Artykuł metodologiczny

Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56401

⸱

20 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, Loma Linda University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.

Streszczenie

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b (MHC-Ib). Najnowsze dane sugerują, że cząsteczki Qa-1 odgrywają ważną rolę w badaniu komórek pod kątem integralności strukturalnej i funkcjonalnej, indukowaniu regulacji immunologicznej i ograniczaniu odpowiedzi immunologicznej na infekcje wirusowe. Dodatkowo, funkcjonalna augmentacja limfocytów T CD8 + z ograniczeniami Qa-1 poprzez immunizację epitopów wykazała efekty terapeutyczne w kilku zwierzęcych modelach chorób autoimmunologicznych, np. eksperymentalnym alergicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego, zapaleniu stawów wywołanym kolagenem i cukrzycy nieotyłej. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania metody, która może skutecznie i szybko zidentyfikować funkcjonalne epitopy Qa-1 w białku. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje linie komórek T CD8 + z ograniczeniami Qa-1 specyficzne dla biblioteki nakładających się peptydów (OLP) do oznaczania epitopów Qa-1 w białku. Ta biblioteka OLP zawiera 15-merowe nakładające się peptydy, które pokrywają całą długość białka, a sąsiednie peptydy nakładają się na siebie o 11 aminokwasów. Korzystając z tego protokołu, niedawno zidentyfikowaliśmy 9-merowy epitop Qa-1 w glikoproteinie oligodendrocytów mielinowych (MOG). Wykazano, że ten nowo zmapowany epitop MOG Qa-1 indukuje specyficzne dla epitopu, ograniczone do Qa-1 limfocyty T CD8 +, które wzmacniają regulację immunologiczną specyficzną dla mieliny. Dlatego protokół ten jest przydatny do przyszłych badań nad nowymi celami i funkcjami limfocytów T CD8 + z ograniczeniami Qa-1.

Wprowadzenie

Qa-1 należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b (MHC-Ib) u myszy. Jego ludzkim homologiem jest HLA-E. Wcześniejsze dowody wykazały, że cząsteczki Qa-1 pełnią ważne funkcje biologiczne. Po pierwsze, cząsteczki Qa-1 odgrywają ważną rolę w badaniu komórek pod kątem integralności strukturalnej i funkcjonalnej. W związku z tym cząsteczki Qa-1 rozwinęły kilka strategii monitorowania normalnej funkcji komórki. Jedna z takich strategii umożliwia cząsteczkom Qa-1 tworzenie kompleksów z przetworzonym peptydem liderowym (epitopem), tj. modyfikatorem determinantu Qa-1 (Qdm), który jest przetwarzany z klasycznych cząsteczek MHC-Ia w retikulum endoplazmatycznym1. Te kompleksy Qa-1/Qdm pojawiają się później na powierzchni komórki i wiążą się z hamującymi receptorami NKG2A na komórkach NK, aby zahamować aktywność zabijania NK2. Jeśli ekspresja cząsteczek MHC-Ia zostanie utracona, komórka (np. komórka złośliwa) staje się wrażliwa na zabijanie NK2. Druga strategia umożliwia cząsteczkom Qa-1 tworzenie nowych kompleksów Qa-1/epitopów na powierzchni komórki, która ma niedobór TAP (transporter związany z przetwarzaniem antygenu)3 i/lub ERAAP (aminopeptydaza retikulum endoplazmatycznego związana z przetwarzaniem antygenu)4 (oba niedobory często występują w komórkach złośliwych). Komórka, która wyraża te nowe kompleksy Qa-1 / epitop, może być następnie rozpoznana i wyeliminowana przez specyficzne dla epitopu limfocyty T CD8 + ograniczone do Qa-1. Po drugie, cząsteczki Qa-1 indukują regulację immunologiczną5. W związku z tym wykazano, że kompleksy Qa-1/epitopy stymulują limfocyty T regulatorowe CD8 + (Treg), które są ważne dla zapobiegania uszkodzeniom tkanek własnych za pośrednictwem układu odpornościowego6,7,8,9,10. Po trzecie, wykazano, że limfocyty Treg CD8 + z ograniczeniami Qa-1 ograniczają odpowiedź immunologiczną na infekcję wirusową11.

Dlatego specyficzne zwiększanie specyficznych dla epitopów limfocytów T CD8+ z ograniczeniami Qa-1 jest potencjalnie obiecującą strategią eliminacji nieprawidłowych komórek, wzmocnienia regulacji immunologicznej i kontroli wielkości odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez wirusa. Chociaż nie ustalono, czy augmentacja limfocytów T CD8 + CD8 + specyficznych dla epitopu Qa-1 może wzmocnić nadzór immunologiczny i ograniczyć odpowiedzi immunologiczne wywołane wirusem, nasze laboratoria i inne wyraźnie wykazały, że immunizacja epitopami Qa-1 może zwiększyć funkcję komórek Treg CD8 + z ograniczeniami Qa-1 specyficznych dla patogennych autoimmunologicznych limfocytów T CD4 +, prowadząc do skutecznej kontroli CD4 + Choroby autoimmunologiczne zależne od limfocytów T w różnych modelach zwierzęcych, takich jak eksperymentalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (zwierzęcy model ludzkiego stwardnienia rozsianego)6,10, kolagenowe zapalenie stawów (zwierzęcy model ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów)7, oraz cukrzyca nieotyła (zwierzęcy model ludzkiej cukrzycy typu 1)8. Ponadto odkryliśmy, że immunizacja specyficznym tkankowo epitopem Qa-1 prowadzi do specyficznej kontroli stanu zapalnego o podłożu immunologicznym w tej tkance poprzez augmentację komórek Treg CD8 + sup12. Powyższe sukcesy badań przedklinicznych wskazują na potrzebę pełnej oceny immunizacji epitopami Qa-1 w leczeniu chorób immunologicznych specyficznych tkankowo oraz potencjalnie w terapii innych chorób związanych z niedoborami TAP i ERAAP.

W związku z tym, istnieje zapotrzebowanie na technologię, która może niezawodnie i szybko analizować epitopy Qa-1 w białku. W związku z tym opisano ograniczoną liczbę biologicznie ważnych epitopów Qa-1. Większość z tych epitopów Qa-1 została zidentyfikowana przypadkowo podczas badania odpowiedzi limfocytów T CD8 + na bakterie13, komórki z niedoborem TAP3, komórki z niedoborem ERAAP4, oraz komórki, które powodują EAE6,9. W związku z tym pożądana jest technika wysokoprzepustowa do identyfikacji biologicznie ważnych epitopów Qa-1 w określonym białku. Poniżej opisujemy strategię biblioteki nakładających się peptydów (OLP), która mapuje funkcjonalne epitopy Qa-1 w białku przy użyciu linii komórek T CD8 + z repryksem Qa-1 specyficznych dla puli OLP (OLP_pool) białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Protokołem Opieki i Użytkowania Zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Teksańskim w El Paso i Uniwersytecie Loma Linda.

1. Generowanie biblioteki OLP obejmującej całą długość białka

  1. Zaprojektuj bibliotekę OLP, w której wszystkie peptydy mają długość 15 merów, a sąsiednie peptydy nakładają się na siebie o 11 aminokwasów.
    UWAGA: W badaniu MOG OLP sekwencję prekursora MOG [Mus musculus] pobrano z bazy danych białek NCBI pod tym linkiem: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Prekursor MOG (247 aminokwasów), który zawierał zarówno peptydy sygnałowe, jak i dojrzałe, został użyty, ponieważ większość zgłoszonych epitopów Qa-1 (HLA-E) znajdowała się w peptydach sygnałowych (np. Qdm1). Zaczynając od N-końca, sekwencje 15-merowych peptydów zostały zidentyfikowane w taki sposób, że dwa sąsiednie peptydy nałożyły się na siebie przez 11 aminokwasów (Rysunek 1). W związku z tym zidentyfikowano dokładnie 59 OLP w prekursorze 247 aminokwasów MOG. Jednak ostatni OLP może wynosić od 12 do 15 merów, w zależności od długości białka. Dodatkowo wybraliśmy bibliotekę 15-merową, ponieważ my i inni wykazaliśmy, że peptydy 15-merowe, po dodaniu do komórek dendrytycznych (DC) lub makrofagów, mogą być efektywnie przetwarzane na epitopy do rozpoznania przez limfocyty T CD8 +14,15.
  2. Kup każdy pojedynczy peptyd komercyjnie. 5 mg na peptyd powinno wystarczyć do badania przesiewowego. OLP i peptydy skrócone (krok 6.1) mogą być peptydami odsolonymi (czystość wynosi około 50 - 70%). Czystość optymalnego peptydu (krok 6.2), który zostanie wykorzystany do wytworzenia tetrameru i do przyszłych analiz biologicznych, powinna wynosić >90%. Rozpuść peptydy w sterylnych warunkach.
  3. Zrób 50 mg / ml pojedynczych zapasów peptydów w 100% DMSO. Na 5 mg każdego peptydu dodać 100 μl DMSO do każdej probówki, wymieszać i przechowywać peptydy w temperaturze -20 °C. Zapasy te zostaną wykorzystane do wytworzenia zapasu OLP_pool do wytwarzania linii limfocytów T CD8 + reaktywnych na OLP_pool. Ponadto zapasy te zostaną również wykorzystane do wytworzenia indywidualnych zapasów peptydów 10 mg / ml w celu określenia zdolności każdego pojedynczego peptydu do stymulowania odpowiedzi ograniczonej do Qa-1 w OLP_pool-reaktywnej linii komórek T CD8 +.
  4. Przygotuj OLP_pool bulionu, dodając równą objętość każdego peptydu do świeżej probówki. Ten OLP_pool zapas zawiera 100% DMSO. W badaniu MOG OLP było 59 OLPów12. Stąd stężenie każdego peptydu w OLP_pool wynosiło 847,46 μg/ml (50 mg/ml ÷ 59).
  5. Przygotować 10 mg / ml pojedynczych zapasów peptydowych przez rozcieńczenie (5x) 50 mg / ml zapasu w sterylnym H2O na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V (ten zapas zawiera 20% DMSO). Zrób te zapasy na płytce 96-dołkowej, ponieważ określenie odpowiedzi z ograniczeniami Qa-1 dla każdego pojedynczego peptydu zostanie przeprowadzone na płytce 96-dołkowej przy użyciu 8- lub 12-kanałowej pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Wszystkie peptydy, w tym OLP i peptydy skrócone, należy rozcieńczyć na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub na 96-dołkowym stojaku na próbki wypełnionym probówkami o pojemności 1 ml, ponieważ badanie przesiewowe biblioteki peptydów przeprowadza się na płytkach 96-dołkowych za pomocą pipety wielokanałowej. Jeśli trudno jest rozcieńczyć peptyd, dodaj kroplami 1 N NaOH, aby pomóc rozpuścić peptyd.

2. Gruntowanie komórek TK b-/- Db-/- CD8+ za pomocą OLP_pool-pulsacyjnych komórek Kb-/- Db-/- Ogniw dendrytycznych (DC).

UWAGA: Istnieją dwa główne allele Qa-1: jeden to Qa-1a, a drugi to Qa-1b. Ponieważ zwierzęta powszechnie wykorzystywane do badań akademickich, np. myszy C57BL/6 i Balb/c, są nosicielami Qa-1b, protokół ten opisuje procedurę mapowania epitopów Qa-1b w białku. Limfocyty T CD8 + stosowane w tym protokole są oczyszczane z myszy Kb / -Db / - (tło C57BL / 6), w których limfocyty T CD8 + są ograniczone głównie przez nieklasyczne cząsteczki MHC-Ib, w tym Qa-1.

  1. Wytwórz DC pochodzące ze szpiku kostnego, jak opisano wcześniej12.
    1. Krótko mówiąc, hodowla zawiesin jednokomórkowych szpiku kostnego (1 x 106 komórek/ml) w pożywce RPMI-10 (RPMI 1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 5,5 x 10-5 M 2-merkaptoetanolem, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM aminokwasem endogennym) zawierającymi 10 U/ml IL-4 i 100 U/mL GM-CSF w 6-dołkowej płytce (4 ml/dołek) w temperaturze 37 °C, 5 % emisji CO2 %.
    2. Dwa dni później ostrożnie usuń nieprzylegające komórki i dodaj świeże podłoże i cytokiny.
    3. Po hodowli komórek przez kolejne dwa dni, przenieś nieprzylegające komórki zawierające świeże pożywki i cytokiny na nową płytkę 6-dołkową.
    4. Hoduj komórki przez kolejne dwa dni i uzupełnij je świeżymi pożywkami i cytokinami zawierającymi LPS (0,1 μg/ml) w celu aktywacji DC.
    5. 24 godziny później zbierz kontrolery domeny do eksperymentów.
  2. Napromieniuj DC 3000 radami.
    1. Alternatywnie, potraktować DC (5 x 107 komórek/ml) mitomycyną C (50 μg/ml) w PBS w temperaturze 37 °C przez 20 min. Dodać RPMI-0 (RPMI 1640 bez surowicy), aby napełnić probówkę (~12 ml) i wirować komórki przez 10 minut w wirówce stołowej o stężeniu 300 x g. Odrzucić supernatanty i powtórzyć procedurę mycia jeszcze dwa razy. Te trzy płukania mają kluczowe znaczenie, ponieważ każda śladowa ilość mitomycyny C może hamować odpowiedź limfocytów T CD8 + podczas kohodowli komórek DC-T.
  3. Dostosuj stężenie DC do 5 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy (pożywka bez surowicy AIM-V uzupełniona 5,5 x 10-5 M 2-merkaptoetanolem, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM aminokwasem endogennym).
  4. Dodaj OLP_pool roztwór podstawowy, który zawiera 100% DMSO, do DC tak, aby końcowe stężenie DMSO wynosiło 0,5% (200x). W badaniu MOG OLP stężenie każdego OLP w OLP_pool wynosiło 847,46 μg/ml; stąd końcowe stężenie każdego OLP w kulturze DC wynosiło 4,2 μg/ml (847,46 μg/ml ÷ 200). Jednak stężenie to można skalować do 100 μg/ml, o ile stężenie DMSO w hodowli komórkowej pozostaje mniejsze niż 1%.
  5. Inkubować DC w temperaturze pokojowej przez 3 godziny i delikatnie wstrząsać komórkami co 15 minut.
  6. Podczas tego okresu inkubacji oczyść limfocyty T CD8 + z pobranej śledziony lub węzłów chłonnych myszy Kb / -Db / - za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania limfocytów T CD8 +, dostosuj stężenie komórek do 10 x 106 komórek / ml w pożywce bez surowicy zawierającej 50 U / ml interleukiny 2 (IL-2) i 100 U / ml IL-7.
  7. Teraz dodaj limfocyty T CD8 + do 48-dołkowej płytki jako 0,5 ml / dołek (po dodaniu 0,5 ml / studzienki OLP_pool-pulsacyjnych DC w kroku 2.8, końcowe stężenie limfocytów T CD8 + wyniesie 5 x 106 komórek / ml).
    UWAGA: Limfocyty T CD8 + ze śledziony i węzłów chłonnych myszy można oczyścić za pomocą zestawu do izolacji CD8 Positive Isolation Kit, postępując zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Uzyskane limfocyty T CD8 + są wolne od kulek.
  8. Zakręć OLP_pool-pulsacyjne DC (300 x g, 10 min) w temperaturze RT. Rozpuść OLP_pool-pulsacyjne DC do 2 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy i dodaj 0,5 ml/studzienkę do 48-dołkowej płytki zawierającej limfocyty T CD8 + (końcowe stężenie OLP_pool-pulsacyjnych DC wynosi 1 x 106 komórek/ml, końcowe stężenie limfocytów T CD8 + wynosi 5 x 106 komórek / ml, końcowe stężenie IL-2 wynosi 25 U / ml, a końcowe stężenie IL-7 wynosi 50 U / ml). Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. W dniu 4 usunąć i wyrzucić około 400 μl pożywki hodowlanej i dodać 500 μl świeżej pożywki bez surowicy zawierającej 100 U/ml IL-2 i 100U/ml IL-7 do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  10. W dniu 7 lub 8 ponownie stymuluj OLP_pool zagruntowane limfocyty T CD8 + za pomocą OLP_pool.

3. Restymulacja zaszczepionych limfocytów T CD8+ za pomocą makrofagów pulsujących z OLP_pool

  1. Cztery dni przed ponowną stymulacją limfocytów T CD8 + zagruntowanych OLP_pool przygotuj 2% (v/v) roztwór kulek poliakrylamidowych: przemyj 2 g kulek poliakryloamidu dwukrotnie w 20 ml wolnego od endotoksynH2Olub PBS. Granulki poliakryloamidu osadzać przez odwirowanie (400 x g) przez 5 minut i ponownie zawiesić w 100 ml PBS. Autoklaw z prędkością 15 lb/m przez 20 min. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 1 ml / mysz sterylnego 2% roztworu kulek poliakrylamidu, aby przyciągnąć migrację monocytów / makrofagów do jamy otrzewnowej 16.
  3. Cztery dni później należy złożyć zwierzęta w ofierze z powodu przedawkowania CO2 .
    1. W sterylnych warunkach wytnij mały otwór na środku brzucha, tak aby otwór był wystarczający do przejścia pipety transferowej o pojemności 5 ml. Napełnij pipetę transferową RPMI-0 i włóż pipetę do jamy brzusznej przez otwór.
    2. Przepłukać jamę brzuszną za pomocą pipetowania. Odpipetować jak najwięcej płynu z jamy brzusznej do sterylnej rurki (są to makrofagi otrzewnowe). Powtórz krok płukania 4 - 5 razy.
  4. Napromienij makrofagi otrzewnowej 3000 Radami.
    1. Alternatywnie, należy potraktować makrofagi otrzewnowe mitomycyną C (postępować zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.2).
  5. Dostosuj stężenie makrofagów otrzewnowej do 5 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy. Dodaj OLP_pool bulionu (końcowe stężenie DMSO jest mniejsze niż 1%) i M-CSF (stężenie końcowe = 100 U/ml).
    UWAGA: W tym badaniu MOG OLP użyliśmy 0,5% DMSO. W ten sposób MOG OLP_pool zapas rozcieńczono 200x (np. 1 μl MOG OLP_Pool zapasu dodano do 199 μl makrofagów otrzewnowych). Stąd końcowe stężenie każdego OLP wynosiło 4,2 μg/ml).
  6. Dodać 200 μl/basenik (1 x 106 komórek/basenik) do 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
  7. Usunąć nieprzylegające komórki i kulki poliakryloamidu przez delikatne przemycie 200 μl/studzienkę wstępnie podgrzanego RPMI-0.
  8. Zbierz i połącz OLP_pool zagruntowane limfocyty T CD8 + z kroku 2.10. Dostosuj stężenie OLP_pool zagruntowanych limfocytów T CD8 + do 1 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy zawierającej 25 U/ml IL-2 i 50 U/ml IL-7. Dodaj 1 ml / studzienkę do 48-dołkowej płytki, która zawiera makrofagi otrzewnowe z OLP_pool pulsacją.
  9. Cztery dni później uzupełnij pożywkę w 48-dołkowej płytce. Wyjąć i wyrzucić około 400 μl pożywki hodowlanej z 48-dołkowych płytek hodowlanych. Dodać 500 μl świeżej pożywki bez surowicy zawierającej 100 U/ml IL-2 i 100 U/ml IL-7 do każdej studzienki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  10. Trzy lub cztery dni później zbadaj limfocyty T CD8 + z OLP_pool restymulacją pod kątem specyficznej dla OLP_pool, ograniczonej odpowiedzi Qa-1 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISPOT). Po tym czasie należy ponownie stymulować limfocyty T CD8 + co 7 - 10 dni.
    UWAGA: Makrofagi są preferowane do ponownej stymulacji limfocytów T CD8 + zagruntowanych OLP_pool. Zauważyliśmy, że limfocyty T CD8 + restymulowane przez makrofagi rosły lepiej niż DC in vitro.

4. Określenie specyficznej dla OLP_pool, ograniczonej Qa-1 odpowiedzi w OLP_pool remiksowanej linii komórek T CD8+

UWAGA: Specyficzna dla OLP_pool, ograniczona Qa-1 odpowiedź w linii komórek T CD8+ z OLP_pool restymulowaną jest determinowana przez wydzielanie IFNγ po stymulacji przez OLP_pool w obecności C1R lub C1R. LimfocytyQa-1 b przy użyciu testu IFNγ ELISPOT. Ogniwa C1R można uzyskać komercyjnie. C1R. LimfocytyB Qa-1 mogą być generowane przez transdukcję komórek C1R za pomocą wektora lentiwirusowego Qa-1.

  1. Dodać 100 μl/basenik przeciwciała anty-IFN-γ rozcieńczonego w buforze powlekającym (PBS) do dołków płytki ELISPOT. Uszczelnić i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Drugiego dnia odrzucić bufor powlekający zawierający przeciwciało anty-IFN-γ wychwytujące i dodać 200 μl/roztwór blokujący basenik (pożywka bez surowicy) i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Napromieniować C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 z 9,600 Radami.
    1. Alternatywnie traktuj C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 z mitomycyną C, jak opisano w kroku 2.2, z wyjątkiem tego, że czas leczenia będzie wynosił 30 minut.
  4. Wyreguluj C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 w podłożu bez surowicy do 4 x 106 komórek/ml.
  5. Odrzucić roztwór blokujący z płytki i dodać C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 w stężeniu 50 μl / dołek (200 000 komórek / dołek) i wymieszać.
  6. Dodaj 50 μl/dołek 100x rozcieńczonego bulionu OLP_pool (w podłożu bez serum) i odpowiednio wymieszaj. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny.
  7. Dostosuj limfocyty T CD8 + z resymulacją OLP_pool do 1 - 2 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy zawierającej 150 U/ml IL-7 i dodaj 50 μL/dołek (50 000 - 100 000 komórek/dołek) do płytki. Odwirować płytkę (58 x g) przez 5 minut.
  8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  9. Odessać zawiesinę komórek. Umyj studzienki 2 razy wodą dejonizowaną (DI) (250 μL/studzienkę). Pozostaw studzienki do namoczenia przez 5 minut na każdym etapie mycia.
  10. Przemyć studzienki 3 razy buforem do płukania I (PBS zawierający 0,05% Tween20). Pozwól studzienkom moczyć się przez 1 minutę na każdym etapie mycia. Wyrzuć bufor do mycia.
  11. Dodać 100 μl przeciwciała wykrywającego rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym (PBS zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)).
  12. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  13. Odrzuć roztwór przeciwciała wykrywającego. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 250 μl/studzienkę buforem do płukania I. Pozostaw studzienki do namoczenia przez 1 minutę na każdym etapie mycia.
  14. Dodać 100 μl/basenik koniugatu enzymatycznego (Streptawidyna-HRP) rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym w rozcieńczeniu 1:100.
  15. Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  16. Odrzuć sprzężony roztwór enzymu. Przemyj studzienki 4 razy za pomocą 250 μl/studzienkę buforem do płukania I. Pozostaw studzienki do namoczenia przez 1 minutę na każdym etapie mycia.
  17. Przemyć studzienki 2 razy 250 μl/studzienkę buforem do płukania II (PBS).
  18. Dodaj 100 μl roztworu substratu (wymieszaj 1 kroplę = 20 μl chromogenu AEC z 1 ml substratu AEC) do każdej studzienki. Monitoruj rozwój plamki przez 5 do 60 minut.
  19. Gdy zaczną pojawiać się pożądane rezultaty, zatrzymaj reakcję substratu, myjąc studzienki wodą destylowaną.
  20. Suszyć płytki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc, aż całkowicie wyschną. Wyjęcie plastikowej tacki spod talerzy ułatwi suszenie. Przechowuj płytki w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w ciemności, dopóki nie zostaną przeanalizowane.
  21. Ręczne liczenie plamek odbywa się za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub czytnika płytek ELISPOT. Zobacz reprezentatywny wynik w Rysunek 2.

5. Oznaczanie poszczególnych peptydów w OLP_pool, które stymulują do ograniczonego wydzielania IFN-γ Qa-1 w linii komórek T CD8+ specyficznej dla OLP_pool

  1. Określ poszczególne peptydy, które stymulują OLP_pool-specyficzne, ograniczone przez Qa-1 wydzielanie IFN-γ w OLP_pool-specyficznej linii komórek T CD8 + za pomocą wyżej opisanego testu IFN-γ ELISPOT (końcowe stężenie każdego pojedynczego peptydu użytego do testu ELISOPT wynosi 10 μg/ml). Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 3.
    UWAGA: Odpowiedź specyficzna dla OLP, ograniczona przez Qa-1 jest definiowana jako odpowiedź, która jest co najmniej trzykrotnie większa niż odpowiedź w obecności C1R. Komórki Qa-1b, ale bez OLP. W badaniu MOG OLP OLP68, OLP96 i OLP105 spełniały to kryterium. W związku z tym wszystkie trzy OLP potencjalnie zawierają epitopy Qa-112 (Rysunek 3). Jednak OLP105 konsekwentnie dawał najsilniejszą odpowiedź; W związku z tym przeprowadziliśmy szczegółową analizę OLP105 (Rysunek 4 i Rysunek 5)12.

6. Identyfikacja optymalnego epitopu Qa-1 w 15-merowym OLP, który stymuluje specyficzną dla epitopu, ograniczoną odpowiedź Qa-1 w linii limfocytów T CD8+ specyficznej dla OLP_pool

  1. Zsyntetyzuj C- i N-końcowo skrócone peptydy 15-merowego OLP, jak pokazano w Rysunek 4.
  2. Zbadaj wydzielanie IFN-γ w linii komórek T CD8 + specyficznej dla OLP, stymulując limfocyty T CD8 + każdym ze skróconych peptydów, a także rodzicielskim 15-merowym OLP w obecności C1R lub C1R. Limfocyty Qa-1b przy użyciu opisanego powyżej testu IFN-γ ELISPOT. Końcowe stężenie każdego pojedynczego peptydu użytego w teście ELISPOT wynosi 10 μg/ml. Peptyd definiuje się jako optymalny epitop Qa-1, jeśli peptyd: 1) konsekwentnie daje podobną lub silniejszą odpowiedź IFN-γ, w porównaniu z oryginalnym peptydem 15-merowym, w obecności C1R. LimfocytyB Qa-1; 2) mieści się w przedziale 8 - 10-merów (preferowany peptyd 9-merowy), które są długościami peptydów związanymi z cząsteczkami MHC-I15,17. Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Projekt biblioteki OLP obejmującej całą długość białka

Zaczynając od N-końca białka, każdy peptyd składa się z 15 aminokwasów (15-mer). Zatem pierwszy peptyd obejmuje pozycje od 1 do 15. N-koniec drugiego peptydu nakłada się na C-koniec pierwszego peptydu o 11 aminokwasów. W związku z tym drugi peptyd obejmuje pozycje od 5 do 19. Pozostałe peptydy należy zaprojektować aż do C-końca białka (Rysunek 1). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy protokół analizy epitopów Qa-1 w białku. W odniesieniu do tego protokołu, kilka innych strategii zostało również zgłoszonych wcześniej. Po pierwsze, do identyfikacji Qdm1 wykorzystano allogeniczne linie i klony limfocytów T CD8 +. Po drugie, przypuszczalny motyw wiązania Qa-1 z analizy Qdm został wykorzystany do identyfikacji HSP60p216-224 i epitopu TCRBV8.1 9,18. Po trzecie, do immunizacji zwierząt wyko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Penelope Garcia za jej pomoc techniczną i przygotowanie tego rękopisu. Prace te były wspierane przez grant na innowacje badawcze (RIG) z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Loma Linda (681205-2967) oraz grant pilotażowy z National Multiple Sclerosis Society (PP1685) dla XT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białko do analizyNIENie dotyczy Sekwencję białka można uzyskać z NCBI
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichCat#: D2650 SIGMADMSO należy sterylnie i poddać badaniu na hodowli komórkowej.
Myszy Kb-/-Db-/-Laboratorium LacksonStock#: 019995Użyliśmy myszy Taconic H2-KbH2-Db myszy z podwójnym nokautem (Cat#: 4215-F i 4215-M), które jednak nie są już dostępne.
AIM V Serum Free MediumThermoFisher ScientificCat#:
ThermoFisher ScientificCat#: 21985023
Pirogronian soduThermoFisher ScientificCat#: 11360070
Aminokwasy endogenneThermoFisher ScientificCat#: 11140076
Dynabeads CD8 Zestaw do izolacjidodatniejThermoFisher ScientificCat#: 11333D
Bio-Gel P-100Bio-RadKat#: 150-4171
Foshate Balanced Solution (PBS)ThermoFisher ScientificCat#: Pipeta 20012027
TrasferGlobe ScientificMfg#: Mysi 137238
M-CSFPeproTechKat#: 315-02
48-dołkowe płytki do hodowli tkankowychUSAScientific Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple Well Plates, 96-dołkowe, dno w kształcie litery VSigma-AldrichCat#: Z372129 Sigma
1ml głęboka 06-dołkowa płytka PP, sterylnaUSA ScientificPozycja#: 1896-1110
Rekombinowana mysia IL-2PeproTechCat#: 212-12
Rekombinowana mysz IL-7PeproTechCat#L: 217-17
Wychwytywanie przeciwciała anty-IFN-γBD BiosciencesKat#: 551881
Płytka ELISPOTSigma-Aldrich Kot#: S2EM004M99
C1RATCCKat#: ATCC CRL-1993
C1R. Qa-1bWykonane na zamówienie (dostęp do GenBank #: NM_010398.3)
Qa-1 wektor lentiwirusowyGeneCopoeiaProdukt#: Mm02955
Wykrywanie przeciwciała anty-IFN-&gammaBD BiosciencesKot #: 551881
Tween20Sigma-AldrichKot#: P9416
Streptavidin-HRPBD BiosciencesKot#: BD557630
Podłoże AECBD BiosciencesCat#: 551951
ImmunoSpot AnalyzerImmunoSpotKażdy analizator immunoSpot powinien działać w tym celu.
DOTYCZY 2-merkaptoetanol 12055091

Bibliografia

  1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
  2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
  3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
  4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
  5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
  6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
  7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
  8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
  9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
  10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
  11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
  12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064(2016).
  13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
  14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210(2013).
  15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
  16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
  17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
  18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
  19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
  20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457(2016).
  21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ograniczone przez Qa 1 limfocyty T CD8test ELISPOTtruncacja peptyd wregulacja immunologicznacz steczki MHC Ibpulsowanie kom rek dendrytycznychsekrecja interferonu gammascreening puli peptyd w

Powiązane artykuły