występowanie u kręgowców, immunochemia stanowi ważne narzędzie pozwalające na ocenę przestrzennego rozkładu modyfikacji DNA w różnych kontekstach biologicznych. W tym miejscu opisano metody analizy obliczeniowej modyfikacji DNA uwidocznionych za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie mikroskopii konfokalnej. W szczególności pokazano generowanie wykresów intensywności sygnału w wymiarze 2,5 (2,5D), profile intensywności sygnału, kwantyfikację intensywności barwienia w wielu komórkach oraz określenie współczynników kolokalizacji sygnału. Łącznie techniki te mogą być przydatne w ocenie poziomów i lokalizacji tych modyfikacji DNA w jądrze, przyczyniając się do wyjaśnienia ich ról biologicznych w metazoanach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja DNA, dobrze udokumentowany mechanizm związany z regulacją transkrypcji pociąga za sobą modyfikację reszt cytozyny w kontekście dinukleotydu 5'-cytozyno-fosforan-guanina-3' (CpG) poprzez dodanie grupy metylowej (-CH3) do atomu węgla 5- pierścienia pirymidynowego cytozyny, tworząc 5-metylocytozynę (5mC)1. U ssaków około 70% CpG jest metylowanych, co stanowi tylko 1% ich genomów, ponieważ są one pozbawione tej sekwencji palindromicznej z powodu mutagennej skłonności 5mC do spontanicznej deaminacji do tyminy2. Obecność grup metylowych w sekwencjach promotorów genów wykazuje silną korelację z represją transkrypcyjną u kręgowców3,4,5. Dodawanie tych grup metylowych jest katalizowane przez wysoce konserwatywne enzymy metylotransferazy DNA (DNMT) DNMT3a, 3b i 3L oraz DNMT1, które modyfikują cytozyny CpG odpowiednio w kontekstach metylacji de novo i podtrzymującej6. Ekspresja DNMT3A/B jest podwyższona podczas rozwoju w embrionalnych komórkach macierzystych i epiblastach; Jednak jego zmniejszona ekspresja jest obserwowana po zaangażowaniu linii komórek pluripotencjalnych w losy somatyczne podczas różnicowania8. Dzieląc redundancję funkcjonalną, DNMT3a i 3b wykazują specyficzne tkankowo wzorce ekspresji, przy czym 3a wykrywa się jednolicie w zarodkach myszy, ale 3b jest głównie zlokalizowane w tkankach neuroektodermy i ektodermy kosmówkowej8.

Sygnatury metylacji mogą być dziedziczone podczas mitozy i mejozy10. Metylacja podtrzymująca polega na ułatwionej przez DNMT1 modyfikacji reszt cytozyny CpG istniejących w półmetylowanych palindromiach na dwuniciowym DNA11. DNMT1 wiąże DNA w widełkach replikacyjnych11, a w konsekwencji poziomy metylacji genomu osiągają szczyt podczas fazy S cyklu komórkowego12. DNMT1 metyluje niezmodyfikowane cytozyny, wyróżniając w ten sposób nowo zsyntetyzowane nici DNA, promując inaktywację chromosomu X i utrzymując profile represji transkrypcji13. Poprzez rozpoznawanie hemi-metylowanych sekwencji CpG DNA, DNMT1 utrzymuje ustalone wzorce metylacji wyznaczone przez metylację de novo, np. represję promotorów retrotranspozonów długo przeplatanego pierwiastka jądrowego 1 (LINE1) w celu zahamowania jego potencjalnie rakotwórczego rozprzestrzeniania się14. Chociaż posiada powinowactwo do wiązania preferencyjnego hemi metylowanego DNA, DNMT1 może metylować niemetylowane sekwencje wyspy CpG (CGI) w zmutowanych komórkach DNMT3a/b -/-, spełniając awaryjną rolę metylacji de novo15. Tak więc, ze względu na półkonserwatywną naturę replikacji DNA16, metylacja podtrzymująca może wiernie odtworzyć sygnatury metylacji od komórki rodzicielskiej do potomnej17.

Jednakże, aby ekspresja genów mogła być dynamicznie modulowana, represyjna modyfikacja metylacji musi zostać usunięta, co można osiągnąć za pomocą pasywnych i aktywnych mechanizmów demetylacji18. Białka translokazy Ten-Eleven (TET) należące do konserwatywnej rodziny białek dioksygenazy są zdolne do iteracyjnego utleniania grup metylowych na resztach CpG19. Te białka Tet, homologiczne do białek wiążących J-Base (JBP) odkrytych w Trypanosome bruceii, rozpoznają i wiążą zmodyfikowane zasady DNA, np. 5mC i dotleniają te reszty do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC)20. Utlenianie 5mC wspomagane białkiem Tet powoduje stopniową zmianę konformacji z konfiguracji metylowej na hydroksylową, karbonylową i karboksylową, jednak modyfikacje 5fC i 5caC można zsyntetyzować bezpośrednio z utleniania 5mC21,22,23,24.

Pouczającym wskaźnikiem aktywności białka TET w zrozumieniu ich regulacji jest badanie rozmieszczenia i obfitości znaczników oksy-metylo-cytozyny. Znacząca obecność 5mC w ubogich promotorach CpG jest wykrywalna w przeciwieństwie do niemetylowanych regionów bogatych w CpG, przy czym te ostatnie są charakterystyczne dla wysp CpG25. We wszystkich tkankach najwyższą specyficzną dla tkanek metylację obserwuje się w mózgu, jądrach i krwi, podczas gdy błona śluzowa jamy ustnej wykazuje największą hipometylację, co wskazuje na zróżnicowany wzorzec metylacji występujący w promotorach specyficznych dla tkanki26.

Poprzez wykorzystanie czułych przeciwciał anty-5mC i anty-5hmC w selektywnym immunoprecypitacji metylowego/hydroksymetylowego DNA (meDIP/hmeDIP), a następnie sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości, Ficz et al. wykazali wysokie obłożenie 5hmC w promotorach, eksonach i sekwencjach retrotranspozonów LINE-1, które korelowały z obniżonymi poziomami 5mC w tych miejscach w embrionalnych komórkach macierzystych myszy27. I odwrotnie, największe wzbogacenie o 5 mC zaobserwowano w powtarzających się sekwencjach satelitarnych, w których obecność 5hmC była ograniczona28. Badania przeprowadzone na tkance mózgowej ludzkiego płata czołowego wykazały bardzo znaczące wzbogacenie 5hmC, czterokrotnie wyższe niż w embrionalnych komórkach macierzystych myszy28. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, wysokoprzepustowe sekwencjonowanie tkanki płata czołowego wykazało większość 55-59% sygnału 5hmC zlokalizowanego w regionach promotorowych CpG o niskiej gęstości, 35-38% w ciałach genowych i około 6% zajętości w regionach międzygenowych. W przeciwieństwie do tego, 5mC było wzbogacone w regionach międzygenowych (25-26%) i wyższe w ciałach genów (52-55%), ale zmniejszone (22-24%) w sekwencjach promotorowych29. Badania te wskazują na obfitość 5hmC w embrionalnych komórkach macierzystych i tkance somatycznej, zwłaszcza w mózgu, jednak badania nad dystrybucją 5fC i 5caC są ograniczone.

Ciekawe, niedawno odkryte u eukariontów metylacja reszt adeniny na pozycji 6 azotu (N6) (6mA) wykazują genomowy profil obfitości odwrotny do profilu 5mC30. Obserwacje z tandemowej spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową ujawniają, że bezwzględne poziomy 6mA występują w nadmiarze u wczesnych zarodków ryb danio pręgowanego i świń w porównaniu z plemnikami, przy czym ich poziomy (0,003% adeniny genomowych) stale rosną po zapłodnieniu, osiągając szczyt w stadium rozwoju moruli (33 razy więcej niż plemniki) i osiągając poziomy somatyczne w stanie stacjonarnym 0,004% adenin genomowych31. Immunoprecypitacja sekwencji DNA wzbogaconych o 6mA wykazała dominujące zajęcie (około 80% wzbogacenia) tego znaku w powtarzających się regionach pierwiastków i miejscach rozpoczęcia transkrypcji32. Obserwacje te kontekstualizują i potwierdzają odkrycie embrionalnych komórek macierzystych 6mA pozbawionych demetylazy, wykazujących skumulowane wyciszanie retrotranspozonów LINE-1 za pośrednictwem 6mA w porównaniu z elementami aktywnymi transkrypcyjnie w komórkach typu dzikiego. Dane te sugerują transkrypcyjną funkcję regulacyjną dla klasy 6mA33.

Podczas gdy sprzężone znaczniki biochemiczne sprzężone z kolejnymi testami DIP wskazują na obecność lub brak utlenionych pochodnych metylocytozyny (oksy-mC), nie mogą one przekazać rozkładu przestrzennego ani ilościowych informacji o tych znakach34,35. Niedawno opracowano protokół czułego wykrywania immunochemicznego 5hmC i 5caC36. Ta sprzężona z fluoroforem metoda barwienia immunologicznego opartego na przeciwciałach wtórnych w połączeniu z wykorzystaniem skaningowej laserowej mikroskopii konfokalnej ma wyjątkową zaletę polegającą na zapewnieniu wizualnej lokalizacji tych modyfikacji DNA w komórkach, podkreślając w ten sposób poszczególne dodatnio lub ujemnie zabarwione komórki odpowiadające heterogenicznej obecności tych znaków. Bezwzględne intensywności sygnału 5hmC i 5caC wzmocnione przez sprzężone przeciwciała umożliwiają zaproponowanie półilościowych interpretacji wielkości i pozycji tych znaczników w jądrze, np. regionów heterochromatycznych i euchromatycznych37,38. W tym miejscu opisano technikę analizy obliczeniowej obrazów z mikroskopii konfokalnej. Zademonstrowano generowanie wykresów rozkładu przestrzennego 2,5D do wyświetlania odrębnych pików sygnału 5hmC i 5caC na piksel oraz ich lokalizacji w jądrach. Wykresy histogramu profili intensywności sygnału 5hmC i 5caC mogą ilustrować trendy w obfitości tych znaków, ponieważ szczyty i dołki są wykreślane jako oddzielne, nienakładające się kanały. Wreszcie, realizując funkcję kolokalizacji, można określić stopień zbliżenia jednego sygnału do drugiego, a w rezultacie zidentyfikować ich odpowiednie współrzędne genomowe.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie obrazów konfokalnych

  1. W ramach przygotowań do analizy zmodyfikowanych form cytozyny należy przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne zgodnie z opisem Abakir i wsp.34.
  2. Wykonaj obrazowanie szkiełek za pomocą mikroskopu i zapisz pliki w formacie LSM.
    UWAGA: Podczas porównywania profili intensywności między próbkami wartości stosowane dla mocy i wzmocnienia lasera dla każdego kanału muszą być zachowane przez cały czas trwania procedury wykonywania obrazu, aby umożliwić bezpośrednie porównanie na etapie analizy obrazu.

2. Generowanie wykresów intensywności 2.5D

  1. Otwórz oprogramowanie (np. Zen Black) i wybierz "Przetwarzanie obrazu".
  2. Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz. Wybierz obraz, który wymaga przetworzenia.
  3. Kliknij "Pokaż wszystko" pod obrazem, aby wyświetlić wszystkie elementy graficzne. W dolnej połowie ekranu znajdują się trzy zakładki; 'Wymiary', 'Wyświetlacz' i 'Grafika', wybierz zakładkę 'Grafika'.
    1. Wybierz narzędzie "prostokąt", aby wybrać jądra/obszar zainteresowania.
    2. Wybierz "Wytnij region", aby przyciąć obraz. Spowoduje to wygenerowanie nowego obrazu dla przyciętego regionu w osobnej karcie.
    3. Przejdź do menu Plik i wybierz Zapisz jako. Nadaj plikowi nazwę i zapisz go jako plik LSM lub CZI.
  4. Otwórz oprogramowanie (np. Zen Blue) i wybierz "Zen Desk".
  5. Wyślij przycięty obraz z Zen Black do Zen Blue, wybierając plik i klikając menu Plik, a następnie wybierz Wyślij do Zen 2012-blue edition. Przycięty obraz otworzy się w odpowiednim programie.
    UWAGA: Plik obrazu jest przesyłany, ponieważ funkcja wykresu intensywności 2.5D w Zen Black 2012 nie wyświetla obrazów z wielu kanałów jednocześnie.
  6. Po lewej stronie obrazu wybierz zakładkę oznaczoną '2.5D', która umożliwia wizualizację obrazu w 2.5D. Kliknij "Pokaż wszystko", aby wyświetlić wszystkie elementy graficzne.
  7. Zmień ustawienia wizualizacji za pomocą czterech szarych pasków umieszczonych po lewej stronie i pod obrazem.
    UWAGA: Lewy pasek, górna część ekranu = powiększenie. Lewy pasek, dolna część ekranu = obróć obraz wokół osi. Dół ekranu, lewy pasek = obrót obrazu. Dół ekranu, prawy pasek = paski skali rozwijania i zmniejszania.
  8. Upewnij się, że wybranym trybem renderowania jest powierzchnia, ponieważ zapewnia to najlepszą wizualizację poszczególnych szczytów.
  9. Zmień odległość siatki, zmieniając wartość procentową, im niższa wartość procentowa, tym bardziej zdefiniowany jest każdy pojedynczy szczyt.
  10. Aby zapisać obraz 2.5D, najpierw ukryj listę plików po prawej stronie i narzędzia graficzne pod obrazem, klikając szarą strzałkę poniżej wykresu 2.5D (obok "pokaż wszystko"), co spowoduje ukrycie zakładek graficznych pozwalających na rozszerzenie obrazu w celu wypełnienia ekranu. Aby zapisać wykres 2.5D, naciśnij "PrtSc" na klawiaturze. Spowoduje to zrobienie zrzutu ekranu wyświetlacza. Wklej zrzut ekranu w programie Microsoft Paint i przytnij obraz przed zapisaniem.

3. Profilowanie intensywności

  1. Otwórz oprogramowanie (np. Zen Black) i wybierz Przetwarzanie obrazu.
  2. Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz. Wybierz obraz, który wymaga przetworzenia.
  3. Gdy obraz pojawi się na ekranie, po lewej stronie obrazu wybierz zakładkę oznaczoną "Profil".
  4. W dolnej połowie ekranu wybierz (zaznacz) zakładkę "Pokaż wszystko". Umożliwi to dostęp do wszystkich opcji formatowania.
  5. W dolnej połowie ekranu znajdują się trzy zakładki: "Wymiary", "Wyświetlacz" i "Profil"; wybierz "Profil" i zaznacz (zaznacz) pole "Tabela". Wybierz przycisk "Strzałka".
  6. Na obrazie użyj myszy, aby wybrać punkt początkowy i przeciągnij myszą po ciągłej liczbie komórek. Zwolnij przycisk myszy, aby utworzyć wykres intensywności dla komórek wzdłuż linii; Dodatkowo tabela zostanie wypełniona danymi pomiaru intensywności dla pikseli wzdłuż linii dla każdej długości fali.
    UWAGA: Tabela poda odległość (μm), przy której odczytywana jest intensywność pikseli dla fluorescencji czerwonej, zielonej i niebieskiej.
  7. Aby wyeksportować te dane, kliknij prawym przyciskiem myszy na tabelę, wybierz opcję "Zapisz tabelę..." i zapisz w odpowiedniej lokalizacji jako plik .txt.
  8. Aby zapisać wybrane zdjęcie profilu intensywności, wybierz menu Plik i wybierz opcję "Eksportuj...". W wyskakującym okienku wybierz "Oznaczony plik obrazu (format)" i "Zawartość okna obrazu - pojedyncze okienko (dane)", a następnie kliknij "Wybierz nazwę pliku i zapisz...", wybierz odpowiednią lokalizację i kliknij "Zapisz".
  9. Powtórz ten proces dla każdego indywidualnego profilu intensywności w zależności od pól widzenia i liczby profili do analizy.
  10. Zaimportuj zapisane dane o profilach intensywności (patrz 3.7) i przeanalizuj je w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie wykonaj analizę statystyczną.

4. Analiza kolokacji

  1. Otwórz oprogramowanie i wybierz "Przetwarzanie obrazu".
  2. Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz. Wybierz obraz, który wymaga przetworzenia.
  3. Gdy obraz pojawi się na ekranie, po lewej stronie obrazu wybierz zakładkę oznaczoną "Coloc".
  4. W dolnej połowie ekranu wybierz (zaznacz) zakładkę "Pokaż wszystko". Umożliwi to dostęp do wszystkich opcji formatowania.
  5. W dolnej połowie ekranu znajdują się cztery zakładki: "Wymiary", "Wyświetlacz", "Grafika" i "Kolokalizacja"; wybierz "Kolokalizacja" i zaznacz pola "Tabela" i "Obraz".
    1. Wybierz trzecią ikonę u góry tej zakładki (Zamknij tekst Beziera pojawi się, gdy najedziesz myszą na narzędzie), a następnie użyj tego narzędzia, aby otoczyć pojedyncze jądra, wartości dla tych jąder pojawią się w tabeli.
      UWAGA: Dla każdego otoczonego jądra tworzony jest wykres punktowy dla fluorescencji czerwonej i zielonej, który jest wizualizowany w lewym panelu ekranu. Oś jest następnie przesuwana w celu wyprowadzenia komórek w zależności od progu. Ponieważ jądra będące przedmiotem zainteresowania są wybierane ręcznie na obrazach, dostosowywanie progów bramkowania powyżej zera nie jest wymagane. Wszystkie wartości intensywności pikseli obserwowane w obrębie obwodów jądrowych są uważane za sygnał dodatni.
  6. Powtórz ten proces, wybierając trzecią ikonę w zakładce i okrążając kolejne jądra, aż zbiór danych zostanie uzupełniony.
  7. Aby wyeksportować te dane, kliknij prawym przyciskiem myszy na tabelę, wybierz zapisz tabelę i zapisz w odpowiedniej lokalizacji.
  8. Aby zapisać obraz kolokalizacyjny, wybierz menu Plik i wybierz "Eksportuj...", a następnie wybierz; Oznaczone Plik obrazu (Format) i 'Zawartość okna obrazu - pojedyncza płaszczyzna (Dane)', a następnie kliknij 'Wybierz nazwę pliku i zapisz...', wybierz odpowiednią lokalizację i kliknij 'Zapisz'.
  9. Wykreśl dane kolokalizacji w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie przeprowadź analizę statystyczną.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić rozkład przestrzenny 5hmC i 5caC w różnicowaniu komórek progenitorowych wątroby, zobrazowano preparaty immunologiczne dla tych modyfikacji DNA za pomocą mikroskopu.

Wstępna analiza przestrzennego rozkładu tych oksy-mC została przeprowadzona poprzez generowanie wykresów intensywności 2.5D (Rysunek 1A, 1B). Czerwone i zielone piki wydawały się być dobrze zdefiniowane, z ograniczoną obecnością pomarańczowych pików, co wskazuje tylko na niewielkie nakładanie się sygnałów 5caC i 5hmC. Zgodnie z tymi wynikami, profile intensywności 5hmC i 5caC w odpowiedniej komórce nie pokrywają się ze sobą silnie (Rysunek 1C). Ilustruje to, że 5caC i 5hmC wykazują wyraźne wzorce dystrybucji jądrowej w progenitorach wątroby, co sugeruje, że zależne od Tet utlenianie 5mC prowadzi do generowania różnych utlenionych pochodnych tej modyfikacji DNA w określonych regionach chromatyny.

Aby porównać poziomy 5caC i 5hmC w komórkach rdzeniaka zarodkowego Daoy i wyściółczaka BXD-1425EPN, przeprowadzono barwienie immunologiczne dla tych oksy-mC na obu próbkach w identycznych warunkach eksperymentalnych. Natężenia sygnałów 5caC i 5hmC porównano następnie w 20 profilach wygenerowanych w 3-5 komórkach zarejestrowanych dla każdej linii komórkowej (Rysunek 2A-2D). Kwantyfikacja tych wyników wykazała, że komórki BXD-1425EPN wykazują znacznie niższe poziomy barwienia immunologicznego zarówno 5hmC, jak i 5caC w porównaniu z komórkami Daoy (Rysunek 2D).

Biorąc pod uwagę dwa kanały: czerwony (5hmC) i zielony (5caC), które mogą być oznaczone odpowiednio jako R i G, współczynnik korelacji Pearsona (PCC) opisuje stopień przestrzennego nakładania się i kosegregacji R & G, zakładając, że oba znaki istnieją w liniowym związku ze sobą, oznaczonym przez R statistic34. Podniesienie do kwadratu wartości PCC, oznaczonej przez R2, umożliwia pomiar zmienności intensywności sygnału zielonego, na którą wpływa intensywność sygnału czerwonego34. Jest to zbędne w przypadku naszej analizy kolokalizacji 5caC i 5hmC.

Aby zbadać rozkład przestrzenny 5caC i 5hmC w niezróżnicowanych (Undiff) hiPSC i endodermie wątroby 24 godziny (HE24) po indukcji, przeprowadzono analizę kolokalizacji tych modyfikacji DNA na tych samych obrazach konfokalnych, z wartościami R dla 20 jąder analizowanych dla każdej linii komórkowej (Rysunek 3A-3C).

Kwantyfikacja tych wyników wykazała, że stopień kolokalizacji jest znacznie wyższy (P < 0,05) w HE24 w porównaniu do Undiff (Rysunek 3c). Może to być spowodowane zmniejszoną wielkością obecności 5caC, a tym samym zmniejszoną intensywnością sygnału w komórkach Undiff.

figure-results-1
Rycina 1: Barwienie immunohistochemiczne komórek progenitorowych endodermy wątroby po 72 godzinach od indukcji różnicowania. (A) Współbarwienie 5hmC (czerwony), 5caC (zielony) i przeciw barwieniu jądrowemu DAPI (niebieski). Biała przerywana strzałka "B" oznacza kierunek profilowania próbki pobranej przez jądro, zilustrowany w 1C. Podziałka skali reprezentuje 5 μm. Kanał czerwony: zysk 800, laser 1%. Zielony kanał: zysk 750, laser 2,4%. Kanał DAPI: zysk 750, laser 2,6%. (B) Wykres intensywności 2.5D sygnałów 5hmC, 5caC i DAPI. Poszczególne piki reprezentują bezwzględne natężenia sygnału każdego piksela. Wyświetlane są scalone widoki i poszczególne kanały. (C) Profile intensywności sygnałów 5hmC, 5caC i DAPI w progenitorach wątroby po 72 godzinach od indukcji różnicowania. Szczytowe intensywności zarejestrowano wzdłuż wymiarów białej przerywanej strzałki "B" i są one oznaczone wzdłuż profilu intensywności osi x za pomocą czarnej przerywanej strzałki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza intensywności sygnału 5hmC i 5caC w liniach komórkowych rdzeniaka zarodkowego Daoya i wyściółczaka wyściółdza BXD-1425EPN. (A) Barwienie immunofluorescencyjne 5hmC (czerwony) i 5caC (zielony) w komórkach Daoy i BXD-1425EPN. Obrazy zostały wykonane za pomocą obiektywu z olejkiem o powiększeniu 63x, oba przy tych samych ustawieniach. Wyświetlane są scalone widoki i poszczególne kanały. Podziałka liniowa wynosi 10 μm. Kanał czerwony: zysk 746, laser 1%. Zielony kanał: zysk 750, laser 2,4%. Poszczególne komórki (B) Daoy i (C) BXD-1425EPN są rozszerzone na sąsiednich rysunkach. Podziałki dla (B) i (C) reprezentują 5 μm. (D) Średnia intensywność fluorescencji sygnałów 5hmC vs 5caC w komórkach Daoy i BXD-1425EPN (n = 20, SD). Istotność oceniono za pomocą testu F i testu t dla dwóch prób. Gwiazdki oznaczają statystycznie istotne wartości p ** jako p <0,01 i *** jako p <0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Analiza kolokalizacji sygnałów bezwzględnych 5hmC i 5caC w niezróżnicowanych hiPSC (Undiff) w porównaniu z endodermą wątroby 24 godziny po zróżnicowanych komórkach progenitorowych (HE24). Obrazy z mikroskopii konfokalnej (A) niezróżnicowanych hiPSC i (B) komórek HE24 wybarwionych na 5hmC (czerwony), 5caC (zielony) i DAPI (niebieski). Komórki zostały zobrazowane za pomocą 63-krotnej soczewki immersyjnej z olejkiem przy identycznych ustawieniach. 20 otaczających jąder ilustruje komórki pobrane do analizy kolokalizacji. Podziałka liniowa wynosi 20 μm. Kanał czerwony: zysk 800, laser 1%. Zielony kanał: zysk 750, laser 2,4%. Kanał DAPI: zysk 750, laser 2,6%. (C) Analiza kolokalizacyjna obecności sygnału 5caC w zakresie bliskości 5hmC w undiff i HE24 (n = 20, SD). Istotność oceniono za pomocą testu F i testu t dla dwóch prób. Gwiazdki oznaczają statystycznie istotne wartości p wynoszące * p <0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje krokowy proces generowania wizualnych reprezentacji modyfikacji DNA w jądrach. Chociaż techniki te są wrażliwe i skuteczne, mają szereg ograniczeń.

Należy podkreślić, że dane generowane z wykresów 2,5D, profili intensywności sygnału oraz analizy kolokalizacyjnej mają charakter półilościowy. Dzięki punktowemu oświetlaniu próbki podczas akwizycji obrazu za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, rejestrowane są bezwzględne natężenia sygnału każdego kanału. Nie są to jednak bezwzględne wielkości 5hmC i 5caC, które są wykrywane, a jedynie wskazują na obecność, brak lub skalę tych znaczników epigenetycznych.

Ze względu na powtarzalny charakter wzmocnień sygnału, ograniczenia zgodne z wielkością maszyn stosowanych w celu wzmocnienia sygnału nieuchronnie zakłócają przybliżenia rzeczywistego fizycznego zajętości genomu tych znaków34. Prawdziwa lokalizacja genomowa tych znaczników może być przesłonięta przez te masywne białka, które fizycznie zajmują obszary nierozdzielne nawet przy optymalnych granicach rozdzielczości konfokalnej 200-300 nm34. Co więcej, intensywność sygnału poszczególnych kanałów dla każdego znaku nie może być porównywana ze sobą ze względu na różnice w czułości przeciwciał i koniugacji fluoroforu34. Jednak informacje uzyskane za pomocą obrazowania rzucają światło na przestrzenną i czasową organizację znaczników genomowych.

W celu dokładnego określenia ilościowego sygnałów 5hmC i 5caC, jądra są podświetlane i otaczane względem przeciwbarwienia DAPI, wyraźnie wyznaczając obszar, który ma być analizowany. Procedura ta zwalnia z wymogu kalibracji progów bramkowania, ponieważ szum tła jest pomijany w ręcznym procesie selekcji jąder1. Automatyzację tego procesu można osiągnąć w najnowszym oprogramowaniu, które pozwala na przeprowadzenie segmentacji jądrowej. Podczas gdy dostępne są bezpłatne alternatywne pakiety oprogramowania, takie jak FIJI do analizy kolokalizacji, wady, takie jak wymóg konwersji obrazów do binarnych formatów 8-bitowych, maskowanie obrazów i wprowadzanie danych wykluczenia rozmiaru w celu wybrania obszarów zainteresowania, ograniczają dostępność tego programu dla użytkownika. Dodatkowo, biorąc pod uwagę ogólnie ograniczone poziomy 5hmC i 5caC w genomie w połączeniu z ich dominującą lokalizacją w regionach euchromatycznych i ogólnym zubożeniem genomowych sekwencji CpG, ręczne okrążanie jąder wprowadza stronniczość użytkownika. W związku z tym podświetlanie jąder automatycznie zakłada, że wszystkie zdarzenia zachodzące w obrębie wyznaczonego obszaru są pozytywne i ignoruje wszelkie piksele tła, które mogą być obecne. W związku z tym analizowanie obrazów na podstawie intensywności pikseli może być bardziej znaczące. Czynniki te są ważne przy rozważaniu zastosowania współczynnika kolokalizacji Mandera do analizy stopnia przestrzennego nakładania się dwóch sygnałów, niezależnie od ich intensywności sygnału, w przeciwieństwie do współczynnika korelacji Pearsona, który zakłada liniową zależność między sygnałami.

Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj techniki niosą ze sobą temat wizualnej reprezentacji danych biologicznych w intuicyjnym formacie. Chociaż półilościowa analiza obrazu nie może zastąpić potężnych technik, takich jak spektrometria mas pod względem czułości lub sekwencjonowanie całego genomu o pojedynczej rozdzielczości podstawowej, dostarcza ona danych uzupełniających, umożliwiając precyzyjne formułowanie wniosków i hipotez na podstawie analizy obrazów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ujawniono żadnych potencjalnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez Radę Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi [BB/N005759/1 do A.R.]. NRFH został sfinansowany przez The Rosetrees Trust i The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Mikroskop Zeiss Elyra PS.1, komputery przetwarzające i oprogramowanie zostały sfinansowane przez BBSRC BB/L013827/1 (Multidisciplinary Super Resolution Microscopy Facility at Nottingham University grant)

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zeiss Elyra PS1. Mikroskop o wysokiej rozdzielczości wyposażony w głowicę konfokalną LSM780ZeissNA
Zeiss Zen 2012ZeissNA
Zen Blue 2012ZeissNA
Microsoft ExcelMicrosoftNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71 (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20 (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17 (1), 141(2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5 (12), e15367(2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. , Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46(2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA ModificationsImmunostainingConfocal MicroscopyComputational Analysis2 5D Intensity PlotsSignal Intensity ProfilesColocalization AnalysisEpigenetic ResearchNuclear LocalizationImage Processing

Related Articles