Tutaj prezentujemy protokół oparty na mikroskopii do obrazowania w wysokiej rozdzielczości oraz trójwymiarową rekonstrukcję mysiego układu nerwowo-naczyniowego i bariery krew-mózg za pomocą swobodnie pływających odcinków mózgu. Metoda ta pozwala na wizualizację, analizę i kwantyfikację organelli wewnątrzkomórkowych w BBB.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bariera krew-mózg (BBB) to dynamiczny interfejs wielokomórkowy, który reguluje transport cząsteczek między krążeniem a mózgiem. Transcytoza w barierze krew-mózg reguluje dostarczanie hormonów, metabolitów i przeciwciał terapeutycznych do miąższu mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który łączy immunofluorescencję swobodnie pływających odcinków z laserową skaningową mikroskopią konfokalną i analizą obrazu w celu wizualizacji organelli subkomórkowych w komórkach śródbłonka na granicy krwi. Połączenie tego zestawu danych z oprogramowaniem do analizy obrazu 3D pozwala na półautomatyczną segmentację i kwantyfikację objętości i powierzchni naczyń włosowatych, a także liczby i intensywności organelli wewnątrzkomórkowych w BBB. Do zilustrowania metody wykorzystano wykrywanie endogennej immunoglobuliny myszy (IgG) w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych i ich ilościowe oznaczanie w BBB. Protokół ten może być potencjalnie zastosowany do badania mechanizmów kontrolujących transcytozę BBB różnych cząsteczek in vivo.
Wprowadzenie
Bariera krew-mózg (BBB) to ciągła bariera komórkowa utworzona przez astrocyty, perycyty, neurony i komórki śródbłonka, która oddziela ośrodkowy układ nerwowy (OUN) od krążenia krwi1. Regulacja transportu przez barierę krew-mózg odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy mózgu i jest pośredniczona przez wyspecjalizowane właściwości komórek śródbłonka mózgu (BEC). Obecność ścisłych połączeń międzykomórkowych między BEC i niska podstawowa szybkość transcytozy ograniczają odpowiednio parakomórkowy i transkomórkowy transport cząsteczek krwiopochodnych2. Ostatnio szlak transcytozy w BEC został wykorzystany do usprawnienia dostarczania terapeutycznych dużych cząsteczek do mózgu3,4. Jednak mechanizmy transcytozy w BBB nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane5,6.
Przeprowadzono szeroko zakrojone prace in vitro, aby rozszyfrować komórkowe i molekularne mechanizmy regulujące transport wewnątrzkomórkowy między BECs7,8,9,10,11, ale takie systemy nie są w stanie podsumować złożonej architektury i fizjologii jednostki nerwowo-naczyniowej (NVU). Z drugiej strony, badania in vivo12,13 dostarczają szczegółowych informacji ilościowych na temat szybkości transportu przez barierę krew-mózg, ale nie dostarczają wglądu w wewnątrzkomórkowe mechanizmy transportu. Dlatego badanie komórkowych i wewnątrzkomórkowych składników NVU in vivo i ex vivo pozostaje bardzo trudne14. Tylko ograniczona liczba technik jest możliwa do analizy struktur subkomórkowych w komórkach NVU. W większości badań wykorzystuje się mikroskopię elektronową, ale technika ta jest ograniczona przez złożone protokoły wymagane do prawidłowego przygotowania tkanek i obchodzenia się z próbką. Dlatego opracowaliśmy metodologię opartą na mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości, która ułatwiłaby przetwarzanie próbek mózgu, analizę i kwantyfikację przedziałów subkomórkowych w komórkach NVU.
Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje swobodnie pływające sekcje mózgu myszy do wykonywania ilościowego obrazowania BBB i NVU na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Przetestowaliśmy i zwalidowaliśmy szereg przeciwciał w celu zobrazowania i zrekonstruowania NVU w trzech wymiarach. Co więcej, protokół ten umożliwia obrazowanie z maksymalną rozdzielczością ograniczoną dyfrakcją optyczną organelli w naczyniach włosowatych mózgu. Wraz z analizą obrazu, protokół ten może być wykorzystany do zbadania wewnątrzkomórkowego transportu makrocząsteczek przez barierę krew-mózg w różnych warunkach eksperymentalnych, na przykład w mysich modelach choroby neurodegeneracji.
Protokół
Etyczna aprobata dla tego badania została udzielona przez Federalne Biuro Bezpieczeństwa Żywności i Weterynarii Szwajcarii. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłym przestrzeganiu szwajcarskiego rozporządzenia federalnego w sprawie ochrony i dobrostanu zwierząt, a także zgodnie z zasadami Międzynarodowego Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC).
1. Generowanie sekcji swobodnie pływających w mózgu
- Aby zapewnić optymalną jakość próbki, w dniu perfuzji należy przygotować świeży roztwór 2% paraformaldehydu (PFA) w roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
UWAGA: PFA jest umiarkowanie toksyczny w kontakcie ze skórą i prawdopodobnie jest czynnikiem rakotwórczym. Do obchodzenia się z PFA należy używać rękawic nitrylowych i przygotować roztwór pod wyciągiem chemicznym.- Przygotować 60 ml roztworu PFA na zwierzę.
- Wprowadzić PFA do roztworu, zwiększając pH o 180 - 200 μl 5 M roztworu KOH na każde 100 ml PBS i podgrzewając roztwór do 60 °C.
UWAGA: NaOH nie powinien być stosowany, ponieważ negatywnie wpływa na konserwację tkanek po utrwaleniu. - Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i obniż pH do 7,4 za pomocą HCl. Przefiltruj roztwór za pomocą bibuły filtracyjnej (patrz Tabela materiałów).
- Wykonaj całą fiksację myszy poprzez perfuzję przezsercową, jak opisano wcześniej15 z pewnymi modyfikacjami. Najpierw wypłucz krew z naczyń krwionośnych za pomocą 20 ml PBS, a następnie przepłucz 40 ml 2% PFA.
- Usuń mózg z czaszki, jak opisano wcześniej15.
- Zanurz świeżo 2% perfundowany PFA mózg w 20 ml 2% PFA na 7 godzin w temperaturze 4 °C w celu późniejszego utrwalenia.
UWAGA: Zwiększanie inkubacji w PFA nie jest zalecane, ponieważ może zapobiec wykryciu struktur wewnątrzkomórkowych. - Dokładnie umyj mózg lodowatym PBS.
- Osadź stałe mózgi w agarozie.
- Przygotuj 3% roztwór agarozy w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej do podgrzewania. Delikatnie zamieszaj roztwór, aby go schłodzić, ale unikaj zestalenia.
- Osuszyć nadmiar PBS wokół mózgu przed zanurzeniem w roztworze agarozy w plastikowym pojemniku. Obróć mózg wewnątrz agarozy, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Pozwól agarozie zastygnąć, schładzając ją na lodzie.
- Ostrożnie wyjmij blok agarozy z plastikowego pojemnika i pokrój kostkę wokół mózgu za pomocą żyletki. Zamontuj mózg na uchwycie na próbkę wibratomu (patrz Tabela materiałów) za pomocą kleju cyjanoakrylowego (patrz Tabela materiałów). Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby klej zastygł przed przystąpieniem do cięcia.
- Przenieś mózg w uchwycie na próbkę do tacki buforowej wibratomu wypełnionej PBS. Użyj wibratomu do przecięcia 100 μm wycinków mózgu (strzałkowych lub czołowych). Zbierz skrawki mózgu w 6-dołkowej płytce uprzednio wypełnionej PBS.
- Po zakończeniu sekcji mózgu ostrożnie usuń PBS i zastąp go roztworem PBS/glicerolu w stosunku 1:1.
- Przechowywać skrawki w PBS/glicerolu w temperaturze -20 °C.
2. Znakowanie komórek lub organelli za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego
- Ostrożnie przenieś wycinek mózgu do studzienki 24-dołkowej płytki uprzednio wypełnionej 500 μl PBS na studzienkę. Sekcja pozostanie w tej samej studni do końca procedury.
- Przepłukać sekcję dwukrotnie 500 μl PBS przez 5 minut pod delikatnym mieszaniem.
- Usuń PBS i wykonaj jednoczesne blokowanie i przepuszczalność wycinków mózgu.
- Przygotować roztwór blokujący i przepuszczalny z 0,3% Triton-X i 10% surowicą osła w PBS.
UWAGA: Surowicę osła można zastąpić surowicą kozią, aby dopasować gatunek gospodarza do zastosowanych specyficznych przeciwciał drugorzędowych. - Inkubować skrawki z 250 μl roztworu blokującego i przepuszczalnego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.
- Przygotować roztwór blokujący i przepuszczalny z 0,3% Triton-X i 10% surowicą osła w PBS.
- Usunąć roztwór i dodać roztwór PBS zawierający 5% surowicy osła i pierwszorzędowe przeciwciało w odpowiednim rozcieńczeniu (np. 1:100 do 1:1 000). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C przy delikatnym mieszaniu.
UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać listę przeciwciał, które z powodzeniem znakują różne typy komórek NVU za pomocą tego protokołu. Optymalne rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych musi być określone empirycznie. W celu jednoczesnego znakowania różnych antygenów należy rozcieńczyć wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe w tym samym roztworze. Wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe muszą być hodowane u różnych gatunków. Aby poprawić penetrację przeciwciał, próbki można inkubować do 72 godzin w temperaturze 4 °C. - Usunąć roztwór przeciwciała i przemyć skrawki trzy razy przez 10 minut w PBS pod delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Usunąć PBS i dodać 250 μl roztworu PBS zawierającego 5% surowicy osła i odpowiednie, specyficzne dla gatunku, znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe. Inkubować skrawki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę pod delikatnym mieszaniem.
- Patrz Tabela materiałów, aby uzyskać listę przeciwciał drugorzędowych stosowanych w tym protokole.
- Usunąć roztwór przeciwciała i przemyć skrawki trzy razy przez 10 minut w PBS pod delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
- Usunąć PBS i dodać 250 μl roztworu 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) o końcowym stężeniu 1 μg/ml. Inkubować skrawki w temperaturze pokojowej przez 10 minut pod delikatnym mieszaniem. Usunąć roztwór DAPI i przemyć sekcje 3 razy przez 5 minut za pomocą PBS.
- Zamontuj sekcję mózgową na szkiełkach mikroskopowych do klejenia (np. Szkiełka z wiązaniem histo-bond). Ostrożnie usuń nadmiar PBS wokół sekcji na szkiełku. Dodaj kroplę podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) na wierzch sekcji mózgowej i ostrożnie przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym ze szkła borokrzemianowego o średnicy 0,17 mm (nr 1,5).
- Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu uzyskania obrazu.
3. Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości
- Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą odpowiedniego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) z liniami laserowymi o długości fali 405, 488, 561 i 633 nm w celu wzbudzenia fluoroforów w niebieskich, zielonych, pomarańczowych i czerwonych obszarach widma światła. Do robienia zdjęć należy używać obiektywu olejowego 63X o aperturze numerycznej 1,4.
- W menu akwizycji oprogramowania sterującego mikroskopem ustaw parametry akwizycji obrazu. W menu "Rozmiar obrazu" wybierz wartość 1024 x 1024 pikseli. Zmień rozmiar piksela na wartość od 200 do 300 nm, dostosowując wartość menu "Zoom"."
UWAGA: W celu analizy struktur wewnątrzkomórkowych należy zmniejszyć rozmiar piksela do 75 nm. To ustawienie rozmiaru obrazu znacznie wydłuża czas akwizycji i można je zmniejszyć do 512 x 512 pikseli, aby skrócić czas akwizycji poprzez obrazowanie mniejszego pola widzenia. - W menu rozwijanym "Szybkość akwizycji" wybierz wartość 400 Hz, czyli 400 linii na sekundę. W menu "Ustawienia systemowe" wybierz menu rozwijane "Głębokość pikseli" i zmień wartość na 12 bitów.
- W oprogramowaniu mikroskopu, w zakładce "Akwizycja", włącz opcję sekwencyjnej akwizycji klatek. Ustaw grubość przekroju optycznego na wartość od 0,75 do 1 μm dla każdego kanału, modyfikując wartość w menu "Otworek".
- W panelu wzbudzenia fluorescencyjnego aktywuj laser wymagany do optymalnego wzbudzenia fluoroforów w próbce, na przykład linię laserową o długości fali 488 nm dla fluoroforu emitującego zieleń.
UWAGA: Użyj przeglądarki widm fluoroforowych (patrz Tabela materiałów), aby wybrać odpowiedni laser wzbudzający. - W panelu wykrywania fluorescencyjnego przesuń suwak, aby wybrać długości fal, które będą mierzone w każdym kanale, na przykład między 510 a 550 nm dla fluoroforu emitującego zieleń.
UWAGA: Użyj przeglądarki widm fluoroforowych (patrz Tabela materiałów), aby wybrać odpowiednie długości fal detekcji. - Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego z sekcją mózgu, aby dopasować współczynnik załamania szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu. Umieść próbkę w mikroskopie i włącz lampę epifluorescencyjną, aby uwidocznić próbkę za pomocą lornetki mikroskopowej.
- Za pomocą przycisków na statywie mikroskopu zmień koło filtrów, aby wybrać filtr odpowiedni do wizualizacji jąder barwionych DAPI. Użyj zgrubnej ostrości, aby ustawić ostrość sygnału z jąder barwionych DAPI.
- Za pomocą przycisków na statywie mikroskopu zmień filtry, aby zobrazować sygnał z markerów naczyniowych (na przykład CollagenIV lub CD31) i wyśrodkować pole widzenia na pojedynczym segmencie naczyń włosowatych.
- Naciśnij przycisk, aby uruchomić tryb skanowania na żywo. Podczas skanowania dostosuj wzmocnienie i intensywność lasera dla każdego kanału, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny obrazów i uniknąć nasycenia pikseli.
UWAGA: Użyj tabeli przeglądowej, która oznacza nasycone piksele, aby wizualnie ocenić nadmierne nasycenie. Aby uniknąć przesycenia sygnału, dostosuj ustawienia dla próbki, która ma mieć najwyższy sygnał fluorescencyjny. - Ustaw wartość uśredniania wierszy na 2,
UWAGA: W przypadku korzystania z wyższych prędkości akwizycji należy zwiększyć tę wartość, aby zmniejszyć szumy. - Ustal sekcje początkowe i końcowe do wykonywania optycznych stosów z, które obejmują całą objętość kapilary. Użyj kroku o rozmiarze 0,45 μm.
UWAGA: Jeśli obrazy będą używane do późniejszej kwantyfikacji, zachowaj te same ustawienia akwizycji dla całego zestawu danych. - W celu oceny ilościowej należy pobrać od 10 do 20 stosów z na sekcję od co najmniej trzech różnych myszy w celu porównań statystycznych.
UWAGA: Uzyskaj pełny zestaw danych podczas tej samej sesji, aby zmniejszyć zmienność wynikającą z bielenia próbki i wahań intensywności lasera.
4. Przetwarzanie obrazu i rekonstrukcja 3D jednostki nerwowo-naczyniowej
- (Opcjonalnie) Aby zwiększyć rozdzielczość osiową uzyskanych stosów z, należy przeprowadzić dekonwolucję zestawu danych obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
- W oprogramowaniu do dekonwolucji zmień ustawienia, aby wykonać dekonwolucję "na ślepo" (tj. za pomocą adaptacyjnej funkcji rozproszenia punktowego).
- W ustawieniach oprogramowania do dekonwolucji włącz opcję Usuwanie tła; ta opcja określi najmniejszą wartość intensywności w stosie obrazów i odejmie ją od wartości intensywności od wszystkich pikseli obrazu.
- W ustawieniach oprogramowania do dekonwolucji wyłącz opcje przeskalowania intensywności i zmiany rozmiaru do 16 bitów; te opcje zachowają oryginalne wartości intensywności i zakres dynamiczny obrazów.
- W menu "Współczynnik załamania światła" ustaw wartość na 1,52. W menu "Ustaw długość fali" wybierz wartości emisji dla każdego kanału obrazu. Na przykład wybierz 520 dla fluoroforu emitującego zieleń.
- Otwórz zestaw danych obrazu za pomocą oprogramowania odpowiedniego do wizualizacji i analizy 3-wymiarowych zestawów danych (patrz Tabela materiałów). W oprogramowaniu do analizy obrazu naciśnij przycisk "Surpass", aby renderować objętość 3D naczyń włosowatych.
- W oprogramowaniu do analizy obrazu naciśnij przycisk "Dodaj nową powierzchnię", aby podzielić powierzchnię kapilarną na segmenty. Użyj dolnych strzałek, aby przechodzić między krokami w kreatorze tworzenia powierzchni.
- W zakładce 'Utwórz' ustaw kanał źródłowy na kanał ze znacznikiem kapilarnym, na przykład CollagenIV, i ustaw szczegółowość obszaru powierzchni na wartość 0,5 μm.
UWAGA: Ta druga opcja powoduje zastosowanie filtra Gaussa do obrazu i określa gładkość powierzchni. - W zakładce "utwórz" włącz opcję bezwzględnego progu intensywności.
UWAGA: Ta opcja spowoduje utworzenie powierzchni poprzez wygenerowanie maski na podstawie bezwzględnej intensywności wybranego kanału na obrazie. - W następnym kroku kreatora tworzenia powierzchni dostosuj dolny próg intensywności dla powierzchni, przesuwając okno przesuwane po histogramie intensywności, aż renderowana maska pokryje całą kapilarnę obrazu. Określ zakres wartości dla tego parametru empirycznie dla każdego zestawu danych.
- W ostatnim kroku kreatora tworzenia powierzchni kliknij menu rozwijane w sekcji "Typ filtra" i wybierz opcję "Liczba wokseli". Ustawia minimalną liczbę wokseli na wartość z zakresu od 1,0e5 do 2,0e5,
UWAGA: Ta opcja wykluczy powierzchnie z małą liczbą wokseli, na przykład małe segmenty naczyń włosowatych na krawędzi ramy. - Zakończ kreatora tworzenia powierzchni i zapisz parametry tworzenia, klikając "Zapamiętaj parametry" w zakładce przebudowy w menu powierzchni.
- Powtórz procedurę dla całego zestawu danych obrazowania, wczytując zestaw parametrów użyty dla pierwszego obrazu. Dostosuj parametry intensywności, progu i minimalnej liczby wokseli dla każdego obrazu, aby uwzględnić różnice odpowiednio w intensywności tła i morfologii naczyń włosowatych.
- W zakładce 'Utwórz' ustaw kanał źródłowy na kanał ze znacznikiem kapilarnym, na przykład CollagenIV, i ustaw szczegółowość obszaru powierzchni na wartość 0,5 μm.
- Aby podzielić wewnątrzkomórkowe struktury pęcherzykowe (np. endosomy wypełnione immunoglobulinami), najpierw utwórz nowy kanał, który zawiera tylko sygnał fluorescencyjny z wnętrza naczynia włosowatego.
UWAGA: Ten proces zdefiniuje obszar zainteresowania poprzez utworzenie maski przy użyciu powierzchni kapilarnej utworzonej w kroku 4.3- Wybierz menu "edytuj" w panelu "powierzchnia kapilarna". W sekcji "właściwości maski" kliknij "Maskuj wszystko". Wybierz kanał, który zawiera sygnał pęcherzyka wewnątrzkomórkowego jako "Kanał źródłowy" i włącz opcję "Duplikuj kanał przed nałożeniem maski".
- W kolumnie "ustawienia maski" wybierz "Stała wewnątrz/na zewnątrz" i "Ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na:" i ustaw jej wartość na 0,00,
UWAGA: Ten proces utworzy dodatkowy kanał na obrazie, w którym wszystkie woksele poza maską kapilarną będą miały wartość intensywności 0. Aby określić ilościowo zdarzenia poza kapilarą (tj. w miąższu mózgu), wybierz "Ustaw woksele wewnątrz powierzchni na:" i ustaw jego wartość na 0,00. - Aby podzielić struktury pęcherzykowe na segmenty, naciśnij przycisk, aby uruchomić kreatora "Dodaj nowe plamy". Użyj dolnych strzałek, aby przechodzić między krokami w kreatorze tworzenia powierzchni.
- Na karcie tworzenia użyj menu rozwijanego w sekcji "Kanał źródłowy", aby wybrać wewnątrzkomórkowy kanał maskowany utworzony w kroku 4.4.4.
- W zakładce tworzenia, w sekcji "Wykrywanie punktowe" ustaw szacowaną średnicę XY na wartość od 0,5 do 1 μm, w zależności od średniej wielkości pęcherzyków zaobserwowanych w eksperymencie. Ta opcja określa najmniejszy rozmiar, który zostanie wykryty przez algorytm segmentacji.
- Na karcie tworzenia, w sekcji "Wykrywanie spotów", włącz opcję "Odejmowanie tła".
UWAGA: Ta opcja wygładzi obraz filtrem gaussowskim o promieniu plamki 0,75 (od wartości wybranej w kroku 4.4.7), a następnie odejmie intensywność oryginalnego obrazu przefiltrowanego gaussowsko o promień plamki 0,88. - W zakładce "utwórz" naciśnij menu rozwijane w sekcji "Typ filtra" i wybierz "Jakość". Zwróć uwagę, że spowoduje to segmentację obrazu poprzez zastosowanie progów na podstawie intensywności w środku plam. Dostosuj dolny próg intensywności, przesuwając przesuwane okienko po histogramie "Jakość", aż większość możliwych do zidentyfikowania pęcherzyków zostanie oznaczona.
UWAGA: Zakres wartości dla tego parametru należy określić empirycznie dla każdego zestawu danych. - Zakończ kreator tworzenia miejsca i zapisz parametry tworzenia, naciskając przycisk "Zapamiętaj parametry" w zakładce przebudowy w menu powierzchni.
- Powtórz procedurę dla całego zestawu danych obrazowania, wczytując zestaw parametrów użyty dla pierwszego obrazu. Dostosuj parametry "Próg intensywności jakości" dla każdego obrazu, aby uwzględnić różnice w intensywności tła.
5. Kwantyfikacja transportu wewnątrzkomórkowego na BBB
- Określić ilościowo objętość (w μm3) i powierzchnię (w μm2) segmentu kapilarnego. W oprogramowaniu do analizy uzyskaj dostęp do panelu statystyk powierzchni naczyniowej utworzonego w kroku 4.3. Wybierz zakładkę "Szczegółowe" i za pomocą menu rozwijanego wybierz "Wszystkie wartości", aby znaleźć wartości objętości i powierzchni.
- Określ ilościowo liczbę pęcherzyków w segmencie kapilarnym. W oprogramowaniu analitycznym uzyskaj dostęp do panelu statystyk spotów utworzonych w kroku 4.4. Wybierz zakładkę "Ogólne", aby znaleźć wartość całkowitej liczby plam na obrazie.
- Aby obliczyć liczbę pęcherzyków na objętość kapilarną, dla każdego obrazu znormalizuj liczbę plamek przez objętość obliczoną w kroku 5.1. Pomnóż tę wartość przez 1,000, aby uzyskać liczbę pęcherzyków na 1,000μm3 objętości naczyń włosowatych.
- Aby określić ilościowo całkowitą intensywność w kapilarze, utwórz nową powierzchnię, która pokrywa cały obraz, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w krokach 4.3 z następującymi modyfikacjami. Wybierz kanał, który zawiera odpowiedni sygnał (np. mIgG) jako kanał źródłowy i ustaw wartość poziomu szczegółowości obszaru powierzchni na 5 μm. Aby utworzyć powierzchnię pokrywającą cały obraz, ustaw wartość dolnego progu intensywności na 0.
- W oprogramowaniu do analizy uzyskaj dostęp do panelu statystyk powierzchni utworzonej w kroku 5.4. Wybierz zakładkę "Szczegółowe" i użyj menu rozwijanego, aby wybrać "Wszystkie wartości". Zapisz wartości w polu "Suma intensywności" dla kanałów będących przedmiotem zainteresowania; Ten parametr odpowiada sumie poszczególnych wartości intensywności we wszystkich pikselach.
UWAGA: W przypadku sygnału wewnątrzkomórkowego odpowiada to zduplikowanemu kanałowi z wokselami na zewnątrz powierzchni ustawionymi na 0,0. W przypadku sygnału w miąższu mózgu odpowiada to zduplikowanemu kanałowi z wokselami wewnątrz powierzchni ustawionymi na 0,0. - Aby obliczyć intensywność fluorescencji na objętość kapilarną, dla każdego obrazu znormalizuj intensywność przez objętość obliczoną w kroku 5.1. Pomnóż tę wartość przez 1 000, aby uzyskać wartość intensywności fluorescencji na 1 000 μm3 objętości kapilary.
UWAGA: W przypadku sygnałów fluorescencyjnych w miąższu mózgu znormalizuj wartości przez całkowitą objętość obrazu pomniejszoną o objętość naczyń włosowatych i pomnóż przez 1,000, aby uzyskać całkowitą intensywność na 1,000μm3 miąższu mózgu. - Powtórz procedurę dla całego zbioru danych i użyj odpowiedniego oprogramowania do przeprowadzenia analizy statystycznej danych.
Wyniki
Jako reprezentatywne przykłady obrazów uzyskanych zgodnie z opisanym tutaj protokołem, przekroje mózgu myszy barwiono przeciwciałami rozpoznającymi różne komponenty NVU, w tym błonę podstawną, astrocyty, perycyty i komórki śródbłonka (szczegółowe informacje o użytych przeciwciałach znajdują się w Tabeli materiałów) (Rycina 1A, D, oraz E). Przy tej rozdzielczości możliwe jest rozróżnienie poszczególnych wypustek astrocytarnych i stópek końcowych, które pozostają w bezpośrednim kontakcie z kapilarami.
Aby podkreślić przydatność niniejszego protokołu do wykrywania struktur wewnątrzkomórkowych, przekroje mózgu zwierząt, którym obwodowo wstrzyknięto ludzkie przeciwciało mAb86 przeciwko Tau16, zabarwiono przeciwciałem przeciwko ludzkim przeciwciałom znakowanym fluorescencyjnie (Rysunek 1B). Wiadomo, że mAb86 specyficznie celuje w neurony wykazujące patologiczną formę białka Tau16. Stosując opisany tutaj protokół, mAb86 wykryto z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie w pojedynczych strukturach pęcherzykowych wewnątrz neuronów (Rysunek 1B-C). Dodatkowo, endogenne IgG mysie wykryto w strukturach wewnątrzkomórkowych w komórkach śródbłonka, ale nie w perycytach (Rysunek 1D-E oraz Rysunek 2).
Pozyskanie wysokorozdzielczych stosów z-stack confocal naczyń krwionośnych mózgu umożliwia trójwymiarową segmentację naczyń włosowatych oraz pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w obrębie BBB. Rycina 2 przedstawia przykład procesu renderowania i segmentacji naczynia włosowatego znakowanego CollagenIV oraz pęcherzyków wewnątrzkomórkowych wykazujących obecność mysiego IgG (mIgG). Poprzez kwantyfikację pełnego zbioru danych z obrazów poddanych segmentacji, na przykład poprzez pomiar liczby pęcherzyków w przeliczeniu na objętość naczynia włosowatego, możliwe jest badanie zmian w procesach transportu wewnątrzkomórkowego w różnych warunkach. Rycina 3B-C pokazuje różnice w liczbie pęcherzyków mIgG oraz intensywności fluorescencji odpowiadającej mIgG w parenchymie mózgu, odpowiednio, po usunięciu perycytów w modelu mysim pdgf-bret/ret , zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami17. To samo podejście zostało niedawno wykorzystane do analizy zmian w transporcie wewnątrzkomórkowym w obrębie BBB między różnymi regionami mózgu18.
Rycina 1: Etykietowanie wielu typów komórek i struktur subkomórkowych jednostki naczyniowo-nerwowej. Reprezentatywne obrazy jednostki naczyniowo-nerwowej (A i D) oraz pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w neuronach (B) lub komórkach śródbłonka (E) uzyskane zgodnie z niniejszym protokołem. Obraz maksymalnej projekcji intensywności w A (góra) pokazuje rozkład astrocytów GFAP-dodatnich (czerwony) otaczających naczynia włosowate oznakowane CollagenIV (zielony). Strzałki wskazują poszczególne wypustki astrocytarne. Pasek skali = 20 µm. Przy tej rozdzielczości poszczególne wypustki astrocytarne i stopki końcowe są wyraźnie widoczne, co pokazano na powiększonym obrazie zaznaczonego obszaru (dół). Groty strzałek wskazują stopki końcowe astrocytów. Pasek skali = 10 µm. Obraz w B pokazuje akumulację przeciwciała wstrzykniętego obwodowo, mAb86 (zielony), w neuronie hipokampa. Groty strzałek wskazują poszczególne pęcherzyki mAb86-dodatnie. Pasek skali = 10 µm. Wykres w C przedstawia profil intensywności linii pojedynczego pęcherzyka. Rozmiar pęcherzyka oszacowano na podstawie pełnej szerokości w połowie maksimum dopasowania Gaussa (czarna linia ciągła) krzywej intensywności (zielona linia i kółka). Obrazy w D przedstawiają trójwymiarową rekonstrukcję komórki śródbłonka (zielony) otoczonej przez perycyyt (czerwony) w obrębie błony podstawnej (CollagenIV, szary). Dolne panele pokazują poszczególne kanały fluorescencji. Pasek skali = 10 µm. Obrazy w E pokazują lokalizację mIgG (czerwony) w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych w komórkach śródbłonka (panel lewy, CD31 w kolorze zielonym), ale nie w perycytach (panel prawy, CD13 w kolorze zielonym). Na wszystkich obrazach jądra barwione DAPI są pokazane w kolorze niebieskim. Pasek skali = 5 µm. Panele D i E zostały zmodyfikowane z referencji17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Trójwymiarowe odwzorowanie naczyń włosowatych i pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w barierze krew-mózg. Zgodnie z opisanym protokołem uzyskano wysokorozdzielcze obrazy konfokalne naczyń włosowatych wykazujących obecność kolagenu IV (zielony) oraz wewnątrzkomórkowych pęcherzyków zawierających mysie IgG (czerwony) (A). Panel lewy przedstawia pojedynczy przekrój optyczny z przekrojami poprzecznymi. Strzałki wskazują poszczególne pęcherzyki mIgG-dodatnie wewnątrz komórek śródbłonka mózgu. Panel prawy przedstawia rekonstrukcję 3D pełnego stosu z-stack wykonaną za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów). Objętość naczyń włosowatych (B) oraz poszczególne pęcherzyki (C) zostały odwzorowane w trzech wymiarach i poddane kwantyfikacji przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów). Na wszystkich obrazach jądra barwione DAPI przedstawiono w kolorze niebieskim. Paski skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3Ilościowe oznaczenie wewnątrzkomórkowej lokalizacji mIgG w barierze krew-mózg. Reprezentatywne obrazy przedstawiające (A) trójwymiarowe rekonstrukcje naczyń włosowatych (oznaczonych kolagenem IV, zielony) oraz rozkład mIgG (czerwony) u myszy C57BL/6 i w pdgf-bret/ret myszy z uszczupleniem perycytów opisanymi wcześniej w19Skale = 10 µmObrazy w B przedstawia segmentację pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w obrębie maski CollagenIV. Wykres w B przedstawia ilościowe określenie i porównanie liczby pęcherzyków mIgG w jednostce objętości kapilary. Każdy punkt reprezentuje pomiary z poszczególnych segmentów kapilar. Linia ciągła oznacza średnią, a słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe danych. Obrazy w C pokaż sygnał fluorescencji mIgG poza maską CollagenIV. Podobnie wykres w C przedstawia kwantyfikację i porównanie intensywności fluorescencji mIgG w miąższu mózgu myszy C57BL/6 oraz pdgf-bret/ret myszy z wyczerpaną populacją perycytów. Jednostki intensywności fluorescencji znormalizowano względem średniej intensywności mIgG w miąższu, zmierzonej u wszystkich myszy C57BL/6. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie literatury17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Opisany powyżej protokół opisuje przygotowanie swobodnie pływających skrawków mózgu, barwienie immunofluorescencyjne, akwizycję obrazu i parametry analizy do mikroskopii BBB o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta została niedawno wykorzystana do zbadania lokalizacji platform dostarczania przeciwciał3, transportu endogennej IgG przez barierę krew-mózg17 oraz niejednorodności bariery krew-mózg po utracie perycytów18. Różne kroki w protokole mogą być modyfikowane, aby dostosować się do konkretnego celu eksperymentu. Po pierwsze, zastosowanie grubych (100 μm) skrawków ułatwia ich obsługę podczas procedur barwienia immunologicznego i montażu. Pozwala również na odbudowę 3D sieci naczyń włosowatych, jednostki nerwowo-naczyniowej oraz na generowanie przekrojów kapilarnych i NVU. Jednak przenikanie przeciwciał do skrawków tkanek może się różnić, a niektóre barwienie przeciwciał może być ograniczone do powierzchownej warstwy tkanki w pobliżu szkiełka nakrywkowego. Protokół można zmodyfikować poprzez zwiększenie stężenia detergentu na etapie permeabilizacji i/lub długości etapu przepuszczalności, aby poprawić penetrację przeciwciał do tkanki. Po drugie, jakość obrazu może być pogorszona podczas próby uzyskania obrazów głębiej w tkance (zwykle od 20 do 30 μm pod powierzchnią) z powodu rozpraszania światła, a także aberracji optycznych spowodowanych niedopasowaniem współczynnika załamania światła. Aby przezwyciężyć ten problem, nowe metody oczyszczania tkanek i aktywnej penetracji przeciwciał20 można połączyć z tym protokołem w celu obrazowania większych objętości tkanki. Po trzecie, dekonwolucja jest wykonywana po akwizycji obrazu w celu poprawy rozdzielczości osiowej obrazu. Wybór algorytmu ślepej dekonwolucji zastosowanego w tym protokole opierał się na (i) jego łatwości użycia, ponieważ nie jest wymagane wstępne obliczanie funkcji rozproszenia punktów, (ii) jego odporności na poprawę jakości obrazu21 oraz (iii) braku artefaktów na wewnątrzkomórkowych strukturach mIgG po wdrożeniu. W zależności od struktur wewnątrzkomórkowych wizualizowanych w próbce, inne algorytmy dekonwolucji mogą skutkować wyższą jakością obrazu. Poniższe piśmiennictwo21,22 zawiera obszerną dyskusję na temat zalet i ograniczeń dodatkowych algorytmów dekonwolucji obrazu. Wreszcie, zastosowanie pakietu oprogramowania do analizy obrazu pozwoliło na segmentację naczyń włosowatych i struktur wewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach. Oczywiście analiza obrazu nie jest ograniczona do oprogramowania opisanego w protokole, a alternatywne pakiety, na przykład te omówione w odnośniku23, mogą być używane do segmentacji obrazów. Przydatność różnych programów do analizy struktur wewnątrzkomórkowych w poprzek bariery krew-mózg powinna być weryfikowana empirycznie poprzez ocenę dokładności segmentacji obrazu.
Ponieważ metoda ta opiera się na utrwalonych próbkach, nie dostarcza bezpośrednich informacji na temat dynamiki transcytozy w całej barierze krew-mózg. Można go jednak połączyć z eksperymentami w czasie24, na przykład poprzez dożylne wstrzyknięcie cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania i zmierzenie jej akumulacji w BEC w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu, w celu zrekonstruowania kinetyki transportu wewnątrzkomórkowego. Zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ono na analizę głębokich obszarów mózgu, jak pokazano narysunku 18, które są obecnie niedostępne dla metod obrazowania na żywo w trybie przyżyciowym. Krytycznym krokiem podczas protokołu jest dokładne monitorowanie utrwalenia tkanki. Wiązanie z 4% PFA radykalnie zmniejsza immunogenność organelli wewnątrzkomórkowych oraz endogennych lub obwodowo podawanych immunoglobulin17 (Figura 1B). Ograniczeniem tego protokołu jest wymóg wysokiej jakości przeciwciał (tj. niskie barwienie nieswoiste, niska reaktywność krzyżowa) odpowiednich do immunofluorescencji. Pod warunkiem, że takie odczynniki są dostępne, metoda może być zastosowana do zbadania wewnątrzkomórkowej lokalizacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład protokół został wykorzystany do identyfikacji lizosomów w komórkach śródbłonka mózgu17. Należy również zauważyć, że ponieważ protokół ten opiera się na mikroskopii konfokalnej, rozdzielczość boczna jest ograniczona dyfrakcją i nie może rozdzielić struktur mniejszych niż około 175 do 250 nm (ryc. 2).
W poprzednich badaniach przeprowadzono szczegółową analizę składu komórkowego jednostki nerwowo-naczyniowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej25,26. Jednak badanie transportu wewnątrzkomórkowego w BBB opiera się głównie na wykorzystaniu transmisyjnej mikroskopii elektronowej 19,27,28. Chociaż metoda ta zapewnia najwyższą rozdzielczość boczną struktur wewnątrzkomórkowych, mikroskopia elektronowa pozostaje trudną techniką o niskiej przepustowości. Co więcej, liczba różnych celów molekularnych, które można uwidocznić za pomocą EM, jest bardzo ograniczona. Protokół ten stanowi dostępną alternatywę dla badania transportu wewnątrzkomórkowego w BBB. Cała procedura, od pobrania mózgu po analizę obrazu, można przeprowadzić w ciągu 5 do 6 dni. Jeśli dostępne są odpowiednie przeciwciała, immunofluorescencja umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu typów/cząsteczek komórek w tej samej próbce. Co więcej, protokół ten można połączyć z technikami mikroskopii superrozdzielczej w celu przezwyciężenia ograniczeń rozdzielczości przestrzennej29. Ogólnie rzecz biorąc, opisany powyżej protokół umożliwia ilościowe określenie zmian w wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek będących przedmiotem zainteresowania w jednostce nerwowo-naczyniowej. Jego zastosowanie w przypadku różnych zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych pozwoli na zbadanie wewnątrzkomórkowej struktury i funkcji transportowych BBB in vivo.
Oświadczenia
Autorzy są zatrudnieni przez firmę Roche za wynagrodzeniem.
Podziękowania
R.V. praca była wspierana przez Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Klon przeciwciała monoklonalnego szczura ER-MP12 przeciwko CD31 / PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Etykiety Komórki śródbłonka mózgu Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej antyszczurzej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 |
| Przeciwciało monoklonalne szczura przeciwko Podocalyxin | R& Systemy MAB1556 | Etykiety Światło naczyń włosowatych Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej przeciw szczurom IgG (H+L) osła sprzężonej z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 | |
| Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Etykiety Błona podstawna naczyń włosowatych Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej anty-króliczej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowany w rozcieńczeniu 1:400 |
| Przeciwciało poliklonalne kozy przeciwko CD13 | R& D Systems | AF2335 | Etykiety perycyty Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej antykozyj IgG (H+L) osła sprzężonej z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanej w rozcieńczeniu 1:400 |
| Mysie przeciwciało monoklonalne klon G-A-5 przeciwko GFAP sprzężony z Cy3 | Abcam | ab49874 | Etykiety Astrocyty Stosować w rozcieńczeniu 1:100 |
| Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko Iba-1 | Wako | 019-19741 | Etykiety Microglej Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnego antyszczurzego przeciwciała IgG (H+L) osła sprzężonego z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 |
| Szczurze przeciwciało monoklonalne ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Etykiety Lizosomy Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej anty-szczurzej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowany w rozcieńczeniu 1:400 |
| przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysim IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Stosować w rozcieńczeniu 1:400 |
| przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysiej IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Stosować w rozcieńczeniu 1:400 |
| kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko mysim IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Stosować w rozcieńczeniu 1:400 |
| Bibuła filtracyjna | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Plisowana jakościowa bibuła filtracyjna Whatman Grade 0858 1/2, ziarnisty |
| Klej cyjanoakrylowy | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescencyjny Medium montażowe | Dako | S3023 | Dako Medium do montażu fluorescencyjnego |
| Dorosłe myszy | Laboratorium Jacksona | 000664 | C57BL/6J samiec lub samica myszy w wieku od 9 do 19 miesięcy |
| Wibratom | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S z wibracyjnym ostrzem |
| Mikrotom konfokalny ze skaningiem laserowym | Leica Microsystems | PL | Leica TCS SP8 X z detektorami HyD i laserem światła białego |
| Oprogramowanie do przetwarzania obrazów | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF w wersji 3.1.0 build 8587 |
| Oprogramowanie do analizy obrazu | Oprogramowanie naukowe Bitplane | NA | Imaris wersja 7.6.5 kompilacja 31770 dla x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
Bibliografia
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340(2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990(2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658(2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
Przedruki i uprawnienia
