Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56323

⸱

9 października 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 2School of Physics, Beijing Institute of Technology, 3Beijing Key Laboratory of Central Nervous System Injury, Beijing Neurosurgical Institute, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Translational Medicine for Cerebrovascular Disease, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 5China National Clinical Research Center for Neurological Diseases, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół neuroprotekcyjnej aplikacji niskodawkowego leczenia plazmą atmosferyczną w przypadku urazów SH-SY5Y wywołanych deprywacją glukozy.

Streszczenie

Strumień plazmy atmosferycznej (APPJ) przyciągnął uwagę wielu badaczy z wielu dyscyplin w ostatnich latach, ponieważ jego emisje obejmują wiele rodzajów reaktywnych form azotu (RNS) i reaktywnych form tlenu (ROS). Nasze poprzednie badanie wykazało cytoprotekcyjne działanie APPJ przeciwko urazom wywołanym stresem oksydacyjnym. Celem niniejszego badania jest przedstawienie szczegółowego protokołu leczenia in vitro dotyczącego neuroprotekcyjnego zastosowania helu APPJ w uszkodzeniach wywołanych deprywacją glukozy w komórkach SH-SY5Y. Ludzka linia komórkowa pochodząca z nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y była utrzymywana w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 15% płodową surowicą cielęcą. Pożywka hodowlana została następnie zmieniona na RPMI 1640 bez glukozy przed leczeniem APPJ. Po 1-godzinnej inkubacji w inkubatorze komórkowym żywotność komórek określono za pomocą zestawu do liczenia komórek 8. Wyniki wykazały, że w porównaniu z grupą z deprywacją glukozy, komórki leczone APPJ wykazywały znacznie zwiększoną żywotność komórek w sposób zależny od dawki, przy czym 8 s / dobrze obserwowano jako dawkę optymalną. Tymczasem przepływ helu nie miał wpływu na upośledzenie komórek wywołane deprywacją glukozy. Nasze wyniki wskazują, że APPJ może być potencjalnie stosowany jako metoda leczenia chorób ośrodkowego układu nerwowego związanych z deprywacją glukozy. Protokół ten może być również stosowany jako zastosowanie cytoprotekcyjne dla innych komórek z różnymi zaburzeniami, ale warunki hodowli komórkowej i leczenia APPJ powinny zostać ponownie dostosowane, a dawka leczenia musi być stosunkowo niska.

Wprowadzenie

Mózg dorosłego człowieka prawie wyłącznie wykorzystuje glukozę jako substrat do metabolizmu energetycznego w normalnych warunkach fizjologicznych. Ludzki mózg stanowi tylko 2% masy ciała, ale zużywa około 25% całkowitej ilości glukozy w organizmie1. Jest dobrze udokumentowane, że dysfunkcja metabolizmu glukozy jest jedną z głównych zmian patologicznych podczas udaru niedokrwiennego i różnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), choroby Huntingtona (HD) i choroby Parkinsona (PD)2,3. Brak glukozy i upośledzony wychwyt glukozy lub fosforylacja oksydacyjna mogą bezpośrednio wpływać na produkcję ATP i dalej indukować śmierć komórek nerwowych, co może zwiększać ryzyko dysfunkcji neuronów, co sugeruje, że utrzymanie żywotności komórek lub opóźnienie uszkodzenia komórek po deprywacji glukozy może być rozsądnym podejściem do leczenia tych chorób. Interesujące było badanie efektów neuroprotekcyjnych poprzez modulację glukozy, koncentrując się na środkach przeciwzapalnych, modulatorach kanałów jonowych, wymiataczach wolnych rodników, czynnikach neurotroficznych itp. Jednak przełożenie tych podejść neuroprotekcyjnych z laboratorium na praktykę kliniczną nie powiodło się4.

Strumienie plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym (APPJ) to nowy rodzaj technologii atmosferycznego wyładowania gazu o niskiej temperaturze, która w ostatnich latach przyciągnęła uwagę wielu badaczy z wielu dyscyplin. APPJ są używane od dziesięcioleci w różnych zastosowaniach biomedycznych, takich jak leczenie komórek rakowych, inaktywacja bakterii, krzepnięcie krwi, gojenie ran, medycyna jamy ustnej itp.5,6, ze względu na emisję wielu rodzajów reaktywnych form azotu (RNS) i reaktywnych form tlenu (ROS) (Rysunek 1)7. Poprzednie zastosowania biomedycyny plazmowej koncentrowały się głównie na stresie oksydacyjnym i/lub nitratywnym na bakteriach, komórkach i tkankach8. Jednak APPJ może być również "mieczem obosiecznym", ponieważ RNS i ROS są ważnymi wewnątrzkomórkowymi cząsteczkami sygnałowymi związanymi z wieloma procesami fizjologicznymi i patofizjologicznymi9. Podtlenek azotu (NO) kontroluje szeroki zakres procesów biologicznych i odgrywa podwójną rolę w organizmie człowieka, zwłaszcza w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Niskie poziomy NO wykazały ich działanie neuroprotekcyjne zarówno in vitro, jak i in vivo za pośrednictwem wielu szlaków sygnałowych10. Nasze poprzednie badanie po raz pierwszy wykazało, że produkcja NO indukowana przez hel APPJ była zaangażowana w neuroprotekcyjne działanie APPJ przeciwko urazom wywołanym stresem oksydacyjnym11. Nie zgłoszono jednak wpływu APPJ na inne urazy. W związku z tym celem niniejszego badania jest przedstawienie protokołu leczenia in vitro dotyczącego neuroprotekcyjnych zastosowań helu APPJ w uszkodzeniach wywołanych deprywacją glukozy w komórkach SH-SY5Y. W odróżnieniu od poprzednich badań, nasz protokół wykorzystywał leczenie osoczem w niskich dawkach do zastosowań neuroprotekcyjnych bez konsekwencji nadmiernych uszkodzeń wywołanych osoczem, co wskazuje, że leczenie APPJ może być potencjalnie stosowane jako nowy "lek dawcy NO" do przyszłych badań, a nawet do translacji klinicznej. Zasugerowano również, że protokół ten powinien być stosowany jako zastosowanie cytoprotekcyjne dla innych typów komórek z różnymi zaburzeniami, ale warunki leczenia APPJ powinny zostać ponownie dostosowane, a dawka leczenia musi być stosunkowo niska.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie urządzenia APPJ

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Podczas wykonywania wszystkich eksperymentów należy stosować odpowiednie zasady bezpieczeństwa, w tym używać dygestorium i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice ochronne, fartuch laboratoryjny itp.). Protokół wymaga standardowych technik obchodzenia się z komórkami (sterylizacja, odzyskiwanie komórek, pasażowanie komórek, zamrażanie komórek, barwienie komórek itp.).

  1. Wybierz rurkę kwarcową o średnicy wewnętrznej 1 mm i średnicy zewnętrznej 3 mm. Wygładź przekroje na obu końcach za pomocą folii polerskiej.
  2. Jako elektrodę wysokonapięciową należy użyć niklowanej igły ze stali nierdzewnej o średnicy 1.0 mm. Oszlifuj jego końcówkę do promienia krzywizny 0,05 mm.
  3. Owiń folię aluminiową (o szerokości 2 mm) wokół rurki kwarcowej w odległości 1 cm od dyszy rurki kwarcowej. Zamocuj końcówkę igły ze stali nierdzewnej w odległości 1 cm od drugiego końca folii aluminiowej. Użyj pierścienia z folii aluminiowej jako elektrody niskiego napięcia.

2. Przejęcie odrzutowców

  1. Aby dostarczyć sygnał AC, podłącz wysokonapięciowy wzmacniacz mocy do funkcyjnego generatora sygnału, który służy jako źródło zasilania. Aby zarejestrować przebiegi przyłożonego napięcia do elektrody wysokiego napięcia, podłącz jeden koniec sondy wysokonapięciowej do oscyloskopu cyfrowego, a drugi koniec podłącz do zasilacza. Aby chronić obwód, użyj rezystora 2 kΩ jako rezystora ochronnego. Podłącz obwód, jak pokazano w Rysunek 2.
    UWAGA: Nie dotykaj dużej objętościtage linie.
  2. Stale przepuszczaj hel (ułamek objętościowy, 99,999%) przez rurkę kwarcową i kontroluj natężenie przepływu gazu na stabilnym poziomie 1,4 litra standardowego na minutę (SLM).
    UWAGA: Nie używamy filtra przed leczeniem kultur komórkowych. Udział objętościowy helu użytego w eksperymencie wynosi 99,999%, a większość mikroorganizmów nie może żyć w tych warunkach.
  3. Włącz zasilanie oscyloskopu, generatora sygnału i wysokonapięciowego wzmacniacza mocy. Obróć pokrętło regulacji częstotliwości na 5 kHz. Stopniowo zwiększaj napięcie do wartości międzyszczytowej 6 kV.
    UWAGA: Strumień jest wystarczająco długi (około 3 cm), gdy wartość międzyszczytowa napięcia przyłożonego do igły wynosi około 6 kV.

3. Przygotowanie komórek SH-SY5Y

  1. Hodować ludzką linię komórkową pochodzącą z nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w kolbie o średnicy 25cm2 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 15% płodową surowicą cielęcą (FBS). Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5%CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C.
  2. Gdy komórki osiągną 85% konfluencji, ostrożnie odessaj pożywkę hodowlaną i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny + 0,1% EDTA do komórek.
  3. Po 15 sekundach inkubacji w temperaturze pokojowej ostrożnie odessać trypsynę i dodać 2 ml RPMI 1640 zawierające 15% FBS w celu zneutralizowania.
  4. Delikatnie pipetuj w górę iw dół, myjąc dno studzienki, aż monowarstwa SH-SY5Y zostanie całkowicie odłączona.
  5. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 2 x 105 komórek/ml, dodając pożywkę RPMI 1640 +15% FBS, a następnie przenieś 100 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
  6. Pozwól komórkom przyczepić się przez 12 godzin w inkubatorze komórkowym przed leczeniem APPJ.

4. Leczenie metodą APPJ SH-SY5Y

  1. Dostosuj odległość między dyszą rurki kwarcowej a platformą, na której zostanie umieszczona 96-dołkowa płytka, do 3 cm. Upewnij się, że wiązka może dotykać powierzchni pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Odległość nie jest mierzona od spodu płyty. Najpierw ustawia się go na 3 cm między dyszą rurki kwarcowej a platformą służącą do umieszczania płytki 96-dołkowej.
  2. Przed poddaniem działaniu APPJ należy zmienić pożywkę hodowlaną w każdym dołku z wyjątkiem studzienek kontrolnych na RPMI 1640 bez pożywki glukozowej.
  3. Umieść płytkę pod dyszą APPJ i upewnij się, że dysze mogą strzelać pionowo do każdej studzienki.
  4. Traktuj komórki w oddzielnych studzienkach za pomocą APPJ przez 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s i 12 s.
    UWAGA: APPJ jest generowany przez jonizację helu (Rysunek 1). Komórki uszkodzone przez deprywację glukozy są leczone przepływem helu przez 4 s i 8 s w celu wyeliminowania wpływu helu na komórki. Wszystkie zabiegi należy wykonać w trzech egzemplarzach.

5. Test żywotności komórek

UWAGA: Nie zmieniaj medium w tym kroku.

  1. Po zabiegu APPJ inkubować komórki przez 1 godzinę w inkubatorze komórkowym.
  2. Dodaj 10 μl roztworu Cell Counting Kit-8 (CCK-8) do każdej studzienki.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 4 h.
    UWAGA: Linia komórkowa SH-SY5Y jest wrażliwa na warunki niedoboru glukozy12. Żywotność komórek spada do blisko 50% po 1 godzinie deprywacji glukozy, co jest optymalnym warunkiem żywotności komórek w badaniach farmakodynamicznych. CCK-8 nie ma cytotoksyczności dla komórek, a komórki inkubuje się z odczynnikiem CCK-8 przez kolejne 4 godziny w warunkach deprywacji glukozy po leczeniu APPJ w celu sprawdzenia żywotności komórek. Po 8 godzinach deprywacji glukozy i leczeniu APPJ ochronne działanie APPJ zostało znacznie zmniejszone, ponieważ długotrwała deprywacja glukozy doprowadziła do poważnego uszkodzenia komórek SH-SY5Y. Nie znaleziono dowodów na istnienie żywych komórek po 24 godzinach deprywacji glukozy11.
  4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dane przedstawiono jako średnia ± SD z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Wyniki grup przeanalizowano pod kątem wariancji za pomocą testu ANOVA. Wszystkie analizy wykonano przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej Prism, a próg istotności statystycznej określono jako p<0.05.

Żywotność komórek zmierzono po 4 h inkubacji z CCK-8. Jak pokazano na Rysunku 3, deprywacja glukozy zmniejszyła żywotność komórek SH-SY5Y do 44,1 ± 2,6% w porównaniu z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki SH-SY5Y są ludzką linią komórkową pochodzącą z nerwiaka zarodkowego i są szeroko stosowane jako odpowiedni model komórkowy do badań in vitro nad neurotoksycznością lub neuroprotekcją12. Linia komórkowa SH-SY5Y była wrażliwa na warunki niedoboru glukozy. Żywotność komórek zmniejszyła się do prawie 50% po 1 godzinie deprywacji glukozy, co jest optymalnym warunkiem żywotności komórek dla badań farmakodynamicznych. Ponadto odczynnik CCK-8 nie ma cytotoksyczności dla komórek, a komórki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

W odniesieniu do niniejszego artykułu nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundusz Innowacji Instytutu Neurochirurgii w Pekinie (2014-11), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 11475019 i 81271286) oraz Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 7152027).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa SH-SY5YChińskie Centrum Zbierania Kultur Typu3111C0001CCC000026
RPMI 1640 mediumThermo Scientific21875091przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C
RPMI 1640 podłoże bez glukozyThermo Scientific11879020przechowywany w temperaturze 4 & st.; C
Surowica cielęca płoduThermo Scientific16000044przechowywana w temperaturze -20 stopni; C
roztwór tripsin-EDTASolarbioT1300przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
96 dołków płytkowychcorning3599
Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)Dojindo LaboratoriesCK04przechowywany w temperaturze 4 &; C
Czytnik mikropłytekTecanM200 Prodo pomiaru absorbancji przy 450 nm
Wysokonapięciowy wzmacniacz mocyTrekPD06087do wzmacniania mocy
Funkcja Generator sygnałuMaZe Electronics Science& TechnologiaAT30120do dostarczania określonego sygnału
High – Sonda napięciowaTektronixP6015Ado wykrywania wysokiego napięcia
Oscyloskop cyfrowyTektronixDPO4104Bdo wyświetlania sygnału

Bibliografia

  1. Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
  2. Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
  3. Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
  4. Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
  5. Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339(2015).
  6. Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005(2012).
  7. Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
  8. Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
  9. Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049(2016).
  10. Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
  11. Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401(2017).
  12. Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  13. Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309(2014).
  14. Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test żywotności komórekzestaw do liczenia komórek Cell Counting Kit 8przepływ heluwzmacniacz wysokiego napięcialeczenie neuroprotekcyjnezastosowanie medycyny plazmowejprotokół in vitro
Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.