Artykuł metodologiczny

Generowanie modeli komórkowych raka gruczołu krokowego oporności na lek antymitotyczny docetaksel

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56327

⸱

8 września 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Oncological Sciences, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

Oporność na terapie przeciwnowotworowe przyczynia się do postępu choroby i śmierci. Określenie mechanistycznych podstaw oporności ma kluczowe znaczenie dla poprawy odpowiedzi terapeutycznej. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje protokół generowania opornych na taksany modeli komórkowych raka gruczołu krokowego (PC), aby pomóc w analizie szlaków zaangażowanych w progresję do oporności na docetaksel u pacjentów z PC.

Streszczenie

Środki celujące w mikrotubule (MTA) są podstawą w leczeniu szerokiego zakresu nowotworów. Jednak nabyta oporność na chemioterapeutyki jest częstym mechanizmem progresji choroby i cechą prognostyczno-determinacyjną nowotworów złośliwych. W przypadku raka gruczołu krokowego (PC) oporność na MTA, takie jak taksan docetaksel, decyduje o niepowodzeniu leczenia, a także o progresji do śmiertelnych stadiów choroby, które charakteryzują się złym rokowaniem i wysoką śmiertelnością. Chociaż badania prowadzone są od dziesięcioleci, szereg mechanizmów przyczyniających się do nabytej oporności nie jest w pełni poznany, a tym samym stanowi istotne ograniczenie w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych, które mogłyby przynieść korzyści pacjentom w tych zaawansowanych stadiach choroby. W tym protokole opisujemy wytwarzanie linii komórkowych raka prostaty opornych na docetaksel, które naśladują śmiertelne cechy raka prostaty w późnym stadium, a zatem mogą być wykorzystane do badania mechanizmów powstawania nabytej chemooporności. Pomimo potencjalnych ograniczeń nieodłącznie związanych z modelem komórkowym, takich jak utrata właściwości oporności w czasie, linie komórkowe oporne na docetaksel wytworzone tą metodą zostały z powodzeniem wykorzystane w ostatnich badaniach i oferują możliwość pogłębienia naszej wiedzy molekularnej na temat nabytej chemooporności w śmiertelnym raku gruczołu krokowego.

Wprowadzenie

Zwiększone tempo proliferacji spowodowane utratą kontroli nad cyklem komórkowym jest cechą charakterystyczną raka1. Ta właściwość funkcjonalna sprawia, że komórki rakowe są wyjątkowo zależne od wierności kluczowych procesów cyklu komórkowego podczas faz S i M, co doprowadziło do opracowania różnych leków zaburzających cykl komórkowy, które indukują uszkodzenia DNA lub defekty mitotyczne. Chociaż liczne środki antymitotyczne, takie jak inhibitory kinaz mitotycznych lub białka motoryczne, są obecnie opracowywane i testowane w badaniach klinicznych, starsze środki ukierunkowane na mikrotubule (MTA) nadal są jedynym klinicznie zatwierdzonym podejściem do celowania w mitozę w raku2,3,4. MTA albo destabilizują (Winblastyna, Winkrystyna, Winorelbina), albo stabilizują (leki pochodzące z taksanów paklitaksel, docetaksel lub kabazytaksel) mikrotubule i w ten sposób zapobiegają tworzeniu się działającego wrzeciona mitotycznego5,6. Czynniki te wywołują punkt kontrolny montażu wrzeciona7,8, co powoduje przedłużone zatrzymanie mitozy i ostateczną śmierć komórki w hodowanych komórkach9,10 i defekty mitotyczne w nowotworach11,12 i dlatego są przydatne w leczeniu wielu różnych nowotworów, w tym raka prostaty13.

Rak prostaty jest najczęściej diagnozowanym nowotworem i główną przyczyną zgonów związanych z rakiem u mężczyzn14. Leki antymitotyczne, takie jak docetaksel, poprawiają przeżywalność pacjentów z rakiem prostaty i są podstawą leczenia tej choroby15,16,17. Niestety, pomimo początkowego kurczenia się guza, komórki nowotworowe często rozwijają oporność na leki podczas leczenia. Kilka mechanizmów komórkowych jest zaangażowanych w powodowanie rozwoju chemooporności, w tym deregulacja szlaków apoptotycznych i zapalnych lub aktywacja/nadekspresja pomp wypływu leków, takich jak transporter kasetowy wiążący ATP P-glikoproteina (P-gp/ABCB1), z których ten ostatni powoduje eksport chemioterapeutyków z komórek18,19. Oporność na taksany została również powiązana z innymi przyczynami, takimi jak zmiany w ekspresji izotypów tubuliny lub mutacje tubuliny, które uniemożliwiają interakcję między lekiem a jego celem 20,21. Ponadto oporność jest związana z akumulacją niestabilności genomu i niejednorodnością guza22,23. Jednak mechanizmy przyczyniające się do oporności na taksany nie są do końca poznane, co widać po braku strategii terapeutycznych, które zapobiegają jej pojawieniu się. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia modeli eksperymentalnych, które pomogą w rozłożeniu tych mechanizmów i zidentyfikowania nowych podejść terapeutycznych, które zapobiegną rozwojowi oporności na te leki.

W tym artykule opisujemy metodę, która pozwala na generowanie komórek raka prostaty opornych na docetaksel (DR). Opiszemy dalej, jak zweryfikować stan oporności tych komórek za pomocą testów tworzenia kolonii i ilościowego RT-PCR. Komórki wytworzone tą metodą mają tę zaletę, że rekapitulują wiele cech molekularnych znalezionych w publicznie dostępnych bazach danych próbek ludzkich nowotworów, z dodatkową korzyścią polegającą na zapewnieniu wszechstronności w wykonywaniu szerokiej gamy testów eksperymentalnych przez dłuższy czas niż pozwala na to próbki guza. Te modele oporności na terapię mogą być rozwijane przez wiele tygodni w hodowli tkankowej, a między innymi mogą być manipulowane genetycznie, wizualizowane za pomocą metod mikroskopowych i analizowane pod kątem ekspresji genów. Co więcej, można je ksenotrasować myszom w celu dalszej analizy wpływu na powstawanie i wzrost guza in vivo. Obecnie główną alternatywną metodą badania lekooporności w kontekście raka gruczołu krokowego jest bezpośrednia analiza próbek guza. Chociaż próbki te stanowią bardzo silny system gromadzenia informacji o ekspresji genów i statusie mutacji danych nowotworów, dostęp do nich może być bardzo ograniczony i trudno jest je utrzymać w celu dalszych manipulacji i analiz eksperymentalnych, które można łatwo wykonać za pomocą linii komórkowych wygenerowanych za pomocą tego protokołu24,25. Co ważne, w przyszłości alternatywne podejścia, takie jak generowanie organoidów pochodzenia ludzkiego bezpośrednio od pacjentów, byłyby bardzo potężnym narzędziem i alternatywą dla obecnej metody26,27. Ponieważ będą one podsumowywać w kontekście 3D, czym był guz w swoim pierwotnym środowisku, organoidy będą idealnym modelem między liniami komórkowymi a ludzkimi nowotworami. Jednak eksperymentalne modele komórek opisane w tym protokole są nadal tańsze w utrzymaniu i nadają się do szybszej analizy. Wyniki uzyskane w wyniku badania tych linii komórkowych można ekstrapolować i potwierdzać w próbkach ludzkich i kulturach 3D. Dlatego protokół ten może być interesujący dla badaczy poszukujących modeli komórkowych do badania mechanizmów chemooporności w dowolnej linii komórkowej, ponieważ nasz protokół można dostosować do badania innych leków i typów raka. Opisane tutaj metody są łatwe do zastosowania w każdym laboratorium, niedrogie i pozwalają na wstępne badania molekularnych i komórkowych mechanizmów oporności na leki.

Protokół

1. Określenie stężenia docetakselu powodującego 50% spadek zdolności do tworzenia kolonii (IC50)

UWAGA: W tym protokole, stężenie Docetaxel IC50 zostało ocenione na podstawie zdolności do tworzenia kolonii. Alternatywne metody stosowane do oceny żywotności komórek (tj. testy MTS) mogą być stosowane w oparciu o preferencje badaczy.

  1. Hodować komórki DU145 lub 22Rv1 w kolbie o średnicy 75cm2 i przygotować wystarczającą ilość 10 mM docetakselu rozcieńczonego w DMSO, aby można je było wykorzystać w przyszłych eksperymentach.
  2. W celu pokrycia komórek w celu oznaczenia IC50 docetakselu, usunąć pożywkę z kolby, ostrożnie przemyć komórki 5 ml PBS i inkubować z 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w celu oderwania komórek od powierzchni kolby.
  3. Wypłukać trypsynizowane komórki z kolby za pomocą 5 ml świeżej pożywki i zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Komórki osadu przez odwirowanie (300 x g, 3 min, temperatura pokojowa (RT)).
  4. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml świeżej pożywki i policzyć komórki. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 2-2,5 x 105 komórek/ml dla DU145 i 4-4,5 x 105 komórek/ml dla 22Rv1, dobrze wymieszać pipetując w górę iw dół i zasiać 2 ml zawiesiny w każdym dołku dwóch płytek 6-dołkowych.
  5. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną 70-80 % zbieżności, dodać do każdej studzienki zwiększające dawkę stężenia docetakselu 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM i 1000 nM. Dobrze potraktuj kontrolę DMSO przy najwyższej objętości używanej dla docetakselu (Rysunek 2A).
  6. Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać 2 ml świeżej pożywki. W ciągu około 4-5 dni płytki będą gotowe do barwienia.
  7. Aby zabarwić kolonie, należy je delikatnie przemyć 2-3 ml PBS i inkubować w 2-3 ml roztworu fioletu krystalicznego (0,1% w/v w 10% formalinie) przez 20 minut w kapturze do hodowli tkankowej lub okapie oparowym.
  8. Usunąć roztwór barwiący i umyć płytki 2-3 mlH2O, usunąćH2Oi wysuszyć płytki na powietrzu.
  9. Przeanalizuj wyniki, wizualizując studzienki, aby określić, który z nich ma stężenie docetakselu, które zmniejsza żywotność komórek o 50% (IC50). Ręcznie policz kolonie za pomocą markera (aby uniknąć dwukrotnego liczenia tych samych kolonii) i przedstaw procent żywotności komórek na wykresie (Rysunek 2A). Na koniec zrób cyfrowe zdjęcia płyt w celu przedstawienia figury (jak pokazano na Rysunek 3A).

2. Wytwarzanie komórek raka prostaty opornych na docetaksel

UWAGA: Przeprowadź leczenie komórkami przy użyciu tego samego roztworu Docetaxel, który jest używany do oznaczania stężenia leku IC50 (przygotuj wystarczająco dużo zapasu wcześniej do użytku eksperymentalnego). Zawsze miej małą kolbę z komórkami z poprzedniego kroku, na wypadek, gdyby coś nie działało dobrze. Komórki rodzicielskie powinny być hodowane równolegle w małej kolbie przez cały czas trwania procedury i poddawane działaniu nośnika (DMSO) w odpowiednich objętościach, naśladując ilości użyte w kolbach poddanych działaniu docetakselu.

  1. Płytka: komórki DU145 lub 22Rv1 w 150 cm,2 kolby zawierające 20 ml pożywki (3,5 x 10,6 komórek na kolbę dla DU145 i 6,5*10;6 komórek na kolbę dla 22Rv1). Zaleca się użycie od 10 do 20 kolb komórek, aby mieć wystarczającą liczbę komórek na końcu protokołu.
  2. Po 24 godzinach, gdy komórki są w około 70-80% zbieżności (Rysunek 2B, przed docetakselem), dodaj Docetaksel w stężeniu IC50 określonym w kroku 1 protokołu (5 nM dla komórek opisanych w tym protokole).
  3. Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać świeżą, wolną od docetakselu pożywkę (Rycina 2B, 72 godziny po docetakselu). Zmieniaj nośnik co 3-4 dni. W ciągu około 1-2 tygodni oporne klony pojawią się widoczne pod mikroskopem (Ryc. 2B, 7 i 14 dni po docetakselu).
  4. Odessać pożywkę, ostrożnie przemyć komórki 15 ml PBS i inkubować z 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w celu oderwania komórek od powierzchni kolby.
  5. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w kolbie, używając 8 ml świeżej pożywki. Pula komórek ze wszystkich kolb poddanych działaniu środka . Komórki osadu przez odwirowanie (300 x g, 3 min, RT).
  6. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 20 ml świeżej pożywki i umieścić komórki w2 kolbach o długości 150 cm (3,5 x 106 komórek na kolbę dla DU145 i 6,5*106 komórek na kolbę dla 22Rv1).
  7. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną około 70-80% zbieżności, ponownie dodaj 5 nM Docetakselu (początkowe stężenie IC50).
  8. Powtórz kroki od 2.3 do 2.6 w dniu 3.
  9. Po 24 godzinach, gdy komórki są w około 70-80% zbieżności, potraktuj komórki 2X stężeniem docetakselu IC50 (10 nM dla komórek opisanych w tym protokole).
  10. Powtórzyć kroki od 2.3 do 2.8 po zwiększeniu dawki stężenia docetakselu (25 nM, 50 nM, 100 nM i 250 nM), aby wytworzyć stabilną populację komórek rosnących w kolbach przy końcowym najwyższym stężeniu. W przypadku wyższych stężeń protokół eskalacji dawki może być wdrożony na okres do 6 miesięcy, aż do osiągnięcia stężenia 1,000 nM (Rysunek 1A).

3. Charakterystyka funkcjonalna nabytej odporności na docetaksel za pomocą testu tworzenia kolonii

UWAGA: W tym protokole, chemooporność została oceniona za pomocą testów tworzenia kolonii. Alternatywne metody stosowane do oceny żywotności komórek (tj. testy MTS) mogą być stosowane w oparciu o preferencje badaczy.

  1. Umieść 2,000 komórek (DU145 lub 22Rv1, zarówno rodzicielskich, jak i opornych na docetaksel) na dołku na płytkach 6-dołkowych, używając 2 ml pożywki na studzienkę.
  2. Po 24 godzinach dodać zwiększające się stężenia docetakselu (komórki rodzicielskie: 0,25, 0,5, 1, 2,5 i 5 nM; Ogniwa DR: 50, 125, 250, 500 i 1 000 nM). Dla obu linii komórkowych DU145 i 22Rv1. Dodać DMSO tylko do jednego dołka jako kontrolnego o tej samej objętości, co dla najwyższej dawki docetakselu.
  3. Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać świeżą pożywkę wolną od docetakselu.
  4. Inkubuj płytki przez 1-2 tygodnie, aż kolonie będą widoczne pod mikroskopem.
  5. Aby zabarwić kolonie, umyj je delikatnie 2-3 ml PBS i inkubuj z 2-3 ml roztworu fioletu krystalicznego (0,1% w/v w 10% formalinie) przez 20 minut w kapturze do hodowli tkankowej lub okapie oparowym.
  6. Usunąć roztwór barwiący i umyć płytki 2-3 mlH2O, usunąćH2Oi wysuszyć płytki na powietrzu.
  7. Analizuj wynik, wizualizując dołki i ręcznie licząc kolonie za pomocą markera (aby uniknąć dwukrotnego liczenia tych samych kolonii) i przedstaw procent żywotności komórek na wykresie. Zrób cyfrowe zdjęcia płyt w celu przedstawienia rysunku (Rysunek 3A).

4. Charakterystyka fenotypowa nabytego fenotypu oporności na docetaksel za pomocą analizy qRT-PCR

UWAGA: Komórki odporne na docetaksel (DR) wykazują inny profil ekspresji w porównaniu do ich rodzicielskich linii komórkowych28,29. W związku z tym sukces selekcji można zweryfikować za pomocą qRT-PCR przy użyciu starterów dla określonych markerów (sekwencje starterów znajdują się w sekcji materiały; szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji dotyczącej wyników). Należy to zrobić po każdej rundzie selekcji, począwszy od trzeciej rundy. Alternatywnie możliwa jest również ocena fenotypu opornego na docetaksel za pomocą Western blot.

  1. Ekstrahuj RNA zarówno z komórek rodzicielskich, jak i opornych na docetaksel za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA i postępując zgodnie z instrukcjami producenta (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów i odczynników). Zaleca się użycie co najmniej 1-2 x 106 komórek.
  2. Określić ilościowo RNA przy absorbancji 260 nm za pomocą spektrofotometru. Aby uzyskać najlepszą czystość, współczynniki absorbancji 260 nm/280 nm powinny być bliskie 2,0.
  3. Wykonaj odwrotną transkrypcję w celu uzyskania komplementarnego DNA (cDNA) za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji i postępując zgodnie z instrukcjami producenta (szczegóły w Tabeli materiałów i odczynników), używając 1 μg RNA w mieszaninie reakcyjnej o pojemności 20 μl (jeśli potrzebna jest większa ilość cDNA, należy odpowiednio zwiększyć zawartość mieszaniny reakcyjnej).
  4. Przygotować reakcję qPCR w trzech egzemplarzach dla każdego interesującego genu w następujący sposób:
    - 2 μl 10 μM startera do przodu
    - 2 μl 10 μM startera odwrotnego
    - 10 μL SYBR Green PCR master mix
    - 5 μL H2O
    - 1 μl nowo przygotowanego cDNA z kroku 4.3.
    UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z sekwencjami starterów użytych w tym protokole.
  5. Ustaw program PCR w następujący sposób:
    - 95 °C przez 15 min
    - 94 °C przez 30 s |
    - 56 °C przez 40 s | 40 razy
    - 72 °C przez 30 s |
  6. Aby przeanalizować wyniki qPCR i określić zmiany w ekspresji genów między próbkami rodzicielskimi i DR, wartości progu cyklu (Ct) dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania określa się trzykrotnie, a średnią normalizuje się do kontroli obciążenia (średnia z trójki aktyny) dla DR (Ct DR) i komórek rodzicielskich (Ct parental). Wartości dla komórek rodzicielskich są znormalizowane do 1. ΔCt (Ct DR - Ct parental) jest oznaczany w celu uzyskania końcowych zmian fałdowania mRNA i reprezentowany na wykresie. Wzrost o >2 lub spadek o < 0,5 są uważane za znaczące i dobrą walidację ustanowienia fenotypu nabytego oporności na Docetaksel (Figura 3B).

Wyniki

Niniejszy protokół prowadzi do wygenerowania komórek raka prostaty opornych na docetaksel (DR). Czas realizacji może wynosić od 4 do 7 miesięcy, co przedstawiono w schematycznym ujęciu kroków protokołu na Rysunku 1A oraz Rysunku 1B. Nakład czasu może się różnić w zależności od wybranej linii komórkowej oraz zakresu stężeń leku zastosowanych zgodnie z opisem w protokole. Co istotne, wyznaczenie stężenia IC50 docetakselu dla każdej linii komórkowej pozwala na zaprojektowanie zakresu stopniowo zwiększanych stężeń leku do zastosowania w protokole dla wybranych komórek (Rysunek 2A). Po rozpoczęciu protokołu wstępne efekty działania docetakselu na komórki DU145 i 22Rv1 można obserwować pod mikroskopem w różnych punktach czasowych, aby monitorować prawidłowy przebieg procedury. Sugerowane punkty czasowe monitorowania procesu leczenia docetakselem to: przed ekspozycją na docetaksel (poziom bazowy), po ekspozycji na docetaksel przez 72 h, 7 dni oraz 14 dni. Należy zauważyć, że tylko niewielka część komórek nowotworowych przeżywa ekspozycję na docetaksel i tworzy klony, co można zaobserwować pod mikroskopem (Rysunek 2B).

Reprezentatywne testy tworzenia kolonii oraz wykresy ilościowe komórek wyjściowych i nowo wygenerowanych komórek opornych na docetaksel (DR) przedstawiono na Rysunku 3A. Należy zauważyć, że wygenerowane komórki oporne na docetaksel mogą przeżyć w stężeniach leku do 1 000 razy wyższych niż komórki wyjściowe.

Na koniec fenotyp oporny na Docetaksel można potwierdzić za pomocą qRT-PCR (Rysunek 3B). Należy zauważyć, że komórki oporne na Docetaksel, w porównaniu z komórkami macierzystymi, wykazują charakterystyczną nadekspresję ABCB1 oraz GATA2 i obniżoną ekspresję CK19 oraz CDH1. Geny te wybrano do walidacji, ponieważ w naszej wcześniej opublikowanej pracy wykazaliśmy doświadczalnie nadekspresję GATA2 oraz obniżoną ekspresję CK19 wraz z CDH1 w obu modelach komórek DR28,29. Wybrano również gen ABCB1 jako gen referencyjny, w odniesieniu do którego inni badacze wykazali stałą nadekspresję w komórkach lekoopornych18,19. Należy jednak pamiętać, że badacz może wybrać inne geny zgodnie z literaturą, w zależności od modeli komórkowych oraz leków wybranych do generowania linii opornych.

Oporność na docetaksel w komórkach raka prostaty, schemat czasowy, żywotność komórek, wyniki qRT-PCR.
Rycina 1: Harmonogram generowania modeli komórek raka prostaty opornych na docetaksel. (A) Reprezentatywny schemat harmonogramu protokołu generowania modeli komórek opornych na docetaksel. Ilustracja przedstawia leczenie docetakselem, etapy walidacji oraz czas potrzebny na każdą z części. (B) Schematyczne przedstawienie etapów walidacji protokołu, w tym funkcjonalne testy tworzenia kolonii komórek rodzicielskich i opornych na docetaksel traktowanych wskazanymi stężeniami docetakselu przez 72 h (na czerwono), reprezentatywny wykres procentowego udziału kolonii oraz qRT-PCR w celu walidacji fenotypowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza IC50 żywotności komórek; traktowanie Docetakselem linii DU145, 22Rv1; wyniki mikroskopowe, klony oporne.
Rycina 2: Tworzenie modelowych systemów komórkowych raka prostaty opornych na Docetaxel. (A) Schemat przedstawiający oznaczenie IC50 dla Docetaxelu w macierzystych liniach komórkowych raka prostaty DU145 i 22Rv1 (Krok 1 protokołu). Uwzględniono oczekiwane wartości procentowe żywotności komórek oraz wymagane zwiększające się stężenia Docetaxelu. Przedstawiono reprezentatywne wykresy żywotności komórek DU145 i 22Rv1, wskazujące wartość IC50 na poziomie 5 nM po 72 h ekspozycji na Docetaxel. Eksperymenty wykonano w trzech powtórzeniach, a dane przedstawiają średnią ± SD. (B) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii w jasnym polu komórek DU145 i 22Rv1 w określonych punktach czasowych podczas wytwarzania oporności na Docetaxel (Krok 2 protokołu). Czerwone strzałki wskazują klon oporny na Docetaxel po zakończeniu protokołu. Paski skali = 50 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Odpowiedź komórek nowotworowych na docetaksel; test tworzenia kolonii, analiza oporności, wpływ stężeń leku.
Rysunek 3: Charakterystyka funkcjonalna i fenotypowa modeli komórek opornych na docetaksel. (A) Reprezentatywne testy tworzenia kolonii komórek rodzicielskich i opornych na docetaksel traktowanych wskazanymi stężeniami docetakselu przez 72 h. Procent kolonii dla każdego stężenia leku przedstawiono na dołączonym wykresie. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a dane przedstawiają średnią ± SD. Paski skali = 5 mm. (B) Przedstawiono krotność wzrostu względnego poziomu mRNA DR/parental dla ABCB1, GATA2, CK19 i CDH1, wyznaczoną za pomocą qRT-PCR. Wszystkie surowe dane qPCR zostały znormalizowane względem aktyny (szczegóły w protokole). Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a dane przedstawiają średnią ± SD. *p <0,05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano metodę generowania systemów modelowych komórek raka prostaty opornych na docetaksel, która pozwala na badanie mechanizmów przyczyniających się do nabycia fenotypu chemooporności. Chociaż podejście to jest wysoce wiarygodne i powtarzalne, należy wziąć pod uwagę pewne potencjalne ograniczenia. Ponieważ tylko niewielka część masowej populacji komórek będzie wykazywać chemooporność28, zaleca się rozpoczęcie od dużej populacji komórek (zwykle podajemy 20 kolb po 150 cm2, co stanowi około 1,2 x 108 komórek). Aby zapewnić powodzenie procedury, należy rozważyć kluczowe etapy protokołu. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby używać tego samego świeżo przygotowanego wywaru Docetakselu do długotrwałego stosowania (10 mM porcji wyjściowych może być używane przez lata, jeśli są prawidłowo przechowywane w temperaturze -80 °C). Niewielkie zmiany w podwielokrotności docetakselu mogą mieć wpływ na wyniki IC50, czas wytwarzania linii komórkowej i wyniki tworzenia kolonii. Po drugie, ważne jest, aby rozpocząć protokół określający IC50 w każdej pojedynczej linii komórkowej, ponieważ przy użyciu nowej partii komórek mogą wystąpić różnice. Po trzecie, konieczne jest monitorowanie skuteczności leczenia farmakologicznego poprzez częste sprawdzanie komórek pod mikroskopem, aby można było szybko wykryć i skorygować wszelkie błędy. Na koniec zalecamy, aby zawsze mieć zapas etapów pośrednich na wypadek zanieczyszczenia lub nieoczekiwanych problemów, które mogą wpłynąć na żywotność komórek w trakcie trwania protokołu. Co ważne, nasz protokół ma na celu wygenerowanie modeli oporności na leki poprzez wystawienie komórek raka prostaty na działanie wysokich dawek docetakselu przez 72 godziny, po których następują długie okresy rekonwalescencji, a nie niższe stałe stężenia leku, próbując naśladować najlepszy scenariusz kliniczny zgłoszony w leczeniu raka prostaty za pomocą tego taksanu15,16.

Dodatkowo należy zauważyć, że ogniwa lekooporne wykazują dużą plastyczność, co może prowadzić do postępującej w czasie utraty nabytych właściwości oporności. Dlatego nie zaleca się przedłużania stosowania tych komórek na więcej niż 2-3 miesiące w hodowli. Jeśli potrzebne jest stałe zasilanie, zaleca się ciągłe wytwarzanie nowych partii odpornych ogniw. Jeśli jednak partie komórek były hodowane przez dłuższy czas, testy tworzenia kolonii i qPCR można zastosować do ponownej oceny ich odporności. Inną alternatywą jest zwiększenie słabnącej odporności poprzez traktowanie komórek wysoką dawką docetakselu przez 72 godziny (500-1000 nM). Po okresie rekonwalescencji trwającym od jednego do dwóch tygodni fenotyp można ponownie przetestować za pomocą qPCR i testów tworzenia kolonii. Możliwe jest również, choć nie jest to zalecane, przechowywanie podwielokrotności traktowanych komórek w ciekłym azocie (w FBS, 10% DMSO). Należy pamiętać, że po cyklu zamrażania i rozmrażania fenotyp chemooporności powinien być zawsze ponownie oceniany za pomocą wyżej wymienionych metod.

Pomimo tych zastrzeżeń, my28,29 i inni 30,31,32,33 byliśmy w stanie z powodzeniem zastosować te systemy modelowe do identyfikacji kluczowych nowych mechanizmów komórkowych i molekularnych prowadzących do zwiększonej zdolności inicjowania nowotworu, przeżycia komórek i agresywności w komórkach opornych na docetaksel. Korzystając z tych systemów modelowania komórek rakowych, odkryliśmy, że komórki wykazujące niezróżnicowany fenotyp, charakteryzujący się brakiem markerów różnicowania nabłonka i prostaty oraz nadekspresją docelowych szlaków sygnałowych rozwojowych (Notch i Hedgehog), przeżywają ekspozycję na chemioterapię28. W drugim badaniu, wykorzystując te modele wraz z publicznie dostępnymi zestawami danych genów pacjenta24,25, odkryliśmy, że pionierski czynnik transkrypcyjny GATA2 jest wysoce nadeksprymowany w przerzutowych, opornych na chemioterapię komórkach raka prostaty. GATA2 zwiększa przeżywalność komórek poprzez bezpośrednią aktywację zależnej od IGF2 sieci sygnalizacyjnej kinazy29. Warto zauważyć, że badania te pomogły zidentyfikować nowe kluczowe role GATA2 w agresywności zaawansowanego raka gruczołu krokowego z przerzutami34.

Rozwój oporności na leki jest problemem, który nie ogranicza się do docetakselu i raka prostaty, ponieważ jest on powszechny wśród wielu innych rodzajów nowotworów leczonych szeroką gamą leków chemioterapeutycznych. Rzeczywiście, obowiązują podobne ograniczenia w dostępności modeli eksperymentalnych i można sobie wyobrazić, że nasz protokół może zostać dostosowany do badania innych typów nowotworów i ich odpowiednich mechanizmów chemooporności.

Generacja komórek opornych na docetaksel, opisana w niniejszym protokole, może być wykorzystana jako funkcjonalne narzędzie do identyfikacji nowych, istotnych molekularnych i komórkowych mechanizmów chemooporności. Otwiera to drzwi do znalezienia nowych celów, na których może opierać się opracowanie nowych metod leczenia wysoce złośliwego raka prostaty, po raz kolejny przesuwając granice tego, co wiemy o tej chorobie i o tym, jak leczymy jej pacjentów.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

V.R.-B. otrzymuje finansowanie od Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych, NIH, grantu National Cancer Institute numer 1 K22 CA207458-01, a J.D.-D. otrzymuje finansowanie od Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej USA, NIH, grantu National Cancer Institute numer 1 R01 CA207311-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki DU145ATCCHTB-81
Komórki 22Rv1ATCCCRL-2505
DocetaxelSelleck ChemicalsS1148w DMSO (10mM)
Kolba do hodowli tkankowych 150cm2Falcon355001
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFalcon353046
RPMI 1640 MediumGibco11875093Uzupełnione 10% FBS i 1% Penicilin/Streptomycyna
Foundation B Płodowa surowica bydlęcaGemini900208
1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Corning21-040-CM
0,05% Trypsyna-EDTAGibco25300-062
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
RNeasy Mini zestawQiagen74106
SuperScript III system syntezy pierwszej nici do RT-PCRInvitrogen18080051
Power SYBR Green PCR Master MixInvitrogen4367659
Crystal VioletSigma-AldrichC0775
10% roztwór formalinySigma-AldrichHT501128
Startery do qRT-PCR:Life technologie
CK19 F: CTGCGGGAAAGATTCTTGGT
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA
AKTYNA F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC
AKTYNA R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT

Bibliografia

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Lapenna, S., Giordano, A. Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer. Nature reviews. Drug discovery. 8 (7), 547-566 (2009).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nature reviews. Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature reviews. Drug discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  5. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  6. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  7. Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (5), 379-393 (2007).
  8. Kops, G. J. P. L., Weaver, B. A. A., Cleveland, D. W. On the road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint. Nature reviews. Cancer. 5 (10), 773-785 (2005).
  9. Derry, W. B., Wilson, L., Jordan, M. A. Substoichiometric binding of taxol suppresses microtubule dynamics. Biochemistry. 34 (7), 2203-2211 (1995).
  10. Jordan, M. A., Wendell, K., Gardiner, S., Derry, W. B., Copp, H., Wilson, L. Mitotic block induced in HeLa cells by low concentrations of paclitaxel (Taxol) results in abnormal mitotic exit and apoptotic cell death. Cancer research. 56 (4), 816-825 (1996).
  11. Orth, J. D., Kohler, R. H., Foijer, F., Sorger, P. K., Weissleder, R., Mitchison, T. J. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer research. 71 (13), 4608-4616 (2011).
  12. Zasadil, L. M., et al. Cytotoxicity of paclitaxel in breast cancer is due to chromosome missegregation on multipolar spindles. Science translational medicine. 6 (229), (2014).
  13. Dominguez-Brauer, C., Thu, K. L., Mason, J. M., Blaser, H., Bray, M. R., Mak, T. W. Targeting Mitosis in Cancer: Emerging Strategies. Molecular cell. 60 (4), 524-536 (2015).
  14. Torre, L. A., Bray, F., Siegel, R. L., Ferlay, J., Lortet-Tieulent, J., Jemal, A. Global cancer statistics, 2012. CA: a cancer journal for clinicians. 65 (2), 87-108 (2015).
  15. Petrylak, D. P., et al. Docetaxel and estramustine compared with mitoxantrone and prednisone for advanced refractory prostate cancer. The New England journal of medicine. 351 (15), 1513-1520 (2004).
  16. Tannock, I. F., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer. The New England journal of medicine. 351 (15), 1502-1512 (2004).
  17. Sweeney, C. J., et al. Chemohormonal Therapy in Metastatic Hormone-Sensitive Prostate Cancer. The New England journal of medicine. 373 (8), 737-746 (2015).
  18. Mahon, K. L., Henshall, S. M., Sutherland, R. L., Horvath, L. G. Pathways of chemotherapy resistance in castration-resistant prostate cancer. Endocrine-related cancer. 18 (4), R103-R123 (2011).
  19. Follit, C. A., Brewer, F. K., Wise, J. G., Vogel, P. D. In silico identified targeted inhibitors of P-glycoprotein overcome multidrug resistance in human cancer cells in culture. Pharmacology research & perspectives. 3 (5), e00170(2015).
  20. Ranganathan, S., Benetatos, C. A., Colarusso, P. J., Dexter, D. W., Hudes, G. R. Altered beta-tubulin isotype expression in paclitaxel-resistant human prostate carcinoma cells. British journal of cancer. 77 (4), 562-566 (1998).
  21. Martello, L. A., et al. Elevated levels of microtubule destabilizing factors in a Taxol-resistant/dependent A549 cell line with an alpha-tubulin mutation. Cancer research. 63 (6), 1207-1213 (2003).
  22. Lee, A. J. X., et al. Chromosomal instability confers intrinsic multidrug resistance. Cancer research. 71 (5), 1858-1870 (2011).
  23. Sansregret, L., Swanton, C. The Role of Aneuploidy in Cancer Evolution. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 7 (1), (2017).
  24. Grasso, C. S., et al. The mutational landscape of lethal castration-resistant prostate cancer. Nature. 487 (7406), 239-243 (2012).
  25. Taylor, B. S., et al. Integrative genomic profiling of human prostate cancer. Cancer cell. 18 (1), 11-22 (2010).
  26. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  27. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  28. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer cell. 22 (3), 373-388 (2012).
  29. Vidal, S. J., et al. A targetable GATA2-IGF2 axis confers aggressiveness in lethal prostate cancer. Cancer cell. 27 (2), 223-239 (2015).
  30. Marín-Aguilera, M., et al. Identification of docetaxel resistance genes in castration-resistant prostate cancer. Molecular cancer therapeutics. 11 (2), 329-339 (2012).
  31. Zhao, L., et al. Identification of candidate biomarkers of therapeutic response to docetaxel by proteomic profiling. Cancer research. 69 (19), 7696-7703 (2009).
  32. Lin, H. -M., et al. Circulating microRNAs are associated with docetaxel chemotherapy outcome in castration-resistant prostate cancer. British journal of cancer. 110 (10), 2462-2471 (2014).
  33. Puhr, M., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition leads to docetaxel resistance in prostate cancer and is mediated by reduced expression of miR-200c and miR-205. The American journal of pathology. 181 (6), 2188-2201 (2012).
  34. Rodriguez-Bravo, V., Carceles-Cordon, M., Hoshida, Y., Cordon-Cardo, C., Galsky, M. D., Domingo-Domenech, J. The role of GATA2 in lethal prostate cancer aggressiveness. Nature reviews. Urology. 14 (1), 38-48 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oporność na docetakselgenerowanie oporności na lekopracowywanie linii komórkowycheskalacja dawki docetakselutest tworzenia koloniibarwienie fioletem krystalicznymmikroskopia w polu jasnymwyznaczanie IC50klony oporne na lek
Generowanie modeli komórkowych raka gruczołu krokowego oporności na lek antymitotyczny docetaksel
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.