Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

Qa-1 należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b (MHC-Ib) u myszy. Jego ludzkim homologiem jest HLA-E. Wcześniejsze dowody wykazały, że cząsteczki Qa-1 pełnią ważne funkcje biologiczne. Po pierwsze, cząsteczki Qa-1 odgrywają ważną rolę w badaniu komórek pod kątem integralności strukturalnej i funkcjonalnej. W związku z tym cząsteczki Qa-1 rozwinęły kilka strategii monitorowania normalnej funkcji komórki. Jedna z takich strategii umożliwia cząsteczkom Qa-1 tworzenie kompleksów z przetworzonym peptydem liderowym (epitopem), tj. modyfikatorem determinantu Qa-1 (Qdm), który jest przetwarzany z klasycznych cząsteczek MHC-Ia w retikulum endoplazmatycznym¹. Te kompleksy Qa-1/Qdm pojawiają się później na powierzchni komórki i wiążą się z hamującymi receptorami NKG2A na komórkach NK, aby zahamować aktywność zabijania NK². Jeśli ekspresja cząsteczek MHC-Ia zostanie utracona, komórka (np. komórka złośliwa) staje się wrażliwa na zabijanie NK². Druga strategia umożliwia cząsteczkom Qa-1 tworzenie nowych kompleksów Qa-1/epitopów na powierzchni komórki, która ma niedobór TAP (transporter związany z przetwarzaniem antygenu)³ i/lub ERAAP (aminopeptydaza retikulum endoplazmatycznego związana z przetwarzaniem antygenu)⁴ (oba niedobory często występują w komórkach złośliwych). Komórka, która wyraża te nowe kompleksy Qa-1 / epitop, może być następnie rozpoznana i wyeliminowana przez specyficzne dla epitopu limfocyty T CD8 ⁺ ograniczone do Qa-1. Po drugie, cząsteczki Qa-1 indukują regulację immunologiczną⁵. W związku z tym wykazano, że kompleksy Qa-1/epitopy stymulują limfocyty T regulatorowe CD8 ⁺ (Treg), które są ważne dla zapobiegania uszkodzeniom tkanek własnych za pośrednictwem układu odpornościowego^6,7,8,9,10. Po trzecie, wykazano, że limfocyty Treg CD8 ⁺ z ograniczeniami Qa-1 ograniczają odpowiedź immunologiczną na infekcję wirusową¹¹.

Dlatego specyficzne zwiększanie specyficznych dla epitopów limfocytów T CD8⁺ z ograniczeniami Qa-1 jest potencjalnie obiecującą strategią eliminacji nieprawidłowych komórek, wzmocnienia regulacji immunologicznej i kontroli wielkości odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez wirusa. Chociaż nie ustalono, czy augmentacja limfocytów T CD8 + CD8 ⁺ specyficznych dla epitopu Qa-1 może wzmocnić nadzór immunologiczny i ograniczyć odpowiedzi immunologiczne wywołane wirusem, nasze laboratoria i inne wyraźnie wykazały, że immunizacja epitopami Qa-1 może zwiększyć funkcję komórek Treg CD8 ⁺ z ograniczeniami Qa-1 specyficznych dla patogennych autoimmunologicznych limfocytów T CD4 ⁺, prowadząc do skutecznej kontroli CD4 ⁺ Choroby autoimmunologiczne zależne od limfocytów T w różnych modelach zwierzęcych, takich jak eksperymentalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (zwierzęcy model ludzkiego stwardnienia rozsianego)^6,10, kolagenowe zapalenie stawów (zwierzęcy model ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów)⁷, oraz cukrzyca nieotyła (zwierzęcy model ludzkiej cukrzycy typu 1)⁸. Ponadto odkryliśmy, że immunizacja specyficznym tkankowo epitopem Qa-1 prowadzi do specyficznej kontroli stanu zapalnego o podłożu immunologicznym w tej tkance poprzez augmentację komórek Treg CD8 ⁺ sup¹². Powyższe sukcesy badań przedklinicznych wskazują na potrzebę pełnej oceny immunizacji epitopami Qa-1 w leczeniu chorób immunologicznych specyficznych tkankowo oraz potencjalnie w terapii innych chorób związanych z niedoborami TAP i ERAAP.

W związku z tym, istnieje zapotrzebowanie na technologię, która może niezawodnie i szybko analizować epitopy Qa-1 w białku. W związku z tym opisano ograniczoną liczbę biologicznie ważnych epitopów Qa-1. Większość z tych epitopów Qa-1 została zidentyfikowana przypadkowo podczas badania odpowiedzi limfocytów T CD8 ⁺ na bakterie¹³, komórki z niedoborem TAP³, komórki z niedoborem ERAAP⁴, oraz komórki, które powodują EAE^6,9. W związku z tym pożądana jest technika wysokoprzepustowa do identyfikacji biologicznie ważnych epitopów Qa-1 w określonym białku. Poniżej opisujemy strategię biblioteki nakładających się peptydów (OLP), która mapuje funkcjonalne epitopy Qa-1 w białku przy użyciu linii komórek T CD8 ⁺ z repryksem Qa-1 specyficznych dla puli OLP (OLP_pool) białka.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Protokołem Opieki i Użytkowania Zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Teksańskim w El Paso i Uniwersytecie Loma Linda.

1. Generowanie biblioteki OLP obejmującej całą długość białka

1. Zaprojektuj bibliotekę OLP, w której wszystkie peptydy mają długość 15 merów, a sąsiednie peptydy nakładają się na siebie o 11 aminokwasów.
   UWAGA: W badaniu MOG OLP sekwencję prekursora MOG [Mus musculus] pobrano z bazy danych białek NCBI pod tym linkiem: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Prekursor MOG (247 aminokwasów), który zawierał zarówno peptydy sygnałowe, jak i dojrzałe, został użyty, ponieważ większość zgłoszonych epitopów Qa-1 (HLA-E) znajdowała się w peptydach sygnałowych (np. Qdm¹). Zaczynając od N-końca, sekwencje 15-merowych peptydów zostały zidentyfikowane w taki sposób, że dwa sąsiednie peptydy nałożyły się na siebie przez 11 aminokwasów (Rysunek 1). W związku z tym zidentyfikowano dokładnie 59 OLP w prekursorze 247 aminokwasów MOG. Jednak ostatni OLP może wynosić od 12 do 15 merów, w zależności od długości białka. Dodatkowo wybraliśmy bibliotekę 15-merową, ponieważ my i inni wykazaliśmy, że peptydy 15-merowe, po dodaniu do komórek dendrytycznych (DC) lub makrofagów, mogą być efektywnie przetwarzane na epitopy do rozpoznania przez limfocyty T CD8 ^+14,15.
2. Kup każdy pojedynczy peptyd komercyjnie. 5 mg na peptyd powinno wystarczyć do badania przesiewowego. OLP i peptydy skrócone (krok 6.1) mogą być peptydami odsolonymi (czystość wynosi około 50 - 70%). Czystość optymalnego peptydu (krok 6.2), który zostanie wykorzystany do wytworzenia tetrameru i do przyszłych analiz biologicznych, powinna wynosić >90%. Rozpuść peptydy w sterylnych warunkach.
3. Zrób 50 mg / ml pojedynczych zapasów peptydów w 100% DMSO. Na 5 mg każdego peptydu dodać 100 μl DMSO do każdej probówki, wymieszać i przechowywać peptydy w temperaturze -20 °C. Zapasy te zostaną wykorzystane do wytworzenia zapasu OLP_pool do wytwarzania linii limfocytów T CD8 ⁺ reaktywnych na OLP_pool. Ponadto zapasy te zostaną również wykorzystane do wytworzenia indywidualnych zapasów peptydów 10 mg / ml w celu określenia zdolności każdego pojedynczego peptydu do stymulowania odpowiedzi ograniczonej do Qa-1 w OLP_pool-reaktywnej linii komórek T CD8 ⁺.
4. Przygotuj OLP_pool bulionu, dodając równą objętość każdego peptydu do świeżej probówki. Ten OLP_pool zapas zawiera 100% DMSO. W badaniu MOG OLP było 59 OLPów¹². Stąd stężenie każdego peptydu w OLP_pool wynosiło 847,46 μg/ml (50 mg/ml ÷ 59).
5. Przygotować 10 mg / ml pojedynczych zapasów peptydowych przez rozcieńczenie (5x) 50 mg / ml zapasu w sterylnym H₂O na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V (ten zapas zawiera 20% DMSO). Zrób te zapasy na płytce 96-dołkowej, ponieważ określenie odpowiedzi z ograniczeniami Qa-1 dla każdego pojedynczego peptydu zostanie przeprowadzone na płytce 96-dołkowej przy użyciu 8- lub 12-kanałowej pipety wielokanałowej.
   UWAGA: Wszystkie peptydy, w tym OLP i peptydy skrócone, należy rozcieńczyć na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub na 96-dołkowym stojaku na próbki wypełnionym probówkami o pojemności 1 ml, ponieważ badanie przesiewowe biblioteki peptydów przeprowadza się na płytkach 96-dołkowych za pomocą pipety wielokanałowej. Jeśli trudno jest rozcieńczyć peptyd, dodaj kroplami 1 N NaOH, aby pomóc rozpuścić peptyd.

2. Gruntowanie komórek T^{K b-/-} D^b-/- CD8⁺ za pomocą OLP_pool-pulsacyjnych komórek K^b-/- D^b-/- Ogniw dendrytycznych (DC).

UWAGA: Istnieją dwa główne allele Qa-1: jeden to Qa-1^a, a drugi to Qa-1^b. Ponieważ zwierzęta powszechnie wykorzystywane do badań akademickich, np. myszy C57BL/6 i Balb/c, są nosicielami Qa-1^b, protokół ten opisuje procedurę mapowania epitopów Qa-1^b w białku. Limfocyty T CD8 ⁺ stosowane w tym protokole są oczyszczane z myszy K^{b / -}D^{b / - (}tło C57BL / 6), w których limfocyty T CD8 ⁺ są ograniczone głównie przez nieklasyczne cząsteczki MHC-Ib, w tym Qa-1.

1. Wytwórz DC pochodzące ze szpiku kostnego, jak opisano wcześniej¹².
   1. Krótko mówiąc, hodowla zawiesin jednokomórkowych szpiku kostnego (1 x 10⁶ komórek/ml) w pożywce RPMI-10 (RPMI 1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 5,5 x ^10-5 M 2-merkaptoetanolem, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM aminokwasem endogennym) zawierającymi 10 U/ml IL-4 i 100 U/mL GM-CSF w 6-dołkowej płytce (4 ml/dołek) w temperaturze 37 °C, 5 % emisji CO₂ %.
   2. Dwa dni później ostrożnie usuń nieprzylegające komórki i dodaj świeże podłoże i cytokiny.
   3. Po hodowli komórek przez kolejne dwa dni, przenieś nieprzylegające komórki zawierające świeże pożywki i cytokiny na nową płytkę 6-dołkową.
   4. Hoduj komórki przez kolejne dwa dni i uzupełnij je świeżymi pożywkami i cytokinami zawierającymi LPS (0,1 μg/ml) w celu aktywacji DC.
   5. 24 godziny później zbierz kontrolery domeny do eksperymentów.
2. Napromieniuj DC 3000 radami.
   1. Alternatywnie, potraktować DC (5 x 10⁷ komórek/ml) mitomycyną C (50 μg/ml) w PBS w temperaturze 37 °C przez 20 min. Dodać RPMI-0 (RPMI 1640 bez surowicy), aby napełnić probówkę (~12 ml) i wirować komórki przez 10 minut w wirówce stołowej o stężeniu 300 x g. Odrzucić supernatanty i powtórzyć procedurę mycia jeszcze dwa razy. Te trzy płukania mają kluczowe znaczenie, ponieważ każda śladowa ilość mitomycyny C może hamować odpowiedź limfocytów T CD8 ⁺ podczas kohodowli komórek DC-T.
3. Dostosuj stężenie DC do 5 x 10⁶ komórek/ml w pożywce bez surowicy (pożywka bez surowicy AIM-V uzupełniona 5,5 x ^10-5 M 2-merkaptoetanolem, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM aminokwasem endogennym).
4. Dodaj OLP_pool roztwór podstawowy, który zawiera 100% DMSO, do DC tak, aby końcowe stężenie DMSO wynosiło 0,5% (200x). W badaniu MOG OLP stężenie każdego OLP w OLP_pool wynosiło 847,46 μg/ml; stąd końcowe stężenie każdego OLP w kulturze DC wynosiło 4,2 μg/ml (847,46 μg/ml ÷ 200). Jednak stężenie to można skalować do 100 μg/ml, o ile stężenie DMSO w hodowli komórkowej pozostaje mniejsze niż 1%.
5. Inkubować DC w temperaturze pokojowej przez 3 godziny i delikatnie wstrząsać komórkami co 15 minut.
6. Podczas tego okresu inkubacji oczyść limfocyty T CD8 ⁺ z pobranej śledziony lub węzłów chłonnych myszy K^{b / -}D^{b / - za} pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania limfocytów T CD8 ⁺, dostosuj stężenie komórek do 10 x 10⁶ komórek / ml w pożywce bez surowicy zawierającej 50 U / ml interleukiny 2 (IL-2) i 100 U / ml IL-7.
7. Teraz dodaj limfocyty T CD8 ⁺ do 48-dołkowej płytki jako 0,5 ml / dołek (po dodaniu 0,5 ml / studzienki OLP_pool-pulsacyjnych DC w kroku 2.8, końcowe stężenie limfocytów T CD8 ⁺ wyniesie 5 x 10⁶ komórek / ml).
   UWAGA: Limfocyty T CD8 ⁺ ze śledziony i węzłów chłonnych myszy można oczyścić za pomocą zestawu do izolacji CD8 Positive Isolation Kit, postępując zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Uzyskane limfocyty T CD8 ⁺ są wolne od kulek.
8. Zakręć OLP_pool-pulsacyjne DC (300 x g, 10 min) w temperaturze RT. Rozpuść OLP_pool-pulsacyjne DC do 2 x 10⁶ komórek/ml w pożywce bez surowicy i dodaj 0,5 ml/studzienkę do 48-dołkowej płytki zawierającej limfocyty T CD8 ⁺ (końcowe stężenie OLP_pool-pulsacyjnych DC wynosi 1 x 10⁶ komórek/ml, końcowe stężenie limfocytów T CD8 ⁺ wynosi 5 x 10⁶ komórek / ml, końcowe stężenie IL-2 wynosi 25 U / ml, a końcowe stężenie IL-7 wynosi 50 U / ml). Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
9. W dniu 4 usunąć i wyrzucić około 400 μl pożywki hodowlanej i dodać 500 μl świeżej pożywki bez surowicy zawierającej 100 U/ml IL-2 i 100U/ml IL-7 do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
10. W dniu 7 lub 8 ponownie stymuluj OLP_pool zagruntowane limfocyty T CD8 ⁺ za pomocą OLP_pool.

3. Restymulacja zaszczepionych limfocytów T CD8⁺ za pomocą makrofagów pulsujących z OLP_pool

1. Cztery dni przed ponowną stymulacją limfocytów T CD8 ⁺ zagruntowanych OLP_pool przygotuj 2% (v/v) roztwór kulek poliakrylamidowych: przemyj 2 g kulek poliakryloamidu dwukrotnie w 20 ml wolnego od endotoksyn_H2Olub PBS. Granulki poliakryloamidu osadzać przez odwirowanie (400 x g) przez 5 minut i ponownie zawiesić w 100 ml PBS. Autoklaw z prędkością 15 lb/m przez 20 min. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 1 ml / mysz sterylnego 2% roztworu kulek poliakrylamidu, aby przyciągnąć migrację monocytów / makrofagów do jamy otrzewnowej ¹⁶.
3. Cztery dni później należy złożyć zwierzęta w ofierze z powodu przedawkowania CO₂ .
   1. W sterylnych warunkach wytnij mały otwór na środku brzucha, tak aby otwór był wystarczający do przejścia pipety transferowej o pojemności 5 ml. Napełnij pipetę transferową RPMI-0 i włóż pipetę do jamy brzusznej przez otwór.
   2. Przepłukać jamę brzuszną za pomocą pipetowania. Odpipetować jak najwięcej płynu z jamy brzusznej do sterylnej rurki (są to makrofagi otrzewnowe). Powtórz krok płukania 4 - 5 razy.
4. Napromienij makrofagi otrzewnowej 3000 Radami.
   1. Alternatywnie, należy potraktować makrofagi otrzewnowe mitomycyną C (postępować zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.2).
5. Dostosuj stężenie makrofagów otrzewnowej do 5 x 10⁶ komórek/ml w pożywce bez surowicy. Dodaj OLP_pool bulionu (końcowe stężenie DMSO jest mniejsze niż 1%) i M-CSF (stężenie końcowe = 100 U/ml).
   UWAGA: W tym badaniu MOG OLP użyliśmy 0,5% DMSO. W ten sposób MOG OLP_pool zapas rozcieńczono 200x (np. 1 μl MOG OLP_Pool zapasu dodano do 199 μl makrofagów otrzewnowych). Stąd końcowe stężenie każdego OLP wynosiło 4,2 μg/ml).
6. Dodać 200 μl/basenik (1 x 10⁶ komórek/basenik) do 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
7. Usunąć nieprzylegające komórki i kulki poliakryloamidu przez delikatne przemycie 200 μl/studzienkę wstępnie podgrzanego RPMI-0.
8. Zbierz i połącz OLP_pool zagruntowane limfocyty T CD8 ⁺ z kroku 2.10. Dostosuj stężenie OLP_pool zagruntowanych limfocytów T CD8 ⁺ do 1 x 10⁶ komórek/ml w pożywce bez surowicy zawierającej 25 U/ml IL-2 i 50 U/ml IL-7. Dodaj 1 ml / studzienkę do 48-dołkowej płytki, która zawiera makrofagi otrzewnowe z OLP_pool pulsacją.
9. Cztery dni później uzupełnij pożywkę w 48-dołkowej płytce. Wyjąć i wyrzucić około 400 μl pożywki hodowlanej z 48-dołkowych płytek hodowlanych. Dodać 500 μl świeżej pożywki bez surowicy zawierającej 100 U/ml IL-2 i 100 U/ml IL-7 do każdej studzienki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
10. Trzy lub cztery dni później zbadaj limfocyty T CD8 ⁺ z OLP_pool restymulacją pod kątem specyficznej dla OLP_pool, ograniczonej odpowiedzi Qa-1 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISPOT). Po tym czasie należy ponownie stymulować limfocyty T CD8 ⁺ co 7 - 10 dni.
    UWAGA: Makrofagi są preferowane do ponownej stymulacji limfocytów T CD8 ⁺ zagruntowanych OLP_pool. Zauważyliśmy, że limfocyty T CD8 ⁺ restymulowane przez makrofagi rosły lepiej niż DC in vitro.

4. Określenie specyficznej dla OLP_pool, ograniczonej Qa-1 odpowiedzi w OLP_pool remiksowanej linii komórek T CD8⁺

UWAGA: Specyficzna dla OLP_pool, ograniczona Qa-1 odpowiedź w linii komórek T CD8⁺ z OLP_pool restymulowaną jest determinowana przez wydzielanie IFNγ po stymulacji przez OLP_pool w obecności C1R lub C1R. Limfocyty^{Qa-1 b} przy użyciu testu IFNγ ELISPOT. Ogniwa C1R można uzyskać komercyjnie. C1R. Limfocyty^B Qa-1 mogą być generowane przez transdukcję komórek C1R za pomocą wektora lentiwirusowego Qa-1.

1. Dodać 100 μl/basenik przeciwciała anty-IFN-γ rozcieńczonego w buforze powlekającym (PBS) do dołków płytki ELISPOT. Uszczelnić i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.
2. Drugiego dnia odrzucić bufor powlekający zawierający przeciwciało anty-IFN-γ wychwytujące i dodać 200 μl/roztwór blokujący basenik (pożywka bez surowicy) i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Napromieniować C1R i C1R. Limfocyty^B Qa-1 z 9,600 Radami.
   1. Alternatywnie traktuj C1R i C1R. Limfocyty^B Qa-1 z mitomycyną C, jak opisano w kroku 2.2, z wyjątkiem tego, że czas leczenia będzie wynosił 30 minut.
4. Wyreguluj C1R i C1R. Limfocyty^B Qa-1 w podłożu bez surowicy do 4 x 10⁶ komórek/ml.
5. Odrzucić roztwór blokujący z płytki i dodać C1R i C1R. Limfocyty^B Qa-1 w stężeniu 50 μl / dołek (200 000 komórek / dołek) i wymieszać.
6. Dodaj 50 μl/dołek 100x rozcieńczonego bulionu OLP_pool (w podłożu bez serum) i odpowiednio wymieszaj. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny.
7. Dostosuj limfocyty T CD8 ⁺ z resymulacją OLP_pool do 1 - 2 x 10⁶ komórek/ml w pożywce bez surowicy zawierającej 150 U/ml IL-7 i dodaj 50 μL/dołek (50 000 - 100 000 komórek/dołek) do płytki. Odwirować płytkę (58 x g) przez 5 minut.
8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez noc.
9. Odessać zawiesinę komórek. Umyj studzienki 2 razy wodą dejonizowaną (DI) (250 μL/studzienkę). Pozostaw studzienki do namoczenia przez 5 minut na każdym etapie mycia.
10. Przemyć studzienki 3 razy buforem do płukania I (PBS zawierający 0,05% Tween20). Pozwól studzienkom moczyć się przez 1 minutę na każdym etapie mycia. Wyrzuć bufor do mycia.
11. Dodać 100 μl przeciwciała wykrywającego rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym (PBS zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)).
12. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
13. Odrzuć roztwór przeciwciała wykrywającego. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 250 μl/studzienkę buforem do płukania I. Pozostaw studzienki do namoczenia przez 1 minutę na każdym etapie mycia.
14. Dodać 100 μl/basenik koniugatu enzymatycznego (Streptawidyna-HRP) rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym w rozcieńczeniu 1:100.
15. Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
16. Odrzuć sprzężony roztwór enzymu. Przemyj studzienki 4 razy za pomocą 250 μl/studzienkę buforem do płukania I. Pozostaw studzienki do namoczenia przez 1 minutę na każdym etapie mycia.
17. Przemyć studzienki 2 razy 250 μl/studzienkę buforem do płukania II (PBS).
18. Dodaj 100 μl roztworu substratu (wymieszaj 1 kroplę = 20 μl chromogenu AEC z 1 ml substratu AEC) do każdej studzienki. Monitoruj rozwój plamki przez 5 do 60 minut.
19. Gdy zaczną pojawiać się pożądane rezultaty, zatrzymaj reakcję substratu, myjąc studzienki wodą destylowaną.
20. Suszyć płytki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc, aż całkowicie wyschną. Wyjęcie plastikowej tacki spod talerzy ułatwi suszenie. Przechowuj płytki w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w ciemności, dopóki nie zostaną przeanalizowane.
21. Ręczne liczenie plamek odbywa się za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub czytnika płytek ELISPOT. Zobacz reprezentatywny wynik w Rysunek 2.

5. Oznaczanie poszczególnych peptydów w OLP_pool, które stymulują do ograniczonego wydzielania IFN-γ Qa-1 w linii komórek T CD8⁺ specyficznej dla OLP_pool

1. Określ poszczególne peptydy, które stymulują OLP_pool-specyficzne, ograniczone przez Qa-1 wydzielanie IFN-γ w OLP_pool-specyficznej linii komórek T CD8 ⁺ za pomocą wyżej opisanego testu IFN-γ ELISPOT (końcowe stężenie każdego pojedynczego peptydu użytego do testu ELISOPT wynosi 10 μg/ml). Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 3.
   UWAGA: Odpowiedź specyficzna dla OLP, ograniczona przez Qa-1 jest definiowana jako odpowiedź, która jest co najmniej trzykrotnie większa niż odpowiedź w obecności C1R. Komórki Qa-1^b, ale bez OLP. W badaniu MOG OLP OLP68, OLP96 i OLP105 spełniały to kryterium. W związku z tym wszystkie trzy OLP potencjalnie zawierają epitopy Qa-1¹² (Rysunek 3). Jednak OLP105 konsekwentnie dawał najsilniejszą odpowiedź; W związku z tym przeprowadziliśmy szczegółową analizę OLP105 (Rysunek 4 i Rysunek 5)12.

6. Identyfikacja optymalnego epitopu Qa-1 w 15-merowym OLP, który stymuluje specyficzną dla epitopu, ograniczoną odpowiedź Qa-1 w linii limfocytów T CD8⁺ specyficznej dla OLP_pool

1. Zsyntetyzuj C- i N-końcowo skrócone peptydy 15-merowego OLP, jak pokazano w Rysunek 4.
2. Zbadaj wydzielanie IFN-γ w linii komórek T CD8 ⁺ specyficznej dla OLP, stymulując limfocyty T CD8 ⁺ każdym ze skróconych peptydów, a także rodzicielskim 15-merowym OLP w obecności C1R lub C1R. Limfocyty Qa-1^b przy użyciu opisanego powyżej testu IFN-γ ELISPOT. Końcowe stężenie każdego pojedynczego peptydu użytego w teście ELISPOT wynosi 10 μg/ml. Peptyd definiuje się jako optymalny epitop Qa-1, jeśli peptyd: 1) konsekwentnie daje podobną lub silniejszą odpowiedź IFN-γ, w porównaniu z oryginalnym peptydem 15-merowym, w obecności C1R. Limfocyty^B Qa-1; 2) mieści się w przedziale 8 - 10-merów (preferowany peptyd 9-merowy), które są długościami peptydów związanymi z cząsteczkami MHC-I^15,17. Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 5.

Projekt biblioteki OLP obejmującej całą długość białka

Zaczynając od N-końca białka, każdy peptyd składa się z 15 aminokwasów (15-mer). W związku z tym pierwszy peptyd obejmuje pozycje od 1 do pozycji 15. N-koniec drugiego peptydu nakłada się na C-koniec pierwszego peptydu o 11 aminokwasów. W związku z tym drugi peptyd obejmuje pozycję 5 do pozycji 19. Zaprojektuj pozostałe peptydy do końca C białka (Rysunek 1). Wybraliśmy bibliotekę 15-merową, ponieważ my i inni wykazaliśmy, że peptydy 15-merowe, po dodaniu do komórek dendrytycznych (DC) lub makrofagów, mogą być skutecznie przetwarzane na epitopy do rozpoznania przez limfocyty T CD8 +14,15. Liczba OLP w bibliotece zależy od długości białka. Dodatkowo, ostatni OLP może wynosić od 12 do 15 merów w zależności od długości białka. Na przykład glikoproteina mieliny oligodendrocytów (MOG) ma długość 247 aminokwasów. Biblioteka MOG OLP zawiera 59 ORPs12. Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym artykule pochodzą z analizy biblioteki MOG OLP.

Określenie specyficznej dla OLP_pool, ograniczonej Qa-1 odpowiedzi w stymulowanej OLP_pool linii komórek T CD8+

Stworzyliśmy linię komórek T CD8+, która została zaszczepiona przez Kb-/-Db-/- DC pulsowane za pomocą MOG OLP_pool (MOG_pool) i reaktywowane przez makrofagi otrzewnowe Kb-/-Db-/- MOG_pool pulsacyjne, jak opisano w wyżej wymienionym protokole (Protokół 1, 2 i 3). Aby określić potencjalną MOG_pool-specyficzną, ograniczoną przez Qa-1 odpowiedź w tej linii komórek T CD8 +, zbadaliśmy odpowiedź tej linii komórek T CD8 + na MOG_pool w obecności C1R lub C1R. Komórki Qa-1b przy użyciu testu IFN-γ ELISPOT (Rysunek 2) (Krok protokołu 4). Nasze dane wykazały, że stymulowana przez MOG_pool linia komórek T CD8 + wydzielała niski poziom IFN-γ w obecności C1R. LimfocytyB Qa-1 (32 komórki tworzące plamki lub SFC), ale nie komórki C1R (2 SFC), co sugeruje obecność limfocytów T CD8 +, które zareagowały na epitopy wiążące Qa-1 pochodzące z komórek C1R (komórki C1R to ludzkie komórki limfoblastoidalne B). SFC zostały zwiększone, gdy MOG_pool została dodana do studzienki zawierającej komórki C1R (78 SFC), co sugeruje obecność limfocytów T CD8 +, które reagowały na epitopy inne niż Qa-1. SFC znacznie wzrosły, gdy MOG_pool został dodany do studni, w której znajdował się C1R. LimfocytyB Qa-1 (320 SFC), co sugeruje obecność limfocytów T CD8 +, które zareagowały na peptydy wiążące Qa-1. Dane pokazują również, że MOG_pool zawiera epitop (epitopy) wiążące Qa-1.

Określenie poszczególnych peptydów w OLP_pool, które przyczyniają się do ograniczonego przez Qa-1 wydzielania IFN-γ w OLP_pool-reaktywnej linii komórek T CD8+

Aby określić peptydy w OLP_pool, które stymulowały wydzielanie IFN-γ z ograniczeniami Qa-1 w MOG_pool-reaktywnej linii komórek T CD8+, stymulowaliśmy MOG_pool-reaktywne limfocyty T CD8+ pojedynczymi 59 OLP w obecności C1R lub C1R. Komórki Qa-1b (Rysunek 3) (Krok 5 protokołu). Nasze dane wykazały, że w studzienkach, które zawierały komórki C1R i OLP, zaobserwowano niewiele SFC. W przeciwieństwie do tego, SFC wzrosły we wszystkich studzienkach, które zawierały C1R. LimfocytyB Qa-1 i OLP. Z Rysunek 2, dowiedzieliśmy się, że limfocyty T CD8+ w obecności C1R. Sama Qa-1b również tworzyła SFC. W związku z tym zwiększone SFC w większości studzienek może być spowodowane niespecyficzną stymulacją w wyniku prezentacji epitopów Qa-1 pochodzących z białek wewnątrzkomórkowych w komórkach C1R przez cząsteczki Qa-1. Jednak OLP w 3 obramowanych studzienkach w Rysunek 3C (B8, D12 i E9), które pasowały do 3 podświetlonych OLP w Rysunek 3A (OLP68, OLP96 i OLP105), spełniały kryterium definiowania odpowiedzi IFN-γ specyficznej dla OLP, ograniczonej Qa-1, zgodnie z opisem w kroku protokołu 5.112. Dane sugerują, że 3 OLP zawierają epitop (epitopy) Qa-1. Ponieważ OLP105 konsekwentnie generował najwyższą odpowiedź, przeprowadziliśmy szczegółową analizę klasy OLP10512.

Projekt okrojonej biblioteki peptydów dla 15-merowego OLP

15-merowy OLP, który został uznany za stymulujący ograniczone przez Qa-1 wydzielanie IFN-γ w OLP_pool-reaktywnej linii komórek T CD8+, musi zostać przeanalizowany pod kątem optymalnego epitopu przy użyciu okrojonej biblioteki peptydów. Taka skrócona biblioteka peptydów została zaprojektowana przez stopniowe skracanie 15-merowego OLP o 1 aminokwas na jego końcach N i C (Rysunek 4). Podobnie jak inne cząsteczki MHC klasy I, cząsteczki Qa-1 wiążą się głównie z peptydami 8-10-merowymi. Dlatego zalecamy, aby najkrótszy ścięty peptyd miał długość 6 merów.

Identyfikacja optymalnego epitopu Qa-1 w 15-merowym OLP, który stymuluje ograniczone Qa-1 wydzielanie IFN-γ w OLP_pool-reaktywnej linii komórek T CD8+

Powyższe N- i C-końcowo ścięte peptydy są testowane pod kątem siły w stymulowaniu wydzielania IFN-γ w linii komórek T CD8+ specyficznej dla OLP_pool lub 15-merowego OLP za pomocą IFN-γ ELISPOT opisanego powyżej. W badaniu epitopów Qa-1 w klasie MOG12 wygenerowaliśmy linię komórek T CD8 +, która była specyficzna dla MOG OLP105 (Rysunek 5A). Dalsza analiza wykazała, że N-końcowo skrócony peptyd 9-merowy spełniał dwa kryteria optymalnego epitopu, jak opisano w kroku 6.2 protokołu (Rysunek 5B). Dlatego doszliśmy do wniosku, że N-końcowo skrócony peptyd 9-merowy był optymalnym epitopem Qa-1.

Rysunek 1: Projekt biblioteki OLP obejmującej całą długość białka. Zaczynając od N-końca, zidentyfikowano peptydy o długości 15 aminokwasów (15 merów). N-koniec każdego peptydu, z wyjątkiem pierwszego peptydu, nakładał się na C-koniec poprzedniego peptydu o 11 aminokwasów.

Rycina 2: Limfocyty T CD8 + stymulowane przez MOG_pool były częściowo MOG_pool specyficzne i ograniczone przez Qa-112.Limfocyty T CD8 + in vitro stymulowane przez MOG OLP_pool (MOG_pool) badano pod kątem odpowiedzi na MOG_pool w obecności C1R lub C1R. LimfocytyB Qa-1 jako komórki prezentujące antygen przy użyciu testu IFN-γ ELISPOT. Pokazano reprezentatywne obrazy ELISPOT. Liczba komórek tworzących plamki (SFC) jest pokazana w lewym górnym rogu każdej studzienki. Limfocyty T CD8 +: 50 000 komórek / dołek. C1R lub C1R. KomórkiB Qa-1: 200 000 komórek / studzienkę.

Rysunek 3: Analiza OLP w MOG_pool, które były odpowiedzialne za ograniczoną odpowiedź Qa-1. (A) Układ 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V, która zawierała 10 mg/ml poszczególnych MOG OLP. Liczby w studzienkach reprezentowały identyfikatory OLP. Wyróżnione 3 studzienki zawierały OLP, które spełniały kryterium specyficznej dla OLP, ograniczonej przez Qa-1 odpowiedzi IFN-γ, zgodnie z opisem w kroku protokołu 5.112. (B) Reprezentatywne SFC w każdym dołku, który zawierał OLP (końcowe stężenie = 4,2 μg / mL, OLP ID pasowało do tego w "A"), MOG_pool-reaktywne limfocyty T CD8 + (50 000 komórek / studzienkę) i komórki C1R (200 000 komórek / studzienkę). (C) Reprezentatywne SFC w każdym dołku, który zawierał OLP (końcowe stężenie = 4,2 μg / mL, OLP ID pasowało do tego w "A"), MOG_pool-reaktywne limfocyty T CD8 + (50 000 komórek / studzienkę) i C1R. LimfocytyB Qa-1 (200 000 komórek / studzienkę). 3 obramowane studnie zawierały OLP, które spełniały kryterium specyficznej dla OLP, ograniczonej Qa-1 odpowiedzi IFN-γ12. Rysunek został zaadaptowany z reference12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Projektowanie obciętych peptydów peptydu 15-merowego. Peptyd 15-merowy był stopniowo skracany na końcach N i C przez 1 aminokwas do 6-meru. Następnie zsyntetyzowano 15-mer i jego skrócone peptydy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza optymalnego epitopu Qa-1 w OLP105. (A) Stymulowaną przez OLP105 linię komórek T CD8 + zbadano pod kątem odpowiedzi na OLP68, OLP96 i OLP105 w obecności C1R lub C1R. LimfocytyQa-1 b przy użyciu testu IFN-γ ELISPOT. Pokazane są reprezentatywne SFC IFN-γ (numery w lewym górnym rogu). (B) Specyficzna dla OLP105 linia komórek T CD8 +, jak pokazano w (A), została zbadana pod kątem odpowiedzi na poszczególne N- i C-końcowo skrócone peptydy, jak pokazano w Figura 4, w obecności C1R. LimfocytyB Qa-1 za pomocą testu IFN-γ ELISPOT. OLP105: 15-merowy OLP. N6-14: N-końcowo obcięte peptydy OLP105. C6-14: C-końcowo skrócone peptydy OLP105. Limfocyty T CD8 +: 50 000 komórek / dołek. C1R. KomórkiB Qa-1: 200 000 komórek / studzienkę. Liczby w lewym górnym rogu to SFC na 50 000 limfocytów T CD8 +. Czerwony prostokąt oznaczał studnię, która spełniała kryteria definiowania optymalnego epitopu Qa-1 w OLP, jak opisano w kroku 6.2 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.