Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Streszczenie

Badania w dziedzinie mikrobiologii opierają się na zastosowaniu szerokiego zakresu metodologii. W szczególności opracowanie odpowiednich metod w istotny sposób przyczynia się do dostarczenia szerokiej wiedzy na temat metabolizmu mikroorganizmów rosnących w chemicznie zdefiniowanych podłożach zawierających unikalne źródła azotu i węgla. W przeciwieństwie do tego, zarządzanie poprzez metabolizm wielu źródeł składników odżywczych, pomimo ich szerokiej obecności w środowisku naturalnym lub przemysłowym, pozostaje praktycznie niezbadane. Sytuacja ta wynika głównie z braku odpowiednich metodologii, co utrudnia prowadzenie dochodzeń.

Przedstawiamy eksperymentalną strategię, aby ilościowo i kompleksowo zbadać, jak działa metabolizm, gdy składnik odżywczy jest dostarczany jako mieszanina różnych cząsteczek, tj. złożony zasób. W tym miejscu opisujemy jego zastosowanie do oceny podziału wielu źródeł azotu przez sieć metaboliczną drożdży. Przepływ pracy łączy informacje uzyskane podczas eksperymentów ze znacznikiem stabilnych izotopów przy użyciu wybranych ¹³substratów znakowanych C lub ¹⁵N. Najpierw składa się z równoległych i powtarzalnych fermentacji w tym samym środowisku, które obejmuje mieszaninę cząsteczek zawierających N; Jednak za każdym razem oznaczane jest wybrane źródło azotu. Zastosowano kombinację procedur analitycznych (HPLC, GC-MS) w celu oceny wzorców znakowania docelowych związków oraz ilościowego określenia zużycia i odzysku substratów w innych metabolitach. Zintegrowana analiza całego zestawu danych zapewnia przegląd losów zużytych substratów w komórkach. Takie podejście wymaga dokładnego protokołu pobierania próbek – ułatwionego przez zrobotyzowany system monitorowania fermentacji online – oraz przeprowadzenia wielu czasochłonnych analiz. Pomimo tych ograniczeń pozwoliło to po raz pierwszy zrozumieć podział wielu źródeł azotu w całej sieci metabolicznej drożdży. Wyjaśniliśmy redystrybucję azotu z bardziej obfitych źródeł w kierunku innych N-związków i określiliśmy metaboliczne pochodzenie lotnych cząsteczek i aminokwasów proteinogennych.

Wprowadzenie

Zrozumienie, jak działa metabolizm mikroorganizmów, jest kluczowym zagadnieniem dla projektowania skutecznych strategii usprawniających procesy fermentacji i modulujących produkcję związków fermentacyjnych. Postępy w genomice i genomice funkcjonalnej w ciągu ostatnich dwóch dekad w znacznym stopniu przyczyniły się do poszerzenia wiedzy na temat topologii sieci metabolicznych w wielu mikroorganizmach. Dostęp do tych informacji doprowadził do opracowania podejść, które mają na celu kompleksowe spojrzenie na funkcje komórkowe¹. Metodologie te często opierają się na modelowej interpretacji mierzalnych parametrów. Te dane doświadczalne obejmują, z jednej strony, tempo wychwytu i produkcji metabolitów, a z drugiej strony, ilościowe informacje wewnątrzkomórkowe, które uzyskuje się z doświadczeń ze znacznikami izotopowymi. Dane te dostarczają informacji niezbędnych do wnioskowania o aktywności in vivo różnych szlaków w zdefiniowanej sieci metabolicznej^2,3,4. Obecnie dostępne techniki analityczne umożliwiają dokładne wykrywanie wzorców znakowania cząsteczek tylko w przypadku stosowania izotopu pojedynczego pierwiastka i ewentualnie w przypadku jednoczesnego znakowania z dwoma pierwiastkami izotopowymi. Co więcej, w większości warunków wzrostu źródło węgla składa się tylko z jednego lub dwóch związków. W związku z tym podejścia oparte na ¹³znacznikach izotopowych C z substratów węglowych zostały szeroko i skutecznie zastosowane w celu opracowania pełnego zrozumienia operacji sieci metabolicznej węgla^5,6,7,8.

Dla porównania, w wielu środowiskach naturalnych i przemysłowych, dostępne zasoby azotu, które wspierają rozwój mikroorganizmów, często składają się z szerokiej gamy molekuł. Na przykład podczas fermentacji wina lub piwa azot jest dostarczany w postaci mieszaniny 18 aminokwasów i amonu w różnych stężeniach⁹. Ten szereg związków N, które są dostępne dla anabolizmu, sprawia, że te złożone warunki podłoża znacznie różnią się od tych powszechnie stosowanych w badaniach fizjologicznych, ponieważ te ostatnie są osiągane przy użyciu unikalnego źródła azotu, zwykle amonu.

Ogólnie rzecz biorąc, zinternalizowane związki azotu mogą być bezpośrednio włączane do białek lub katabolizowane. Struktura sieciowa metabolizmu azotu w wielu mikroorganizmach, w tym w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, jest bardzo złożona w zależności od różnorodności substratów. Schematycznie, system ten opiera się na połączeniu centralnego rdzenia metabolizmu azotu, który katalizuje wzajemną konwersję glutaminy, glutaminianu i α-ketoglutaranu^10,11, z transaminazami i deaminazami. Poprzez tę sieć gromadzone są grupy aminowe z amonu lub innych aminokwasów i uwalniane są α-ketokwasy. Te produkty pośrednie są również syntetyzowane przez centralny metabolizm węgla (CCM)^12,13. Ta duża liczba reakcji rozgałęzionych i pośrednich, biorących udział zarówno w katabolizmie egzogennych źródeł azotu, jak i w anabolizmie aminokwasów proteinogennych, spełnia wymagania anaboliczne komórek. Aktywność poprzez te różne połączone ze sobą szlaki powoduje również wydalanie metabolitów. W szczególności α-ketokwasy mogą być przekierowywane przez szlak Ehrlicha w celu wytworzenia wyższych alkoholi i ich pochodnych estrów octanowych ¹⁴, które są niezbędnymi składnikami profili sensorycznych produktów. Następnie, sposób metabolizmu azotu odgrywa kluczową rolę w produkcji biomasy i tworzeniu lotnych cząsteczek (aromatu).

Reakcje, enzymy i geny biorące udział w metabolizmie azotu są obszernie opisane w literaturze. Jednak kwestia rozmieszczenia wielu źródeł azotu w całej sieci metabolicznej nie została jeszcze rozwiązana. Istnieją dwa główne powody, które wyjaśniają ten brak informacji. Po pierwsze, ze względu na dużą złożoność sieci metabolizmu azotu, do pełnego zrozumienia jej działania potrzebna jest duża ilość danych ilościowych, które do tej pory były niedostępne. Po drugie, wiele ograniczeń eksperymentalnych i ograniczeń metod analitycznych uniemożliwiało wdrożenie podejść, które wcześniej były stosowane do wyjaśnienia funkcji CCM.

Aby przezwyciężyć te problemy, zdecydowaliśmy się opracować podejście na poziomie systemu, które opiera się na uzgadnianiu danych z serii eksperymentów z izotopowymi znacznikami. Przepływ pracy obejmuje:
- Zestaw fermentacji przeprowadzanych w tych samych warunkach środowiskowych, przy czym za każdym razem oznaczane jest inne wybrane źródło składników odżywczych (substrat).
- Kombinacja procedur analitycznych (HPLC, GC-MS) w celu dokładnego określenia, na różnych etapach fermentacji, stężenia resztkowego znakowanego substratu oraz stężenia i wzbogacenia izotopowego związków, które pochodzą z katabolizmu znakowanej cząsteczki, w tym pochodzącej biomasy.
- Obliczenie masy i równowagi izotopowej dla każdej zużytej znakowanej cząsteczki oraz dalsza zintegrowana analiza zestawu danych w celu uzyskania globalnego przeglądu zarządzania wieloma źródłami składników odżywczych przez mikroorganizmy poprzez określenie proporcji strumienia.

Aby zastosować tę metodologię, należy zwrócić uwagę na powtarzalne zachowanie szczepu/mikroorganizmu między kulturami. Ponadto próbki z różnych kultur muszą być pobierane podczas tego samego, dobrze określonego postępu fermentacji. W pracach eksperymentalnych opisanych w tym manuskrypcie system wspomagany przez robota jest używany do monitorowania fermentacji online w celu uwzględnienia tych ograniczeń.

Ponadto, ważne jest, aby wybrać zestaw oznaczonych substratów (związek, rodzaj i położenie etykiety), który jest odpowiedni do rozwiązania naukowego problemu badania. Tutaj ^{wybrano 15}znakowanych N amonu, glutaminy i argininy jako trzy główne źródła azotu znajdujące się w soku winogronowym. Pozwoliło to na ocenę wzorca redystrybucji azotu od spożywanych związków do aminokwasów proteinogennych. Naszym celem było również zbadanie losów szkieletu węglowego spożywanych aminokwasów i ich udziału w produkcji cząsteczek lotnych. Aby osiągnąć ten cel, do badania włączono ^{jednolicie 13}znakowanych C leucyny, izoleucyny, treoniny i waliny jako aminokwasów pochodzących z głównych produktów pośrednich szlaku Ehrlicha.

Ogólnie rzecz biorąc, zbadaliśmy ilościowo, jak drożdże zarządzają złożonymi zasobami azotu, redystrybuując egzogenne źródła azotu, aby spełnić swoje wymagania anaboliczne podczas fermentacji, jednocześnie usuwając nadmiar prekursorów węgla w postaci lotnych cząsteczek. Procedura eksperymentalna opisana w tym artykule może być zastosowana do zbadania innych wielorakich źródeł składników odżywczych wykorzystywanych przez dowolny inny mikroorganizm. Wydaje się, że jest to odpowiednie podejście do analizy wpływu tła genetycznego lub warunków środowiskowych na zachowanie metaboliczne mikroorganizmów.

Protokół

1. Fermentacja i pobieranie próbek

1. Przygotowanie pożywek i fermentorów
   UWAGA: Wszystkie fermentacje są przeprowadzane równolegle, przy użyciu tego samego szczepu i w tym samym chemicznie zdefiniowanym pożywce syntetycznej (SM, skład podany w tabeli 1), która zawiera mieszaninę amonu i aminokwasów jako źródła azotu¹⁵. Do każdej fermentacji dostarczany jest pojedynczy związek azotu wyłącznie w postaci jednorodnie znakowanej ¹³C lub ¹⁵N (100%), podczas gdy pozostałe pozostają nieoznakowane. Dla każdego znakowanego źródła azotu, które jest używane w zestawie doświadczeń (tutaj: ¹⁵NH₄, ^U-15N4-Arg, ^U-15N2-Gln, ^U-13C6-Leu, ^U-13C5-Val, ^U-13C6-Ile, ^U-13C4-Thr) przygotowuje się dwa fermentory. Dla każdego warunku przeprowadza się podwójną fermentację przy użyciu tylko nieznakowanych cząsteczek (7 fermentacji kontrolnych).
   1. Dla każdego źródła azotu, które ma być badane, należy przygotować 500 ml pożywki SM, która zawiera wszystkie źródła azotu wymienione w tabeli 1, z wyjątkiem związku, który ma być stosowany w postaci znakowanej w 100%.
      UWAGA: Znakowana cząsteczka jest dodawana w kolejnych krokach.
   2. Pasteryzować każde podłoże w kolbie o pojemności 1 l (10 min, 100 °C) zawierającej mieszadło magnetyczne. Zważyć odpowiednią ilość znakowanej cząsteczki, aby osiągnąć końcowe stężenie podane w tabeli 1 i rozpuścić ją w pożywce.
   3. Wysterylizuj pożywkę za pomocą jednorazowego systemu filtracji próżniowej (membrana z octanu celulozy, 0,22 μm). Używając sterylnego cylindra miarowego, podziel pożywkę między dwa wstępnie wysterylizowane fermentory (250 ml), które zawierają mieszadło magnetyczne i są wyposażone w blokady fermentacyjne, aby uniknąć przedostawania się tlenu, ale umożliwić uwolnienie CO₂ .
   4. Podgrzać kolby fermentacyjne do temperatury 28 °C, umieszczając je w pomieszczeniu do inkubacji na 1 noc (temperatura ustawiona na 28 °C).
2. Inokulacja i monitorowanie fermentacji
   1. Szczep S. cerevisiae należy uprawiać w sterylnych probówkach zawierających 10 ml pożywki YPD w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez 12 godzin. Następnie odpipetować 1 ml kultury wstępnej YPD i przenieść ją do 10 ml pożywki SM (w sterylnych probówkach o pojemności 15 ml). Inkubować kulturę przez 12 godzin w temperaturze 28 °C, wytrząsając (150 obr./min).
   2. Pod wpływem przepływu laminarnego zebrać podwielokrotność prekultury i określić ilościowo populację komórek za pomocą elektronicznego licznika cząstek, który jest wyposażony w aperturę 100 μm. Odwirować kulturę wstępną (2 000 x g, 15 min, 4 °C) i zawiesić osad w odpowiedniej objętości sterylnej wody, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 x 10^{8 komórek}/ml. Zaszczepić każdy fermentor 1 ml zawiesiny komórkowej.
      UWAGA: Zrobotyzowany system służący do monitorowania postępu fermentacji jest opisany w Rysunek 1.
   3. Przygotuj platformę fermentacyjną, instalując fermentory w prowadnicach wsporczych, które są prawidłowo umieszczone na 21-pozycyjnych płytach mieszających i ustaw szybkość mieszania na 270 obr./min. Aby rozpocząć monitorowanie on-line każdej fermentacji, uruchom aplikację sterowania robotem, a następnie kliknij przycisk "rozpocznij test" i wybierz objętość fermentacji, która ma zostać przeprowadzona (300 ml).
   4. Wyświetlany interfejs pozwala na wskazanie liczby i położenia fermentorów na platformie. Aby upewnić się, że tak się stanie, kliknij prawym przyciskiem myszy lokalizację szczeliny i wybierz "włącz", aby aktywować monitorowanie fermentora znajdującego się w tym miejscu.
   5. Zainicjuj oprogramowanie obliczeniowe, które jest stale uruchomione w systemie, przed rozpoczęciem akwizycji masy. Kliknij przycisk "Inicjator" i zatwierdź przyciskiem "ok". Kliknij przycisk "Start" w aplikacji do sterowania robotem, aby rozpocząć akwizycję masy.
3. Procedura pobierania próbek
   UWAGA: Dla każdego fermentora próbki są pobierane, gdy produkcja CO₂ (wartość pokazana on-line na komputerze z uruchomionym oprogramowaniem obliczeniowym) osiągnie wymaganą wartość zadaną: 5, 10, 40 i 90 g/l w tym badaniu.
   1. Procedura pobierania próbek dla kultur ze znakowanymi związkami.
      1. Odwirować dwie próbki o pojemności 6 ml (2 000 x g, 5 min, 4 °C). Przechowywać i przechowywać zamrożone supernatanty w dwóch podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C. Przemyć granulki dwukrotnie 5 ml wody destylowanej i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu pomiaru wzbogacenia izotopowego.
   2. Procedura pobierania próbek dla kultur bez znakowanych związków
      1. Zbierz 10 ml kultury, która zostanie wykorzystana do oznaczenia suchej masy. Osadzać komórki z dwóch próbek o objętości 10 ml przez odwirowanie (2 000 x g, 5 min, 4 °C). Przemyć granulki dwukrotnie 10 ml wody destylowanej i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu oznaczenia zawartości białka i aminokwasów.

2. Kwantyfikacja zużytych źródeł azotu

1. Enzymatyczne oznaczanie resztkowych stężeń amoniaku
   UWAGA: Oznaczanie stężenia amoniaku w supernatantach przeprowadza się przy użyciu dostępnego w handlu zestawu na bazie enzymów; Wszystkie odczynniki są dostarczane przez producenta.
   1. Przygotować mianowany roztwór amoniaku (61,4 mg/l), rozpuszczając 25 mg precyzyjnie odważonego (NH₄)_2SO4 w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
   2. Aby spełnić zalecenia producenta, należy przeprowadzić rozcieńczenie 1:2 próbek, które zostały pobrane przed fermentacją i przy 5 g/l uwolnionego CO₂ . Doprowadzić pH próbek do około 8 poprzez dodanie 1 M KOH. Zwrócić uwagę na dodaną objętość i uwzględnić ją we współczynniku rozcieńczenia.
   3. W kuwetach spektrofotometru o pojemności 4 ml wymieszać 100 μl próbki (w razie potrzeby rozcieńczonej), wody destylowanej lub mianowanego roztworu amoniaku z 2 ml odczynnika 1 (0,75 mM ADP i 30 U/ml dehydrogenazy glutaminianu w buforze o pH 7,8) i 500 μl odczynnika 2 (1,3 mM NADH). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej i odczytać absorbancję NADH przy 340 nm (A1).
   4. Dodać 500 μl odczynnika 3 (60 mM α-ketoglutaranu w buforze o pH 8), inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej i odczytać absorbancję NADH przy 340 nm (A2).
   5. Obliczać stężenie amoniaku za pomocą:
      C_amoniak (g/L) = 0,083 x [(0,839 x A1 -A2)_próbka- (0,839 x A1 -A2)_{woda destylowana}]
   6. Sprawdzić, czy w roztworze wzorcowym uzyskano prawidłowe stężenie.
2. Chromatograficzne oznaczanie resztkowych stężeń aminokwasów
   UWAGA: Oznaczanie stężeń aminokwasów w supernatantach odbywa się za pomocą dedykowanego systemu analizy aminokwasów, który opiera się na chromatografii jonowymiennej z pokolumnową derywatyzacją N-związków z ninhydryną, co pozwala na ich kolorymetryczną detekcję.
   1. Przygotować roztwór wzorcowy, dodając 200 μl handlowej mieszaniny aminokwasów obojętnych i kwaśnych, 200 μl handlowej mieszaniny aminokwasów zasadowych i 200 μl 2,5 mM glutaminy do 400 μL 200 mM buforu cytrynianu litu o pH 2,2. Ten chemicznie zdefiniowany roztwór odniesienia traktuje się jako próbkę.
   2. Dodać 200 μl 25% (w/v) roztworu kwasu sulfosalicylowego, który zawiera 2,5 mM norleucyny (wzorzec wewnętrzny) do 800 μl próbki w celu usunięcia cząsteczek o dużej masie cząsteczkowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, odwirować (3 000 x g, 10 min, 4 °C) i przefiltrować przez membranę nitrocelulozową o wielkości porów 0,22 μm (system strzykawkowy).
   3. W oprogramowaniu programatora należy kliknąć przycisk "Uruchom", aby rozpocząć analizy chromatografii cieczowej (LC) z analizatorem wyposażonym w kolumnę kationowymienną (postać litowa). Eluować aminokwasy za pomocą kolejnych litu, aby utworzyć zarówno gradient pH, jak i gradient stężenia przeciwjonów w połączeniu z gradientem temperatury (tabela 2).
   4. Oznaczyć ilościowo związki azotu po derywatyzacji ninhydryny za pomocą detektora spektrofotometrycznego przy 570 nm (purpurowe zabarwienie: reakcja między ninhydryną a grupą aminową aminokwasów) i 440 nm (żółte zabarwienie: reakcja między ninhydryną a grupą iminową proliny).
   5. Przeprowadzić jednopunktową kalibrację wewnętrzną, używając roztworu odniesienia i norleucyny jako wzorca wewnętrznego, aby obliczyć stężenia aminokwasów w próbkach przy użyciu oprogramowania producenta.

3. Kwantyfikacja aminokwasów proteinogennych

1. Pomiar masy suchej komórki
   1. Przefiltrować 10 ml kultury przez filtr nitrocelulozowy (wielkość porów 0,45 μm), który jest wstępnie zważony w aluminiowym kubku, za pomocą urządzenia próżniowego. Przemyć dwukrotnie 50 ml wody destylowanej.
   2. Umieść filtr w aluminiowym kubku i susz w piekarniku grzewczym w temperaturze 105 °C przez 48 godzin (do momentu, gdy nie zaobserwuje się dalszej zmiany masy) przed ponownym ważeniem filtra w kubku. Oblicz różnicę masy.
   3. Oblicz średnią z co najmniej 3 niezależnych pomiarów, aby dokładnie określić suchą masę komórek kultury drożdży.
2. Kwantyfikacja zawartości białka w komórkach
   UWAGA: Kwantyfikacja frakcji białkowej komórek przeprowadza się co najmniej trzykrotnie przy użyciu nieznakowanych osadów komórkowych, które otrzymano w sposób opisany w sekcji 1.3.2.
   1. Ekstrahować białka przez dodanie 1 ml roztworu DMSO (50 % v/v) do zamrożonych granulek i inkubować w temperaturze 105 °C przez 1 godzinę w suchym piecu grzewczym.
   2. Określić ilościowo zawartość białka w ekstraktach DMSO za pomocą biochemicznego testu kolorymetrycznego, który opiera się na redukcji przez białka Cu⁺⁺ do jonów Cu⁺, które są dalej wytrącane przez kwas bicinchoninowy w niebieskim kompleksie (test BCA).
3. Oznaczanie względnego udziału aminokwasów w białkach
   UWAGA: Profil aminokwasów proteinogennych określa się co najmniej w trzech egzemplarzach z nieznakowanych osadów komórkowych (1.3.2.).
   1. Przygotuj utleniony ekstrakt, zawieszając osad komórkowy w 200 μl kwasu nadzwyczajnego (90% kwasu mrówkowego, 10% nadtlenku wodoru). Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 4 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 33,6 mg siarczanu sodu.
      UWAGA: Etap utleniania jest wymagany do przekształcenia cysteiny i metioniny w sulfon metioniny i kwas cysteinowy, które zostaną następnie określone ilościowo za pomocą chromatografii jonowymiennej. Jednak niektóre aminokwasy (tyrozyna, fenyloalanina, histydyna i arginina) ulegają denaturacji podczas utleniania. W związku z tym przygotowuje się dwa hydrolizaty (z utlenianiem i bez).
   2. Dodać 800 μl 6N HCl do granulek komórkowych lub utlenionego ekstraktu i inkubować próbkę w hermetycznie zamkniętej szklanej probówce przez 16 godzin w temperaturze 110 °C w suchym piecu grzewczym. Dodać 200 μl 2,5 mM norleucyny i usunąć HCl strumieniem azotu. Przemyć (ponownie zawiesić wysuszony ekstrakt, a następnie usunąć ciecz strumieniem azotu) dwukrotnie 800 μl wody destylowanej, a następnie 800 μl etanolu. Pobrać 800 μl 200 mM buforu octanu litu, pH 2,2,
      UWAGA: Należy zwrócić uwagę na czas inkubacji hydrolizy, ponieważ niektóre aminokwasy nie są stabilne w warunkach kwaśnych. Frakcja tryptofanu w białku jest szacowana na podstawie danych znalezionych w literaturze¹⁶, ponieważ aminokwas ten ulega całkowitej denaturacji podczas hydrolizy HCl.
   3. Przygotować wzorzec hydrolizatu do jednopunktowej kalibracji wewnętrznej. Dodaj 160 μl komercyjnego roztworu hydrolizowanych aminokwasów do 840 μl 200 mM buforu octanu litu o pH 2,2, który zawiera 625 μM sulfonu metioniny, 625 μM kwasu cysteinowego i 625 μM norleucyny.
   4. Oznaczyć względne stężenia aminokwasów w białkach za pomocą metody chromatograficznej opisanej w sekcji 2.2.
4. Obliczenia
   1. Obliczyć procentową zawartość wagową każdego aminokwasu w białkach, dzieląc zmierzoną ilość każdego aminokwasu (mg/L) przez całkowitą ilość aminokwasu, która została zmierzona w ekstrakcie białkowym (suma w mg/L).
   2. Pomnóż ten procent przez stężenie białek w kulturze (mg/L), tj. iloczyn między zawartością białka w biomasie a suchą masą, aby ocenić stężenie każdego aminokwasu białkowego w kulturze (mg/L).

4. Pomiar wzbogacenia izotopowego aminokwasów proteinogennych

UWAGA: Do pomiaru wzbogacenia izotopowego aminokwasów proteinogennych użyj oznaczonych granulek komórkowych. Na etapie derywatyzacji stosuje się trzy różne środki w celu ilościowego określenia wzbogacenia izotopowego aminokwasów. Intensywności jonów klastrowych są mierzone w celu oszacowania wzorców znakowania aminokwasów. Sygnał z każdego jonu klastra odpowiada obfitości izotopomerów masowych (m₀ = bez znakowania, m _{+ 1} = 1 znakowany atom, ...) fragmentu aminokwasu. Przykład chromatogramu, który jest uzyskiwany po procedurze DMADMF, znajduje się w Rysunek 2.

1. Hydroliza biomasy
   1. Hydrolizować granulki komórek (odpowiadające 1-2 mg wysuszonej biomasy) przez dodanie 1,2 ml 6 M HCl i inkubację próbki przez 16 godzin w temperaturze 105 °C w szczelnie zamkniętych szklanych probówkach w suchym piecu grzewczym.
   2. Dodaj 1,2 ml wody destylowanej i wiruj przy 3,000 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Rozprowadzić supernatant na sześć frakcji o objętości 400 μl w otwartych szklanych probówkach. Frakcje suszyć w piekarniku grzanym w temperaturze 105 °C do uzyskania konsystencji syropu (4-5 h).
2. Derywatyzacja chloromrówczanu etylu (ECF)
   1. Rozpuścić wysuszony hydrolizat w 200 μl 20 mM HCl, a następnie dodać 133 μl pirydyny:etanolu (1:4). Dodać 50 μl ECF do pochodnej aminokwasów i poczekać, aż cały CO₂ zostanie uwolniony. Przenieść mieszaninę do probówek wirówkowych, które zawierają 500 μl dichlorometanu w celu ekstrakcji derywatyzowanych związków.
   2. Wirować probówki przez 10 s i odwirowywać je przez 4 minuty przy 10 000 x g; zebrać dolną fazę organiczną za pomocą pipety Pasteura i przenieść do fiolek GC, które zawierają stożkowe wkładki szklane, tak aby próbki mogły być bezpośrednio wstrzykiwane do przyrządu GC/MS.
3. Derywatyzacja (N,N)-dimetyloformamidu dimetyloacetalu (DMFDMA).
   1. Wysuszony hydrolizat rozpuścić w 50 μl metanolu i 200 μl acetonitrylu. Dodać 300 μl DMFDMA. Wirować probówkę i przenieść próbki do fiolek z automatycznym podajnikiem próbek GC, które zawierają stożkowe wkładki szklane.
4. Derywatyzacja N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (BSTFA)
   1. Zawiesić hydrolizat w 200 μl acetonitrylu. Dodać 200 μl BSTFA, hermetycznie zamknąć szklaną probówkę i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 135 °C przed przeniesieniem ekstraktu bezpośrednio do fiolek GC.
5. Analiza GC-MS
   1. Analizować próbki za pomocą chromatografu gazowego, który jest wyposażony w wtryskiwacz automatycznego podajnika próbek i jest sprzężony ze spektrometrem masowym.
      1. Do sterowania urządzeniem i analizowania chromatogramów należy używać oprogramowania specyficznego dla danego urządzenia. W menu "Sekwencja" kliknij "Przykładowa tabela dziennika", aby utworzyć przykładową listę, a następnie kliknij przycisk "Uruchom", aby rozpocząć wstrzykiwanie.
         UWAGA: Chromatograf gazowy jest wyposażony w kolumnę kapilarną z krzemionki apolarnej o wymiarach 30 m x 0,25 mm i grubości warstwy 0,15 μm. Ustawić temperaturę kwadrupolową spektrometru mas na 150 °C i utrzymywać linię przesyłową na poziomie 250 °C dla wszystkich analiz. Stosowane są trzy programy analityczne, z których każdy jest specyficzny dla każdego czynnika derywatyzacji.
      2. Pochodne ECF: Użyj helu jako fazy ruchomej o przepływie 1,2 ml/min. Ustaw temperaturę wlotu na 230 °C, a źródła na 250 °C. Zaprogramuj automatyczny podajnik próbek tak, aby wstrzykiwał 1 μl próbek w stosunku podziału 3:1. Przeprowadzić analizy, stopniowo zwiększając temperaturę pieca w następujący sposób: 130 °C przez 3 minuty; nachylenie od 15 °C/min do 260 °C; Utrzymuj temperaturę na poziomie 260 °C przez 20 min.
      3. Pochodne DMFDMA: Użyj helu jako fazy ruchomej o stałym przepływie 1,2 ml/min. Ustaw temperaturę wlotu na 230 °C, a źródła na 250 °C. Zaprogramuj automatyczny podajnik próbek tak, aby wstrzykiwał 1 μl próbek w stosunku podziału 3:1. Przeprowadzić analizy, stopniowo zwiększając temperaturę pieca w następujący sposób: 60 °C przez 1 minutę; nachylenie od 20 °C/min do 130 °C; drugi gradient od 4 °C/min do 260 °C; Utrzymywać temperaturę 260 °C przez 10 min.
      4. Pochodne BSTFA: Stosować hel jako fazę ruchomą o stałym przepływie 1,2 ml/min. Ustawić temperaturę wlotu na 275 °C, a źródła na 300 °C. Uruchomić analizy (wtrysk: 1 μl), stopniowo zwiększając temperaturę pieca w następujący sposób: 110 °C przez 1 min; pierwszy gradient od 2 °C/min do 154 °C; drugi gradient od 5 °C/min do 300 °C; Utrzymywać temperaturę 300 °C przez 10 minut.
      5. Procedura wykrywania: Dla każdego trybu derywatyzacji wstrzyknąć próbkę (1 μl) w trybie SCAN z jonizacją dodatniego wpływu elektronów przy napięciu 70 eV i zwrócić uwagę na czas retencji każdego aminokwasu.
      6. Wartości te należy wykorzystać do zdefiniowania okien czasowych na całym chromatogramie oraz dla różnych wybranych jonów, które są charakterystyczne dla każdego aminokwasu i wymienione w tabeli 3; wartości te powinny być uwzględnione dla każdego aminokwasu. Uwzględnij te informacje w programie do wykrywania karty SIM i uruchom analizy w trybie SIM z jonizacją dodatniego wpływu elektronów przy napięciu 70 eV.
   2. Zbierz wyniki analiz, a mianowicie, dla każdego aminokwasu zapisz klaster intensywności, które odpowiadają jego różnym izotopomerom masowym. Przetwarzaj dane za pomocą dedykowanego oprogramowania¹⁷, aby skorygować naturalne znakowanie i obliczyć wzbogacenie izotopowe aminokwasów proteinogennych (zdefiniowanych jako znakowana frakcja aminokwasu w odniesieniu do jego całkowitej ilości w próbkach białkowych).
      UWAGA: Wzbogacenie izotopowe cząsteczki (I.E.), wyrażone w procentach, oblicza się, dzieląc sumę skorygowanych intensywności izotopomerów masowych z oznakowaniem (m₁, m₂, ...m_n) przez sumę skorygowanych intensywności wszystkich izotopomerów masowych (m₀, m₁, m₂,... m_n):
      I. E. = (m₁ + m₂ + ...+ m_n) / (m₀ + m₁+ m₂ + ...+ m_n)

5. Kwantyfikacja i wzbogacanie izotopowe związków lotnych

1. Ekstrakcja znakowanych związków lotnych
   1. Dodać 10 μl deuterowanych wzorców wewnętrznych do 5 ml supernatantu (końcowe stężenie związków deuterowanych: 100 μg/l) w szklanej probówce o pojemności 15 ml. Dodaj 1 ml dichlorometanu, szczelnie zamknij probówki i potrząsaj nimi na bujanej platformie przez 20 minut. Wirować przez 5 minut przy 3 000 x g i zebrać organiczną dolną fazę do szklanej probówki o pojemności 15 ml. Powtórzyć ekstrakcję dichlorometanem.
   2. Wysuszyć ekstrakt organiczny ponad 500 mg bezwodnego siarczanu sodu i zebrać fazę ciekłą za pomocą pipety Pasteura. Zagęścić ekstrakt czterokrotnie pod wpływem strumienia azotu i przenieść go do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek do pomiaru wag.
2. Kwantyfikacja GC-MS związków lotnych
   1. Wyposażyć chromatograf gazowy w kapilarną kolumnę kapilarną ze stopionej krzemionki o wymiarach 30 m x 0,25 mm i warstwie o grubości 0,25 μm i zastosować stały przepływ helu 1,0 ml/min. Utrzymać wtryskiwacz i przewód przesyłowy w temperaturze 250 °C.
   2. Wstrzyknąć 2 μl próbki w stosunku podziału 10:1 i oddzielić wyekstrahowane cząsteczki lotne, stosując następujący profil temperatury pieca: utrzymać temperaturę 40 °C przez 3 minuty, zwiększyć ją o 4 °C/min do 220 °C, a następnie utrzymać piec w temperaturze 220 °C przez 20 minut.
   3. Wykryć związki za pomocą spektrometru mas z temperaturą źródła ustawioną na 230 °C i temperaturą kwadrupolową spektrometru mas ustawioną na 150 °C. Zapisać widma masowe w trybie monitorowania wybranych jonów (SIM) z jonizacją dodatniego wpływu elektronów przy napięciu 70 eV i przy użyciu klastrów jonów specyficznych dla związków lotnych, które podano w tabeli 4.
   4. Użyj zewnętrznej kalibracji 7-punktowej, aby określić ilościowo stężenia lotnych cząsteczek na podstawie sum intensywności odpowiedniego klastra jonów. Przygotować roztwory podstawowe każdego związku (10 g/l) w 100% etanolu. Następnie przygotuj roztwory wzorcowe dla każdej klasy cząsteczek lotnych (estry etylu, octany, alkohole i kwasy), mieszając roztwory podstawowe. Na koniec rozcieńczyć różne ilości roztworów wzorcowych w 12% roztworze wodno-alkoholowym zawierającym 5 g/l kwasu winowego o pH dostosowanym do 3,3 w celu przygotowania roztworów kalibracyjnych.
   5. Równolegle należy skorygować naturalne znakowanie intensywności każdego klastra jonów i obliczyć wzbogacenie izotopowe związków lotnych, które definiuje się jako znakowaną frakcję cząsteczek i wyraża się w procentach za pomocą dedykowanego oprogramowania¹⁷.

6. Obliczenia dla zintegrowanej analizy zbioru danych

1. Gromadzenie surowych danych
   1. Korzystając z arkuszy kalkulacyjnych przedstawionych w tabelach 5, 6, 7 i 8, wprowadź wartości danych surowych, które odpowiadają stężeniu aminokwasów zewnątrzkomórkowych, suchej masie komórek, zawartości białka w komórkach, stężeniu cząsteczek lotnych oraz wzbogaceniu izotopowemu aminokwasów proteinogennych i cząsteczek lotnych.
      UWAGA: Dane przedstawione w tabelach są wyrażone w mM. Wszystkie wyniki są również wyrażane w mg/L przez pomnożenie wartości w mM przez masę cząsteczkową każdej cząsteczki lub w mg N/L przez pomnożenie milimolowego stężenia aminokwasu proteinogennego przez masę atomową azotu (14 u) oraz przez liczbę atomów azotu, które są dostarczane przez katabolizm tej cząsteczki.
   2. Obliczyć procent masowy każdego aminokwasu w białkach, dzieląc jego ilość w mg/l w hydrolizacie przez całkowitą ilość aminokwasów (ich suma w mg/l).
   3. Oblicz średnie, odchylenia standardowe i błędy standardowe średniej na podstawie danych uzyskanych w niezależnych eksperymentach.
   4. Obliczyć stężenie białkowe (mg/l) dla każdego aminokwasu, mnożąc procentową zawartość tego aminokwasu w białkach (mg aa/g białek) przez frakcję białkową w biomasie (g białek/g DW) i zawartość suchej masy (produkcja biomasy) w podłożu (g DW/l).
2. ^Eksperymentyze znacznikiem izotopowym 15 N
   1. Korzystając z arkuszy kalkulacyjnych przedstawionych w tabeli 9, oblicz znakowane i nieznakowane frakcje azotu, które są obecne w aminokwasach proteinogennych (wyrażonych w mg N/L) na podstawie ich całkowitych stężeń (wyrażonych w mg N/L) i ich wzbogaceń izotopowych. Dla każdego aminokwasu znakowana frakcja odpowiada produktowi między jego całkowitym stężeniem a wzbogaceniem izotopowym, a część nieznakowana jest różnicą między ilością całkowitą a oznaczoną na etykiecie.
   2. Następnie należy określić frakcję azotu całkowitego w białkach, która jest zawarta w aminokwasach proteinogennych oznaczonych ilościowo w tym badaniu, sumując całkowitą ilość Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu i Arg (w mg N/L) i dzieląc całkowitą ilość azotu zawartego w białkach przez tę sumę.
   3. Obliczyć azot dostarczony przez argininę, glutaminę lub amon, który został odzyskany w kwasach proteinogennych oznaczonych ilościowo w tym badaniu, sumując znakowaną frakcję (w mg N / L) aminokwasów proteinogennych, które zostały określone ilościowo w badaniu (Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu i Arg) podczas eksperymentów w obecności ¹⁵Arginina, glutamina lub amon znakowana azotem i dzieląc tę znakowaną frakcję azotu przez całkowitą ilość azotu w ilościowo oznaczonych aminokwasach proteinogennych.
   4. Oceń udział 3 najobficiej występujących aminokwasów w wewnątrzkomórkowej puli azotu wykorzystywanej do biosyntezy de novo, łącząc dane z doświadczeń ze znacznikiem izotopów ¹³C i ¹⁵N (arkusz kalkulacyjny w tabeli 7).
   5. Od całkowitej ilości (wyrażonej w mM) proteinogennych Val, Leu, Ile lub Thr odejmij część pochodzącą z bezpośredniego włączenia zużytych związków (eksperymenty ¹³C) i część, która została zsyntetyzowana de novo przy użyciu azotu z 3 głównych źródeł, aby ocenić frakcję, która została zsyntetyzowana de novo przy użyciu azotu z innych aminokwasów.
   6. Następnie oblicz stosunek ilości aminokwasu de novo syntetyzowanego przy użyciu azotu dostarczonego przez Gln, Arg i NH₄⁺ (suma wyrażona w mM) do całkowitej ilości aminokwasów proteinogennych (w mM), aby określić ilościowo udział argininy, glutaminy i amonu w wewnątrzkomórkowej puli azotu.
3. ^Eksperymentyze znacznikiem izotopowym 13 C
   1. Obliczyć znakowane i nieznakowane frakcje aminokwasów proteinogennych ze stężeń wyrażonych w mM i wzbogaceń izotopowych aminokwasów proteinogennych, które uzyskano podczas doświadczeń w obecności ¹³znakowanych C Leu, Val, Ile lub Thr. (patrz 6.2.1, tabela 10).
   2. Obliczyć znakowane i nieznakowane frakcje związków lotnych ze stężeń wyrażonych w mM i wzbogaceń izotopowych związków lotnych, które uzyskano podczas eksperymentów w obecności ¹³znakowanych C Leu, Val, Ile lub Thr znakowanych C (Tabela 10).

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia schematyczny schemat przepływu pracy, który został wdrożony w celu zbadania zarządzania przez drożdże wieloma źródłami azotu, które znajdują się podczas fermentacji wina.
Dla różnych punktów pobierania próbek, parametry biologiczne – charakterystyka wzrostu, wzorce zużycia azotu i profil aminokwasów proteinogennych – wykazują wysoką odtwarzalność wśród fermentacji (Rysunek 4). Ta spójność potwierdza przydatność po...

Dyskusja

Ilościowe określenie podziału związków w sieciach metabolicznych przy użyciu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi jest obiecującym podejściem do zrozumienia działania metabolizmu drobnoustrojów. Metodologia ta, choć z powodzeniem stosowana z jednym lub dwoma znakowanymi substratami, nie może być obecnie wdrożona do badania metabolizmu różnych źródeł przy użyciu wielu znakowanych izotopów pierwiastkowych (tj. więcej niż dwóch substratów). Rzeczywiście, dostępne techniki analityczne umożliwiają dokładne określ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-Glukoza	PanReac	141341.0416
D-Fruktoza	PanReac	142728.0416
Kwas DL-jabłkowy	Sigma Aldrich	M0875
Kwas cytrynowy jednowodny	Sigma Aldrich	C7129
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma Aldrich	P5379
Siarczan potasu	Sigma Aldrich	P0772
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma Aldrich	230391
Dwuwodny chlorek wapnia	Sigma Aldrich	C7902
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S9625
Chlorek amonu	Sigma Aldrich	A4514
Wodorotlenek sodu	Sigma Aldrich	71690
Siarczan manganu jednowodny	Sigma Aldrich	M7634
Siarczan siedmiowodny	Sigma Aldrich	Z4750
Siarczan miedzi (II) pięciowodny	Sigma Aldrich	C7631
Jod potasu	Sigma Aldrich	P4286
Sześciowodny chlorek kobaltu (II)	Sigma Aldrich	C3169
Kwas borowy	Sigma Aldrich	B7660
Heptamolibdenian amonu	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inozytol	Sigma Aldrich	I5125
Kwas D-pantotenowy sól hemiwapniowa	Sigma Aldrich	21210
Tiamina, chlorowodorek	Sigma Aldrich	T4625
Kwas nikotynowy	Sigma Aldrich	N4126
Pirydoksyna	Sigma Aldrich	P5669
Biotyna	Sigma Aldrich	B4501
Ergosté rol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Absolutny etanol	VWR Chemicals	101074F
Sześciowodny chlorek żelaza (III)	Sigma Aldrich	236489
Kwas L-asparaginowy	Sigma Aldrich	A9256
Kwas L-glutaminowy	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanina	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginina	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteina	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamina	Sigma Aldrich	G3126
Glicyna	Sigma Aldrich	G7126
L-Histydyna	Sigma Aldrich	H8000
L-Izoleucyna	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucyna	Sigma Aldrich	L8000
L-Lizyna	Sigma Aldrich	L5501
L-Metionina	Sigma Aldrich	M9625
L-Fenyloalanina	Sigma Aldrich	P2126
L-Prolina	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-treonina	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptofan	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrozyna	Sigma Aldrich	T3754
L-Walina	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Walina	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucyna	Eurisotop	CLM-2262-H-0,25
15Chlorek N-amonu	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamina	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-arginina	Eurisotop	NLM-396-PK
Octan etylu	Sigma Aldrich
Propanian etylu	Sigma Aldrich	112305
2-metylopropanian etylu	Sigma Aldrich	246085
Butanian etylu	Sigma	Aldrich E15701
2-metylobutanian etylu	Sigma Aldrich	306886
3-metylobutanian etylu	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Heksanian etylu	Sigma Aldrich	148962
Oktanian etylu	Sigma Aldrich	W244910
Dekanian etylu	Sigma Aldrich	W243205
Dodekanian etylu	Sigma Aldrich	W244112
Mleczan etylu	Sigma Aldrich	W244015
Bursztynian dietylu	Sigma Aldrich
octan 2-metylopropylu	Sigma Aldrich	W217514
octan 2-metylobutylu	Sigma Aldrich	W364401
octan 3-metylobutylu	Sigma Aldrich	287725
octan 2-fenyloetylu	Sigma Aldrich	290580
2-metylopropanol	Sigma Aldrich	294829
2- metylobutanol	Sigma Aldrich	133051
3-metylobutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-fenyloetanol	Sigma Aldrich	77861
Kwas propanowy	Sigma Aldrich	94425
Kwas butanowy	Sigma Aldrich	19215
Kwas 2-metylopropanowy	Sigma Aldrich	58360
Kwas 2-metylobutanowy	Sigma Aldrich	193070
Kwas 3-metylobutanowy	Sigma Aldrich	W310212
Kwas heksanowy	Sigma Aldrich	153745
Kwas oktanowy	Sigma Aldrich	W279900
Kwas dekanowy	Sigma Aldrich	W236403
Kwas dodekanowy	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermentor ręcznie robiony do fermentacji
Jednorazowy system filtracji próżniowej	Dominique Deutscher	029311
Fermentory (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermentor ręcznie robiony do fermentacji
Sterylne rurki	Sarstedt	62.554.502
Zamki fermentacyjne	Legallais	AT1356	Zamki fermetacyjne ręcznie robione do fermentacji
Ekstrakt z drożdży baktonowych	Becton, Dickinson and Company	212750
Bactopeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Wytrząsarka do inkubatora	Infors HT
Licznik cząstek	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter
Counter Wirówka	Jouan		GR412
Plate Butler System robotyczny	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic Instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Oprogramowanie do monitorowania robotów
RobView			Opracowane przez nas oprogramowanie obliczeniowe
My SQL			Międzynarodowa baza źródeł
Mieszadła wielopunktowe Cimarec i Telesystem	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
Platforma BenchBlotter rocker	Dutscher	60903
Zestaw enzymatyczny amoniaku	R-Biopharm AG	5390
Kuwety spektrofotometru	VWR	634-0678
Spektrofotometr UviLine 9400	Secomam
Standardy aminokwasów fizjologiczne - kwasowe i neutralne	Sigma Aldrich	A6407
Wzorce aminokwasów fizjologiczne - podstawy	Sigma Aldrich	A6282
litowe cytrynianu - Odczynnik Ultra ninhydryny	Biochrom	BC80-6000-06
Kwas sulfosalycylowy	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Oprogramowanie do sterowania instrumentami i analizy danych
Żywica Ultropac 8 Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	kolumnowy o wysokiej rozdzielczości
Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (wielkość porów 0,22 i mikro; m)
Filtr membranowy PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0,45µ
m Pompa próżniowa Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminiowa gładka półmisek wagowa 70mm	VWR	611-1380
Waga precyzyjna	Mettler		Dane techniczne AE163
Suszony dimetylosulfoksydek	Merck	1029310161	(maks. 0,025% H2O) Piec
do spalania	SeccoSolv Legallais
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Interchim	UP40840A
Kwas mrówkowy	Fluka	94318
Nadtlenek wodoru	Sigma Aldrich	H1009
Kwas solny dymiący 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Bufor octanu litu	Biochrom	80-2038-10
Komercyjny roztwór hydrolizowanych aminokwasów	Sigma Aldrich	AAS18
L-metionina sulfon	Sigma Aldrich	M0876
L-cysteinowy monohydrat Sigma	Aldrich	30170
Probówki hodowlane ze szkła pyrexowego	Sigma Aldrich	Z653586
Pirydyna	Acros Organics	131780500	99% ekstraczysty
chloromrówczan etylu	Sigma Aldrich	23131
Dichlorometan	Fiolki Sigma Aldrich	32222
	Sigma Aldrich	854165
Mikrowkładki do fiolek 1,5 ml	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Oprogramowanie do kontroli i analizy danych
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, do HPLC
Acetonitryl	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, do HPLC
N,N-Dimethylformamide dimetyloacetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS kolumna	Agilent Technologies	122-4731	30 m * 0,25 mm * 0,15 i mikro; m
Siarczan sodu, bezwodny	Sigma Aldrich	238597
Azot techniczny	Produkty powietrzne	14629
Kolumna Zebron ZB-WAX	Phenomenex	7HG-G007-11	30 m * 0,25 mm * 0,25 i mikro; m
Helium BIP	Air products	26699
Szklane pipety Pasteura	VWR	612-1702