Artykuł metodologiczny

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56398

⸱

2 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Streszczenie

Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem genów reporterowych wstawionych do heterochromatyny były szeroko stosowane do badania mechanizmów kontroli epigenetycznej w organizmach modelowych. Technologie, w tym krótkie RNA spinki do włosów (shRNA) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), umożliwiły takie badania przesiewowe w diploidalnych komórkach ssaków. Tutaj opisujemy zakrojone na szeroką skalę badanie przesiewowe shRNA pod kątem regulatorów inaktywacji chromosomu X (XCI), przy użyciu mysiej linii komórkowej z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycyny wbitymi na C-końcu genu metylowego białka wiążącego CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X (Xi). Reaktywacja konstruktu w linii komórek reporterowych dała przewagę w zakresie przeżycia przy selekcji higromycyny B, umożliwiając nam przebadanie przesiewowe dużej biblioteki shRNA i zidentyfikowanie spinek do włosów, które reaktywowały reporter, mierząc ich wzbogacenie po selekcji za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. Wzbogacone spinki do włosów zostały następnie indywidualnie zweryfikowane, testując ich zdolność do aktywacji reportera lucyferazy na Xi.

Wprowadzenie

Jedna z najczęstszych form dziedzicznego upośledzenia umysłowego u kobiet, zespół Retta, jest spowodowany heterozygoycznymi mutacjami w MeCP2, genie chromosomu X, który koduje białko niezbędne do prawidłowego funkcjonowania neuronów1. Potencjalnym podejściem do leczenia tego zaburzenia byłaby reaktywacja allelu MeCP2 typu dzikiego na Xi, ponieważ wykazano, że przywrócenie ekspresji MeCP2 odwraca deficyty neurologiczne w mysim modelu tej choroby1,2,4. Jednak epigenetyczne wyciszenie jednego z dwóch chromosomów X w komórkach żeńskich jest ściśle utrzymywane przez cały okres życia organizmu3,4, a silna reaktywacja genu Xi prawdopodobnie wymagałaby poważnego zakłócenia w wielu epigenetycznych szlakach regulacyjnych.

Aby zidentyfikować czynniki niezbędne do utrzymania wyciszenia MeCP2, najpierw opracowaliśmy transgeniczny model myszy przenoszący fuzję genu oporności na MeCP2-lucyferazy-higromycynę (MeCP2-LUC-HR) na jednym z dwóch chromosomów X (XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Chociaż MeCP2 wyrażany z konstruktu fuzyjnego okazał się niestabilny i spowodował utratę funkcji, fenotypowo naśladując delecję MeCP2 u hemizygotycznych samców (XMeCP2-LUC-HR/Y), ekspresja genów reporterowych była łatwo wykrywalna we wzorze zgodnym z ekspresją endogennego MeCP25. Następnie wygenerowaliśmy unieśmiertelnione klony fibroblastów z konstruktem na nieaktywnym lub aktywnym chromosomie X i potwierdziliśmy, że ten pierwszy wyrażał MeCP2 typu dzikiego, a nie konstrukt reporterowy; W przypadku tych drugich było odwrotnie. Po wystawieniu na działanie środka demetylującego DNA, o którym wiadomo, że znosi wyciszanie genów, 5-azacytydyny (5-AZA), komórki z reporterem na Xi ("komórki reporterowe") uzyskały aktywność w teście bioluminescencji, co wskazuje, że nasz konstrukt może zostać reaktywowany, a zatem wykorzystany do genetycznych badań przesiewowych.

Następnie opracowaliśmy wysokoprzepustowe genetyczne badanie przesiewowe dla regulatorów wyciszania MeCP2. Linia komórkowa reporterowa została najpierw zainfekowana biblioteką retrowirusową zawierającą >60 000 różnych shRNA ukierunkowanych na > 25 000 genów w całym genomie myszy 5,6, a następnie poddana selekcji higromycyny B. Częstość występowania spinki do włosów porównano w próbkach pre- i poselskich przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji, ponieważ reaktywacja reporterowa dawała przewagę wzrostu w ramach selekcji higromycyny B i skutkowała wzbogaceniem odpowiedzialnych spinek do włosów. Korzystając z tego podejścia, zidentyfikowaliśmy 30 genów zaangażowanych w wyciszanie MeCP2, a następnie potwierdziliśmy wyniki poprzez transdukcję komórek reporterowych za pomocą indywidualnych spinek do włosów i pomiar ich aktywności lucyferazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie kroki z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Nie wiadomo, czy stosowane tutaj odczynniki stanowią znaczące zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, z wyjątkiem 5-azacytydyny (5-AZA).

1. Generowanie reporterowej linii komórkowej z transgenem MeCP2-LUC-HR na Xi

  1. Przygotowanie fibroblastów ścięgien myszy od samicy myszy XMeCP2-LUC-HR /XMeCP2
    1. Poddaj eutanazji 10-12-dniową samicę myszy XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2.
    2. Za pomocą prostych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie obwodowe przez skórę bliższej części ogona.
    3. Trzymając tuszę w pobliżu podstawy ogona, odciągnij skórę od myszy, aby odsłonić włóknisto-chrzęstną część ogona. Usuń i przetnij końcówkę 10 mm odsłoniętej tkanki na fragmenty o długości 1 mm za pomocą skalpela chirurgicznego.
    4. Przenieś rozdrobnioną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego o 1 U/ml penicyliny, 1 μg/ml streptomycyny i 1,5 mg/ml kolagenazy, wstępnie przefiltrowane przez filtry siatkowe 0,45 μm, a następnie 0,2 μm. Inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C z ciągłym obracaniem.
    5. Odwirować próbkę w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 10 minut. Zawiesić osad w 10 ml DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 U/ml penicyliny i 1 μg/ml streptomycyny (DMEM-10) i umieścić na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Przejdź komórki raz i rozwiń do 10 cm płytki przed przejściem do następnego kroku.
    6. Unieśmiertelnić komórki, wykonując transdukcję z wektorem ekspresyjnym przenoszącym onkogeny wirusa HPV-16 (E6/E7), jak opisano wcześniej7.
  2. Selekcja klonów pojedynczych komórek i charakterystyka ekspresji reporterowej MeCP2
    1. Zbierz komórki z talerza o średnicy 10 cm. Najpierw odessać pożywkę, dodać 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 9 ml DMEM-10 i zebrać zawieszone komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    2. Rozcieńczyć komórki DMEM-10 do końcowego stężenia 1 komórka/100 μl. Przenieść na płytki 96-dołkowe, pipetując 100 μl zawiesiny do każdej studzienki.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C, aż studzienki zlecą się, co może potrwać do 2-3 tygodni. Wymieniaj pożywkę na nowy DMEM-10 co 3-5 dni. W przypadku zlewania zmobilizuj komórki za pomocą 20 μl 0,05% trypsyny-EDTA na dołek i podziel je na dwa zduplikowane zestawy 96-dołkowych płytek.
    4. Użyj jednego zestawu płytek do oznaczenia aktywności lucyferazy. Użyj jednorodnego zestawu do oznaczania lucyferazy świetlika, który nie wymaga usuwania pożywki. Postępuj zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu.
    5. Użyj wyników z kroku 1.2.4, aby wybrać klony bez wykrywalnej aktywności lucyferazy z pozostałego zestawu płytek. Rozwiń te klony do płytek 24-dołkowych, a następnie 6-dołkowych.
    6. Wykonaj to samo dla klonu o najwyższej aktywności lucyferazy; zostanie to wykorzystane jako kontrola pozytywna do celów walidacji.
    7. Zbierz porcję każdej studzienki na płytce 6-dołkowej, aby uzyskać Western blot. Zmobilizuj komórki za pomocą 200 μl 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 2 ml DMEM-10 i przenieść połowę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umyj komórki raz PBS przed lizą w celu uzyskania Western blot. Alternatywnie przenieś połowę komórek na inną 6-dołkową płytkę. Gdy komórki przyczepią się do dna płytki, spłucz PBS i lizą w celu uzyskania Western blot.
    8. Wykonaj Western blot z przeciwciałem anty-MeCP2, aby potwierdzić, że komórki lucyferazy ujemne wykazują ekspresję, podczas gdy komórki lucyferazy-dodatnie nie wykazują ekspresji MeCP2 typu dzikiego z aktywnego chromosomu X; postępuj zgodnie z wcześniej opisanym protokołem8. Użyj lizatu tkanki mózgowej od dowolnej myszy typu dzikiego jako kontroli pozytywnej.
    9. Płytka z kilkoma ujemnymi klonami w 2 x 105 komórek/dołku na płytce 6-dołkowej. Potraktować raz 10 μM 5-AZA, inkubować przez 72 godziny bez zmiany pożywki i oznaczyć aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.
    10. Wybierz jeden negatywny klon (klon Xi), który uzyskał aktywność lucyferazy z 5-AZA i zacznij rozszerzać go na wiele 10-centymetrowych płytek. Zamroź pozostałe ujemne klony w ciekłym azocie jako kopię zapasową. Dodatni klon (klon Xa) może być utrzymywany w kulturze tkankowej lub zamrażany do czasu dalszego wykorzystania.

2. Sprawdzanie biblioteki pod kątem reaktywacji za pomocą wyboru higromycyny B

  1. Zakażenie klonu testowego, zastosowanie selekcji i pobranie DNA do sekwencjonowania
    1. Uzyskaj koncentraty wirusowe konstruktów retrowirusowych eksprymujących spinki do włosów z biblioteki shRNA lub wyprodukuj skoncentrowany supernatant wirusowy przy użyciu protokołu dołączonego do żądanej biblioteki.
    2. Przed przystąpieniem do badania przesiewowego należy miareczkować bibliotekę (za pomocą znacznika GFP, jeśli jest dostępny). Dąż do wielokrotności infekcji od 0,3 do 0,5,5,
      UWAGA: Wykonaj co najmniej cztery niezależne badania, aby zminimalizować odsetek wyników fałszywie dodatnich. Użyj 20 płyt na ekran, aby uzyskać 100-krotne pokrycie biblioteki, aby zachować odpowiednią reprezentację spinów do włosów i uniknąć losowych przerw9. Jednak biorąc pod uwagę ekran pozytywnego wyboru i duży rozmiar biblioteki, prawdopodobnie wystarczyłby mniejszy zasięg.
    3. Rano umieść 1 x 106 komórek Xi na 10 cm płytkach do hodowli tkankowych.
    4. Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę świeżym DMEM-10 zawierającym supernatant wirusowy i 5-10 μg/ml polibrenu. Należy użyć ilości supernatantu wirusa określonej w kroku 2.1.2.
    5. Po 18-24 godzinach odessać pożywkę i dodać 10 ml świeżego DMEM-10 do każdej płytki. Kultura przez kolejne 48 godzin.
    6. Rano zmobilizuj komórki, używając 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA na płytkę i zatruj 9 ml DMEM-10 na płytkę. Przepuść zawiesinę przez filtr siatkowy 100 μm. Zebrać przefiltrowane zawiesiny razem i wysiać dwa zestawy 10 cm płytek w formacie 1 x 106 komórek/płytkę.
    7. Po południu zastąpić pożywkę w jednym zestawie płytek DMEM-10 zawierającym 15 μg/ml higromycyny B (dzień 0). W drugim zestawie wymień nośnik tylko na nowy DMEM-10.
    8. Po 48 godzinach zmobilizuj komórki z nieleczonego zestawu płytek za pomocą 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 9 ml DMEM-10. Przenieść komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatanty i natychmiast przystąpić do ekstrakcji DNA z osadów. Alternatywnie, połącz komórki w większe probówki przed etapem wirowania.
    9. Ekstrahuj DNA za pomocą mieszaniny fenolu i chroformu i wytnij DNA octanem sodu i zimnym etanolem, jak opisano wcześniej10. Zebrać poszczególne próbki DNA poddane selekcji wstępnej selekcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    10. Kontynuuj hodowlę zestawu selekcyjnego higromycyny B przez kolejne 4 dni. Po 2 dniach uzupełnić pożywkę selekcyjną świeżym DMEM-10 zawierającym higromycynę B.
    11. W dniu 7 należy wymienić pożywkę selekcyjną tylko na nową DMEM-10. Odczekaj 2 do 4 dni na regenerację, a następnie zbierz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.1.8. Kontynuuj ekstrakcję DNA zgodnie z opisem w kroku 2.1.9.
  2. Identyfikacja zakrętów wzbogaconych w próbkach poselskich
    1. Użyj kontekstu 5' (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') i 3' starterów z odwróconą pętlą (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') do amplifikacji półspinek do włosów z próbek DNA przed i po selekcji. Użyj całego wyekstrahowanego DNA w oddzielnych reakcjach PCR z 100-200 ng DNA na reakcję.
      UWAGA: Te startery kontekstowe 5' i startery pętli odwróconej 3' odpowiadają odpowiednio sekwencji kontekstowej miR-30 przed wstawką shRNA i sekwencji w pętli shRNA. Różne biblioteki będą wymagały różnych oligonukleotydów. W razie potrzeby dostosuj etapy oczyszczania, aby wyizolować różne rozmiary produktów.
    2. Użyj kulek do wyboru rozmiaru, aby usunąć startery i genomowe DNA oraz odzyskać produkty PCR o stężeniu od 100 do 200 pz. Postępuj zgodnie z protokołem dołączonym do koralików.
    3. Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania, aby uporządkować półspinki do włosów. Wygeneruj co najmniej 50 milionów odczytów na ekran. Postępuj zgodnie z protokołem odpowiednim dla zestawu i sprzętu do sekwencjonowania.
      UWAGA: 50 milionów odczytów na ekran zapewnia 1000-krotną reprezentację każdego shRNA w bibliotece i około 10-krotne pokrycie każdej niezależnej infekcji (przeprowadzane przy 100-krotnej reprezentacji każdego shRNA), co zapewnia odpowiednią reprezentację każdego zdarzenia infekcji.
    4. Wylicz każde shRNA za pomocą skryptu Perla, który zlicza sekwencje z idealnymi dopasowaniami. Wybrano shRNA, które miały co najmniej 10 odczytów w puli preselekcji do dalszej analizy. Oblicz wzbogacenia jako stosunek liczby po do preselekcji i określ współczynnik fałszywych odkryć (FDR) na podstawie 1000 permutacji. Wybrano geny, na które celowane są shRNA z <5% FDR, jako "trafienia" do dalszych testów.

3. Walidacja zidentyfikowanych spinek ("trafień")

  1. Pakowanie lentiwirusów zawierających shRNA zidentyfikowane na ekranie przesiewowym
    1. Wysiewaj 8 x 106 komórek 293FT na płytkę na płytkach 10 cm.
    2. Następnego dnia zastąp pożywkę 9 ml wolnego od antybiotyków DMEM-10 na płytkę; zrób to 30 minut przed transfekcją.
    3. W ciągu 30-minutowego odstępu przygotuj dwie mieszanki do transfekcji:
      1. Przygotuj Mix 1 (na płytkę/shRNA; skaluj w górę zgodnie z całkowitą liczbą shRNA): 10 μl 2 mg/ml polietyleneniminy (PEI) w 0,5 ml optymalnej minimalnej niezbędnej pożywki. Wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. Przygotuj Mix 2 (na shRNA): 4 μg wektora shRNA do zapakowania, 1,5 μg wektora otoczki VSV-G (pMD2.G) i 2,5 μg wektora opakowania (psPAX2), zmieszane w 0,5 ml optymalnej minimalnej niezbędnej pożywki.
        UWAGA: Do opakowania należy dołączyć pusty wektor lentiwirusowy do wykorzystania w późniejszych infekcjach jako kontrola negatywna.
    4. Dodać 0,5 ml mieszaniny 1 do każdej porcji mieszaniny 2 i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    5. Nakładać mieszaninę na każdą płytkę z kroku 3.1.2 kroplami; delikatnie obracać płytkę, aby wymieszać.
    6. Następnego dnia zastąp pożywkę 5 ml świeżego DMEM-10.
    7. Po 48 godzinach od początkowej transfekcji zebrać supernatant i przepuścić go przez filtr 0,22 μm. Wstępnie zwilż filtr DMEM-10, aby zmaksymalizować odzysk.
    8. Przefiltrowany supernatant należy podzielić na ilości idealne do zakażenia 6-dołkowej płytki.
    9. Zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia lub natychmiast przystąpić do transdukcji.
  2. Transdukcja i testowanie poszczególnych spinek do włosów pod kątem reaktywacji reportera lucyferazy i reaktywacji genu MeCP2 typu dzikiego na Xi.
    1. Rano płytka 1 x 105 komórek Xi/studzienka na płytki 6-dołkowe.
    2. Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę 2 ml świeżego DMEM-10 zawierającego supernatant lentiwirusowy i 5-10 μg/ml polibrenu. Zainfekować studzienkę kontrolną supernatantem wirusowym wytwarzanym z pustego wektora lentiwirusowego.
    3. Następnego dnia zastąp pożywkę 2 ml DMEM-10 zawierającego 1 mg/ml puromycyny. Kultura przez cztery dni.
    4. Zastąp pożywkę 2 ml świeżego DMEM-10 i odczekaj 48-72 godziny na odzyskanie.
    5. Zmobilizuj komórki za pomocą 150 μl 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 1,5 ml DMEM-10. Przenieść komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze do lizy dostarczonym w zestawie do oznaczania lucyferazy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przenieś lizaty na białą 96-dołkową płytkę i oznacz aktywność lucyferazy przy użyciu protokołu dołączonego do zestawu. Użyj komórek Xa jako kontroli pozytywnej, a komórek Xi zakażonych pustym wektorem lentiwirusowym jako kontroli negatywnej.
      UWAGA: Unikaj wystawiania białych płytek na działanie światła fluorescencyjnego przed testem; Zmniejszy to tło i zwiększy czułość testu. Stwierdzono, że protokół dostarczony w zestawie testowym jest najskuteczniejszy, jeśli jest wykonywany w ciemności, gdy tylko jest to możliwe.
    7. Aby ustalić, czy spinka do włosów miała wpływ na poziom ekspresji MeCP2 na aktywnym chromosomie X, wyizoluj RNA z transdukowanych komórek Xi i zmierz poziom mRNA MeCP2 za pomocą ilościowego PCR ze starterami zaprojektowanymi do amplifikacji tylko MeCP2 typu dzikiego (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGAACAGC-3').
    8. Opcjonalnie: Zwiększ czułość testu, dodając 5-AZA do końcowego stężenia 0,2 μM po odzyskaniu komórek po selekcji puromycyny. Hoduj komórki przez 72 godziny bez wymiany pożywki, a następnie oznacz aktywność lucyferazy przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania lucyferazy.
    9. Zmierz reaktywację wyciszonego MeCP2 typu dzikiego. Zainfekuj komórki Xa, które są siedliskiem dzikiego typu MeCP2 na Xi, wektorem zawierającym pojedyncze spinki do włosów, postępując zgodnie z krokami protokołu 3.2.1. - 3.2.4. Wyizoluj RNA z komórek i zmierz poziom mRNA MeCP2 za pomocą ilościowej PCR ze starterami przeznaczonymi do amplifikacji tylko MeCP2 typu dzikiego (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Fibroblasty ścięgna myszy pobrano od wcześniej opisanej samicy myszy XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2, unieśmiertelniono poprzez transdukcję retrowirusową onkogenów E6 i E7 wirusa HPV-16, sklonowano metodą rozcieńczeń ograniczających, a następnie przetestowano pod kątem aktywności lucyferazy i ekspresji białka MeCP2 typu dzikiego (Rycyna 1A i 1B). Aktywność lucyferazy była wysoka, gdy reporter znajdował się na Xa, i niewykrywalna, gdy znajdował się na Xi; natywna e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W naszym niedawnym badaniu6 wygenerowaliśmy mysią linię komórkową z genami oporności na lucyferazy i higromycynę połączonymi z MeCP2 na Xi i transdukowaliśmy ją za pomocą biblioteki >60 000 shRNA ukierunkowanych na > 25 000 genów. Znaleźliśmy 30 genów, których knock-down dawał przewagę w przeżywalności przy selekcji higromycyny B, co sugeruje ich rolę w kontroli MeCP2 i wyciszaniu chromosomu X. Wyniki te zostały potwierdzone poprzez transdukcję zgłoszonej linii komórkowej za pomo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Leko przyczynił się do powstania tego artykułu jako pracownik Fred Hutchinson Cancer Research Center. Wyrażone poglądy są jego własnymi poglądami i niekoniecznie reprezentują poglądy National Institutes of Health lub rządu Stanów Zjednoczonych

Podziękowania

Dziękujemy Rossowi Dickinsowi z Uniwersytetu w Melbourne za łaskawe udostępnienie biblioteki shRNA używanej na ekranie. Praca ta została sfinansowana przez Rett Syndrome Research Trust (A.B.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
293FT Linia komórkowaInvitrogenR700-07
5-azacytydynaSigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
Przeciwciało anty-MECP2Millipore07-013
KolagenazaSigmaC2674-1G
Corning 96-dołkowe stałe białe mikropłytki polistyrenoweFisher Scientific07-200-336
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's EagleGibco11965-092
Zatrzymanie ekspresji Wektor retrowirusowy przystosowany do mikroRNA (pMSCV)Otwarte biosystemyEAV4679
Zatrzymanie ekspresji pSM2 Retrowirusowa biblioteka shRNAmirOpen BiosystemsRMM3796
Płodowa surowica bydlęcaFisherbrand03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501Lub równoważny
Hygromycyna BCalbiochem400051-1MU
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-019
System oznaczania lucyferazy Bright-GloPromegaE2610Jednorodny test do badań przesiewowych kolonii
System oznaczania lucyferazyPromegaE4530Niejednorodny test do testowania indywidualnych spinek
do włosówLuminometr TopCount NXTPerkin ElmerN/ALub podobny luminometr
MiSeq Reagent Kit v2IlluminaMS-102-2001Użyj zestawu kompatybilnego z Twoim sprzętem
Opti-MEMGibco31985-070
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
pMD2.GAddgene#12259Wektor
obwiedni VSV-GPolybreneSigmaTR-1003-G
PolietylenomeninaPolysciences23966-1
psPAX2Addgene#12260Wektor opakowania
PuromycinGibcoA11138-02
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300-054

Bibliografia

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341(2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inaktywacja chromosomu Xreaktywacja MeCP2reporter lucyferazowyselekcja higromycynsekwencjonowanie nast pnej generacjiWestern blottransdukcja lentiwirusowahodowla kom rekfibroblasty ci gien myszy

Powiązane artykuły