Artykuł metodologiczny

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

14.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56372

⸱

3 stycznia 2018

 ,  , 
1CELLINK LLC, 2CELLINK AB, 33D Bioprinting Centre, Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Streszczenie

Bioprinting to potężna technika szybkiego i powtarzalnego wytwarzania konstruktów do zastosowań inżynierii tkankowej. W tym badaniu zarówno analogi chrząstki, jak i skóry zostały wytworzone po wstępnej celularyzacji biotuszu przy użyciu nowatorskiej techniki pasywnego mieszania. Technika ta została opracowana w celu uproszczenia etapów związanych z mieszaniem zawiesiny komórkowej z biotuszem o wysokiej lepkości. Rozdzielczość włókien zdeponowanych za pomocą biodruku wymaga zapewnienia jednorodności rozmieszczenia komórek przed drukowaniem, aby uniknąć osadzania się obszarów bez komórek lub zatrzymywania dużych grudek komórek, które mogą zatkać igłę. Wykazujemy zdolność do szybkiego mieszania zawiesiny komórkowej z biotuszem przed biodrukowaniem zarówno analogów chrząstki, jak i skóry. Oba analogi tkanek można hodować przez okres do 4 tygodni. Analiza histologiczna wykazała zarówno żywotność komórek, jak i odkładanie się markerów tkankowo specyficznej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takich jak glikozaminoglikany (GAG) i kolagen I.

Wprowadzenie

W ostatnich latach technologia trójwymiarowego (3D) biodruku stała się bardziej dostępna dla badaczy, co pozwoliło na szersze wykorzystanie tej techniki do produkcji analogów tkanek. Bioprinting obiecuje zrewolucjonizować badania biomedyczne, ułatwiając szybkie i powtarzalne wytwarzanie wieloaspektowych konstruktów tkankowych. Istota technologii biodruku polega na możliwości precyzyjnej kontroli osadzania biomateriałów (znanych jako biotusze) w trzech wymiarach. Pozwala to na generowanie złożonych rusztowań z odrębnymi regionami składu macierzy, czynnikami bioaktywnymi i komórkami, które mogą dokładniej rekapitulować natywną strukturę tkanki.

Bioprinting został wykorzystany do produkcji konstruktów dla wielu zastosowań tkankowych, w tym chrząstek1, skin2, muscle3, oraz bone4. Tkanki te są atrakcyjne do biodruku ze względu na ich wewnętrzne prążkowane mikroarchitektury, które nadają się do rekapitulacji poprzez osadzanie warstwa po warstwie. W szczególności skóra posiada dobrze zdefiniowaną wielowarstwową strukturę5, która nadaje się do wytwarzania za pomocą technik osadzania warstwa po warstwie, takich jak biodruk. Dodatkowo bioprinting może być wykorzystany do generowania konstruktów, które posiadają niezbędne wymiary anatomiczne i kształty do naprawy ubytku tkanki. Możliwość generowania biomateriałów o rozmiarze i kształcie specyficznym dla pacjenta6 może zacząć zaspokajać zapotrzebowanie na częściowe naprawy wielu tkanek, w tym między innymi ubytków kostnych, uszkodzeń chrząstek i zmian skórnych, których zakres różni się w zależności od pacjenta.

W tym badaniu, dwa analogi tkanek (chrząstka stawowa i skóra) zostały wytworzone poprzez biodrukowanie wstępnie uceluloaryzowanych biotuszów. Zapewnienie odpowiedniego mieszania biotuszu z zawiesiną komórkową, która może zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek przy jednoczesnym zachowaniu ich żywotności, może być wyzwaniem. Biotusze nadające się do biodruku poprzez ekstruzję są często bardzo lepkie i dlatego wymagają intensywnego mieszania, aby zapewnić jednorodną mieszankę. Mechaniczne uszkodzenia komórek mogą wystąpić w trudnych warunkach mieszania i negatywnie wpłynąć na żywotność. Badania wykazały, że większość śmierci komórek podczas procesu drukowania atramentowego następuje podczas przygotowania, takiego jak mieszanie7,8. Podczas gdy tradycyjne mieszanie z mieszaniem9 może być wystarczające dla biotuszów o niskiej lepkości odpowiednich do druku atramentowego10, mieszanie komórek w biotusz o wysokiej lepkości, bardziej odpowiedni do biodruku przez wytłaczanie, jest trudniejsze. Wychodząc naprzeciw tej potrzebie, coraz popularniejsze stało się stosowanie dysz mieszających do mieszania biotuszy podczas procesu drukowania11. Mieszalniki te są również szeroko stosowane w badaniach mikrofluidycznych, w których ważne jest mieszanie płynów o niskiej liczbie Reynoldsa12. Wykorzystanie procesu ciągłego mieszania do zmieszania zawiesiny komórkowej z biotuszem pozwoliłoby na uzyskanie jednorodności podczas procesu drukowania. Ponieważ jednak zawiesiny komórek mają niską lepkość w porównaniu z biotuszem, pojawią się trudności w zapobieganiu sedymentacji komórek podczas procesu drukowania9,13,14. Alternatywnie, zmieszanie komórek z biotuszem przed drukowaniem może rozwiązać ten problem.

Aby zminimalizować śmierć komórek podczas mieszania z biotuszem, opracowaliśmy technikę opartą na pasywnym urządzeniu mieszającym, aby połączyć komórki w biotusz w minimalnej liczbie kroków. Chaotyczne mieszanie generowane przez przepływ materiałów przez jednostkę mieszającą jest wystarczające do powtarzalnego zmieszania ze sobą dwóch składników15,16. Metoda ta została opracowana przede wszystkim w celu uproszczenia mieszania dowolnej zawiesiny komórkowej z dowolnym biotuszem, który nadaje się do biodruku przez wytłaczanie. Liczba etapów procesu mieszania została zminimalizowana, aby wyeliminować różnice w mieszaniu między użytkownikami. Nadmierne etapy mieszania mogą być czasochłonne i nie mają zastosowania do wszystkich biotuszów, szczególnie gdy zaangażowane są komórki. Po drugie, naszym celem było opracowanie procesu mieszania, który byłby samowystarczalny, aby zarówno zachować sterylność, jak i zminimalizować straty próbki.

W tym manuskrypcie demonstrujemy mieszanie zawiesiny komórkowej z biotuszem przy użyciu techniki pasywnego mieszania, która minimalizuje obsługę i skutkuje wysoką żywotnością komórek i równomiernym rozkładem. Te wstępnie ukomórkowane biotusze są następnie wykorzystywane do biodruku chrząstki lub konstruktu skóry z odpowiednio jednym lub dwoma typami komórek, które są hodowane przez okres do 6 tygodni. Zastosowany biotusz to mieszanka alginianu i nanocelulozy, która wcześniej wykazała przydatność do bioprintingu1.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań naukowych Uniwersytetu Chalmers.

UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonać w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotowanie materiałów eksploatacyjnych, biotuszu i komórek

  1. Zaopatrz się w dwie strzykawki, jedna strzykawka ( Rysunek 1a) jest przeznaczona do zawiesiny komórek, a druga strzykawka jest przeznaczona do biotuszu (Rysunek 1b).
  2. Zaopatrz się w sterylną pasywną jednostkę mieszającą (Rysunek 1c), którą można połączyć z podwójnymi strzykawkami za pomocą złącza Luer lock.
  3. Zaopatrz się w jednostkę dozującą (Rysunek 1d), która może wytłaczać objętość z dwóch sterylnych strzykawek jednocześnie z kontrolowaną szybkością.
    UWAGA: Proporcja mieszania zastosowana w tym badaniu wynosi 10:1. Dlatego należy użyć strzykawki o pojemności 12 ml i strzykawki o pojemności 1 ml, zgodnie z wymaganiami mieszalnika 10:1.
  4. Zaopatrz się w sterylny wkład (Rysunek 1e) i sterylne żeńskie złącze Luer lock do bezpośredniego mieszania biotuszu i zawiesiny komórek.
  5. Otrzymać lub przygotować biotusz do zmieszania z zawiesiną komórkową.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystano biotusz na bazie nanocelulozy/alginianu. Ten biotusz jest sieciowany poprzez dodanie sterylnego roztworu 100 mM CaCl2 po wydrukowaniu.
  6. Odłącz komórki za pomocą 0,5% roztworu trypsyny/EDTA i policz całkowitą liczbę komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego17.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystano ludzkie fibroblasty.
  7. Określ, jaka gęstość komórek jest pożądana w końcowej wydrukowanej konstrukcji. Oblicz, korzystając z poniższych równań, stężenie zebranych komórek, które należy rozcieńczyć, aby osiągnąć docelową końcową gęstość komórek.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystano końcową gęstość komórek 5 x 106 komórek/ml.
    1. Wybierz żądane stężenie komórek do eksperymentów: komórka C (komórki/ml).
    2. Oblicz ilość niezbędnego biotuszu, Vbiotuszu, na podstawie całkowitej liczby pożądanych konstruktów:
      Vbiotusz = Vkonstrukt × NKonstrukcje
      Uwaga: Na przykład objętość biotuszu na konstrukt wynosi 100 μl. Jeśli drukowanych jest 30 konstruktów, potrzebna objętość biotuszu wynosi 3 ml.
    3. Oblicz liczbę potrzebnych komórek:
      N komórek = komórka C (biolink 1,1 × V)
    4. Ponownie zawiesić komórki (komórki N) w 1/10 objętości biotuszu:
      Zawiesina komórek V = 0,1 × Vbiolink
      UWAGA: Na przykład, jeślibiotusz V = 3 ml, tozawiesina komórek V = 0,1 × 3 ml = 0,3 ml

2. Mieszanie zawiesiny komórkowej i biotuszu

  1. Przenieść zawiesinę komórek do strzykawki do sporządzania zawiesiny komórek.
  2. Przenieść biotusz do innej strzykawki lub zaopatrzyć się w strzykawkę zawierającą biotusz.
  3. Odciągnąć tłok strzykawki z biotuszem do tyłu i włożyć strzykawkę do jednostki dozującej. Ustaw urządzenie pionowo ze złączem Luer lock skierowanym do góry (Rysunek 1f1).
  4. Pociągnij tłok strzykawki z komórkami do podobnej długości do strzykawki z biotuszem i włóż do jednostki dozującej (Rysunek 1f2).
  5. Podłącz obie strzykawki do mieszalnika, przekręcając złącza Luer lock (Rysunek 1f3).
  6. Zalać system mieszania, naciskając jednostkę dozującą w celu wytłoczenia powietrza ze strzykawki. Przerwij zalewanie, zanim roztwór dotrze do śluzy Luer (Rysunek 1g4).
  7. Po zalaniu przymocuj wkład napełniający do końca mieszalnika za pomocą złącza Luer lock (Rysunek 1g5). Upewnij się, że tłok we wkładzie napełniającym znajduje się na dole przed założeniem.
  8. Powoli skompresuj (Rysunek 1h6) jednostkę dozującą, aby wymieszać biotusz i zawiesinę komórkową razem z wkładem (Rysunek 1i7).
  9. Popchnąć tłok wkładu napełniającego w dół za pomocą sterylnej końcówki pipety, aby po wymieszaniu zetknąć się z mieszaniną biotuszu i komórek. Utrzymuj dozowanie do momentu ściśnięcia, aby upewnić się, że mieszanina komórek i biotuszu nie zostanie wytłoczona z powrotem do jednostki mieszającej.
  10. Zakryj wkład i delikatnie postukaj w powierzchnię roboczą, aby przesunąć pęcherzyki powietrza na górę wkładu (koniec tłoka).
    UWAGA: W tym momencie mieszanina komórki/biotuszu jest gotowa do drukowania. W poniższych sekcjach omówiono konkretne zastosowania i procedury drukowania.

3. Określanie żywotności komórek za pomocą mieszalnika w porównaniu do ręcznego mieszania szpatułkowego

  1. Odłączyć ludzkie fibroblasty (pasaż 7) 0,5% roztworem trypsyny/EDTA przy 80% zbiegu, policzyć liczbę i ponownie zawiesić w pożywce hodowlanej o wystarczającej gęstości komórek, aby osiągnąć końcowe stężenie po zmieszaniu z biotuszem (stosunek 1:10 komórka:biotusz) 5 x 106 komórek/ml.
  2. Zmieszaj komórki z biotuszem za pomocą techniki pasywnego mieszania (krok 2) lub za pomocą szpatułki, aby ocenić wpływ obu technik na żywotność komórek.
  3. Zmiksuj komórki z biotuszem za pomocą techniki pasywnego mieszania 1, 2 lub 3 razy przed dozowaniem do formy w celu sieciowania przy użyciu 100 mM CaCl2,
    UWAGA: Aby wykonać dodatkowe mieszania, wymieszaj komórkę/biotusz bezpośrednio ze strzykawką, a nie z wkładem. Następnie ponownie wymieszaj mieszankę przez jednostkę mieszającą zgodnie z poprzednim protokołem, ale bez składnika strzykawki z komórkami.
  4. Zmiksuj komórki w osobny biotusz, używając ręcznego mechanicznego mieszania za pomocą szpatułki przez 30, 60 lub 90 s. Przenieś mieszaniny (na każdy czas mieszania) do formy w celu usieciowania za pomocą 100 mM CaCl2.
  5. Przenieść próbki do płytki studzienkowej po zakończeniu sieciowania i hodowli w standardowych warunkach.
  6. Po 1 dniu hodowli przemyć konstrukty (n = 3 - 4 na grupę) w pożywce do hodowli komórkowych bez surowicy przez 30 minut. Wybarwić komórki w konstruktach roztworem barwiącym (4 μM Calcein AM, 1 μM Ethidium homodimer-1) przez 30 min.
    1. Przemyć jeszcze dwa razy i inkubować próbki w pożywce do hodowli komórkowych bez surowicy, łącznie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przenieść próbki do roztworu do obrazowania żywych komórek.
  7. Uzyskuj obrazy za pomocą kolorowej kamery cyfrowej przy 10-krotnym powiększeniu za pomocą odwróconego mikroskopu z filtrami FITC i Texas Red oraz analizuj je za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
  8. Losowo wybierz trzy obrazy z każdego konstruktu, aby określić ilościowo żywotność komórek.
  9. Oblicz żywotność na podstawie stosunku żywych komórek do całkowitej liczby komórek. Przeanalizuj dane za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya.

4. Bioprinting analogów chrząstki z pojedynczym typem komórki

  1. Narysuj model 3D żądanego analogu tkanki. Konwertuj na plik Gcode do biodruku i załaduj plik Gcode do bioprinter1.
    UWAGA: W tym protokole kwadratowa struktura o wymiarach 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 została wyeksportowana jako plik STL. Wygenerowano plik Gcode struktury kratowej przy użyciu następujących ustawień: grubość warstwy, 0,3 mm; wzór wypełnienia, prostoliniowy; gęstość wypełnienia, 25%; prędkość, 10 mm/s.
  2. Wyizoluj i kriokonserwuj pierwotne ludzkie chondrocyty nosa (hNC) od pacjentów zgodnie z przywołanym protokołem1.
  3. Rozmrozić i rozprężyć kriokonserwowane hNC i rozprężyć raz w hodowli jednowarstwowej przy użyciu standardowej pożywki hodowlanej w temperaturze 37 °C. Odłączyć komórki przy 80-90% zbiegu za pomocą 0,5% roztworu trypsyny/EDTA i policzyć przy użyciu protokołu wykluczenia błękitu trypanowego. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono przy użyciu hNC w pasażu 2.
  4. Zawiesić hNC w stężeniu 100 x 106 komórek/ml w 300 μl pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 50 μg/ml kwasu askorbinowego, w ramach przygotowań do zmieszania z biotuszem.
  5. Zmieszaj zawiesinę komórek hNC z biotuszem na bazie nanocelulozy/alginianu zgodnie z protokołem pasywnej jednostki mieszającej w stosunku zawiesiny biotuszu do komórki 10:1, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 9 x 106 komórek/ml.
  6. Upewnij się, że biodrukarka jest wysterylizowana przez ekspozycję na promieniowanie UV i przetrzyj 70% etanolem. Zachowaj sterylność, umieszczając w komorze z przepływem laminarnym.
  7. Podłącz sterylne dysze drukarskie do wkładów zawierających mieszaniny zawiesiny biotuszu i komórek i włóż do biodrukarki.
  8. Skalibruj biodrukarkę ręcznie lub zgodnie z protokołami specyficznymi dla drukarki.
  9. Bioprint konstrukcji o strukturze kratowej, obciążonej komórkami, przy użyciu następujących parametrów drukowania: dysza stożkowa 25G pod ciśnieniem 25 kPa. Bioprint konstrukty bezkomórkowe (zmieszane z pożywką komórkową niezawierającą komórek) jako kontrola.
  10. Usieciować konstrukty, dodając roztwór jonowy 100 mM CaCl2 przez 5 minut. Przepłukać konstrukty i inkubować w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności względnej). Zmieniaj nośnik co drugi lub trzeci dzień.
  11. Pobrać próbki do analizy histologicznej w 2. i 4. tygodniu. Wybarwić próbki do produkcji GAG za pomocą niebieskiego barwnika Alcian stain18.

5. Bioprinting analogów skóry z dwoma typami komórek

  1. Narysuj model 3D żądanego analogu tkanki i przekonwertuj go na plik Gcode w celu biodruku. Załaduj plik Gcode na bioprinter.
    UWAGA: W tym protokole kwadratowa struktura o wymiarach 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 została wyeksportowana jako plik STL. Następnie wygenerowano plik Gcode struktury kratowej przy użyciu następujących ustawień: grubość warstwy, 0,3 mm; wzór wypełnienia, prostoliniowy; gęstość wypełnienia, 25%; prędkość, 10 mm/s.
  2. Przygotuj komórki do zmieszania z biotuszem do biodruku. Do wytworzenia analogów skóry wykorzystano dwa typy komórek. Dwa typy komórek zostały zmieszane z biotuszem i biodrukiem.
    1. Uzyskaj podstawowy HDF. Utrzymuj te komórki w pożywce wzrostowej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 50 μg / ml kwasu askorbinowego. Odłącz komórki przy 80-90% zbiegu za pomocą 0,5% roztworu trypsyny/EDTA i policz.
    2. Wyizoluj i kriokonserwuj pierwotny hNC od pacjentów zgodnie z przywołanym protokołem1. Rozmrażanie i rozszerzanie kriokonserwowanych hNC w kulturze jednowarstwowej. Odłącz komórki przy 80-90% zbiegu za pomocą 0,5% roztworu trypsyny/EDTA i policz.
  3. Ponownie zawieś oba typy komórek przy 100 x 106 komórek/ml w pożywce wzrostowej. Wymieszać zawiesiny komórek w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe całkowite stężenie 100 x 106 komórek/ml w 300 μl pożywki.
  4. Zmieszaj zawiesinę komórkową HDF i hNC w proporcji 50:50 z biotuszem na bazie nanocelulozy/alginianu zgodnie z protokołem pasywnej jednostki mieszania w stosunku zawiesiny biotuszu do komórki 10:1, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 9 x 106 komórek/ml.
  5. Upewnij się, że biodrukarka jest wysterylizowana lub umieszczona w komorze z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność.
  6. Podłącz sterylne dysze drukarskie do wkładów zawierających mieszaniny zawiesiny biotuszu i komórek i włóż do biodrukarki.
  7. Skalibruj biodrukarkę ręcznie lub zgodnie z protokołami specyficznymi dla drukarki.
  8. Bioprint konstrukcji o strukturze kratowej, obciążonej komórkami, przy użyciu następujących parametrów drukowania: dysza stożkowa 25G pod ciśnieniem 25 kPa. Bioprint konstrukty bezkomórkowe (zmieszane z pożywką komórkową niezawierającą komórek) jako kontrola.
  9. Usieciować konstrukty, dodając roztwór jonowy 100 mM CaCl2 przez 5 minut. Przepłukać konstrukty i inkubować w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności względnej). Zmieniaj nośnik co drugi lub trzeci dzień.
  10. Pobrać próbki do analizy histologicznej w 2. i 4. tygodniu. Wybarwić próbki do produkcji kolagenu I za pomocą trichromowego barwnika Massona19.

Wyniki

Wyniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie podzielono na dwie sekcje. W pierwszej przeanalizowano żywotność komórek po mieszaniu metodą mechaniczną lub z użyciem jednostki do mieszania pasywnego. Następnie hodowano konstrukty chrząstki i skóry oraz analizowano je pod kątem odpowiednich markerów histologicznych.

Rozkład komórek wydawał się jednorodny w obu przypadkach. Jednak mieszanie ręczne za pomocą szpatułki (Rysunek 2b) wykazuje większą zmienność niż mieszanie z użyciem pasywnej jednostki mieszającej (Rysunek 2a). Zakres, prędkość i technika mieszania szpatułką są w dużym stopniu zależne od użytkownika. Natomiast wprowadzanie komórek do bioatramentu za pomocą pasywnej jednostki mieszającej standaryzuje proces i minimalizuje różnice między partiami. Co więcej, czas mieszania wynoszący 30, 60 i 90 s może być niewystarczający do wymieszania dużej liczby komórek z dużą ilością bioatramentu. W takich przypadkach konieczne może być bardziej intensywne mieszanie szpatułką. W porównaniu do tego, stosowanie pasywnej jednostki mieszającej pozwala lepiej zachować stosunek komórek do bioatramentu podczas blendowania i zapewnia przeprowadzenie jednorodnego mieszania. Dodatkowo, problemem w przypadku tradycyjnych technik mieszania jest utrata próbki, ponieważ ze względu na wysoką lepkość bioatrament może pozostać w szalkach Petriego, probówkach i narzędziach do mieszania. Żywotność komórek była wysoka przy mieszaniu w jednostce mieszającej (> 90%) 1, 2 lub 3 razy. Przy użyciu pasywnej jednostki mieszającej proces blendowania trwał około 1 min przy wolnej, stałej prędkości. Podczas gdy mieszanie szpatułką wykazało wysoką żywotność po 30 i 60 s mieszania, czas przekraczający 90 s doprowadził do znaczącego spadku żywotności w porównaniu z innymi grupami (77,9 ± 14%, p <0,05) (Rysunek 2c). Może to być spowodowane nadmiernym mieszaniem, które prowadzi do uszkodzenia komórek. Długoterminowe barwienie żywe/martwe po 14 i 28 dniach hodowli przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1. Komórki zaczynają się rozprzestrzeniać do 14. dnia, a do 28. dnia są silnie rozprzestrzenione, co wskazuje na dobrą żywotność.

Po hodowli oba analogi tkanki chrzęstnej i skórnej poddano analizie histologicznej. Analiza konstruktów chrzęstnych w dniach 0, 14 i 28 wykazuje wzrost ilości i zasięgu GAG, co zostało wykazane za pomocą barwienia błękitem Alcyjanem (Rysunek 3a-3c). W dniu 0 zauważono brak barwienia, natomiast w dniu 14 barwienie ograniczało się do obszarów w pobliżu komórek. Jednak do 28. dnia hodowli błękit Alcyjan występuje w całym konstrukcie, co świadczy o formowaniu się ECM chondrocytów. Biodrukowane konstrukty skóry przeanalizowano pod kątem barwienia histologicznego kolagenu I przy użyciu barwienia trichromem Massona (Rysunek 3d-3f). Podobnie jak w przypadku konstruktów chrzęstnych, próbki z dnia 0 nie wykazywały osadzania kolagenu. Do 14. dnia hodowli odnotowano znaczne osady kolagenu wokół komórek oraz wzdłuż powierzchni konstruktu. Zjawisko to uległo dalszemu nasileniu do 28. dnia, kiedy to na powierzchni i wewnątrz masy konstruktu stwierdzono obecność gęstych warstw kolagenu.

Schemat procesu filtracji strzykawkowej; kroki z oznakowanymi elementami dla konfiguracji eksperymentalnej w laboratorium.
Rysunek 1: System pasywnej jednostki mieszającej. (a) strzykawka 1 mL do zawiesiny komórkowej, (b) strzykawka 12 mL z biotuszem, (c) jednostka dozująca, (d) pasywna jednostka mieszająca, (e) wkład do napełniania, (f) montaż strzykawki z biotuszem (1) i strzykawki z zawiesiną komórkową (2) w jednostce dozującej, mocowanie pasywnej jednostki mieszającej do końców obu strzykawek (3), (g) przymocowanie żeńsko-żeńskiego konektora Luer lock (4) oraz montaż wkładu do napełniania (5) kończy proces montażu, (h) dociśnięcie jednostki dozującej w celu odpowietrzenia jednostki mieszającej (6), (i) dalsze naciskanie jednostki dozującej w celu wymieszania zawiesiny komórkowej z biotuszem i dozowania do wkładu do napełniania (7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Żywotność po mieszaniu komórek; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (a, b) i wykres słupkowy (c) do analizy.
Rysunek 2: Obrazy i analiza żywotności komórek. Reprezentatywne obrazy przedstawiające żywe (zielone) i martwe (czerwone) ludzkie fibroblasty po mieszaniu za pomocą pasywnej jednostki mieszającej 1, 2 lub 3 razy (a) lub szpatułką przez 30, 60 lub 90 sekund (b) oraz hodowli 3D przez 1 dzień. Przedstawiono obrazy przy powiększeniu 4X. Paski skali wskazują 200 µm. (c) Procent średniej żywotności ludzkich fibroblastów po mieszaniu za pomocą pasywnej jednostki mieszającej lub szpatułki i hodowli 3D przez 1 dzień. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe średniej, * 0,005. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe przedstawiające struktury komórkowe; barwione przekroje tkanek pod mikroskopem świetlnym.
Rycina 3: Tkankowo specyficzna depozycja macierzy zewnątrzkomórkowej. Biodrukowane konstrukty chrzęstne barwione na obecność glikozaminoglikanów z użyciem błękitu Alcian w dniu (a) 0, (b) 14 oraz (c) 28. Obrazy wykonane przy powiększeniu 5X. Biodrukowane konstrukty skóry barwione na obecność kolagenu I metodą trichromu Massona w dniu (d) 0, (e) 14 oraz (f) 28. Obrazy wykonane przy powiększeniu 5X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający hodowle komórkowe z zielonymi markerami fluorescencyjnymi do analizy.
Rysunek uzupełniający 1: Żywotność komórek w dniu 14 (a) oraz w dniu 28 (b). Pasek skali wynosi 200 µm, kolor zielony oznacza komórki żywe, a kolor czerwony komórki martwe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Jak wykazano w tym manuskrypcie, wstępnie komórkowane biotusze zostały poddane biodrukowi w celu wytworzenia analogów chrząstki lub skóry, które były hodowane przez okres do 4 tygodni. Żywotność komórek po zmieszaniu przy użyciu techniki pasywnego mieszania była wyższa niż w przypadku tradycyjnych metod mieszania. Dodatkowo, uproszczenie procesu mieszania za pomocą jednostki mieszającej minimalizuje liczbę etapów obsługi i pozwala na lepszą spójność w zakresie mieszania. Ostatecznie skutkuje to lepszą odtwarzalnością zarówno w rozmieszczeniu komórek w biotuszu, jak i w konstruktach i grupach eksperymentalnych. Odkładanie się specyficznych tkankowo składników ECM, takich jak GAG i kolagen I, obserwowano zarówno dla analogów chrząstki, jak i skóry, odpowiednio po 4 tygodniach hodowli. Wskazuje to na elastyczność zarówno techniki mieszania, jak i wybranej geometrii konstrukcji w celu wytworzenia różnych celów tkankowych. Wytwarzanie zarówno analogów chrząstki, jak i skóry wykazało elastyczność zarówno zastosowania biotuszu z alginianu nanocelulozy, jak i techniki biodruku dla różnych zmodyfikowanych celów tkankowych. Poniżej omówimy dwa elementy badania: (1) technikę pasywnego mieszania oraz (2) zachowanie komórek w analogach chrząstki i skóry.

Opracowanie i optymalizacja techniki mieszania zawiesiny komórkowej z biotuszem miały kluczowe znaczenie dla wytworzenia tych konstruktów. W przeciwieństwie do tradycyjnych materiałów hydrożelowych o niskiej lepkości, wysoka lepkość biotuszów powodowała trudności we wstępnej celularyzacji biotuszu przed drukowaniem. Jako alternatywę dla tradycyjnej metody wprowadzania komórek do biotuszu, opracowano i omówiono protokół jednoetapowego mieszania zawiesiny komórkowej z lepkim biotuszem. Dodatkowo oceniono praktyczne zastosowanie tej techniki mieszania w wytwarzaniu konstruktów tkankowych. To jednoetapowe podejście do mieszania ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami mieszania, w tym kontrolowane proporcje mieszania, minimalizację wysokich i nieregularnych naprężeń ścinających oraz zamknięty system eliminujący zamknięcie próbki w naczyniach mieszających. Istnieje jednak kilka krytycznych etapów tej techniki, aby zapewnić jej przewagę nad tradycyjnymi metodami mieszania komórek i biotuszu. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że komórki w strzykawce do komórek są zawieszone i dobrze wymieszane przed zmieszaniem. Zbyt duża przerwa czasowa między podnoszeniem i przenoszeniem komórek w strzykawce a rozpoczęciem procesu mieszania może spowodować osadzanie się komórek, co spowoduje nierównomierne mieszanie i rozprowadzanie w wydrukowanym włóknie. W przypadku zaobserwowania sedymentacji, prosta inwersja (2 - 3 razy) zespołu mieszalnika pasywnego bezpośrednio przed mieszaniem jest wystarczająca do ponownego zawieszenia komórek i zapewnienia równomiernego rozprowadzenia przed zmieszaniem. Bardzo ważne jest również, aby pęcherzyki powietrza w strzykawkach zostały wyeliminowane lub zminimalizowane przed zapewnieniem, że proporcje mieszania pozostają stałe. Jeśli przed zmiksowaniem we wkładzie z biotuszem pozostaną duże pęcherzyki powietrza, zaleca się, aby roztwór przepuścić przez jednostkę mieszającą dodatkowy czas, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Jeśli pozostaną pęcherzyki powietrza, delikatne stuknięcie w kasetę drukującą/strzykawkę może spowodować przemieszczenie resztek pęcherzyków powietrza. Dodatkowo, jeśli w przypadku bardziej złożonych konstrukcji konieczne jest mieszanie wielu materiałów (kilka jednostek mieszających lub materiałów), stężenia mieszanych biotuszy/zawiesin komórkowych muszą być dostosowane, aby zapewnić, że po rozcieńczeniu przez mieszanie nadal osiągane jest właściwe stężenie końcowe.

W porównaniu z innymi technikami mieszania, pasywna jednostka mieszająca jest nowatorskim podejściem do celularyzacji biotuszów. W przeciwieństwie do innych technik mieszania, takich jak mieszanie za pomocą podwójnej strzykawki lub mieszanie za pomocą szpatułki lub innego narzędzia, pasywna jednostka mieszająca zapewnia większą spójność mieszania w różnych partiach i użytkownikach. Charakter ręcznych technik mieszania, takich jak mieszanie szpatułką, skutkuje większą różnicą między użytkownikami w zakresie i szybkości mieszania. Ponadto systemy zamknięte, takie jak mieszalnik pasywny i mieszanie z podwójną strzykawką, mają niewielkie lub żadne straty próbki w porównaniu z ręcznym mieszaniem na szalce Petriego lub probówce.

Oba analogi tkanek wytworzone w tym manuskrypcie składały się z jednego rodzaju biotuszu i jednego lub dwóch typów komórek. Jednak biodrukowanie analogów tkanek, które składają się z architektur zawierających regiony odrębnych biotuszów z różnymi typami komórek, może być konieczne do wytworzenia bardziej fizjologicznych konstruktów tkankowych 20,21,22. Bardziej wyspecjalizowane biotusze o unikalnych składach lub funkcjach mogą być generowane poprzez mieszanie ze sobą kilku rodzajów istniejących biotuszy w celu stworzenia wielomateriałowych biotuszy o odrębnym składzie lub funkcjonalności23,24. Może to być szczególnie ważne w regionach przejściowych między tkankami, takich jak skóra do warstwy podskórnej lub obszar chrząstki do kości tkanki, w których gradient składu biotuszu25,26 może być konieczny do zapewnienia rozwoju tych krytycznych regionów znajdujących się w tkankach natywnych27. Dodatkowo, jednostka mieszająca może być wykorzystana do mieszania czynników wzrostu i morfogenów z biotuszami przed biodrukiem. Eliminacja strat próbki za pomocą zamkniętego systemu mieszania jest atrakcyjna ze względu na stosowanie drogich czynników bioaktywnych o niskim stężeniu, w przypadku których utrata próbki może skutkować zmianą ich końcowego stężenia w biodrukowanym konstrukcie, szczególnie gdy w grę wchodzą gradienty.

Ograniczeniem każdej techniki mieszania, w tym pasywnej jednostki mieszającej zastosowanej w tym badaniu, jest ryzyko uszkodzenia wrażliwych mechanicznie typów komórek. Na przykład wyizolowane komórki macierzyste, takie jak te ze szpiku kostnego lub zarodka, lub indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są bardziej podatne na uszkodzenia mechaniczne28,29. Akt mieszania powoduje nadmierne naprężenia mechaniczne na komórkach z powodu sił ścinających związanych z procesem mieszania i muszą one być zrównoważone, aby zachować żywotność30. Chociaż zastosowanie pierwotnych fibroblastów i chondrocytów w tym badaniu skutkowało dobrą żywotnością (Figura 2), konieczne są dalsze badania, aby określić bezpieczne szybkości i proporcje mieszania dla bardziej wrażliwych typów komórek. Do tego czasu zaleca się, aby mieszanie odbywało się w stałym, powolnym tempie, aby zmaksymalizować żywotność. Dodatkowo gęstość komórek wybrana w tym badaniu została określona na podstawie wcześniejszych badań1. Ta gęstość komórek może nie być idealna dla wszystkich typów komórek. W szczególności mieszanie komórek w wyższym stężeniu może powodować zwiększone kontakty komórka-komórka, co może poprawić żywotność komórek i tworzenie tkanek 31,32. W podobnym duchu, pasywna jednostka mieszająca może być stosowana do mieszania sferoid komórkowych lub innych agregatów komórkowych33 w biotusze.

Jak zaproponowano i wykazano w tym badaniu, pasywny system mieszania może szybko zmieszać zawiesinę komórkową z lepkim biotuszem. Chociaż ryzyko mechanicznego uszkodzenia komórek nadal pozostaje, podejście to pozwala na większą spójność w mieszaniu w ramach jednego badania i wśród użytkowników. Wstępnie ucelulataryzowane biotusze wykorzystujące to podejście wykorzystano do wytworzenia zarówno analogów chrząstki, jak i skóry, które były hodowane przez okres do 4 tygodni i wykazały osadzanie się specyficznych dla tkanki markerów ECM. Przyszłe badania będą koncentrować się na wykorzystaniu systemu pasywnych jednostek mieszających do mieszania specjalistycznych biotuszy ze standaryzowanych biotuszy w celu wytwarzania bardziej złożonych analogów tkanek.

Oświadczenia

Autorami tego manuskryptu są pracownicy firmy CELLINK LLC.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw STARTINKCELLINKSK0001Zestaw zawierający wszystkie elementy do procedury CELLMIXER
Live/Dead KitTechnologiesL3224Zestaw do analizy żywotności komórek po zmieszaniu
Masson's TrichromeSigma AldrichHT15-1KTKit do analizy depozycji kolagenu I w konstruktach skórnych
Alcian BlueSigma AldrichB8438-250MLZestaw do analizy odkładania się glikozaminoglikanu w konstruktach skórnych
Biodrukarka INKREDIBLE+CELLINKGen1+Drukarka wykorzystana w badaniu
DMEM z GlutamaxThermofisher10566016Pożywka do hodowli komórek
10% płodowej surowicy bydlęcejThermofisherA3160402Media suplement
Penicylina-StreptomycynaLife Technologies15070063Media suplement
Roztwór do obrazowania żywych komórekTermofisherA14291DJdo obrazowania na żywo/w stanie martwym
Mikroskop OlympusIX73wykorzystywał
kolorową kamerę cyfrowąZastosowanokamerę
Oprogramowanie do obrazowania cellSensOlympusn/aoprogramowanie stockowe z mikroskopem
ImageJNIHnie dotyczyoprogramowania do analizy obrazu typu open source
GraphPad Prism 7GraphPadn/aoprogramowanie do analizy statystycznej
Oprogramowanie Slic3r (v1.2.9)Slic3rn/aoprogramowanie typu open source do konwersji pliku .stl na gcode
primary adult human dermal fibroblastyATCCPCS-201-012źródło komórek dla fibroblastów
Life komponent wykorzystany przy użyciu mikroskopu odwróconego mikroskopową Olympus XC10

Bibliografia

  1. Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. 3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration. Bioprinting. 1, 22-35 (2016).
  2. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).
  3. Costantini, M., et al. Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo. Biomaterials. 131, 98-110 (2017).
  4. Fedorovich, N. E., et al. Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).
  5. Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. 3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes. Biofabrication. 8 (3), 032001(2016).
  6. Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes. Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).
  7. Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing of viable mammalian cells. Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).
  8. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
  9. Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003(2010).
  10. Derby, B. Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution. Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).
  11. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).
  12. Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. Active mixing of complex fluids at the microscale. Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).
  13. Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003(2010).
  14. Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).
  15. Niu, X., Lee, Y. -K. Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels. J Micromech Microeng. 13 (3), 454(2003).
  16. Liu, R. H., et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel. J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).
  17. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).
  18. Scott, J., Dorling, J. Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions. Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).
  19. Garvey, W. Modified elastic tissue-Masson trichrome stain. Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).
  20. Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
  21. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  22. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  23. Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).
  24. KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells. Biofabrication. 8 (2), 025011(2016).
  25. Gurkan, U. A., et al. Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets. Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).
  26. Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix. Biofabrication. 7 (4), 044105(2015).
  27. Lu, H. H., Thomopoulos, S. Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).
  28. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).
  29. Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells. Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).
  30. Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).
  31. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).
  32. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  33. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analog tkanki chrz stkianalog tkanki sk rymieszanie zawiesiny kom rkowejbioatrament z nanocelulozy i alginianuanaliza histologicznawizualizacja glikozaminoglikan wodk adanie kolagenu typu I
Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.