Artykuł metodologiczny

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56394

⸱

15 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, Histology and Embryology, Medical University of Graz, 2Institute of Pathology, Medical University of Graz, 3Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine ITEM, 4Department of Tumor Biology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 5Sahlgrenska Cancer Center, University of Gothenburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Streszczenie

Rzadkie komórki docelowe mogą być izolowane z wysokiego tła komórek niedocelowych za pomocą przeciwciał specyficznych dla białek powierzchniowych komórek docelowych. Niedawno opracowana metoda wykorzystuje drut medyczny funkcjonalizowany przeciwciałami przeciwko cząsteczkom adhezji komórek przeciwnabłonkowych (EpCAM) do izolacji in vivo krążących komórek nowotworowych (CTC)1. Kohorta dopasowana do pacjentów w raku gruczołu krokowego bez przerzutów wykazała, że technika izolacji in vivo skutkowała wyższym odsetkiem pacjentów z dodatnim wynikiem CTC, a także wyższą liczbą CTC w porównaniu z obecnym złotym standardem w liczeniu CTC. Ponieważ komórek nie można odzyskać z obecnych urządzeń medycznych, wyprodukowano nowy funkcjonalizowany drut (określany jako urządzenie) umożliwiający wychwytywanie, a następnie odłączanie komórek za pomocą obróbki enzymatycznej. Komórki mogą przyczepiać się do urządzenia, wizualizować je pod mikroskopem i odłączać za pomocą obróbki enzymatycznej. Odzyskane komórki są cytowirowane na szkiełkach pokrytych membraną i pobierane pojedynczo za pomocą mikrodysekcji laserowej lub mikromanipulacji. Próbki z pojedynczych komórek są następnie poddawane amplifikacji całego genomu pojedynczej komórki, co pozwala na wielokrotną analizę, w tym badania przesiewowe i podejścia specyficzne dla celu. Procedura izolacji i odzyskiwania pozwala uzyskać wysokiej jakości DNA z pojedynczych komórek i nie upośledza późniejszej amplifikacji całego genomu (WGA). Amplifikowane DNA pojedynczej komórki może zostać przekazane do badań przesiewowych i/lub analizy ukierunkowanej, takiej jak porównawcza hybrydyzacja genomu (array-CGH) lub sekwencjonowanie. Urządzenie umożliwia izolację ex vivo ze sztucznych próbek rzadkich komórek (tj. 500 komórek docelowych wzbogaconych o 5 ml krwi obwodowej). Podczas gdy tempo odklejania komórek jest dopuszczalne (50 - 90%), wskaźnik odzyskiwania komórek oderwanych od szkiełek obejmuje szeroki zakres w zależności od użytej linii komórkowej (<10 - >50%) i wymaga dalszej uwagi. To urządzenie nie jest dopuszczone do stosowania u pacjentów.

Wprowadzenie

Niedawno, CellCollector DC01, przewód medyczny wyposażony w przeciwciała anty-EpCAM do izolowania CTC z krwi obwodowej pacjentów z rakiem, został dodany do metodycznego spektrum enumeracji CTC1,2,3. W trwającym obecnie badaniu nad rakiem gruczołu krokowego bez przerzutów, ten funkcjonalizowany drut zgłasza prawie dwa razy więcej pacjentów z dodatnim CTC i wyższą liczbę CTC u pacjentów z dodatnim CTC w porównaniu z CellSearch, złotym standardem w liczeniu CTC3. Ze względu na tę zachęcającą wydajność, pożądana byłaby izolacja komórek z funkcjonalizowanego przewodu medycznego do analizy pojedynczej komórki, ale ani leczenie enzymatyczne roztworami odłączającymi komórki (np. trypsyną), ani mikrodysekcja laserowa nie pozwalają na odzyskanie nienaruszonych komórek (dane nie pokazane).

Aby umożliwić odłączenie przechwyconych komórek, nowa generacja funkcjonalizowanych przewodów została wyposażona w specyficzny polimer. Ten polimer, który łączy przeciwciała wychwytujące z drutem, jest podatny na leczenie buforem uwalniającym, co pozwala na oderwanie nienaruszonych komórek (CellCollector DC03 określany jako urządzenie). Nowe funkcjonalizowane urządzenie umożliwia izolację komórek docelowych z różnych stężeń komórek linii komórek nowotworowych wzbogaconych odpowiednio do albuminy surowicy bydlęcej (BSA) / soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i krwi obwodowej.

Aby ułatwić wizualne wykrywanie komórek na urządzeniu i po odzyskaniu, docelowe komórki rakowe są znakowane estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) i barwnikiem DNA przed leczeniem (tj. ładowaniem i odłączaniem). Wpływ leczenia na jakość DNA pojedynczych komórek został wcześniej oceniony po WGA za pomocą kontroli jakości PCR4,5, array-CGH6,7 i sekwencjonowaniu celowanym7 nie wykazując różnicy w porównaniu z komórkami niepoddanymi działaniu substancji mikromanipulowanych z zawiesin komórkowych7. Zaletą tej metody jest połączenie rzadkiego wstępnego wzbogacania komórek docelowych i odzyskiwania komórek do dalszej analizy pojedynczej komórki (Rysunek 1). Obecne urządzenie do pobierania próbek in vivo z oznakowaniem CE jest zwykle używane do liczenia CTC, a nie do charakterystyki molekularnej pojedynczej komórki2,8. Jednak bardziej kompleksowa analiza mająca na celu zbadanie heterogeniczności wśród CTC wymaga analizy na poziomie pojedynczej komórki (tj. ukierunkowanego sekwencjonowania na poziomie pojedynczej komórki). Inne metody oparte na komórkach opierają się na immunomagnetycznej izolacji EpCAM-dodatnich CTC i obsłudze pojedynczych komórek w oparciu o dielektroforezę w celu późniejszej molekularnej analizy genetycznej9,10. Charakterystyka molekularna CTC jest ważnym wymogiem dla ich użytecznego wdrożenia w warunkach klinicznych i jest równie ważna w podstawowych badaniach kaskady przerzutowej. Równolegle do CTC, krążące DNA guza (ctDNA) stało się bardzo ważne, ponieważ umożliwia analizę DNA obciążenia guza przy minimalnych procedurach technicznej izolacji11,12. Podejścia oparte na komórkach mogą służyć jako wkład uzupełniający, ponieważ pozwalają na analizę ekspresji RNA13,14 i protein15, a także dla hodowli komórkowych pochodzących z CTC lub ksenoprzeszczepów16,17. Chociaż nadal trzeba pokonać przeszkody, takie jak niska regeneracja komórek i zezwolenie na stosowanie u pacjentów, metoda "złów i wypuść" stanowi ważny kolejny krok w kierunku scharakteryzowania rzadkich komórek docelowych.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Grazu (25-240 ex 12/13). Krew obwodową do eksperymentów z pobrano od zdrowych osób.

UWAGA: Ten protokół opisuje izolację komórek HT-29 (linia komórkowa ludzkiego raka jelita grubego) z PBS lub ze sztucznych mieszanin komórek HT-29 i krwi obwodowej. Ten sam eksperyment przeprowadzono z dwiema dodatkowymi liniami komórkowymi (LNCaP i VCaP, dane eksperymentalne w reprezentatywnych wynikach) i teoretycznie można go przeprowadzić ze wszystkimi komórkami wykazującymi ekspresję EpCAM.

1. Przygotowanie komórek docelowych

  1. Hodowla komórkowa i znakowanie komórek
    UWAGA: W tym protokole komórki są hodowane w kolbach hodowlanych o powierzchni 75 cm². Proszę odpowiednio dostosować ilość odczynników, jeśli używane są inne urządzenia do hodowli komórkowych (np. szalki do hodowli o powierzchni 25 cm², płytki 6-dołkowe itp.). Wszystkie używane płyny są wstępnie podgrzewane do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie kroki protokołu są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT).
    1. Hodowla komórek HT-29 w zmodyfikowanej pożywce McCoy's 5a uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 20 mM Hepes, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
    2. Gdy komórki są w 90% zlewne, usuń pożywkę i przepłucz komórki 10 ml 1x PBS.
    3. W celu pobrania komórek należy dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek (tabela materiałów i odczynników) do komórek i inkubować komórki przez około 5 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Roztwór oddzielający zawiera enzymy proteolityczne i kolagenolityczne w 1x PBS, 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 3 mg/L czerwieni fenolowej. Skrócić czas wstępnego podgrzewania roztworu do oddzielania komórek do minimum, ponieważ stanie się on nieaktywny po 1 godzinie w temperaturze 37 °C. Przykryj całą warstwę komórek, aby uzyskać optymalne oddzielenie komórek.
    4. Sprawdź oderwanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu.
    5. Przenieść wszystkie oderwane komórki do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych (takiej samej, jak użytej w kroku 1.1.1) i ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie.
    6. Umieść pozostałą zawiesinę komórek na poziomym mieszadle rolkowym w temperaturze pokojowej i przejdź do etapu etykietowania.
  2. Znakowanie żywych komórek docelowych
    1. Rozcieńczyć 1 μL 5 mM CFSE (dostarczanego w dimetylosulfotlenku dimetylu, DMSO) w 1 ml 1x PBS wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C w celu uzyskania 5 μM gotowego do użycia roztworu do etykietowania CFSE.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki barwienia, używaj świeżo przygotowanych roztworów.
    2. Przygotować gotowy do użycia roztwór do barwienia DNA (Tabela materiałów i odczynników) w 1x PBS i przechowywać w temperaturze 2 - 6 °C, chronić przed światłem.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki barwienia, używaj świeżo przygotowanych roztworów.
    3. Pobrać komórki z poziomego mieszalnika rolkowego (krok 1.1.6.) i granulować komórki w temperaturze 300 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml 1x PBS.
    4. Ponownie przepłukać komórki 1x PBS i ponownie zawiesić osad komórek w 500 μl gotowym do użycia roztworze do etykietowania CFSE.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 15 minut i zbierać komórki po odwirowaniu w temperaturze 300 x g przez 3 minuty.
    6. Zawiesić znakowane komórki w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom na regenerację w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    7. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić granulki komórek w 1 ml gotowego do użycia roztworu do barwienia DNA w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    8. Osadzać komórki, usuwać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml 1x PBS. Ocenić gęstość komórek za pomocą hemocytometru i sprawdzić znakowanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (Rysunek 2A i 2E).
    9. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić osad komórkowy zgodnie z gęstością komórek potrzebną do odpowiedniego doświadczenia, jak podano w następnej sekcji, i umieścić na lodzie.

2. Ładowanie przewodu

UWAGA: Komórki mogą być izolowane z komórek docelowych/obwodowych w skali mililitrowej lub poprzez dostarczenie małej liczby komórek w skali mikrolitrowej. Podczas gdy pierwsze podejście pozwala na naśladowanie stanu rzadkich komórek we krwi obwodowej, drugie może być preferowanym sposobem przyłączania kilku komórek w celu optymalizacji/testowania protokołu.

  1. Ładowanie drutu za pomocą dużej objętości zawiesin ogniw
    1. Przygotować 2% roztwór blokujący BSA, rozpuszczając 0,8 g BSA w 40 ml 1x PBS (zastosowanie w hodowli komórkowej). Rozpuścić BSA przez wstępne wirowanie, a następnie inkubację w temperaturze pokojowej na poziomym mieszalniku walcowym przez 10 - 20 minut.
    2. Przepłukać puste probówki EDTA/heparyny sodowej 2 ml 2% BSA w celu usunięcia pozostałości antykoagulantu i wyrzucić roztwór. Zablokować powierzchnię probówki przez inkubację w temperaturze pokojowej z 5 ml 2% BSA na poziomym mieszadle rolkowym z prędkością 15 obr./min przez 30 minut i wyrzucić roztwór.
    3. Rozcieńczyć znakowane ogniwa (sekcja 1.2.) do gęstości 100 000 komórek/ml i użyć 5 ml do naładowania drutu.
    4. Dodać 5 ml oznakowanej zawiesiny komórek (łącznie 500 000 komórek) do probówki. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas dodawania zawiesiny komórkowej.
    5. Wyjmij drut ze schowka, a także gumową nasadkę przytrzymującą drut i wypłucz go w 1x PBS (Rysunek 3).
    6. Przebić gumową nasadkę rurki EDTA (krok 2.1.4.) za pomocą igły strzykawkowej (20G) i wprowadzić drut tak, aby część funkcjonalna była całkowicie zanurzona w zawiesinie ogniwa, gdy nasadka znajduje się z powrotem na probówce, a rurka jest umieszczona na przechylonym mieszadle rolkowym.
      UWAGA: Funkcjonalna część przewodu z potrójną spiralą powinna być pokryta zawieszeniem ogniw przez cały czas ładowania.
    7. Obracaj rurki na przechylonym mieszadle rolkowym z prędkością 5 obr./min przez 30 minut, aby umożliwić ogniwom przymocowanie się do drutu.
    8. Przepłukać drut 5 ml 1x PBS i przechowywać go w ciemności w temperaturze 2 - 6 °C w probówce 15 ml zawierającej 1x PBS do czasu oględzin.
      UWAGA: Funkcjonalna część drutu musi być zawsze zanurzona w PBS, aby uniknąć uszkodzenia ogniw.
  2. Izolowanie komórek docelowych ze sztucznych mieszanin z krwią obwodową (alternatywna metoda ładowania dla: 2.1. Ładowanie przewodu za pomocą dużej objętości zawiesin ogniw)
    1. Rozcieńczyć znakowane komórki (sekcja 1.2.) w celu uzyskania zawiesiny komórek o dużej gęstości komórek (> 1 000 000 komórek/ml), utrzymując w ten sposób objętość zawiesiny komórkowej dodawanej do krwi obwodowej na niskim poziomie.
    2. Dodać od 500 do 500 000 komórek do 5 ml krwi obwodowej i wymieszać je, odwracając probówkę.
    3. Wyjmij drut ze schowka, zdejmij gumową nasadkę przytrzymującą drut i opłucz go w 1x PBS.
    4. Przebić nową nasadkę probówki niedziałającą częścią urządzenia za pomocą igły strzykawkowej (20G) tak, aby część funkcjonalna była całkowicie zanurzona w krwi z dodatkami, gdy nasadka znajduje się z powrotem na probówce, a rurka jest umieszczona na przechylonym mieszadle rolkowym.
      UWAGA: Funkcjonalna część przewodu z potrójną spiralą powinna być pokryta zawieszeniem ogniw przez cały czas ładowania.
    5. Inkubować probówkę na przechylonym mieszadle rolkowym z prędkością 5 obr./min przez 30 min w temperaturze suchej.
    6. Przepłucz drut 3 razy w 1x PBS i przechowuj go w ciemności w 15 ml probówce zawierającej 1x PBS do czasu oględzin.
      UWAGA: Funkcjonalna część drutu musi być zawsze zanurzona, aby uniknąć uszkodzenia ogniw.
  3. Ładowanie przewodu z zawieszeń ogniw o małej objętości (alternatywna metoda ładowania do: 2.1. Ładowanie przewodu za pomocą dużej objętości zawiesin ogniw)
    1. Ponownie zawiesić znakowane komórki na poziomie 1 000 000 komórek/ml w 1x PBS.
    2. Zamocuj jednorazową szklaną pipetę Pasteura o średnicy 150 mm poziomo na stojaku.
    3. Wyjmij przewód ze schowka, ale zachowaj żółtą gumową nasadkę przytrzymującą przewód.
    4. Umieść drut w pipecie w taki sposób, aby funkcjonalizowana część znajdowała się na końcówce pipety Pasteura i nie dotykała szkła.
      UWAGA: Końcówka drutu nie powinna wystawać z końcówki pipety Pasteura. Unikaj zatykania tylnego końca końcówki pipety Pasteura gumową nasadką przytrzymującą przewód. Jeśli są mocno zamocowane, zawiesiny komórek nie mogą być ładowane z drugiej strony do końcówki pipety.
    5. Załadować 15 μl zawiesiny komórek do końcówki pipety Pasteura zakrywającej funkcjonalizowaną część drutu.
    6. Inkubuj drut przez 10 minut. Ręcznie obracaj zmontowany drut/końcówkę pipety Pasteura o ćwierć sekundy co minutę.
    7. Usuń drut z końcówki pipety Pasteura, opłucz go w 5 ml 1x PBS i przechowuj w ciemności w temperaturze 2 - 6 °C w probówce 15 ml zawierającej 1x PBS do czasu badania wzrokowego.
      UWAGA: Część funkcjonalna musi być zawsze zanurzona w 1x PBS, aby uniknąć uszkodzenia komórek.

3. Liczenie komórek na drucie

UWAGA: Zawsze utrzymuj funkcjonalną część przewodu zanurzoną w 1x PBS, aby uniknąć uszkodzenia komórek.

  1. Za pomocą pisaka do smaru narysuj prostokątny obszar na szklanym szkiełku podstawowym i dodaj 500 μl 1x PBS.
  2. Zegnij niefunkcjonalną część drutu i umieść ją na szklanym szkiełku tak, aby część funkcjonalna była zanurzona w 1x PBS.
    UWAGA: Dopasuj obszar prostokąta i objętość 1x PBS, aby całkowicie zakryć funkcjonalną część drutu. Użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby zamontować niefunkcjonalną część drutu na prowadnicy.
  3. Sprawdź wzrokowo obie strony przewodu, aby wyliczyć przechwycone komórki (Rysunek 2B i 2F).
    UWAGA: Obecność komórek określa się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry do DAPI i FITC. Obie strony przewodu mogą być sprawdzane, a liczba ogniw może być oceniana (w przypadku dużej liczby ogniw) lub liczona (możliwe tylko wtedy, gdy do drutu podłączona jest mała liczba ogniw). Ten krok można pominąć, jeśli wyliczanie komórek nie jest konieczne.
  4. Po zeskanowaniu umieść drut z powrotem w probówce 15 ml zawierającej 1x PBS (patrz uwaga do 2.3.6. i sekcja 3.), przechowuj go w ciemności.
    UWAGA: Większość niefunkcjonalnej części drutu można przeciąć (w tym zagięcie) i usunąć, co ułatwia przechowywanie.

4. Odłączanie i odzyskiwanie komórek docelowych

UWAGA: Odłączenie komórek powinno nastąpić w ciągu 4 godzin po izolacji.

  1. Rozpuścić 4 mg składnika buforowego o uwalnianiu (tabela materiałów i odczynników) na ml 1x PBS i przefiltrować roztwór przez sterylny filtr 0,2 μm w celu uzyskania gotowego do użycia buforu.
    UWAGA: Polimer drutu składa się z hydrożelu, który jest funkcjonalizowany przeciwciałami anty-EpCAM, umożliwiającymi wiązanie się z komórkami docelowymi prezentującymi EpCAM. Bufor uwalniający zawiera enzym proteolityczny węglowo-tlenowy zdolny do rozszczepienia hydrożelu. Rozszczepienie proteolityczne powoduje degradację polimeru, a tym samym oderwanie się wychwyconych komórek.
  2. Podgrzewać bufor uwalniający w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  3. Dodać 1,6 ml buforu do uwalniania, aby napełnić probówkę reakcyjną o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Probówki przeznaczone do objętości reakcyjnych 1,5 ml pozwalają na aplikację 1,6 ml, która jest niezbędna do zanurzenia funkcjonalnej części drutu.
  4. Inkubować funkcjonalną część drutu w buforze uwalniającym w temperaturze 37 °C (łaźnia wodna) przez 20 minut. Użyj gumowej nasadki dostarczonej z drutem zamiast nasadki probówki, aby zamocować drut w probówce o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas inkubacji w łaźni wodnej.
  5. Przenieś zespół drutu/rurki do wytrząsarki z prędkością 500 obr./min przez 15 min.
    UWAGA: Wytrząsarka ma orbitę 1,5 mm.
  6. Umieść zespół drutu/rurki w wirówce i wiruj go z prędkością 300 x g przez 10 minut.
  7. Wyjmij drut z probówki, zamknij nakrętkę i ponownie odwiruj probówkę przy 300 x g przez 10 min.
    UWAGA: Drut może być przechowywany w 1x PBS w temperaturze 2 - 6 °C w ciemności w celu zliczenia ogniw w celu oceny skuteczności odłączania/sprawdzenia, czy ogniwa pozostały na przewodzie.
  8. Aby zmniejszyć objętość zawiesiny komórek, należy usunąć wszystkie z wyjątkiem 100 μl (mikromanipulacja) lub alternatywnie 300 μl (cytowirowanie i późniejsza mikrodysekcja laserowa) supernatantu i natychmiast przystąpić do pobierania próbek z pojedynczych komórek.

5. Próbkowanie pojedynczej komórki

  1. Mikromanipulacja
    UWAGA: Pojedyncze komórki zostaną dodane do 2 μl głównej mieszanki do lizy komórek, umożliwiając WGA. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z liczbą komórek do przetworzenia, obliczyć dodatkowe objętości strat spowodowanych pipetowaniem i umieścić główną mieszankę do lizy komórek na lodzie.
    1. Przygotuj główną mieszankę do lizy komórek (składniki zestawu WGA, Tabelę Materiałów i Odczynników) zgodnie z protokołem opisanym przez Czyż et al18. Krótko wymieszać 2,0 μl buforu reakcyjnego, 1,3 μl oktylofenoksypolietylenu (10% roztwór), 1,3 μl glikolu 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenu (10% roztwór), 2,6 μl roztworu proteinazy K i 12,8 μl wody wolnej od RNazy/DNaz, aby otrzymać mieszankę wzorcową na 10 próbek (całkowita objętość 20 μl).
      UWAGA: Aby uzyskać więcej próbek, odpowiednio zwiększ objętość. Skład głównej mieszanki do lizy komórek różni się od składu stosowanego w procedurze alternatywnej z wykorzystaniem próbek do mikrodysekcji laserowej (patrz 5.2.).
    2. Użyj pisaka do smaru, aby narysować obszar utrzymujący zawiesinę komórek na miejscu. Dostosuj obszar i objętość, jeśli gęstość komórek jest zbyt duża (tj. zaznacz większy obszar na szkiełku podstawowym, załaduj 1x PBS i podwielokrotność zawiesiny komórek).
    3. Odpipetować całą zawiesinę zabarwionych komórek (otrzymaną w kroku 4.8) na szkiełko podstawowe.
    4. Przenieś szklane szkiełko do mikroskopu wyposażonego w mikromanipulator. Pozwól komórkom osiąść przez 5 minut (Rysunek 2D i 2H).
    5. Przygotuj probówki PCR o pojemności 0,2 ml wypełnione 2,0 μl głównej mieszanki do lizy komórek (patrz krok 5.1.1.) i przechowuj ją na lodzie.
    6. Zebrać pojedyncze komórki w 1 μL 1x PBS za pomocą mikromanipulatora i przenieść komórki do probówki zawierającej główną mieszankę do lizy komórek.
      UWAGA: W celu przeniesienia mikromanipulowanych komórek do bufora do lizy komórek należy umieścić kapilarnę bezpośrednio w 2 μl roztworu do lizy i wyrzucać, aż będą widoczne pęcherzyki.
    7. Krótko odwirować próbkę przy 2000 x g przez 3 sekundy za pomocą biurkowej mikrorurki, aby zebrać cały płyn na dnie probówki. Umieścić próbki na lodzie.
    8. Bezpośrednio przejść do jednokomórkowego WGA (patrz punkt 6. oraz Czyż i wsp.19).
  2. Mikrodysekcja laserowa (alternatywna metoda pobierania próbek z pojedynczych komórek dla: 5.1. Mikromanipulacja)
    UWAGA: Skład mieszanki wzorcowej użytej w tej sekcji różni się od składu użytego w sekcji 5.1 do mikromanipulacji. Pojedyncze komórki zostaną dodane do 4,5 μl głównej mieszanki do lizy komórek (składniki zestawu WGA, Tabela materiałów i odczynników) dla WGA.
    1. Przygotować główną mieszankę do lizy komórek zgodnie z Czyż i wsp.19 mieszając 5,0 μl buforu reakcyjnego, 1,3 μL oktylofenoksypolietylenu (10% roztwór), 1,3 μL glikolu 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowego (10% roztwór), lub 2,6 μl roztworu proteinazy K i 34,8 μl wody wolnej od RNazy/DNaz w celu uzyskania mieszanki wzorcowej na 10 próbek (całkowita objętość 45 μL). Umieść mieszankę wzorcową na lodzie.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej próbek, odpowiednio zwiększ objętość.
    2. Szkiełka pokryte membraną UV przystosowane do mikrodysekcji laserowej. Dlatego umieść szkiełka w urządzeniu sieciującym DNA i wystaw na działanie najwyższego promieniowania UV przez około 10 minut.
    3. Zmontować szkiełko pokryte membraną w cytowirówce i cytowirować całą zawiesinę komórek przy 300 x g przez 5 min.
      UWAGA: W przypadku stosowania systemu w płynie, w którym komórki są cytowirowane na szkiełku w roztworze, należy usunąć supernatant po cytowirowaniu i zastosować wirowanie na sucho przy 1140 x g przez 1 min.
    4. Bezpośrednio przystąp do mikrodysekcji laserowej lub pozostaw cytospiny do wyschnięcia na powietrzu przez noc i zamroź próbki w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    5. Odpipetować 4,5 μl wzorcowej mieszanki do lizy komórek do nasadki probówki PCR o pojemności 0,2 ml i pobrać pojedyncze komórki za pomocą mikrodysekcji laserowej.
    6. Wyjmij probówkę do PCR z mikroskopu mikrodystrekcyjnego laserowego i zamknij probówkę. Zebrać cały płyn na dnie probówki przez krótkie wirowanie i umieścić próbkę na lodzie.
    7. Kontynuować z jednokomórkowym WGA lub przechowywać wyizolowane próbki w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca przed dalszym przetwarzaniem.

6. Amplifikacja całego genomu oparta na adapterze 18,19

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie niezbędne mieszanki główne (składniki zestawu WGA, Tabela materiałów i odczynników) są przygotowane i przechowywane na lodzie gotowym do użycia. Mieszaniny wzorcowe obejmują mieszaninę do wytrawiania DNA 1 dla próbek poddanych mikromanipulacji (patrz 5.1) (zawierającą 2,0 μl buforu reakcyjnego, 2,0 μl enzymu restrykcyjnego MseI i 16,0 μl wody wolnej od RNazy/DNaz) lub mieszaninę do wytrawiania DNA 2 do mikrodysekcji laserowej (patrz 5.2.) próbek (zawierającą 2,5 μl enzymu restrykcyjnego MseI i 2,5 μl wody wolnej od RNazy/DNaz), mieszanina wzorcowa do wstępnego wyżarzania (zawierająca 5,0 μl buforu reakcyjnego, 5,0 μl każdego z adapterów PCR do wstępnego wyżarzania i 15,0 μl wody wolnej od RNazy/DNaz), mieszanka główna ligacji (zawierająca 30,0 μl wstępnie wyżarzonych adapterów PCR, 10,0 μl roztworu trifosforanu adenozyny i 10,0 μl roztworu ligazy T4) oraz pierwotna mieszanka główna PCR (zawierająca 30,0 μl buforu PCR, 20,0 μl 10 mM roztworu mieszaniny deoksynukleotydów, 10,0 μl mieszaniny polimerazy i 340,0 μl wody wolnej od RNazy/DNaz). Wszystkie objętości przeznaczone są do przygotowania 10 próbek. Dostosuj odpowiednio do liczby próbek.

  1. W celu lizy komórek należy umieścić mikromikroskopijne próbki w termocyklerze i przeprowadzić lizę pojedynczych komórek, inkubując komórkę w temperaturze 42 °C przez 45 min, 65 °C przez 30 min i 80 °C przez 10 min.
    UWAGA: Użyj termocyklera z podgrzewaną pokrywą. Liza komórek może być wykonywana przez O/N przez 10 do 15 godzin. W takim przypadku należy pominąć etap inkubacji w temperaturze 65 °C.
  2. Uruchom wyżarzanie wstępne adapterów PCR. W związku z tym należy inkubować mieszankę wzorcową przed wyżarzaniem w termocyklerze w temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie przez kolejne 49 cykli, po 1 minutę każdy, stopniowo zmniejszając temperaturę o 1 °C/cykl. Po 50 cyklach (w temperaturze 15 °C) inkubować mieszankę wzorcową w temperaturze 15 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny do wygenerowania asymetrycznych adapterów odpowiednich do ligacji (patrz krok 6.6.) z jednokomórkowym DNA poddanym trawieniu restrykcyjnemu MseI.
  3. Po lizie komórek odwiruj lizowane próbki o masie 2000 x g przez 3 sekundy, aby zebrać cały płyn na dnie i umieścić go na lodzie.
  4. Aby rozdrobnić DNA, należy dodać 2 μl mieszanki do wytrawiania DNA 1 do każdej próbki poddanej lizie mikromanipulacji lub 0,5 μl mieszanki do mineralizacji DNA 2 do próbki z mikrodysekcji laserowej i przeprowadzić trawienie restrykcyjne. Używać termocyklera z podgrzewaną pokrywką w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie etap inaktywacji enzymu ograniczającego w temperaturze 65 °C przez 5 minut
    UWAGA: Trawienie w temperaturze 37 °C może być przedłużone do 3 godzin. Jest to jedyny krok protokołu różniący się między próbkami uzyskanymi z mikromanipulacji a próbkami uzyskanymi z mikrodysekcji laserowej.
  5. Odwiruj próbki, aby zebrać cały płyn na dnie i umieść go na lodzie.
  6. W przypadku ligaturowania DNA trawionego restrykcyjnie i wstępnie wyżarzonych adapterów, dodać 5,0 μl głównej mieszanki ligacji do każdej strawionej próbki DNA i podwiązać ją w termocyklerze w temperaturze 15 °C przez 1 h,
    UWAGA: Ten krok można przedłużyć do 12 godzin lub wykonać O/N.
  7. Odwiruj próbki, aby zebrać cały płyn na dnie i umieść go na lodzie.
  8. W przypadku WGA dodać 40,0 μl pierwotnej mieszanki wzorcowej PCR do każdego z produktów ligacji i uruchomić WGA w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą w następujący sposób: Najpierw inkubować próbki w temperaturze 68 °C przez 3 minuty. Po drugie, cykl 15 razy w temperaturze 94 °C przez 40 s, 57 °C przez 30 s i 68 °C przez 1 min 30 s +1 s/cykl. Następnie dodać 9 cykli w temperaturze 94 °C przez 40 s, 57 °C + 1 °C/cykl przez 30 s, 68 °C przez 1 min 45 s +1 s/cykl. Następnie cykl 23 razy w temperaturze 94 °C przez 40 s, 65 °C przez 30 s, 68 °C przez 1 min 53 s +1 s/cykl. Na koniec przeprowadzić końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 3 minuty i 40 s i schłodzić próbki do temperatury 4 °C.
  9. Odwiruj próbki, aby zebrać cały płyn na dnie i sprawdź jakość DNA lub przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub -80 °C do długotrwałego przechowywania.

7. Kontrola jakości produktów WGA

UWAGA: Sprawdź jakość produktów WGA na podstawie zakresu rozmazu DNA i liczby produktów amplifikacji po uruchomieniu 4plex QC-PCR 5. Uruchom podwielokrotności WGA i odpowiednie próbki QC-PCR na 1,0% żelu agarozowym w celu oceny.

  1. Przygotować 100 μM roztwory podstawowe wszystkich starterów używanych do kontroli jakości 4plex PCR (Tabela 1). Dodaj 8 μl każdego startera do 136,0 μl wody klasy PCR, aby uzyskać 200 μl puli starterów. Wirować roztwór przez 3 s, wirować w temperaturze 2000 x g przez 3 s i podwielokrotność 20 μl do przechowywania w temperaturze -20 °C.
  2. Użyj standardowych zestawów PCR, aby przygotować multipleksową mieszankę wzorcową PCR zawierającą 6,0 μl 2x składników PCR (z wyjątkiem starterów), 4,5 μl wody klasy PCR i 0,5 μl puli starterów.
  3. Dodać 1,0 μl produktów WGA, odwirować i uruchomić PCR w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, a następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, wyżarzanie startera w temperaturze 56 °C przez 1 minutę i przedłużanie startera w temperaturze 72 °C przez 1 min 30 s i końcowy etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 7 min. Schłodzić do temperatury 4 °C, odwirować i umieścić próbki na lodzie do analizy żelowej tego samego dnia lub w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.
    UWAGA: Schładzanie w termocyklerze można przeprowadzić w temperaturze 12 °C, aby zwiększyć żywotność elementów Peltiera.
  4. Przeanalizuj produkty WGA (otrzymane z 6.8.) i odpowiednie produkty 4plex QC-PCR na żelu agarozowym5.

Wyniki

Komórki po barwieniu CFSE oraz barwieniu kwasów nukleinowych można ocenić za pomocą mikroskopu immunofluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla DAPI i FITC. Jądra wykazują jasne przeciwbarwienie w kanale DAPI, podczas gdy cytoplazma komórek wykazuje jednorodne znakowanie CFSE o heterogenicznej intensywności międzykomórkowej (Ryc. 2A i 2E). Podobnego kształtu i intensywności barwienia należy oczekiwać od komórek przytwierdzonych do drutu (Ryc. 2B i 2F), jak również od komórek oddzielonych od drutu i naniesionych na szkiełko (Ryc. 2D i 2H).

Wysokie gęstości komórek (np. >1 000 000 cells/mL) mogą prowadzić do całkowitego pokrycia drutu komórkami podczas ich obciążania. Jednak niższe gęstości komórek, zmiany prędkości obrotowej podczas inkubacji oraz stosowanie różnych linii komórkowych wpływają na wydajność izolacji i wymagają osobnego przetestowania. Gdy druty inkubowano z 5 mL komórek HT-29 przy gęstości 100 000 cells/mL, zgodnie z opisem w sekcji 2.1., na drutach uchwycono średnio 254 ± 103 komórki (n = 5). W analogicznym eksperymencie z użyciem komórek LNCaP uzyskano średnio 440 ± 319 komórek (n = 5) na drut.

Przedstawienie 500, 5 000 i 50 000 komórek HT-29 w 5 mL krwi obwodowej na drutach (zgodnie z sekcją 2.2. protokołu) doprowadziło odpowiednio do wychwycenia 75 ± 18 komórek, 25 ± 9 komórek i 47 ± 57 komórek (n = 3 dla każdej grupy). Jeśli drut zostanie naładowany 15 µL zawiesiny komórek (1 000 000 komórek/mL) zgodnie z protokołem w sekcji 2.3., do drutu może przyłączyć się do 1 000 komórek (HT-29).

Wydajność odrywania komórek wynosiła od 81% w komórkach HT-29 (zakres 54,9% - 93,2%, n = 5) do 81% (zakres 63,51% - 92,87%, n = 6) oraz 91% (zakres 84,7% - 95,3%, n = 6) w komórkach LNCaP i VCaP, odpowiednio. Podobnie, odzyskiwanie odseparowanych komórek różniło się w zależności od linii komórkowej: metodą cytocentryfugacji odzyskano średnio 28% odseparowanych komórek HT-29. Podczas gdy w przypadku LNCaP wskaźnik odzysku był niższy niż 10%, średni wskaźnik odzysku dla komórek VCaP wyniósł 55%.

Około 75% pojedynczych komórek poddanych WGA daje wysokiej jakości produkty WGA: są to 1) rozmycie produktów WGA w zakresie od 0,1 do > 1 kb (Rysunek 4, górny panel) oraz 2) trzy lub cztery prążki w PCR kontroli jakości 4plex (Rysunek 4, dolny panel). Produkty WGA mogą być wykorzystane do 1) profilowania array-CGH spełniającego kryteria jakości dla profili array-CGH pojedynczych komórek 6,7 oraz 2) ukierunkowanego NGS po ponownej amplifikacji WGA 7.

Schemat hodowli komórkowej; izolacja pojedynczych komórek za pomocą mikrofabrykacji; do dalszych analiz.
Rysunek 1: Schemat izolacji i odzyskiwania komórek docelowych do analizy pojedynczych komórek. (A) Komórki są hodowane do 90% konfluencji i (B) zbierane w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Po barwieniu CFSE i barwnikiem kwasów nukleinowych, (C) funkcjonalizowany drut jest inkubowany w obecności komórek albo w objętości 5 mL przy użyciu probówek reakcyjnych, albo w małej objętości przy użyciu końcówki pipety Pasteura. Ta druga metoda pozwala na zastosowanie objętości zawiesiny komórkowej tak niskich jak 15 µL. (D) Komórki muszą zostać odspięte w ciągu 4 h po naładowaniu. W związku z tym drut umieszcza się w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 mL wypełnionej buforem uwalniającym. Po 15 min inkubacji na wytrząsarce i 10 min wirowania, drut jest usuwany, a zawiesina komórkowa jest wirowana w celu osadzenia komórek. (E) Odzyskane komórki są przenoszone albo na szkiełko przedmiotowe do mikromanipulacji pojedynczą komórką (góra), albo poddawane cytocentryfugacji na szkiełko powlekane membraną i przekazywane do mikrodysekcji laserowej (dół). (F) Na koniec zebrane pojedyncze komórki są amplifikowane za pomocą amplifikacji całego genomu (WGA). Produkty WGA są kompatybilne z analizami array-CGH oraz celowanym NGS. Epitop EpCAM: zielone koło na powierzchni komórki. Funkcjonalizowany drut: urządzenie, szare potrójne druty helikalne. Polimer: fioletowe linie. Przeciwciała anty-EpCAM: pomarańczowe. Aktywność buforu uwalniającego: czerwona strzałka. Marker z tłuszczu służący do utrzymania zawiesiny komórkowej na miejscu: ciemnoniebieska elipsa. Odzyskana zawiesina komórkowa: jasnoniebieska. Kapilara do mikromanipulacji: czarna linia. Powiększenie: komórka odzyskana za pomocą mikromanipulacji, cytospin na szkiełku pokrytym membraną zawierającym odzyskane komórki (szara wypełniona elipsa). Powiększenie: odzyskiwana komórka poddawana mikrodysekcji laserowej (szara okrągła linia: membrana z szkiełka membranowego służąca jako podłoże dla mikrodysekcji laserowej), obiektyw z wiązką lasera (niebieska linia zbliżająca się do szkiełka membranowego od dołu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wychwytywanie i uwalnianie komórek, mikroskopia fluorescencyjna, HT-29 i LNCaP, analiza urządzenia mikrofluidycznego.
Rysunek 2: Wizualizacja znakowanych komórek. (A,E) Komórki przed załadunkiem: komórki są znakowane CFSE i barwione kontrastowo barwnikiem interkalującym DNA, co pokazuje zakres intensywności sygnału CFSE (zielony). (B,F) Znakowane komórki wychwycone na drucie. (C,G) Drut po procedurze odrywania komórek. (D,H) Komórki oddzielone od drutu i odzyskane poprzez cytocentryfugację na szkiełko. CFSE: kanał FITC (zielony). Barwienie DNA: kanał DAPI (niebieski). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat funkcjonalizowanej igły do mikroekstrakcji, zbliżenie na strukturę igły stosowaną w chemii analitycznej.
Rycina 3: Drut i komora magazynująca. (A) Przegrody drutu. (B) Detal części funkcjonalizowanej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy żelowej PCR; prążki DNA, kontrola jakości 4plex, rozmaz amplifikacji genomu.
Rysunek 4: Kontrola jakości produktów WGA otrzymanych z pojedynczych komórek poddanych micromanipulacji. Panel górny: produkty WGA otrzymane z pojedynczych komórek zazwyczaj dają rozmazy DNA w zakresie od 0,2 kb do > 1,0 kb z maksymalną intensywnością około 0,5 kb. Próbki nr 1, 7 i 13 (oznaczone gwiazdkami) wykazują suboptimalne lub brak rozmazów DNA. Panel dolny: produkty WGA mają wystarczającą jakość, jeśli PCR 4plex daje trzy lub cztery z czterech produktów PCR (o wielkości 100, 200, 300 i 400 bp). Próbki 1, 7, 10 i 13 wykazują mniej niż trzy prążki i zostałyby wykluczone z dalszej analizy. Ścieżka M zawiera drabinę 100 bp, a gwiazdki wskazują próbki o niewystarczającej jakości produktu WGA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Sekwencja starteraUWAGA
5′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′starter forward 100 bp
5′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′odwrócony starter 100 bp
5′-agg tgg agc gag gct agc-3′starter forward 200 bp
5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′rewersyjny primer 200 bp
5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′starter prawy 300 bp
5′-tcc act aac cag tca gcg tc-3′odwrócony primer 300 bp
5′-aca gtc cat gcc atc act gc-3′starter forward 400 bp
5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′odwrócony primer 400 bp

Tabela 1: Sekwencje starterów dla 4plex PCR kontroli jakości

Dyskusja

Opisany protokół ma na celu pobranie komórek z funkcjonalizowanego przewodu (określanego jako urządzenie) w celu analizy genomowej ex vivo pojedynczej komórki. Przetestowaliśmy trzy linie komórkowe EpCAM-dodatnie (HT-29, LNCaP i VCaP), ale w zasadzie metodę tę można zastosować do dowolnej linii komórkowej wykazującej ekspresję EpCAM. Komórki docelowe EpCAM-dodatnie mogą być prezentowane Urządzeniu jako czysta zawiesina komórkowa (patrz 2.1.) lub zmieszane z nadwyżką komórek tła (np. krew obwodowa, patrz 2.2.). Podczas gdy szczególnie te ostatnie mogą być używane do testowania zdolności izolacyjnych w rzadkich warunkach ogniw, precyzyjne dostrojenie liczby ogniw podłączonych do drutu można przeprowadzić przy użyciu opisanego podejścia o małej objętości (patrz 2.3.). Ponieważ należy spodziewać się różnic między liniami komórkowymi, odpowiednie gęstości komórek do ładowania drutu, prędkość obrotowa, a także czas inkubacji muszą być testowane empirycznie, oceniając liczbę przyłączonych komórek za pomocą mikroskopu immunofluorescencyjnego.

W przypadku dalszych zastosowań genomicznych na poziomie pojedynczej komórki wymagane jest WGA. Wybrana metoda WGA może się różnić w zależności od laboratorium i w zasadzie nasza metoda jest otwarta na wszystkie metody, które mogą poradzić sobie z próbkami uzyskanymi z mikromanipulacji lub mikrodysekcji laserowej. W tym protokole stosujemy metodę opartą na enzymatycznie rozdrobnionym DNA ze względu na lepszą wydajność w porównaniu z metodą WGA7 opartą na fragmentacji cieplnej. Opcjonalnie, pojedyncze komórki mogą być przekazywane do izotermicznego WGA w celu późniejszego profilowania DNA20,21.

Opisany protokół ma na celu odzyskanie nienaruszonych komórek po podłączeniu do nowej generacji funkcjonalizowanych przewodów do analizy genomowej pojedynczej komórki. Pierwsza generacja funkcjonalizowanych drutów, które są również jedynymi dostępnymi do tej pory na rynku urządzeniami do wzbogacania in vivo z certyfikatem CE, została wykorzystana do zliczania CTC u pacjentów z przerzutami do raka. Wcześniejsze publikacje i nasze własne dane sugerują, że technika izolacji in vivo jest bardziej czuła w porównaniu z obecną technologią złotego standardu2. W związku z tym, wyposażenie tej techniki izolacji in vivo w funkcję odzyskiwania, jak zrealizowano w urządzeniu, pozwala na połączenie wysokiego odzysku CTC z charakteryzacją na poziomie pojedynczej komórki.

Urządzenie nie jest jednak dopuszczone do stosowania u pacjentów, dlatego dane kliniczne nie są dostępne. Stosowanie ex vivo (tj. izolowanie CTC z krwi obwodowej po pobraniu próbki) nie jest zalecane, ponieważ technologia jest dostosowana do ustawień występujących w błonie łokciowej, np. małej średnicy żyły (zwiększającej prawdopodobieństwo bezpośredniego kontaktu między CTC i wychwycenia przeciwciał) i długiego czasu retencji (30 minut, pozwalający na przejście 2-3 l krwi przez drut). Jednak, jak opisano w sekcji 2.2. Komórki docelowe można również izolować z próbek mieszanych7.

Obecnym ograniczeniem metody jest nieefektywne odzyskiwanie nieutrwalonych ogniw po odłączeniu od przewodów. To jednak może ulec poprawie poprzez etap utrwalenia komórek przed leczeniem odwarstwienia.

Podsumowując, protokół ten jest pierwszym krokiem w kierunku łącznego zastosowania techniki izolacji in vivo z odzyskiwaniem komórek do genetycznej charakterystyki pojedynczych komórek. Konieczne są dalsze wysiłki w celu optymalizacji regeneracji komórek i klirensu do ich zastosowania u pacjentów 1,2. Jednak medycyna spersonalizowana w zakresie monitorowania leczenia i podejmowania decyzji terapeutycznych wykracza poza wyliczenie CTC. Metoda ta jest zatem pierwszym krokiem w kierunku genomowej charakterystyki CTC na poziomie pojedynczej komórki.

Zastosowania w analizie transkryptomu pojedynczych komórek wydają się wykonalne, ponieważ nienaruszone komórki są zbierane. Pozostaje jednak do oceny, czy procedura odzyskiwania ma wpływ na integralność RNA (np. przekazywanie odzyskanych pojedynczych komórek do bezpośredniej lizy, a następnie RT-qPCR22). Jeśli się powiedzie, charakterystyka pojedynczych komórek (np. CTC) może zostać przeniesiona na poziom transkryptomu, co pozwoli na bardziej szczegółowe analizy. W związku z tym sekwencjonowanie RNA przy użyciu Smart-seq2 stanowi cenne narzędzie do dalszej analizy RNA pojedynczych komórek, ponieważ wstępnie amplifikowane cDNA (uzyskane podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania RNA) można poddać ilościowemu PCR. Pozwoli to na połączoną analizę docelową i przesiewową pojedynczych odzyskanych komórek 22,23.

Obecnie funkcjonalizowane przewody oparte są na przeciwciałach anty-EpCAM, które są szeroko stosowanym markerem nabłonkowym do pozytywnej selekcjiCTCs 24. Ponieważ kilka CTC może obniżać poziom markerów nabłonkowych, takich jak cytokeratyny lub EpCAM25, dodanie przeciwciał, takich jak HER2/new, zwiększyłoby szansę na izolację CTC. Ferreira i wsp. opracowali i dokonali przeglądu kilku strategii wzbogacania opartych na przeciwciałach. w 2016 r.26. Mieszanina przeciwciał unieruchomionych na przewodzie może być w przyszłości ulepszeniem technologii prowadzącym do izolacji większej liczby i dodatkowych podtypów CTC.

Na wszystkich etapach związanych z obsługą drutu obowiązkowe jest utrzymywanie funkcjonalnej części drutu zanurzonej w roztworze w celu zachowania jego funkcjonalności. Zalecamy umieszczenie drutu w 1x PBS podczas oceny (mikroskop; np. kroki 3.1. - 3.3.) i magazynowania. Aby uniknąć niewłaściwego zabarwienia, zalecamy użycie świeżo przygotowanego roztworu barwiącego w krokach 1.2.1. oraz 1.2.2. Słabo wybarwione komórki utrudniają liczenie komórek na przewodzie i mogą prowadzić do niedoszacowania przyłączonych komórek.

Należy unikać zatykania pipety Pasteura gumową nasadką podczas wkładania drutu do pipety Pasteura w celu późniejszego załadowania zawiesiny ogniwa (krok 2.3.4.). Gumowa nasadka służy do przytrzymywania drutu na miejscu, tak aby część funkcjonalna znajdowała się wewnątrz końcówki pipety Pasteura. Jeśli nasadka jest zbyt mocno przymocowana do tylnej części pipety Pasteura, nałożenie zawiesiny kuwety nie jest możliwe. W takim przypadku należy poluzować nakrętkę w taki sposób, aby powietrze wypierane przez zawiesinę obciążonej komórki mogło opuścić pipetę.

Gięcie drutu ma kluczowe znaczenie dla jego orientacji podczas liczenia ogniw w krokach 3.2. oraz 3.3. Zamontuj przewody za pomocą taśmy samoprzylepnej w taki sposób, aby niedziałający koniec drutu opadł na bok. Po zeskanowaniu całej długości części funkcjonalnej, drut jest zwijany pod kątem 180°, dzięki czemu można zeskanować drugą połowę przewodu funkcjonalnego. Ten krok jest ważny dla początkowych eksperymentów mających na celu ocenę liczby ogniw na przewodzie. Po ocenie liczby komórek dla określonej linii komórkowej i procedury, procedurę można powtórzyć bez zliczania komórek (np. tylko sprawdzając obecność komórek lub pomijając ten krok). Staranne pipetowanie ma zasadnicze znaczenie dla uniknięcia utraty komórek podczas zmniejszania objętości supernatantu w kroku 4.8. Upewnij się, że pipetowanie odbywa się płynnie, nie powodując turbulencji w granulce.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF), nr projektu. I 1220-B19 (do P.S.) w ramach projektu ERANET w ramach Translational Cancer Research (TRANSCAN) "Krążące komórki nowotworowe jako biomarker minimalnej choroby resztkowej w raku prostaty (CTC-SCAN)". Doktorant S.C. szkolił się w ramach Programu Doktoranckiego Medycyna Molekularna Uniwersytetu Medycznego w Grazu. Autorzy dziękują Ninie Schlögl, Danielowi Kummerowi, Gabi Wendt, Claudii Chudak, Julii Schulz i Johannie Schiller za fachową pomoc techniczną. Autorzy dziękują Georgowi Peinhauptowi za wsparcie w zakresie projektowania graficznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Gilupi Release BufferGilupiGIL083Służy do odłączania komórek od przewodu
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. z L-GlutaminąThermo Fisher Scientific16600-082Pożywka hodowlana używana do komórek HT-29, dostosuj pożywkę hodowlaną do linii komórkowej używanej do eksperymentów
Roztwór buforowy HEPES (1 M)PAAS11-001Suplement do pożywki
McCoy's 5APłodowa surowica bydlęca GoldPAAA15-151Suplement do McCoy's 5a Zmodyfikowana pożywka
penicylina-streptomycyna (100x)BiowestL0018-100Suplement do McCoy's 5a Zmodyfikowana pożywka
z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS)Thermo Fisher Scientific10010-015
AccutaseBiowestL0950-100Roztwór do odrywania komórek (hodowla komórkowa)
Łaźnia wodnaGFLTyp 1003Stosowana do roztworów do podgrzewania
InkubatorThermo Fisher ScientificSłuży do inkubacji komórek (hodowli komórkowych)
50 ml probówki reakcyjneVWR525-0403
Mieszalnik rolkowyStuart ScientificSRT6DSłuży do mocowania komórek do drutu, jednocześnie zapobiegając osadzaniu się komórek
CellTrace CFSE Proliferacja komórek ZestawThermo Fisher ScientificC34554Służy do znakowania żywych komórek (etykieta cytoplazmatyczna)
Hoechst 33342H3570Thermo Fisher ScientificSłuży do barwienia DNA (przeciwbarwienie nukleinowe)
Wirówka (wyposażona w 15 ml i 50 ml probówek reakcyjnych)Thermo Fisher ScientificHeraeus Megafuge 40RSłuży do granulowania komórek
Observer Z1 (mikroskop fluorescencyjny/mikrodyparacyjny)Carl Zeiss MicroimagingOdwrócony (immunofluorescencyjny) mikroskop zdolny do mikrodysekcji laserowej; Mikroskopy fluorescencyjne muszą być w stanie wykryć Hoechst 33342 (filtr DAPI) i CFSE (filtr FITC)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA4503-50GSłuży do powlekania powierzchni szklanych/plastikowych
MS1 MinishakerSigma-AldrichZ404039Używany do wirowania
Probówki Vacutainer EDTA (lub Na-heparyna)BD366450 (lub 366480)Używany jako probówka reakcyjna do wychwytywania komórek docelowych ex vivo
Detektor CANCER03 DC03GilupiGIL003Funkcjonalizowany przewód zdolny do izolowania i odłączania komórek EpCAM-dodatnich (określanych również jako catch& wydanie, C& R)
Igły strzykawkowe (G20)VWR613-0554Służy do nakłuwania gumowych nasadek w celu umożliwienia niefunkcjonalnej części C& R, aby przez nią przeprowadzić Komora
NeubaueraRothT729.1Służy do liczenia komórek
Pipety Pasteura 150 mmVolacD810Służy do aplikacji komórek o małej objętości do C& R
SmarownicaDakoS2002Używana na szkiełkach do utrzymywania zawiesiny komórek na miejscu
Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 i mikro; m)Corning431219Do filtrowania świeżo przygotowanego Gilupi Release Buffer
Delfia PlateShakerPerkin Elmer1296-003Służy do mieszania podczas odrywania komórek
Probówki 1,5 mlEppendorf30,125,150
Ampli1 WGA ZestawSilicon BiosystemsZamawiane za pośrednictwem Silicon Biosystems
Axiovert M200 wyposażony w Mikromanipulator MMJ i CellTram varioZeiss/EppendorfZastosowanie mikromanipulacji pod ręką
Mikrokapilary (25 &mikro; m średnicy), CustomTip Typ IEppendorf930001201Służy do mikromanipulacji komórkami
0,2 ml probówki PCRBiozym710920
Cytowirówka i sprzętHettichUniversal 32Używaj cytowirówki pod ręką
TermocyklerBio-RadDNA Engine DyadKażdy termocykler z podgrzewaną pokrywą może być używany
MikrowirówkaRothCX73.1Używaj wirówki biurkowej pod ręką
MembraneSlide 1.0 PETZeiss415101-4401-050Szkiełka szklane powlekane membraną do mikrodysekcji laserowej
UV Stratalinker 1800Stratagene400072Użyj sieciowania DNA pod ręką
Standardowe odczynniki
6x Ładowanie DNAThermo Fisher ScientificR0611Użyj żelu Ładowanie barwnika pod ręką
Drabinka DNABioLabsN0551GUżyj drabiny 100 pz
pod ręką AgaroseBiozym840004
Stacja elektroforezy żelowejBio-RadUżyj systemu elektroforezy pod ręką
Żel Czerwony kwas nukleinowy BarwnikBiotium41003Barwnik interkalacyjny do wizualizacji DNA W żelach agarozowych
wstępnego PCR

Bibliografia

  1. Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
  2. Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
  3. Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
  4. van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
  5. El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
  6. Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).
  7. Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).
  8. Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
  9. Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
  10. Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
  11. Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
  12. Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
  13. Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
  14. Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
  15. Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622(2017).
  16. Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
  17. Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322(2016).
  18. Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
  19. Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
  20. Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
  21. Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
  22. Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).
  23. Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
  24. El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
  25. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
  26. Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja pojedynczych kom rekmikrodysekcja laserowamikromanipulacjacytocentryfugacjafunkcjonalizowany drutprzeciwcia a anty EpCAMkr ce kom rki nowotworoweadapter linker WGA
Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.