Artykuł metodologiczny

Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56389

⸱

8 listopada 2017

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Neurogenetics and Rare Diseases, IRCCS Neuromed

Autorzy korespondencyjni: Alba Di Pardo <dipardoa@hotmail.com>, Vittorio Maglione <vittorio.maglione@neuromed.it>

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy łatwą i efektywną procedurę oceny uszkodzenia bariery krew-mózg w stanach neurodegeneracyjnych. Aby osiągnąć nasz cel, wstrzyknęliśmy albuminę o wysokiej masie cząsteczkowej izotiocyjanianu fluoresceiny znakowanej (FITC) do żyły szyjnej myszy i oceniliśmy jej wyciek do miąższu mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Naruszenie integralności bariery krew-mózg (BBB) jest powszechną cechą różnych chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych. Chociaż wzajemne oddziaływanie między zaburzoną homeostazą BBB a patogenezą zaburzeń mózgu wymaga dalszych badań, opracowanie i walidacja wiarygodnej procedury dokładnego wykrywania zmian BBB może mieć kluczowe znaczenie i stanowić użyteczne narzędzie do potencjalnego przewidywania postępu choroby i opracowywania ukierunkowanych strategii terapeutycznych.

Tutaj prezentujemy łatwą i efektywną procedurę oceny przecieku BBB w stanie neurodegeneracyjnym, takim jak ten występujący w przedklinicznym mysim modelu choroby Huntingtona, w którym defekty przepuszczalności BBB są wyraźnie wykrywalne przedwcześnie w chorobie. W szczególności albumina o wysokiej masie cząsteczkowej izotiocyjanianu fluoresceiny znakowana (FITC), która jest w stanie przekroczyć barierę krew-mózg tylko wtedy, gdy ta ostatnia jest upośledzona, jest ostro podawana do żyły szyjnej myszy, a następnie określa się jej rozmieszczenie w obszarach naczyniowych lub miąższowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Nagromadzenie zielonej albuminy fluorescencyjnej w miąższu mózgu funkcjonuje jako wskaźnik nieprawidłowej przepuszczalności BBB, a po określeniu ilościowym za pomocą oprogramowania do przetwarzania Image J, jest zgłaszane jako intensywność zielonej fluorescencji.

Wprowadzenie

Homeostaza w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest warunkiem wstępnym prawidłowej komunikacji i funkcjonowania komórek nerwowych. Miąższ OUN jest szczelnie odizolowany od obwodu przez śródbłonkową barierę krew-mózg (BBB), która stanowi interfejs między obwodowym krwiobiegiem a mózgiem i odgrywa kluczową rolę w wzajemnym oddziaływaniu między tymi dwoma okręgami1,2. BBB jest złożoną i dynamiczną trójwymiarową strukturą składającą się głównie z wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mikronaczyń (EC) połączonych ze sobą międzykomórkowymi kompleksami połączeniowymi - ścisłymi połączeniami (TJ) - i otoczonych perycytami, zakończeniami neuronów i wyrostkami stopy astrocytów1,2.

W warunkach fizjologicznych, ekstremalnie niska przepuszczalność nienaruszonego BBB zapewnia ścisłą regulację transportu składników odżywczych i innych cząsteczek do i z mózgu, a także zapewnia CNS unikalną ochronę przed zmianami zachodzącymi w składzie krwi, które mogą wpływać na aktywność neuronalną oraz przed potencjalnymi uszkodzeniami obwodowymi1, 2,3.

Od dawna wiadomo, że zakłócenie integralności BBB i jego zwiększonej przepuszczalności stanowi kluczową cechę dla wielu zaburzeń neurologicznych i neurodegeneracyjnych4 w tym Choroby Huntingtona (HD)5,6, jednak nadal nie jest jasne, czy taka dysfunkcja jest zjawiskiem sprawczym, czy zdarzeniem propagacyjnym w przebiegu choroby. Czas załamania BBB również pozostaje nieuchwytny, jednak pojawiające się dowody naszej grupy i innych wskazują, że zaburzona integralność BBB nie stanowi późnego zdarzenia w progresji choroby, ale raczej wczesny krok6,7,8, co może mieć długoterminowe konsekwencje.

Mając to na uwadze, ważne jest, aby przedwcześnie ujawnić rozpad BBB w neurodegeneracji, aby opracować strategie przydatne do przewidywania postępu choroby i uszkodzenia mózgu oraz do opracowania alternatywnych i bardziej ukierunkowanych interwencji, które są w stanie skutecznie złagodzić kliniczne konsekwencje takiego zakłócenia. Wiarygodne obrazowanie upośledzenia bariery krew-mózg ma zatem ogromne znaczenie zarówno w badaniach eksperymentalnych, jak i klinicznym leczeniu chorób mózgu.

W tym artykule opisujemy udaną i prostą procedurę oceny przepuszczalności BBB w mysim modelu HD przy użyciu izotiocyjanianu fluorescenianu o wysokiej masie cząsteczkowej (albuminy FITC). Wynaczynienie albuminy FITC, która normalnie nie może przekroczyć bariery, do miąższu mózgu mierzono jako wskaźnik przecieku BBB. Technikę tę można łatwo dostosować do szczurów i innych stanów patologicznych charakteryzujących się upośledzeniem naczyń mózgowych9,10.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez IRCCS Neuromed Animal Care Review Board oraz przez "Istituto Superiore di Sanità" (numer zezwolenia: 1163/2015- PR) i były zgodne z wytycznymi Dyrektywy UE 2010/63/UE dotyczącej eksperymentów na zwierzętach.

1. Przygotowanie roztworu albuminy FITC do wstrzyknięcia do żyły szyjnej

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na 11-tygodniowych myszach HD R6/2 oraz na rodzeństwie z miotu typu dzikiego (WT) dopasowanego pod względem wieku i płci.

  1. Rozpuścić albuminę FITC-w proszku (patrz tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w stężeniu 10 mg/ml.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy je przygotować na świeżo dla każdej reakcji etykietowania.

2. Przygotowanie sprzętu do użycia podczas operacji

  1. Rozłóż wcześniej autoklawowane narzędzia chirurgiczne (patrz tabela materiałów).
  2. Wyczyść stół chirurgiczny alkoholem (70% roztwór etanolu). Przygotować pole operacyjne (45 cm x 45 cm) za pomocą sterylnego jednorazowego ręcznika chirurgicznego i ustawić operacyjny mikroskop stereoskopowy.

3. Zabieg chirurgiczny infuzji albuminy FITC do żyły szyjnej

  1. Zapisz masę ciała myszy do znieczulenia.
  2. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym (i.p) odpowiedniej dawki roztworu ketaminy (100 mg/kg) - ksylazyny (10 mg/kg).
  3. Monitoruj sedację zwierząt za pomocą delikatnego odruchu wycofania się z palca u nogi, jak wykazano w Walantus i wsp.11,12.
  4. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj cztery nogi i ogon do stołu chirurgicznego za pomocą taśmy klejącej.
  5. Po zabezpieczeniu myszy należy ostrożnie ogolić odpowiedni margines chirurgiczny na szyi za pomocą elektrycznej maszynki do golenia (patrz Tabela Materiałów) i zdezynfekować ją roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.
  6. Osusz odsłoniętą ogoloną powierzchnię bawełnianymi wacikami.
  7. Delikatnie podciągnij ogoloną skórę i wykonaj skalpelem podłużne nacięcie o długości 1,5 cm w linii środkowej obojczyka, zaczynając w połowie klatki piersiowej i sięgając tuż poniżej szyi.
  8. Ostrożnie rozciągnij tkankę łączną za pomocą kleszczy pod obserwacją mikroskopową (5-krotne powiększenie), aby odsłonić żyłę szyjną zewnętrzną.
  9. Zapewnić wystarczającą ilość miejsca po prawej i lewej stronie żyły szyjnej, aby ułatwić wprowadzenie igły 301/2 G do infuzji roztworu albuminy FITC.
  10. Wstrzyknąć zwierzęciu dożylnie (prawa żyła szyjna) powoli (przez 3 minuty) 100 μl 10 ml/kg albuminy FITC za pomocą igły 301/2 G.
  11. Po 15 minutach poddaj mysz eutanazji przez dekapitację, szybko usuń mózg z czaszki, jak opisano wcześniej13 i zanurz go na 15 minut w co najmniej 10-krotnie większej objętości samego mózgu po wstępnie schłodzonym izopentanie.
  12. Przenieść zamrożony izopentan mózg do wstępnie schłodzonej probówki i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia sekcji histologicznej.

4. Histologiczne wycinki mózgu nasączone albuminą FITC

  1. Osadź zamrożony mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz Tabela materiałów) przed sekcją kriostatu.
  2. Seryjnie pociąć mózg na odcinki o grubości 20 μm za pomocą kriostatu (patrz Tabela materiałów) i zamontować je na szkiełkach mikroskopowych.
  3. Przeprowadzić współbarwienie FITC-albumina/laminina przy użyciu specyficznego przeciwciała anty-lamininy (patrz Tabela Materiałów), jak opisano wcześniej6.
    1. Krótko mówiąc, inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-lamininą (pAb 1:1000) przez noc i postępować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z Cy3.
    2. Szkiełka nakrywkowe z podłożem montażowym zawierającym 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) (pik absorpcji = 360 nm; pik emisji = 460 nm (patrz tabela materiałów).
    3. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc w temperaturze 4 °C w ciemności.
    4. Obserwuj barwienie fluorescencyjne pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz tabela materiałów) przy 20-krotnym powiększeniu, wyposażonym zarówno w filtry FITC (pik absorpcji = 495 nm; pik emisji = 525 nm), jak i Cy3 (pik absorpcji = 550 nm; pik emisji = 570 nm).
      1. Aby obejrzeć próbki bezpośrednio po barwieniu, należy zabezpieczyć szkiełko nakrywkowe w rogach za pomocą lakieru do paznokci i zbadać je pod mikroskopem, jak powyżej (ppkt 4.3.3).

5. Ustawianie mikroskopu fluorescencyjnego i akwizycja kolorowych obrazów

  1. Ustaw mikroskop fluorescencyjny w następujący sposób.
    1. Włącz lampę fluorescencyjną na około 10 minut przed użyciem. Włącz mikroskop, podłączony komputer i aparat cyfrowy. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu (patrz Spis materiałów).
    2. Użyj odpowiedniego celu, aby uzyskać optymalne zbieranie sygnału i rozdzielczość przestrzenną, a następnie wybierz odpowiednie filtry.
  2. Akwizycja obrazów kolorowych
    1. Wybierz polecenie [na żywo] w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) i ustaw optymalne parametry oświetlenia dla każdego filtra.
    2. Wybierz polecenie [zablokuj], aby pobrać jednokanałowy kolorowy obraz i dodać pasek skali ("Edycja>Skala nagrywania")
    3. Zapisz każdy obraz w formacie ".tiff".
    4. Scal kanały w jeden obraz, wybierając opcję "Plik>Scal kanał" i zapisz go w folderze
    5. w formacie TIFF".
    6. Uzyskaj co najmniej cztery dwudziestoczterobitowe kolorowe obrazy (2200 μm x 3400 μm) na wycinek mózgu (6 sekcji na szkiełko).

6. Ocena wynaczynienia albuminy FITC

  1. Przeanalizuj intensywność fluorescencji dla każdego pojedynczego kanału, korzystając z ogólnodostępnego ImageJ14,15.
  2. Znormalizuj całkowitą intensywność sygnału fluorescencyjnego albuminy FITC przez całkowitą intensywność fluorescencji CY3-Lamininy na każdy obraz i zgłoś wynaczynioną albuminę na zewnątrz naczyń jako intensywność zielonej fluorescencji.

Wyniki

Prawidłowe wlewanie albuminy FITC do żyły szyjnej prowadzi do przenikania zielonego fluorescencyjnego znacznika z krwiobiegu do miąższu mózgu w przypadku uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB)6. W warunkach fizjologicznych dystrybucja wlewanej fluorescencyjnej albuminy jest ograniczona do wnętrza naczyń krwionośnych mózgu, a w otaczającym obszarze okołonaczyniowym i/lub w miąższu mózgu nie wykrywa się żadnego sygnału (Rysunek 1A, mikrografie na górze). Z kolei w sytuacjach neuropatologicznych, gdy BBB jest uszkodzona, albumina FITC wykazuje rozproszony wzór fluorescencji wzdłuż przestrzeni okołonaczyniowych oraz w miąższu mózgu (Rysunek 1A, mikrografie na dole). Do wyraźnej lokalizacji miejsca akumulacji albuminy FITC wykorzystano współbarwienie z markerem naczyniowym, lamininą (Rysunek 1A). Zwiększoną intensywność zielonej fluorescencji emitowanej przez albuminę FITC przy uszkodzonej BBB oceniono przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów) i określono jako intensywność zielonej fluorescencji (N = 3; 0.3112 vs 0.5765; ****, p = 0.0004, nieparametryczny test t) (Rysunek 1B). Intensywność albuminy FITC została znormalizowana zgodnie z powyższym opisem.

Porównanie przepuszczalności bariery krew-mózg; mikroskopia fluorescencyjna; wykres przedstawiający wzrost intensywności.
Rycina 1: Przeciekanie albuminy znakowanej FITC jako marker uszkodzenia BBB. (A) Reprezentatywne mikrografie fluorescencyjne krioprzekrojów mózgu wykazujące różnicowy rozkład zielonej fluorescencyjnej albuminy w zależności od zarówno w warunkach fizjologicznych (góra), jak i patologicznych (dół). Czerwone barwienie reprezentuje marker naczyniowy lamininę. Czasy ekspozycji: DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Tx Red 60 ms. Pasek skali = 100 µm (połącz monografię). (B) Wykres ten przedstawia ilościowe oznaczenie zielonej fluorescencji emitowanej przez albuminę FITC, raportowane jako intensywność fluorescencji zielonej (patrz krok 6.2), zarówno w warunkach fizjologicznych (zdrowa BHE), jak i patologicznych (uszkodzona BHE). N = 3. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, *** p = 0,0004 (nieparzysty test t). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Dyskusja

Technika, którą tutaj opisujemy, jest przede wszystkim przydatna do wykrywania wycieku z grupy krew-mózg w warunkach choroby mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg zyskuje na popularności jako powszechna cecha różnych zaburzeń neurologicznych4. Wcześniej używaliśmy tego podejścia do opisania wczesnego zaburzenia integralności BBB w mysim modelu rzadkiej choroby neurodegeneracyjnej, takiej jak HD6.

Metoda ta wykorzystuje względną prostotę i skuteczność procedury, która zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki. Stanowi bardzo czułe narzędzie do badań przedklinicznych i jest przydatne ze względu na szybkość i natychmiastowość, jakie oferuje w jakościowej ocenie zaburzeń BBB poprzez prostą wizualizację zielonej fluorescencji w wyciętej tkance mózgowej. Jednak w połączeniu z analizą biochemiczną i molekularną technika ta z powodzeniem dostarcza ilościowych informacji na temat strukturalnej i funkcjonalnej integralności śródbłonka naczyń krwionośnych i umożliwia analizę korelacji zaburzeń bariery krew-mózg z homeostazą mózgu.

Chociaż nie może dostarczyć żadnych informacji na temat ultrastruktury BBB, opisany tutaj protokół może skutkować mniej kosztownymi i czasochłonnymi procedurami w porównaniu z innymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa o wysokiej rozdzielczości16,17. Ponadto, ze względu na łatwą aplikację i powtarzalność, procedura może być przydatna do monitorowania postępujących zmian naczyniowych mózgu, które charakteryzują modele przedkliniczne zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Ogromna siła oceny rozerwania bariery krew-mózg za pomocą podejścia opartego na fluorescencji leży w potencjale zbadania roli subtelnych zmian w funkcji bariery krew-mózg w powszechnych i rzadkich zaburzeniach neurologicznych, a ostatecznie bezpośredniego przetestowania w czasie rzeczywistym wpływu leków wpływających na barierę krew-mózg lub cząsteczek endogennych po zastosowaniu z krwi lub przedziału mózgowego. Chociaż procedury tej nie można jeszcze przełożyć na ludzi, może ona dostarczyć wskazówek do opracowania nowych znaczników mózgu, które będą w przyszłości stosowane w praktyce klinicznej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez "Fondazione Neuromed" i finansowana przez włoskie Ministerstwo Zdrowia "Ricerca Corrente" dla V.M.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koncyjanian izotiocyjanianu albuminy i fluorescinySIGMAA9771-100MG
pAb anty-LamininNovus BiologicalsNB300-144
CY3 anty-królik wyprodukowany z kozyMILLIPOREAP132
SUPERFROST PLUSThermo ScientificJ1800AMNZ
Szkiełka nakrywkowe 24 X 50 mmThermo Scientific (DIAPATH)61050
Związek Kilik Optimal Temperature (OCT)Bio Optica05-9801
VECTASHIELD Media montażoweVECTORH-1500Media montażowe z DAPI
iNSu/Light Insulina Jednorazowa strzykawkaRAYS Zdrowie i Bezpieczeństwo INS1ML26G13
30G 1/2 "BD Microlance304000Igła do jednorazowej strzykawki z insuliną
Uchwyt skalpelaFST91003-12
#22 Jednorazowe ostrza skalpelaFST10022-00
Nożyczki do cienkiej tęczówki 10,5 cmF.S.T.14094-11
Kleszcze Dumont #5745 45° 0,10 x 0,06 mmFST11251-35
Kleszcze Graefe 10 cmF.S.T.11051-10
Kleszcze Dumont #5 0,1 X 0,06 mmFST11251-20
Łatka medycznaMedicalis34788
Sterylna jednorazowa zasłona na ręcznikDispotechTVO50VE
NIKONSMZ 745 T
Oświetlacz optyczny LED (C-FLED2)NIKON1003167Oświetlacz optyczny do stereoskopowego mikroskopu
Eclipse Ni-UNikon932162Mikroskop epifluorescencyjny
Mikroskop Aparat cyfrowyNikonDS-Ri2Kamera mikroskopowa
IntenslightNikonC-HGFILampa mikroskopowa
NIS-Elements 64-bitNikonAR 4.40.00Oprogramowanie analityczne
Elektryczna maszynka do goleniaGemeiGM-3007
Mikroskop stereoskopowy Oświetlacz optyczny

Bibliografia

  1. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
  2. Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
  3. Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40(2015).
  4. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  5. Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
  6. Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316(2017).
  7. Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
  8. van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615(2017).
  9. Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
  10. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239(2007).
  12. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404(2007).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
  15. Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
  16. Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419(2013).
  17. Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:

Maglione Vittorio

to:

Vittorio Maglione

Przeglądaj więcej artykułów

mikroskopia fluorescencyjnaanaliza w programie ImageJwstrzyknięcie do żyły szyjnejmiąższ mózguintensywność fluorescencji zielonej
Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.