Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
GABAergiczne interneurony korowe to heterogeniczna populacja komórek, które odgrywają kluczową rolę w regulacji wydajności pobudzających neuronów piramidowych, jak również w synchronizacji wyników zespołów neuronów piramidowych. Deficyty w funkcjonowaniu interneuronów są związane z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, w tym schizofrenią, autyzmem i padaczką. Wyprowadzenie interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych nie tylko pozwala na badanie ich rozwoju i funkcji, ale także zapewnia wgląd w mechanizmy molekularne leżące u podstaw patogenezy zaburzeń związanych z interneuronami korowymi. Interneurony mają również niezwykłą zdolność do przetrwania, migracji i integracji z obwodami korowymi gospodarza po przeszczepie, co czyni je idealnymi kandydatami do stosowania w terapiach komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy skalowalną, wysoce wydajną, zmodyfikowaną metodę przekształcania ciała zarodkowego w monowarstwę do wyprowadzania komórek progenitorowych interneuronów z ekspresją Nkx2.1 i ich potomstwa z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). Korzystając z podwójnej linii reporterowej mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, progenitorzy Nkx2.1 lub ich postmitotyczne potomstwo eksprymujące Lhx6 mogą być izolowane poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach. Oferujemy również metody wzbogacania podgrup interneuronów parwalbuminy (PV) lub somatostatyny (SST), które mogą być pomocne w badaniu aspektów determinacji losu lub do wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych, które skorzystałyby z przeszczepów wzbogaconych w podgrupy interneuronów.
Wprowadzenie
Zarówno u myszy, jak i u ludzi, mniej więcej połowa wszystkich korowych interneuronów hamujących (CIns) wywodzi się z przejściowej struktury podkorowej znanej jako przyśrodkowa wyniosłość zwojowa (MGE), gdzie neuroepitelialne progenitory CIns i innych podgrup neuronalnych i glejowych wyrażają czynnik transkrypcyjny Nkx2.11,2. Podgrupy lub podtypy CIn są definiowane przez przecinające się cechy morfologiczne, neurochemiczne, elektrofizjologiczne i łączności3,4. CIns pochodzące z MGE można pogrupować w przeważnie nienakładające się podgrupy na podstawie ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Linia mESC z podwójnym reporterem opisana w tym protokole jest dostępna na żądanie (sande@mail.med.upenn.edu).
1. Przygotowanie mediów
UWAGA: Podgrzej wszystkie podłoża do 37 °C przed użyciem w hodowli komórkowej.
- Pożywka z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) (do przygotowania 500 ml)
- Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 449 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porów.
- Dodać 1 ml środka przeciwbakteryjnego (50 mg/ml) po filtracji. Przechowywać media w temperaturze 4 °C ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół opisany w niniejszej pracy jest zmodyfikowaną wersją naszych opublikowanych protokołów15,16,17 i został zoptymalizowany do użytku z naszą linią mESC z podwójnym reporterem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Poprzez dodanie inhibitora Wnt XAV-939 od DD0-5, w połączeniu z ponownym wysianiem w DD8, osiągamy silną indukcję Nkx2.1, w której ponad 50% wszystkich jąder DAPI+ w hodowli wykazuje również .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż metoda ta jest wysoce skuteczna w modelowaniu mESC pochodzących z J1 (SCRC-1010), doświadczyliśmy zmiennego sukcesu z innymi liniami mESC i izolatami klonalnymi. Na przykład mESC Foxg1::wenus (pochodzące z EB3; Danjo i wsp.13) słabo reagują na ten protokół, a indukcja Foxg1 przez DD12 jest zwykle rzędu 1-2%. Z powodów, których nie do końca rozumiemy, inny klon podwójnego reportera Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP (określany jako JQ59), który został wyizolowany jednocześnie z linią opisan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Qing Xu za opracowanie linii mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP, a także Jennifer Tyson, Asif Maroof i Timowi Petrosowi za ich wczesną pracę nad rozwojem tego protokołu. Dziękujemy również rdzeniowi cytometrii przepływowej CHOP za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez NIH R01 MH066912 (SA) i F30 MH105045-02 (DT).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Butelkowy system filtrów próżniowych | Corning | CLS430769 | |
| probówka z sitkiem do komórek Zatrzask | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| Mysie fibroblasty embrionalne (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 fiolka z 7M MEF wystarcza na cztery 10-centymetrowe płytki TC. Przypisy: 29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Znany również jako środek przeciwdrobnoustrojowy. Nie filtrować z mediami bazowymi - dodać po filtracji. Referencje: 9,11,36,37 |
| N2 suplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | Nie filtruj za pomocą podłoża bazowego -- dodaj po filtracji |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Znany również jako L-alanina-L-glutamina. Referencje: 9,11,38,39 |
| Zamiennik surowicy do nokautu (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Znany również jako średni suplement bez surowicy. Referencje: 9,11 |
| L-glutamina (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-merkaptoetanol | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher 10829018 | Znany również jako DMEM zawierający nieglutaminę. Przypisy: 9,11 | |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Znany również jako FBS klasy komórek macierzystych. Przypisy: 9,11 |
| Naczynie do hodowli tkankowej (10cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Nieprzywierająca sterylna szalka Petriego (10cm) | VWR | 25384-342 | |
| Czynnik hamujący białaczkę (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Nie zamrażać, przechowywać w temperaturze 4'C. Przypisy: 9,11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| 0,1% roztwór żelatyny | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Poli-L-lizyna | Sigma | P6282 | |
| Trypsyna-EDTA (0,05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Znany również jako odczynnik dysocjacji komórek niezawierający trypsyny. Referencje: 9,11 |
| RQ1 DNase Free RNase-Free | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych porcjach |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku |
| rhFGF-2 | R& D Systems | 233-FB | Zawiesić w PBS z 0,1% BSA i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach |
| rhIGF-2 | R& D Systems | 291-G1 | Zawiesić w PBS z 0,1% BSA i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach |
| inhibitora ROCK (Y-27632) | Tocris | 1254 | Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku |
| Wygładzony agonista (SAG) | Milipore | 566660-1MG | Zawiesić w H20 i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R& D Systems | 464-SH-025 | Zawiesić w PBS z 0,1% BSA i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach |
| PKCζ Inhibitor pseudosubstratu, mirystoilowany | milipor EMD | 539624 | zawiesić w H20 i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych podwielokrotnościach |
Bibliografia
- Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Różnicowanie interneuronów korowychprogenitory Nkx2.1sortowanie komórek aktywowane fluorescencjąmetoda monowarstwy ciał embrionalnychwzbogacanie w interneurony parwalbuminowepodgrupy interneuronów somatostatynowychlinia mESC z podwójnym reporteremprotokół transplantacji komórekdeterminacja losu neuronalnego
