Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce

18.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56324

⸱

8 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Healthcare System, 2Departments of Medicine and Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Medicine, Baylor University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do nerki myszy przez miedniczkę nerkową w celu wytworzenia ekspresji transgenu specyficznie w nerce.

Streszczenie

Hydrodynamiczne iniekcja tworzy lokalne, wysokociśnieniowe środowisko do transfekcji różnych tkanek plazmidowym DNA i innymi substancjami. Na przykład hydrodynamiczne wstrzykiwanie żył ogonowych jest dobrze znaną metodą, za pomocą której można transfekować wątrobę. Manuskrypt ten opisuje zastosowanie zasad hydrodynamiki poprzez wstrzyknięcie do nerki myszy bezpośrednio plazmidowego DNA w celu ekspresji genów specyficznych dla nerek. Myszy są znieczulane, a nerka jest odsłaniana przez nacięcie boku, a następnie szybkie wstrzyknięcie roztworu zawierającego plazmidowe DNA bezpośrednio do miedniczki nerkowej. Igła jest utrzymywana na miejscu przez dziesięć sekund, a miejsce nacięcia jest zszywane. Następnego dnia obrazowanie żywych zwierząt, Western blot lub immunohistochemia mogą być użyte do zbadania ekspresji genów lub inne testy dostosowane do wybranego transgenu są używane do wykrywania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Opublikowane metody przedłużania ekspresji genów obejmują integrację transgenu za pośrednictwem transpozonów i leczenie cyklofosfamidem w celu zahamowania odpowiedzi immunologicznej na transgen.

Wprowadzenie

Technika hydrodynamicznego wstrzykiwania żył ogonowych stała się powszechnie stosowanym sposobem na osiągnięcie wysokiego poziomu ekspresji genów w wątrobie myszy1,2. Nerki są również transfekowane tą techniką na znacznie niższym poziomie, około 100-krotnie mniej3. Opisana tutaj hydrodynamiczna iniekcja do miednicy nerkowej zapewnia prosty sposób kontrolowania swoistości ekspresji narządów za pomocą środków fizycznych przy użyciu tych samych zasad hydrodynamicznych, które zostały wcześniej ustalone w wątrobie4,5, muscle6 i innych narządach7,8. Metoda ta polega na transfekcji komórek u żywych zwierząt in vivo, wykorzystując ciśnienie i prędkość do wtłaczania płynu zawierającego DNA do komórek, jednocześnie wywołując uszkodzenie narządu, które jest szybko rozwiązywane9. Korzystając z dobrze znanych technik chirurgicznych do wizualizacji nerki za pomocą nacięcia bocznego10 wraz z pojedynczym wstrzyknięciem za pomocą strzykawki insulinowej, odkryliśmy udaną transfekcję różnych typów komórek nerkowych, głównie fibroblastów śródmiąższowych, kanalików i przewodu zbiorczego11. Sekcja tych myszy wykazała, że inne narządy nie są transfekowane na wystarczająco wysokim poziomie, aby można je było uwidocznić za pomocą technik obrazowania lucyferazy11. Ponieważ technika ta nie jest wirusowa, użycie plazmidowego DNA do transfekcji pozwala na szybkie i łatwe przygotowanie odczynników wymaganych do wstrzyknięcia.

Użyliśmy miejscowych iniekcji hydrodynamicznych, aby wyrazić przeciwutleniającą S-transferazę glutationu A4, receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 oraz hormon erytropoetynę w nerkach, wszystkie z oczekiwanymi efektami biologicznymi11,12,13. Przeprowadzono szczegółową ocenę drogi podania, objętości wstrzyknięcia, dawki DNA i wyboru promotora11. Ponadto wykazano, że zarówno system transpozonów piggyBac, jak i leczenie cyklofosfamidem w celu stłumienia reakcji immunologicznej na transgen poprawiają długoterminowe wyniki ekspresji genów11. Inni badacze z powodzeniem zastosowali podejście do żyły nerkowej u szczurów, osiągając wysoką skuteczność transfekcji przez okresy dłuższe niż jeden miesiąc14. Jednak genetyczna korekta fenotypów naśladujących ludzką chorobę jest zwykle najpierw wykonywana na myszach jako dowód koncepcji, ponieważ większość modeli genetycznych ssaków to modele mysie. Porównaliśmy wstrzyknięcie do żyły nerkowej z wstrzyknięciem do miedniczki nerkowej i stwierdziliśmy, że wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej było lepsze niż w żyle nerkowej pod względem ekspresji genów (około dziesięciokrotnie wyższej) i przeżycia11. Miedniczka nerkowa jest idealną drogą wejścia do nerki, ponieważ jest wystarczająco elastyczna, aby tolerować wahania w produkcji moczu i często jest w stanie zachować swoją integralność strukturalną nawet po rozszerzeniu podczas wodonercza. Dodatkowo wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej umożliwiło dostęp do nerki bez przebijania torebki nerkowej, co pozwoliło na widoczne zatrzymanie wstrzykniętego płynu przez nerkę lepiej niż wstrzyknięcie śródmiąższowe. Inne narządy myszy nie mają innej drogi wejścia niż układ krwionośny, ale przestrzeń moczowa nerki jest idealnym miejscem wstrzyknięcia. Dodatkowo wstrzyknięcie do żyły nerkowej powodowało wyciek krwi do jamy brzusznej. Całkowita objętość nerek myszy typu dzikiego została oszacowana za pomocą rezonansu magnetycznego na około 0,2cm3, więc objętość pojedynczej nerki jest w przybliżeniu równa ilości płynu wstrzykniętego przez hydrodynamiczne wstrzyknięcie miedniczki nerkowej (100 μL)15. W niniejszym dokumencie udostępniliśmy wszystkie szczegółowe niuanse protokołu hydrodynamicznego wstrzykiwania do miednicy nerkowej w celu uzyskania powtarzalnej transfekcji nerki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUCs) Baylor College of Medicine oraz Vanderbilt University Medical Center.

1. Przygotowanie roztworu DNA do iniekcji

  1. Starannie dobierz plazmid(y) do ekspresji transgenu(ów), aby zmaksymalizować pożądane cechy zwiększające wydajność transfekcji oraz ekspresję transgenu.
    UWAGA: Wcześniej opisano hydrodynamiczną iniekcję do miednicy nerkowej plazmidów służących do ekspresji markera fluorescencyjnego TdTomato, hormonu erytropoetyny (Epo) oraz lucyferazy świetlikowej11. W przypadku braku dobrze opracowanego testu wydajności transfekcji dla danego transgenu, przeprowadź obrazowanie lucyferazy u żywego zwierzęcia, dodając 10 µg plazmidu wykazującego ekspresję lucyferazy, np. ulepszonej lucyferazy świetlikowej, do rozcieńczonego DNA przeznaczonego do iniekcji.
    1. Wybierz najmniejszy plazmid, który jest praktyczny dla danego zastosowania.
      UWAGA: Małe plazmidy zazwyczaj lepiej transfekują komórki niż plazmidy duże. Na przykład gen oporności na zeomycynę i pochodzenie replikacyjne R6K są małe, więc zastosowanie tych elementów w szkielecie plazmidu zmniejszy jego rozmiar.
    2. Zapewnij ekspresję transgenu z promotora ssaczego.
      UWAGA: Wybór promotora wpłynie na typ transfekowanych komórek nerkowych, czas trwania oraz siłę ekspresji genu. Porównanie cytomegalowirusa (CMV; konstytutywny wirusowy), czynnika elongacyjnego-1 alfa (EF-1α; konstytutywny endogenny), gamma-glutamylotransferazy (γGT; specyficznej dla kanalików) oraz podocyny (NPHS2; specyficznej dla podocytów) znajduje się w pracy Woodarda et al.11.
    3. Jeśli pożądane są wyższe poziomy długoterminowej ekspresji genu, zastosuj niewirusowy system integrujący, taki jak transpozony11,16. W badaniach z wczesnymi odczytami (mniej niż 5 dni po iniekcji) integracja transgenu nie jest konieczna.
  2. Przygotuj plazmidowe DNA do iniekcji, korzystając z komercyjnej metody, np. zestawu do maxiprepu wolnego od endotoksyn. Starannie unikaj wprowadzania endotoksyn poprzez sprzęt laboratoryjny.
    UWAGA: Obecność endotoksyn w roztworze DNA wywoła silną odpowiedź immunologiczną u zwierzęcia, co zaprzepaści eksperyment i może doprowadzić do śmierci zwierzęcia.
    1. Po zakończeniu ostatniego etapu płukania podczas izolacji DNA, upewnij się poprzez kontrolę wizualną i zapach, że nie pozostał etanol. Do usunięcia widocznych kropli użyj końcówek do nakładania żelu. Probówki zawierające osad DNA susz dnem do góry na laboratoryjnych chłonnych chusteczkach do precyzyjnych prac w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze w temperaturze 37-60 °C przy stałym monitorowaniu. Resuspenduj osad natychmiast po odparowaniu resztkowego etanolu, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu osadu.
      UWAGA: Resztkowy etanol zakłóca odczyt stężenia DNA spektrofotometrem, a jego wprowadzenie do nerki jest niepożądane.
    2. Resuspenduj osad DNA w tym samym buforze, który będzie użyty do iniekcji (bufor do dostarczania hydrodynamicznego; 100-300 µL), aby ograniczyć różnice w składzie chemicznym roztworu DNA między grupami.
      UWAGA: Nie resuspenduj osadu DNA w buforze elucyjnym dołączonym do zestawu. Środek chelatujący EDTA, powszechnie występujący w preparatach buforu „TE”, może wpływać na funkcję nerek i układu sercowo-naczyniowego. W zależności od wielkości osadu, eluuj w 100-300 µL buforu do dostarczania hydrodynamicznego, aby uzyskać wysokie stężenie. Końcowe stężenie w pełni rozcieńczonego DNA wyniesie od 100 ng/µL (dawka 10 µg/mysz) do 500 ng/µL (dawka 50 µg/mysz), zatem stężenie roztworu zapasowego DNA powinno być wyższe.
    3. W pełni resuspenduj osad DNA w buforze. Pozostaw osad w buforze do dostarczania hydrodynamicznego w oryginalnej probówce w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C przed przeniesieniem do sterylnej probówki do wirówek mikrocentryfugalnych, aby upewnić się, że DNA jest całkowicie rozpuszczone.
    4. Zmierz stężenie plazmidowego DNA spektrofotometrem lub inną uznaną metodą.
      UWAGA: Pomiary należy wykonać w duplikacie, a w razie potrzeby w dodatkowych powtórzeniach. Jeśli stosunek 260/280 jest niższy niż 1,8, preparat jest zanieczyszczony RNA lub inną substancją, należy go zatem odrzucić i ponownie przygotować DNA.
    5. Przechowuj plazmidowe DNA resuspendowane w buforze do iniekcji w temperaturze -20 °C w pudełku w zamrażarce z rozmrażaniem ręcznym, aby uniknąć degradacji DNA.
      UWAGA: Przechowywany w ten sposób preparat DNA zachowa trwałość przez wiele lat. Sprawdź integralność DNA za pomocą trawienia restrykcyjnego i elektroforezy w żelu agarozowym. DNA, które tworzy smugę w kanale, uległo degradacji i nie może być użyte, natomiast DNA tworzące wyraźne prążki o prawidłowej wielkości może być wykorzystane do iniekcji.
  3. Przygotuj rozcieńczony roztwór plazmidowego DNA do iniekcji do miednicy nerkowej.
    UWAGA: Starannie zaplanuj grupy kontrolne. W wielu badaniach uwzględnia się kontrole naiwne oraz kontrole z samą iniekcją buforu, ponieważ sama iniekcja powoduje uszkodzenia i może wpłynąć na wynik eksperymentu11.
    1. Rozmroź wolne od endotoksyn DNA eluowane w buforze do dostarczania hydrodynamicznego w temperaturze pokojowej na blacie.
    2. Oblicz ilość DNA potrzebną do iniekcji i przygotuj rozcieńczone DNA dla każdej grupy. Podawaj 10-50 µg plazmidowego DNA, doprowadzając do całkowitej objętości 100 µL za pomocą buforu do dostarczania hydrodynamicznego na mysz.
      UWAGA: Przykładowo, obliczenia dla iniekcji u 3 myszy w dawce 10 µg/mysz plazmidu DNA o stężeniu 0,5 µg/µL wyglądają następująco:
      1. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu DNA, aby mieć około 20% zapasu na napełnienie strzykawek i przestrzeń martwą w igle. Dla 3 myszy przygotuj mieszaninę z nadmiarem 3,5x. Oblicz masę DNA w µg, która powinna znajdować się w roztworze. W tym przypadku będzie to 10 µg x 3,5 = 35 µg.
      2. Oblicz całkowitą pożądaną objętość roztworu do iniekcji 100 µL na mysz. W tym przypadku będzie to 100 µL x 3,5 = 350 µL całkowitej objętości.
      3. Oblicz objętość zapasowego plazmidowego DNA, którą należy dodać do roztworu. W tym przypadku będzie to 35 µg / 0,5 µg/µL = 70 µL zapasowego plazmidowego DNA.
      4. Oblicz objętość buforu do dodania do rozcieńczonego roztworu DNA, odejmując objętość dodanego zapasowego DNA (krok 1.3.2.3) od pożądanej całkowitej objętości rozcieńczonego DNA (krok 1.3.2.2). W tym przypadku będzie to 350 µL - 70 µL = 280 µL buforu do dostarczania hydrodynamicznego.
    3. Przygotuj roztwory w sterylnych probówkach do wirówek mikrocentryfugalnych, korzystając z komercyjnie dostępnych końcówek z filtrem i stosując technikę sterylną na blacie laboratoryjnym.
      UWAGA: Roztwory DNA można przygotować i przechowywać w temperaturze pokojowej w przypadku iniekcji planowanych na ten sam dzień. Nie wstrzykuj myszom zimnego roztworu, ponieważ obniży to ich temperaturę ciała, jednak ogrzewanie roztworu nie jest konieczne.

2. Przeprowadzenie zabiegu hydrodynamicznego wstrzyknięcia do miedniczki nerkowej

  1. Starannie wybierz myszy do zabiegu.
    UWAGA: Różnic specyficznych dla szczepów jeszcze nie zaobserwowano, lecz mogą one występować. Większość iniekcji przeprowadzono na tle genetycznym C57BL/6 lub FVB. Iniekcje do miedniczki nerkowej działają najlepiej u myszy w wieku 6-12 tygodni. U myszy starszych niż 16 tygodni, z niejasnych przyczyn, możliwy jest do 50% wskaźnik niepowodzeń w obrazowaniu lucyferazowym. Taki sam zależny od wieku wskaźnik niepowodzeń zaobserwowano przy hydrodynamicznych iniekcjach dożylnych z ogona do wątroby, co może sugerować ogólne ograniczenie związane z zasadą iniekcji hydrodynamicznej. W podobnym duchu inni wykazali, że hydrodynamiczna iniekcja dożylna z ogona do zwłókniałej wątroby szczura nie jest tak skuteczna jak do zdrowej wątroby, więc możliwe jest, że w warunkach włóknienia nerek hydrodynamiczna iniekcja do miedniczki nerkowej nie będzie tak skuteczna, choć nie zostało to bezpośrednio przebadane17.
  2. Przygotuj myszy i strzykawki z DNA do zabiegu.
    1. Znieczul myszy ketaminą i ksylazyną.
      1. Załóż odpowiednie środki ochrony osobistej wymagane przezy przez zwierzęce, takie jak jednorazowy fartuch laboratoryjny, chirurgiczna maseczka i rękawiczki nitrylowe.
      2. Pracując z 2-4 myszami jednocześnie, zważ każdą mysz w plastikowym zlewce 500 mL na wadze o dokładności do 0,1 g. Oblicz właściwą ilość ketaminy 24 mg/mL i ksylazyny 2 mg/mL rozcieńczonych w normalnej soli fizjologicznej 0,9% do podania każdej myszy drogą domięśniową (patrz w odniesieniu do filmu w celu uzyskania większej liczby informacji na temat iniekcji domięśniowej)18. Zastosuj wzór (50 µL + ((5 µL) x (masa (g))), lub alternatywnie oblicz zgodnie z innym wzorem po konsultacji z lokalnym zespołem weterynaryjnym i IACUC.
      3. Wykonaj iniekcję domięśniową u myszy zgodnie ze standardowymi technikami. Umieść mysz w papierowym pojemniku, aż stanie się nieruchoma.
        UWAGA: Myszy są gotowe do zabiegu, gdy przestają reagować na test uciśnięcia palca u nogi. Myszom, które nadal reagują na test uciśnięcia palca 20-30 min po początkowej iniekcji, podaj dodatkowo 20-60 µL środka znieczulającego, w zależności od siły reakcji.
      4. Umieść mysz na podkładce grzewczej z obiegiem wody przykrytej niebieską matą i nałóż maść weterynaryjną do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
    2. Ogól lewą stronę grzbietu myszy od łopatki do krocza i od boku do kręgosłupa za pomocą maszynki przeznaczonej do pielęgnacji zwierząt. Usuń luźną sierść i zanieczyszczenia.
    3. Przygotuj osobną strzykawkę zawierającą 100 µL rozcieńczonego DNA dla każdej znieczulonej myszy, upewniając się, że nie ma w niej pęcherzyków powietrza.
      1. Użyj sterylnej strzykawki insulinowej U-100 0,5 mL 29G x ½" z na stałe przymocowaną igłą bez zabezpieczenia.
        UWAGA: Typ strzykawki ma krytyczne znaczenie. Ten rozmiar igły umożliwia szybką iniekcję. Na stałe przymocowana igła zapobiega wyciekowi roztworu. Obecność zabezpieczenia utrudni dostęp do miedniczki nerkowej. Strzykawki określone w Tabeli Materiałów ślizgają się bardziej równomiernie podczas iniekcji niż inne testowane marki.
      2. Napełnij strzykawkę do ok. 120 µL i odsuń tłok, aby stworzyć przestrzeń u góry. Opukuj ją długopisem, aż wszystkie pęcherzyki powietrza wypłyną na górę. Trzymając igłę skierowaną w górę, ostrożnie naciśnij tłok, aby usunąć całe powietrze, aż na końcówce igły pojawi się kropla. Nie powinno być obecnych żadnych widocznych pęcherzyków, ponieważ mogą one spowodować zator powietrzny, który uśmierci zwierzę.
      3. Dociśnij tłok, aż w strzykawce pozostanie 100 µL, wylewając nadmiar roztworu DNA do oryginalnej probówki do mikrowirówki. W razie potrzeby starannie oznacz strzykawki i umieść je na sterylnym obrusie, aby zachować sterylność, jeśli placówka, w której wykonywane są prace, nie zezwala na ponowne nakładanie nasadek na igły.
  3. Przeprowadź zabieg iniekcji.
    1. Przygotuj miejsce zabiegu. Połóż sterylny obrus na podkładce grzewczej i wyłóż na niego sterylne narzędzia chirurgiczne, nie dotykając ich. Podnieś mysz i umieść ją w polu widzenia. Dostosuj oświetlenie, aby doświetlić obszar.
    2. Wyjmij z opakowań trzy gaziki antyseptyczne do skóry z glukonianem chlorheksydyny 3,15% i alkoholem izopropylowym 70% i umieść je w pobliżu zwierzęcia.
    3. Załóż sterylne rękawiczki chirurgiczne. Wykonując ruchy okrężne zaczynając od miejsca nacięcia, przemyj zwierzę nowym gazikiem z chlorheksydyną/alkoholem trzy razy.
    4. Zlokalizuj miejsce nacięcia, jak pokazano na Rysunku 1A. Chwytając skórę pęsetą, użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie warstwy skóry w odległości około 1 cm od kręgosłupa i poniżej klatki piersiowej. Gdy długość nacięcia wyniesie około 1 cm, wykonaj podobne nacięcie poniżej, w warstwie mięśniowej.
      UWAGA: Wykonaj nacięcie o odpowiedniej długości, aby nerka mogła ledwo przejść przez nacięcie, a następnie zostać utrzymana na miejscu przez samo nacięcie. Zbyt małe nacięcie uniemożliwi odsłonięcie nerki; zbyt duże spowoduje, że nerka będzie nieustannie wpadać z powrotem do jamy brzusznej.
    5. Zlokalizuj nerkę.
      UWAGA: Może być ona widoczna wśród białej tkanki tłuszczowej. Śledziona również znajduje się po lewej stronie zwierzęcia. Kolor tych organów można odróżnić wizualnie, ponieważ śledziona ma ciemny bordowy kolor, podczas gdy nerka ma ciemnoczerwono-pomarańczowy kolor. Nie zaleca się manipulowania śledzioną, ponieważ może ona łatwo pęknąć.
    6. Nie dotykając nerki, delikatnie odsłoń ją z jamy brzusznej, wywierając stały, delikatny nacisk na brzuch palcami (Rysunek 2C). W razie potrzeby użyj zamkniętej pęsety, aby delikatnie odsunąć niepożądane organy z powrotem do jamy brzusznej. Nie używaj otwartej pęsety, ponieważ może to uszkodzić nerkę lub inne organy.
    7. Gdy nerka znajdzie się poza jamą brzuszną, delikatnie oddziel ją od otaczającego tłuszczu tylko tyle, aby zwizualizować miedniczkę nerkową, widoczną jako mała biała kropka (Rysunek 1B). Odsuń nadmiar tłuszczu na bok lub usuń go, jeśli jest to konieczne. Upewnij się, że nie usunąłeś nadnercza, znajdującego się w pobliżu górnego bieguna nerki, ani torebki nerkowej.
    8. Używając zamkniętej pęsety do uciskania prawej strony nerki w taki sposób, aby miedniczka nerkowa pozostała w polu widzenia, chwyć prawą ręką napełnioną strzykawkę insulinową i trzymaj ją równolegle do powierzchni roboczej z igłą skierowaną w stronę miedniczki nerkowej (Rysunek 2E). Ostrożnie wprowadź igłę do miedniczki nerkowej unieruchomionej nerki, jak pokazano na Rysunku 1B.
    9. Szybko wstrzyknij roztwór w ciągu trzech sekund. Około jednej trzeciej nerki może się przejaśnić i zmienić kolor na biały.
      UWAGA: Po iniekcji często obserwuje się gromadzenie się płynu w torebce nerkowej oraz tworzenie się krwiaka. Pewne uszkodzenia są niezbędne do osiągnięcia wystarczającego poziomu transfekcji DNA w celu detekcji.
    10. Pozostaw igłę na miejscu przez około 10 s, aby zapobiec cofaniu się roztworu. Następnie ostrożnie i powoli wyjmij igłę. Wprowadź organ z powrotem do jamy brzusznej, delikatnie rozszerzając miejsce nacięcia i używając zamkniętej pęsety.
    11. Zszyj warstwę mięśniową zwierzęcia wchłanialnymi szwami 5-0, wykonując 2-4 niezależne węzły.
    12. Zszyj warstwę skóry zwierzęcia niewchłanialnymi szwami nylonowymi 5-0 lub 6-0, wykonując 2-4 niezależne węzły.
      UWAGA: Narzędzia chirurgiczne można ponownie wykorzystać po umieszczeniu w sterylnej kąpieli z kulek i wystudzeniu.

Schemat nacięcia boku gryzonia pokazujący wstrzykiwanie strzykawką do miednicy nerkowej lewej nerki.
Rycina 1. Prawidłowe miejsce nacięcia i rozmieszczenie igły podczas hydrodynamicznych iniekcji do miednicy nerkowej. A) Nacięcie (czerwona linia) powinno znajdować się około 1 cm od kręgosłupa i około 1 cm poniżej klatki piersiowej myszy. B) Po odsłonięciu nerki poprzez nacięcie boku, miednica nerkowa powinna być widoczna jako mała, żółtawiejsza, przejrzysta/biała kropka w połowie długości nerki. Iniekcja nie powinna naruszać żyły nerkowej, tętnicy nerkowej ani moczowodu. Igłę strzykawki insulinowej wprowadza się bezpośrednio do miednicy nerkowej, jak pokazano, na głębokość około 0,5 cm i szybko wciska tłok w czasie 2-3 s. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy zabiegu chirurgicznego u gryzoni w celu ekstrakcji tkanek, z użyciem narzędzi chirurgicznych, seria zdjęć z opisami.
Rysunek 2. Kroki chirurgiczne niezbędne do wykonania hydrodynamicznej iniekcji plazmidowego DNA do miednicy nerkowej. A) Pinceta zaciska skórę, umożliwiając chirurgowi wykonanie skalpelem nacięcia boku o długości ~1 cm, najpierw przez warstwę skóry, a następnie przez warstwę mięśniową. B) Przy użyciu dwóch par zamkniętych pęset do rozszerzenia rany operacyjnej, jeśli to możliwe, wizualizuje się nerkę w jamie brzusznej. C) Poprzez delikatny ucisk brzucha, bez bezpośredniego dotykania narządów, nerka zostaje odsłonięta przez nacięcie boku. D) Tkanka tłuszczowa jest delikatnie oddzielana od nerki, przy jak najmniejszym jej naruszaniu, aby uzyskać dostęp do miednicy nerkowej. E) Naciskając prawą stronę lewej nerki w celu lepszej wizualizacji miednicy nerkowej, strzykawkę trzyma się kciukiem na tłoku, a igłę ostrożnie, lecz pewnie wprowadza do miednicy nerkowej. F) Po iniekcji trwającej <3 s, w obszarach nerki, które przyjęły główną część wstrzykniętego roztworu, można zaobserwować przejaśnienia. G) Do wykonania 2-4 niezależnych węzłów w warstwie mięśniowej stosuje się sterylne fioletowe wchłanialne szwy vicryl. H) Do wykonania 2-4 niezależnych węzłów w warstwie skóry stosuje się sterylne niebieskie niewchłanialne szwy nylonowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Rekonwalescencja po zabiegu i monitorowanie pooperacyjne.
    1. Podawać myszom leki przeciwbólowe zgodnie z wymogami instytucjonalnej komisji IACUC dotyczącymi kontroli bólu. Na przykład, podawać buprenorfinę w zastrzyku podskórnym co 8-12 h przez 48 h po operacji, jeśli w badaniu należy uniknąć uszkodzeń nerek związanych z podaniem NLPZ.
    2. Utrzymywać myszy na podkładce grzewczej pod opieką badacza do czasu odzyskania pełnej sprawności ruchowej i zdolności do utrzymania pozycji na mostku. Po całkowitym wybudzeniu przenieść myszy do czystej klatki zawierającej niewielką ilość ściółki z ich klatki macierzystej w celu redukcji stresu. Nie umieszczać myszy operowanych razem z myszami naiwnymi.
      UWAGA: Stan myszy poprawi się szybko, a normalne zachowanie powinno powrócić w ciągu 24-48 h.
    3. Podawać sól fizjologiczną i zwiększyć dawkę leków przeciwbólowych myszom, które wydają się być zestresowane, aby poprawić ich stan. Jeśli myszy nie wracają szybko do zdrowia, zmierzyć masę ciała myszy i uśmiercić te, które straciły więcej niż 20% początkowej masy ciała. Uśmiercić myszy wykazujące objawy mocznicy lub będące w stanie agonalnym. Możliwe problemy zdrowotne szczegółowo opisano w Tabeli 1.
      UWAGA: Myszy czasami usuwają zewnętrzne szwy lub szwy luzują się przed zamknięciem rany. Niewłaściwe zaszycie warstwy mięśniowej przy nienaruszonej warstwie skóry może prowadzić do powstania przepukliny w miejscu nacięcia, objawiającej się uwypukleniem. W takich przypadkach poddać mysz znieczuleniu (izofluran działa szybciej niż ketamina/ksylazyna) i jak najszybciej naprawić miejsce operacyjne nowymi szwami. Jeśli nieabsorbowalne szwy skórne pozostają po 10-14 dniach, należy je usunąć. Sporadycznie myszy mogą usuwać szwy współlokatorom z klatki lub walczyć. Po zidentyfikowaniu takich zachowań niezwłocznie przenieść agresywne myszy do osobnych klatek z wyposażeniem wzbogacającym, aby zapobiec raniącym innym myszom zachowaniom.
    4. Po osiągnięciu punktów końcowych zdrowotnych lub eksperymentalnych uśmiercić myszy poprzez inhalację dwutlenku węgla lub przedawkowanie izofluranu, a następnie zastosować wtórną metodę eutanazji, taką jak zwichnięcie szyi, zgodnie z obowiązującą w instytucji standardową procedurą operacyjną (SOP) dotyczącą eutanazji
PrzyczynaPoczątekLiczba dotkniętych myszyObjawyDziałanie natychmiastoweRozwiązanie długofalowe
Zanieczyszczenie DNA endotoksynami6-40 h po iniekcji.Prawdopodobnie każda mysz, której podano zanieczyszczony preparat DNA.Problemy z oddychaniem, oznaki silnego bólu, niewydolność narządowa, śmierć.Eutanazja dotkniętych myszy. Testowanie każdego wstrzykiwanego komponentu na obecność endotoksyn przy użyciu testu LAL (Limulus Amebocyte Lysate).Stosowanie zestawów do maxiprepu wolnych od endotoksyn oraz wyłącznie sterylnego i nowego sprzętu laboratoryjnego lub takiego, który był traktowany NaOH. Używanie zakupionego komercyjnie, przetestowanego pod kątem endotoksyn buforu do rozcieńczania DNA.
Przedawkowanie znieczuleniaW trakcie operacji, przed lub po iniekcji DNA.Może dotyczyć tylko młodszych, mniejszych lub chudszych myszy.Zatrzymanie oddechu podczas przebywania na podgrzewaczu, oddawanie moczu.Zmniejszenie dawki znieczulenia dla pozostałych myszy.Ponowna weryfikacja przygotowania i protokołu pod kątem dokładności dawkowania. Wykluczenie osobników niedorozwiniętych („runts”). Konsultacja z weterynarzem, jeśli zastosowano odpowiednią dawkę.
Pęcherzyk powietrza w strzykawce lub igle użytej do iniekcjiBezpośrednio po iniekcji do miedniczki nerkowej.Chyba że wszystkie strzykawki zostały napełnione niedbale, dotyczy to tylko jednej myszy.Łapanie powietrza.Sprawdzenie pozostałych strzykawek pod kątem obecności pęcherzyków powietrza.Staranne przygotowanie strzykawek, opukiwanie strzykawki w celu usunięcia pęcherzyków z dna. Poprawa oświetlenia w celu lepszej wizualizacji pęcherzyków.
Rozszerzenie miejsca operacyjnego12-72 h po iniekcjiJedna lub więcej myszy. Czasami cała klatka.Ziejąca rana, zazwyczaj brak innych objawów dyskomfortuPowtórne zaszycie w celu starannego zamknięcia rany pod znieczuleniem izofluranem z zachowaniem techniki sterylnej. Może być wymagane przemycie solą fizjologiczną lub usunięcie brzegów rany nożyczkami.Jeśli u wszystkich myszy szwy są bardzo krótkie lub brakujące, może to oznaczać, że jedna mysz je usuwa, w związku z czym należy rozdzielić zwierzęta. Poprawa techniki szycia. Stosowanie niezależnych węzłów.
Przepuklina w miejscu operacyjnym48+ h po iniekcjiJedna lub więcej myszy.Widoczne uwypuklenie w miejscu operacyjnym.Pod znieczuleniem izofluranem i z zachowaniem techniki sterylnej nacięcie zagojonej skóry w celu odsłonięcia przepukliny warstwy mięśniowej. Przywrócenie narządów do otrzewnej, zszycie warstwy mięśniowej szwami wchłanialnymi i zamknięcie miejsca operacyjnego.Świadczy to o niewłaściwym zszyciu warstwy mięśniowej. Poprawa techniki szycia. Stosowanie niezależnych węzłów.
Niewydolność nerek48+ h po iniekcjiJedna lub więcej myszy.Utrata masy ciała >20%, możliwość wystąpienia stanu mocznicowego, zgarbiona postawaPodawanie soli fizjologicznej oraz zwiększenie lub przedłużenie analgezji. Jeśli nie zaobserwowano poprawy, należy poświęcić dotknięte myszy.Zmiana stanu chorobowego zwierzęcia w celu zmniejszenia jego nasilenia. Zmiana transgenu na słabszy lub indukowalny. Wykonanie iniekcji u myszy na wcześniejszym etapie progresji choroby.
Ropień lub infekcjaOd kilku dni do kilku tygodni po operacjiJedna lub więcej myszy.Wyczuwalny ropień lub oznaki sepsyEutanazja dotkniętych myszy. Zlecenie sekcji zwłok w celu potwierdzenia podejrzenia infekcji.Może to wystąpić, gdy warunki chirurgiczne i iniekcje nie są wystarczająco sterylne. Przedstawiona procedura dotyczy myszy z prawidłowym układem odpornościowym, jednak należy zachować dodatkowe środki ostrożności w przypadku zwierząt z immunosupresją, np. leczonych cyklofosfamidą.

Tabela 1. Tabela potencjalnych problemów zdrowotnych występujących podczas protokołu iniekcji do miedniczki nerkowej. Chociaż wymienione problemy zdrowotne nie są częste, w trakcie procedury może dojść do szeregu błędów popełnionych przez badacza. Niniejsza tabela może pomóc w zapobieganiu i diagnozowaniu problemów zdrowotnych, a także we wdrażaniu potencjalnych środków zaradczych, aby zapobiec wystąpieniu takich problemów w przyszłości. Wraz z nabytą praktyką badacze powinni spodziewać się rzadkiego występowania problemów zdrowotnych oraz śmiertelności wynikającej z procedury.

3. Ocena wydajności wstrzykiwania i efektów transgenu

  1. Użyj dobrze opracowanego testu dla pożądanego transgenu, aby ocenić wydajność transfekcji. Stosuj ostrożnie kontrole pozytywne i negatywne, aby upewnić się, że test jest swoisty.
    UWAGA: W zależności od wyboru promotora, myszy będą prawdopodobnie wykazywać najsilniejszą ekspresję transgenu w 1. dniu; zawsze w ciągu pierwszego tygodnia po wstrzyknięciu.
  2. Przeprowadź obrazowanie lucyferazy in vivo, dodając 10 µg plazmidu wykazującego ekspresję lucyferazy, np. ulepszonej lucyferazy świetlika, do rozcieńczonego DNA przeznaczonego do wstrzyknięcia.
    1. Wyczyść wszystkie powierzchnie narażone na kontakt z myszami. Umieść pierwszą klatkę z myszami w komorze i szczelnie ją zamknij. Sprawdzając wskaźnik, upewnij się, że w urządzeniu znajduje się wystarczająca ilość izofluranu; jeśli nie, dolej izofluranu, aż poziom osiągnie linię „max”. Rozpocznij przepływ izofluranu, obracając pokrętło izofluranu na 3,5, a tlenu na 2.
    2. Wstrzyknij każdej myszy drogą dosytnieniową 100 µL rozmrożonej lucyferyny o stężeniu 30 mg/mL. Zapisz godzinę.
    3. Otwórz oprogramowanie do sterowania urządzeniem obrazującym, klikając pomarańczowo-żółtą ikonę myszy. W sekcji „Select/Add User ID” wybierz odpowiednie inicjały z menu rozwijanego obok „User ID”. Kliknij „OK”. Na górnym pasku menu kliknij „Acquisition” i wybierz z menu rozwijanego opcję „Autosave To…”. Wybierz folder lub utwórz nowy folder do zapisywania danych.
    4. Przejdź do okna akwizycji obrazu w prawym dolnym rogu. Sprawdź, czy ustawienia automatyczne są następujące: Binning – medium; F/Stop – 1 dla luminescencji, 8 dla fotografii; Emission Filter – open; Imaging Mode – zaznaczone tylko Luminescent, Photograph, Overlay i Alignment. Kliknij „initialize”, aby zainicjować system i poczekaj na zakończenie inicjalizacji, a następnie zmień „Field of View” na „E”, aby obrazować pięć myszy.
    5. Obróć zawór przewodów anestezjologicznych tak, aby maski wewnątrz urządzenia podawały izofluran. Umieść zwierzęta w urządzeniu obrazującym w pożądanej kolejności na brzuchach, grzbietami skierowanymi do kamery znajdującej się powyżej, aby zwizualizować nerkę. Jeśli obrazowaniu podlegają więcej niż jedna klatka, umieść kolejną klatkę w komorze z izofluranem.
    6. Od 5 do 10 min po wstrzyknięciu lucyferyny naciśnij „Acquire”, aby wykonać zdjęcie.
    7. W „Tool Palette” po prawej stronie kliknij „Image Adjust”. W sekcji „Color Scale” zmniejszaj suwak „Min”, aż ekspresja będzie widoczna u wszystkich spodziewanych myszy, wizualizowana jako kolor fioletowy nad każdą nerką myszy. Jeśli u niektórych myszy ekspresja nie jest widoczna, ponownie wstrzyknij im 100 µL lucyferyny i odczekaj co najmniej 3 min przed ponownym wykonaniem zdjęcia.
      1. Jeśli obraz zawiera nasycone piksele, zmniejsz czas ekspozycji i wykonaj zdjęcie ponownie, aby uzyskać obraz ilościowy, ponieważ obecność nasyconych pikseli doprowadzi do niedoszacowania wydajności transfekcji. Najkrótszy możliwy czas ekspozycji to 0,5 s.
      2. Jeśli przy pierwszym czasie ekspozycji obraz wykazuje jedynie słabą ekspresję genu, zwiększ czas ekspozycji do 2 min i wykonaj zdjęcie ponownie. Przy każdym powtórzeniu zdjęcia dane są automatycznie zapisywane w wybranym folderze, dzięki czemu wszystkie obrazy są dostępne do późniejszej analizy.
    8. Powtórz kroki obrazowania dla kolejnych klatek myszy.
    9. Wyjmij myszy z urządzenia obrazującego. Wyłącz gaz. Wyczyść komorę, maski i stół obrazujący. Zamknij program komputerowy.
      UWAGA: Oprogramowanie poprosi o „Save Dataset”. Odnosi się to do manipulacji wykonanych na zbiorze danych, a nie do samych danych.
      1. Kliknij „Yes”, aby zapisać zmiany w skali i obszarach zainteresowania (ROI). Kliknij „No”, aby powrócić do oryginalnych ustawień obrazów.
    10. Aby przeprowadzić analizę danych, otwórz oprogramowanie. W „Tool Palette” kliknij „ROI Tools”. Kliknij ikonę koła i wybierz „1” z menu rozwijanego, aby umieścić nowy ROI w oknie obrazu, co zostanie oznaczone czerwonym owalem z czterema kwadratami wokół niego. Dostosuj rozmiar ROI, umieszczając kursor myszy nad czerwonym kwadratem i przeciągając go tak, aby objął fioletowy obszar nakładający się na wstrzykniętą nerkę.
      1. Mając kursor nad czerwonym kwadratem ROI, kliknij prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierz „Duplicate ROI”, aby utworzyć nowy ROI w oknie obrazu i przesuń go na kolejną mysz. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie myszy na obrazie będą miały ROI nad wstrzykniętą nerką.
      2. W menu bezpośrednio nad obrazem zmień „Units” z „Counts” na „Radiance (Photons)”. Aby wyeksportować dane ROI, w „Tool Palette” kliknij „ROI Tools”, a następnie kliknij ikonę ołówka/linijki, aby utworzyć arkusz pomiarów. W dalszej analizie w wybranym programie do analizy danych i statystyki użyj pomiaru „Avg Radiance”.
  3. Przeprowadź barwienie przekrojów zgodnie z opisem11.
    UWAGA: Wstrzyknięcie nie transfekuje całej nerki równomiernie, więc różne przekroje wykażą różną wydajność transfekcji11. Współwstrzyknięcie kulek, takich jak fluorescencyjne lateksowe mikrosfery, może pomóc w zidentyfikowaniu obszarów, które powinny być pozytywne pod kątem transgenu (Rycina 3D)11. Optymalizacja protokołu barwienia jest niezwykle ważna.
  4. Przeprowadź analizę Western blot, aby zidentyfikować badany gen w transfekowanej nerce.
    UWAGA: Pobieranie organów do ekstraktów białkowych musi odbywać się w lodzie. Ponownie, nie należy używać małego wycinka organu, ponieważ ten obszar mógł nie zostać odpowiednio transfekowany. Transfekcja jest nierównomiernie rozłożona w całym organie, dlatego należy połączyć różne obszary w jedną próbkę. Hydrodynamiczne wstrzyknięcie plazmidu produkującego hormon erytropoetynę do miednicy nerkowej spowodowało umiarkowany wzrost hematokrytu, zatem oczekuje się, że wydzielone produkty transgenu powinny znajdować się w krążeniu11.
  5. W celu uzyskania długotrwałej, wysokiej ekspresji transgenów, połącz system wektora integrującego ze środkami immunosupresyjnymi, takimi jak cyklofosfamid. Odpowiedź immunologiczna na transgen występuje w ciągu pierwszych kilku tygodni po wstrzyknięciu i jest silna11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technika operacyjna i iniekcyjna są proste w wykonaniu po opanowaniu metody i nie wymagają zaawansowanego sprzętu ani kosztownych materiałów. Osoby rozpoczynające pracę z chirurgią nerek metodą nacięcia bocznego powinny zaplanować jeden dzień treningowy na kilku myszach przeznaczonych do eutanazji, przy czym zwierzęta te nie powinny być wybudzane po operacji, ponieważ pierwsza próba może zająć znacznie więcej czasu niż zwykle. Z kolei badacze zaznajomieni z podobnymi technikami mogą uznać...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole tym opisano solidną metodę osiągania powtarzalnej ekspresji genów specyficznie w nerkach. W rękach umiarkowanie doświadczonego chirurga stwierdziliśmy, że odsetek myszy transfekowanych tą techniką mieści się w zakresie 50-100%, w zależności od wieku myszy i czułości odczytu transgenu. Poziom ekspresji genu lucyferazy utrzymywał się powyżej tła przez kilka miesięcy u myszy otrzymujących transpozony piggyBac i całkowicie utrzymywał się przez kilka tygodni u myszy z obniżoną odpornością otrzymujących te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Nagroda za rozwój kariery od Departamentu ds. Weteranów [BX002797] wspierana przez L.E.W. oraz National Institutes of Health [R01-DK095867] i American Heart Association [15GRNT25700209] wspierały J.C. National Institutes of Health [DK093660], Departament ds. Weteranów [BX002190] i Vanderbilt Center for Kidney Disease wspierały M.H.W. Materiał ten jest wynikiem pracy wspieranej zasobami i wykorzystaniem obiektów w systemie opieki zdrowotnej VA Tennessee Valley.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AnaSed XylazinePatterson Veterinary07-808-1947Znieczulenie - Substancja niekontrolowana
Strzykawka insulinowa BD 0,5 ml 29G 1/2 calaCardinal Health309306Wymagane strzykawki
BuprenexFarmaceuta / weterynarzAnalgezja - substancja kontrolowana
Jednorazowa serweta na ręczniki DynarexThermo Fisher Scientific19-310-671Umieść na poduszce grzewczej
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Używaj tylko plazmidu DNA wolnego od endotoksyn
Endosafe Gel-Clot LAL Szybka kontrola pozytywnaCharles RiverPC200Kontrola pozytywna do testu endotoksyn
Endosafe Gel-Clot LAL Szybka pojedyncza fiolka testowaCharles RiverR13500Test endotoksyn
Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjneRoboz Surgical InstrumentRS-5882Narzędzie chirurgiczne
Fisherbrand Instant Sealing Worek do sterylizacji - 9 "Thermo Fisher Scientific01-812-51Do autoklawowania narzędzi chirurgicznych
Pompa ciepła GaymarParagon MedicalTP-700ciepła z obiegiem wody
Germinator 500Roboz Instrument chirurgicznyDS-401Do ponownego użycia narzędzi chirurgicznych podczas operacji
Graefe KleszczeInstrument chirurgiczny RobozRS-5136Narzędzie chirurgiczne
Graefe Kleszczedo tkanek Roboz Instrument chirurgicznyRS-5153Narzędzie chirurgiczne
Uchwyt igły Halsey,instrument chirurgiczny RobozRS-7841Poduszki
grzewcze - 15 "x 21" - potrzebujesz co najmniej 3Paragon MedicalTP22GDo użytku z pompą
ciepła GaymarIsoFlo (Isoflurane, USP)Abbott Animal Health5260-04-05Do obrazowania i eutanazji
System dostarczania izofluranu Isotec WaporyzorSmiths MedicalVCT3K2Do obrazowania i eutanazji
KetaminaFarmaceuta/WeterynarzZnieczulenie - Substancja kontrolowana
KimwipesKimberly-Clark Professional34120Tkanki laboratoryjne
Oprogramowanie Living ImageCaliper Nauki przyrodniczeDo obrazowania żywych zwierząt
LucyferynaPerkin Elmer122796Do obrazowania żywych zwierząt
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000-US-CANSpektrofotometr do pomiaru DNA
Waciki PrevanticsThermo Fisher Scientific23-100-110Do przygotowania chirurgii skóry
Szwy Prolene 5-0 Stożek 30"Thermo Fisher ScientificNC0256891Niewchłanialne szwy do skóry
Maść okulistyczna marki PuralubePatterson Veterinary07-888-2572Aby utrzymać wilgotność oczu podczas operacji
Trans IT - QR Hydrodynamiczne rozwiązanie do dostarczaniaMirus BioMIR-5240Hydrodynamiczny bufor dostarczający do rozcieńczania DNA
Vicryl 5-0 Szwy J303HThermo Fisher ScientificNC9816710Wchłanialne szwy do warstwy mięśniowej
Wahl Mini Arco ClipperMed-Vet International8787-1550Golarka do przygotowania skóry
Xenogen IVIS 200Caliper Nauki przyrodniczeDo obrazowania żywych zwierząt
Pompa o długości 5 cali Narzędzie chirurgiczne

Bibliografia

  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
  3. Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).
  4. Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
  5. Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
  6. Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
  7. Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
  8. Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
  9. Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
  10. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
  11. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  12. Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
  13. Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
  14. Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
  15. Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
  16. Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
  17. Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
  18. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
  19. Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
  20. Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
  21. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wstrzykiwanie hydrodynamicznetransfekcja nerekplazmidowe DNAobrazowanie ywych zwierz tWestern blotimmunohistochemianaci cie bokuprocedura chirurgicznaekspresja gen w
Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.