Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

Summary

Ten manuskrypt opisuje użycie technik wchłaniania przez nos i oskrzela, w szczególności przy użyciu syntetycznych matryc absorpcyjnych (SAM) do pobierania próbek płynu wyściełającego błonę śluzową (MLF) górnych i dolnych dróg oddechowych. Metody te zapewniają lepszą standaryzację i tolerancję niż istniejące techniki pobierania próbek z układu oddechowego.

Abstract

Metody wchłaniania przez nos (NA) i oskrzelowego (BA) wykorzystują syntetyczne matryce absorpcyjne (SAM) do wchłaniania płynu wyściełającego błonę śluzową (MLF) ludzkich dróg oddechowych. NA jest nieinwazyjną techniką, która wchłania płyn z małżowiny dolnej i powoduje minimalny dyskomfort. NA przyniósł powtarzalne wyniki z możliwością częstego powtarzania pobierania próbek z górnych dróg oddechowych.

Dla porównania, alternatywne metody pobierania próbek błony śluzowej układu oddechowego, takie jak aspiracja nosogardzieli (NPA) i konwencjonalne pobieranie wymazów, są bardziej inwazyjne i mogą powodować większą zmienność danych. Inne metody mają ograniczenia, na przykład biopsje i zabiegi oskrzelowe są inwazyjne, plwocina zawiera wiele martwych i umierających komórek i wymaga upłynnienia, kondensat wydychanego powietrza (EBC) zawiera wodę i ślinę, a próbki płukania są rozcieńczone i zmienne.

BA można wykonać za pomocą kanału roboczego bronchoskopu w klinice. Pobieranie próbek jest dobrze tolerowane i może być przeprowadzane w wielu miejscach w drogach oddechowych. BA powoduje, że próbki MLF są mniej rozcieńczone niż próbki z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL).

Ten artykuł demonstruje techniki NA i BA, a także laboratoryjne przetwarzanie otrzymanych próbek, które można dostosować do pożądanego dalszego pomiaru biomarkera. Te techniki absorpcji są użyteczną alternatywą dla konwencjonalnych technik pobierania próbek stosowanych w klinicznych badaniach oddechowych.

Introduction

Większość chorób układu oddechowego powoduje reakcję zapalną i istnieje pilna potrzeba pobrania próbek z powierzchni błony śluzowej dróg oddechowych w alergicznym nieżycie nosa, infekcjach wirusowych i grzybiczych, gruźlicy, astmie, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc, zwłóknieniu płuc i raku płuc 1. Aspirat do nosogardzieli (NPA), płukanie nosa i płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) są powszechnymi technikami pobierania próbek z górnych i dolnych dróg oddechowych. Jednak techniki te stwarzają poważne problemy, w tym słabą tolerancję, rozcieńczenie mediatorów stanu zapalnego i niemożność częstego powtarzania pobierania próbek². Jedną z alternatyw dla pobierania próbek NPA jest użycie wacików, nylonowych flokowanych, bawełnianych lub ze sztucznego jedwabiu^3,4, ale mają one również ograniczenia, ponieważ powodują dyskomfort i uszkodzenie nabłonka nosa, a w niektórych przypadkach nieodwracalne wiązanie mediatorów stanu zapalnego⁵. Techniki te nie mogą być na ogół powtarzane seryjnie przez godzinę, a alternatywne techniki mogą być bardziej skuteczne w wykrywaniu cytokin i chemokin o niskiej liczebności^5,6. Ponadto zmienność użytkowników związana z tymi technikami może generować niespójności w danych, co skutkuje koniecznością stosowania większych kohort pacjentów.

Alternatywnie, techniki absorpcji przy użyciu zarówno naturalnych, jak i syntetycznych gąbek zostały użyte do pobrania MLF z powierzchni błony śluzowej. Gąbki okulistyczne wykonane z naturalnej celulozy (np. Weck-cel) zostały użyte do pobierania próbek śliny, wydzieliny z szyjki macicy i pochwy⁷. Ponadto wykorzystano gąbki syntetyczne wykonane z alkoholu poliwinylowego (PVA) i hydroksylowanego polioctanu winylu (HPVA)⁸. Porównano siedem różnych materiałów absorpcyjnych do pobierania próbek płynu ustnego przed pomiarem przeciwciał⁹, podczas gdy mini-gąbki poliuretanowe zostały użyte do zbierania ludzkich łez¹⁰.

Bibuła filtracyjna składająca się z naturalnej celulozy pochodzącej z bawełny jest szeroko stosowana do wchłaniania wydzieliny z nosa od czasu pionierskiej pracy Alama i współpracowników w 1992 roku^{11,12,13,14,15,16,17}. Krążki z bibuły filtracyjnej zostały wyprodukowane z kart filtracyjnych (np. Shandon) i zostały wykorzystane do pomiaru histaminy i cytokin po kontrolowanych prowokacjach alergenów w nosie i z naturalną ekspozycją na alergeny^18,19,20,21. Jednak różne partie bibuły filtracyjnej różnią się stopniem wiązania białek, a niektóre nie uwalniają cytokin. W związku z tym opracowano metody wykorzystujące syntetyczną matrycę absorpcyjną (SAM)^2,22,23. SAM są obecnie powszechnie używane do uzyskiwania MLF donosowego przez NA. Te chłonne materiały są wygodne w użyciu i mogą pozyskiwać MLF nawet z zapalenia nosa w częstych odstępach czasu przez dłuższy czas.

Absorpcja przez nos jest formą precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej za pomocą SAM do pobierania próbek MLF w górnych drogach oddechowych. Urządzenia NA są produkowane jako wyroby medyczne z oznaczeniem CE z materiałów klasy medycznej w pomieszczeniach czystych i są wolne od kurzu i alergenów. Próbnik NA składa się z uchwytu i SAM w sterylnej krioprobówce. SAM składa się z polimerów, zazwyczaj włókien, ale jest również dostępny w postaci pianki, a te są wybierane tak, aby były miękkie i chłonne, z szybkim odprowadzaniem wilgoci do pobierania próbek. SAM mają minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczne wymywanie wchłoniętych wydzielin. NA jest bardzo delikatną, nieinwazyjną techniką, którą można wykonywać na dawcach w każdym wieku. Ponadto możliwe jest próbkowanie szeregowe, nawet co kilka minut. NA został zweryfikowany pod kątem istniejących technik pobierania próbek z górnych dróg oddechowych⁵, a powtarzalne pobieranie próbek umożliwiło wygenerowanie danych kinetycznych po zbadaniu drogi oddechowej alergenem^23,24,25, endotoksyna bakteryjna²⁶ i agoniści TLR typu wirusowego (Jha, A. i wsp., rękopis w przygotowaniu). NA był również stosowany u niemowląt do badania naturalnej historii atopii ^27,28,29 oraz w wirusowym zapaleniu oskrzelików³⁰.

Bronchoskopowe mikropobieranie próbek (BMS) to procedura pobierania MLF w dolnych drogach oddechowych, która została opracowana przez Olympus^31,32,33. Niestety, ten system BMS jest licencjonowany tylko w Japonii. Olympus dostarcza dwa systemy BMS: jeden z sondą z hydroksylowanego poliestru włóknistego (FHPE)^34,35,36,37, a drugi z sondą bawełnianą^{33,38,39,40,41,42,43}. Główną przeszkodą było to, że sonda BMS stosowana u pacjentów z astmą powodowała krwawienie z błony śluzowej, przy czym połowa wszystkich próbek była zanieczyszczona krwią. Autorzy doszli do wniosku, że nie jest możliwe pobranie próbki MLF za pomocą tego systemu BMS z obwodowych dróg oddechowych u pacjentów z astmą⁴³.

Jako alternatywę, opracowaliśmy BA za pomocą miękkiego SAM, który może być wykonywany podczas bronchoskopowego badania dolnych dróg oddechowych, w tym po eksperymentalnym zakażeniu osób z astmą rinowirusem⁶. Urządzenie BA składa się z: zewnętrznego pustego cewnika, rękojeści, która po aktywacji wytłacza SAM, oraz centralnego plastikowego przewodu prowadzącego, który ma SAM na swoim końcu. Jeśli chodzi o NA, zestawy BA są produkowane z materiałów klasy medycznej w pomieszczeniach czystych i są wolne od kurzu i alergenów. Dodatkowo urządzenia są oznaczone znakiem CE i są dostarczane w stanie naświetlania promieniami gamma. Pasek SAM jest miękki, chłonny i ma szybkie odprowadzanie wilgoci do pobierania próbek. Ma również minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczne wymywanie wchłoniętych wydzielin. Urządzenie może zmieścić się w kanale roboczym bronchoskopu i może być używane do szybkiego i dokładnego pobierania próbek MLF w określonych miejscach zainteresowania w drogach oddechowych. W przeciwieństwie do BAL lub BMS, BA nie powoduje krwawienia kontaktowego ani dodatkowego dyskomfortu pacjenta po zabiegu.

Należy dokładnie rozważyć przetwarzanie próbek NA i BA. Próbki mogą być bezpośrednio zamrażane i przetwarzane partiami lub mogą być przetwarzane natychmiast. Rodzaj przetwarzania można dostosować do niektórych dalszych zastosowań, w tym testów immunologicznych dla cytokin, chemokin i immunoglobulin lub elucji RNA związanego z wirusem, bakteriami i komórkami gospodarza. Przedstawiamy kolekcję kliniczną i techniki przetwarzania laboratoryjnego związane z NA i BA jako przewodnik dla badaczy klinicznych.

Protocol

Techniki użyte w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych w Zachodnim Londynie (numer referencyjny 15/lO/0444).

1. Absorpcja przez nos (NA)

1. Przygotowanie przed pobraniem próbek z azotu północnego
   1. Podczas wykonywania NA, najpierw umyj ręce i załóż rękawiczki, najlepiej w obecności pacjenta.
   2. Sprawdź jamę nosową za pomocą latarki czołowej i poproś lekarza, aby użył niedominującego kciuka do cofnięcia nosa pacjenta, aby uwidocznić jamę nosową.
      nuta: Wziernik do nosa zwykle nie jest wymagany.
   3. Wizualizacja jamy nosowej i małżowiny usznej dolnej przed pobraniem próbki.
      nuta: Nozdrza (nozdrza) nie są okrągłe w przekroju poprzecznym i biegną prosto do tyłu. Ogólnie rzecz biorąc, małżowina nosowa dolna może być postrzegana jako wybrzuszenie lub wgłębienie na bocznej ścianie nozdrza, przy czym przegroda nosowa tworzy gładką, płaską ścianę przyśrodkową. Chcemy pobrać próbkę z tego dolnego małżowiny nosowej, ponieważ leżący pod spodem nabłonek jest prostym nabłonkiem rzęskowym dróg oddechowych⁴⁴.
2. Pobieranie próbek w Ameryce Północnej
   1. Podczas pobierania próbek należy delikatnie przesunąć NA SAM w górę światła nozdrza, ustawiając go tak, aby przylegał płasko do małżowiny dolnej.
   2. Poproś dawcę, aby użył palca wskazującego do przyciśnięcia SAM do błony śluzowej nosa. NA może powodować lekkie łaskotanie, z możliwym łzawieniem oczu, gdy MLF jest wchłaniany.
      nuta: U dorosłych na ogół wykonujemy NA przez 60 s.
   3. Po wchłonięciu MLF wyjmij urządzenie NA z nozdrza i włóż z powrotem do oryginalnej probówki.
   4. Próbki należy natychmiast przetworzyć w laboratorium lub zamrozić, zgodnie z opisem w dalszej części niniejszego protokołu.
      nuta: NA jest badany w różnych modelach prowokacji błony śluzowej nosa, a także w różnych chorobach dróg oddechowych. Należy jednak przeprowadzić walidację w odniesieniu do innych metod pobierania próbek z układu oddechowego dla każdego badania i każdej populacji pacjentów.

2. Absorpcja oskrzelowa (BA)

1. Przygotowanie przed pobraniem próbek BA
   nuta: Licencjat wykonywany jest przez wyspecjalizowany personel w pracowni bronchoskopii.
   1. Przed umieszczeniem urządzenia BA w cewniku należy sprawdzić, czy SAM wysuwa się i wycofuje z powrotem do cewnika.
   2. Przed przeprowadzeniem BA na pacjencie przeprowadź próbne BA na symulatorze bronchoskopii.
2. Pobieranie próbek BA
   1. Przełóż bronchoskop w dół tchawicy i prawego oskrzela głównego do poziomu oskrzela pośredniego, tuż proksymalnie do podziału na prawy dolny i prawy środkowy płat.
      UWAGA: Zazwyczaj pobieramy próbki z oskrzela pośredniego, chociaż można pobrać próbki z innych miejsc w drogach oddechowych. Obserwując cewnik i SAM, nie widać końcówki bronchoskopu. Obserwujemy następujące proste kroki dla BA, gdy bronchoskop dotrze do pożądanego miejsca pobierania próbek.
   2. KATATER W DÓŁ: Wprowadzić cewnik BA przez kanał operacyjny bronchoskopu, aż biała końcówka będzie widoczna w drogach oddechowych, maksymalnie 1 cm dystalnie do końca bronchoskopu. Trzymaj bronchoskop i końcówkę cewnika pośrodku światła dróg oddechowych. Należy uważać, aby zminimalizować kontakt między końcówką cewnika a błoną śluzową oskrzeli, aby zmniejszyć ryzyko otarcia błony śluzowej.
   3. SAM OUT: Wciśnij uchwyt urządzenia BA tak, aby SAM został wytłoczony w świetle prawych środkowych lub prawych dolnych dróg oddechowych. W bezpośrednim widzeniu zegnij końcówkę bronchoskopu, aby upewnić się, że SAM styka się z MLF na ścianie dróg oddechowych. Pozostaw SAM w drogach oddechowych, płasko do ściany błony śluzowej na 30 sekund.
   4. SAM IN: Spójrz przez bronchoskop, aby upewnić się, że wilgotna sonda SAM jest prosta i nie jest wygięta z powrotem nad końcem cewnika. W razie potrzeby cewnik i końcówkę bronchoskopu można przyłożyć z powrotem, aby wyprostować SAM. W przypadku bezpośredniego widzenia delikatnie wsuń prosty SAM z powrotem do cewnika.
      UWAGA: Jeśli wystąpią trudności z wciągnięciem SAM z powrotem do cewnika, należy wyjąć całe urządzenie z SAM wyciśniętym z powrotem z dróg oddechowych.
   5. KABINA GÓRNA: Wyjmij cały cewnik z kanału operacyjnego bronchoskopu.
   6. ODETNIJ SAM: SAM jest odcinany sterylnymi nożyczkami, a następnie umieszczany w kriotubie na lodzie. Próbki te mogą być przetwarzane różnymi metodami, jak opisano w dalszej części niniejszego protokołu.

3. Przetwarzanie próbek NA i BA

Uwaga: Istnieje wiele opcji laboratoryjnego przetwarzania próbek pochodzących z NA i BA. Protokoły te mają na celu przechowywanie próbek do późniejszego wykorzystania i elucję próbki MLF z SAM.

1. Opcje natychmiastowego postępowania z próbkami NA i BA
   1. Opcja 1: Przechowuj wilgotny SAM na lodzie przez kilka godzin przed dalszym przetwarzaniem.
   2. Opcja 2: Natychmiast głęboko zamrozić NA SAM w probówce zbiorczej. Podobnie, zamrozić BA SAM w fiolkach kriogenicznych po wyjęciu nożyczkami z urządzenia do pobierania próbek.
   3. Opcja 3: Umieścić odłączony SAM w buforze elucyjnym (300 μl) przed bezpośrednim przetwarzaniem lub głębokim zamrożeniem.
2. Opcje buforu elucyjnego dla próbek NA i BA
   nuta: Wybór buforu elucyjnego zależy od tego, co ma być analizowane w próbce MLF i sugerujemy cztery główne alternatywy:
   1. Należy użyć wstępnie przygotowanego buforu testowego odpowiedniego do procedur testów immunologicznych. Takie powinny zawierać niewielką ilość detergentu (0,05%), a także białko, np. albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1%.
   2. Alternatywnie należy użyć buforu zawierającego większą ilość detergentu, aby doszło do lizy komórek.
      nuta: Stosujemy zawierające Triton-X lub NP40 w stężeniu 1%. Butory do lizy komórek umożliwiają elucję zarówno cytokin wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych z SAM i generalnie powodują wyższe poziomy cytokin i chemokin. Bufor ten powinien również zawierać białko i jest uzupełniony o BSA do 1%.
   3. W przypadku pomiarów RNA, takich jak ilościowy PCR wirusowego RNA lub pomiar RNA gospodarza, należy dodać bufor do ekstrakcji RNA bezpośrednio do wilgotnego SAM.
      nuta: Buzy do ekstrakcji chaotropowego RNA zawierają guanidynę, która denaturuje białka. Alternatywą jest dodanie buforu do ekstrakcji RNA do eluowanego płynu MLF zawartego w teście immunologicznym lub buforze do lizy komórek.
   4. Rozpuszczalniki organiczne, takie jak kwas trifluorooctowy, należy stosować do ekstrakcji lipidów i metabolitów w celu oceny metodą spektrometrii mas.
      nuta: Szczegółowe informacje na temat wszystkich tych odczynników znajdują się w sekcji Materiały.
3. Technika elucji
   1. W przypadku którejkolwiek z powyższych technik elucji należy umieścić SAM w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml wraz z żądanym buforem ekstrakcyjnym.
   2. Wirowo mieszaj próbkę przez 30 sekund, aby zmyć SAM z luźno przyczepionych płynów i biomolekuł.
   3. Aby zapewnić pełne odzysk próbki, należy przeprowadzić elucję odśrodkową, dodając wilgotny SAM do minikolumny z filtrem wirowym, którą wkłada się do tej samej probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml, która służy do mycia.
      nuta: Można zastosować dwa rodzaje minikolumn z filtrem wirowym. Pierwsza zawiera tylko plastikową siatkę, która utrzymuje SAM na miejscu, umożliwiając pełną elucję płynów. Alternatywnie, jeśli pracujesz z materiałami zakaźnymi, użyj filtrów wirowych o wielkości porów 0,22 μm. Filtry te sterylizują próbki i nadają się do próbek z podejrzeniem infekcji prątkami. Jednak filtry te powinny być wstępnie inkubowane z buforem, aby zminimalizować wiązanie mediatorów z filtrem przez niespecyficzne interakcje.
   4. Użyj wysterylizowanych kleszczyków, aby przenieść wilgotny SAM do filtra wirowego. Zmieniaj kleszcze między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
   5. Odwirować próbki przez 20 minut przy 16 000 x g w miniwirówce schłodzonej do temperatury 4 °C.
4. Podsumowanie przykładowy protokół
   1. W laboratorium oznaczyć 2 ml mikroprobówek wirówkowych do pobrania próbki i dodać żądaną objętość buforu elucyjnego (zwykle 300 μl dla NA; 100 μL dla BA). Zamknij pokrywkę i umieść na lodzie.
   2. Po pobraniu próbek (natychmiast lub w laboratorium) SAM jest usuwany z uchwytu za pomocą kleszczy i umieszczany w probówce zawierającej bufor (wyprodukowanej w poprzednim etapie). Upewnij się, że nakrętka probówki mikrowirówki jest dobrze zamknięta i przenieś próbki na lodzie do laboratorium w celu dalszego przetwarzania.
   3. Wyjąć probówki zawierające SAM i bufor elucyjny z pojemnika transferowego i mieszać wirowo przez 30 s.
   4. Za pomocą sterylnych kleszczyków usuń SAM i umieść w kolumnie wirowej (z filtrem z octanu celulozy 0,22 μm lub bez).
   5. Zebrać bufor elucyjny z probówki zbiorczej i zachować.
   6. Umieścić kolumnę wirową z SAM w oryginalnej probówce zbiorczej (lub nowej, jeśli próbki są sterylnie filtrowane) i dodać bufor do zbierania do kolumny wirowej. W ten sposób płyn płuczący przejdzie przez kolumnę wirową z powrotem do probówki zbiorczej, pomagając w wymyciu próbki z SAM.
   7. Odwirować próbki z zamkniętymi pokrywkami (16 000 x g, 20 min, 4 °C).
   8. Wyjmij próbki z wirówki i umieść je w stojaku.
   9. Otwórz szczelną pokrywę probówek i wyjmij kolumnę wirującą zawierającą SAM. Wyrzuć SAM i kolumnę wirującą do odpowiedniego pojemnika na odpady.
   10. Ostrożnie podwielokrotnić eluat zawarty w probówce do oznakowanych probówek kriogenicznych. Zanotować całkowitą objętość eluatu i objętość w każdej podwielokrotności.
   11. Przenieś zamknięte probówki kriogeniczne do zamrażarki o temperaturze -80°C i przechowuj w pozycji pionowej do czasu użycia.

Results

NA zostało wykorzystane w wielu badaniach do łatwego i nieinwazyjnego pomiaru stanu zapalnego błony śluzowej. Po podaniu alergenu do nosa, można zaobserwować, że poziom prostaglandyn-D2 (PGD2) wzrasta i spada w ciągu kilku minut (Ryc. 1), zgodnie z degranulacją komórek tucznych (Thwaites i wsp., manuskrypt w przygotowaniu). Dodatkowo, mediatory zapalenia typu II, takie jak IL-5 (Rycina 2, przedrukowana za zgodą ²⁴), mogą być mierzone w godzinach następujących po prowokacji alergenem w nosie^23,24. W eksperymentalnym zakażeniu alergicznych astmatyków i zdrowych osób z grupy kontrolnej, NA wykorzystano do pomiaru panelu mediatorów, w tym interferonu-gamma (IFN-γ), w ciągu 7 dni (Rycina 3, przedruk za zgodą ⁶). Dodatkowo, w zakażeniu naturalnym wirusem syncytialnym układu oddechowego (RSV) u niemowląt, NA wykazał, że RSV jest związany z podwyższonym poziomem cytokin zapalnych, takich jak IFN-γ, w porównaniu z niemowlętami bez RSV z zapaleniem oskrzelików i zdrowymi osobami z grupy kontrolnej (Rycina 4, przedruk za zgodą ³⁰). Co ciekawe, ta dyskryminacja między zapaleniem oskrzelików z wirusem RSV a nie-RSV nie była istotna w próbkach NPA dopasowanych w czasie (Ryc. 4).

BA było również używane podczas eksperymentalnego zakażenia astmatyków alergicznych rinowirusem. W 4 dniu zakażenia rinowirusem poziomy IFN-γ, CXCL11, IL-10 i IL-5 były podwyższone w stosunku do wartości wyjściowej (Ryc. 5; A, B, C i D). Dodatkowo, technika ta wykazała podwyższony poziom IL-5 w dolnych drogach oddechowych alergicznych astmatyków podczas infekcji rinowirusem, w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej (Rycina 5D)(Rycina 5 przedrukowana za zgodą ⁶).

Te reprezentatywne wyniki zostały wygenerowane z próbek wymytych przy użyciu buforu testowego zawierającego 0,05% Tween-20 i 1% BSA (patrz Tabela Materiałów).

Rysunek 1: Szybkie wytwarzanie i usuwanie prostaglandyn-D2 po prowokacji alergenem donosowym. Poziomy prostaglandyn-D2 (PGD2) mierzone na podstawie wchłaniania przez nos eluują się w próbkach seryjnych po prowokacji alergenem donosowym pyłkiem trawy tymotki łąki (n = 5). Każdy wiersz reprezentuje dane od jednej osoby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Pomiar kinetyczny IL-5 po prowokacji alergenem donosowym. Wytwarzanie IL-5 w seryjnych próbkach wchłanianych przez nos po prowokacji alergenem donosowym. Przeprowadzono trzy powtórne badania prowokacyjne z alergenem, w których uczestnicy (n=19) otrzymywali placebo (niebieski), małą dawkę (10 mg) doustnego prednizonu (pomarańczowy) lub dużą dawkę (25 mg) doustnego prednizonu (czerwony) na godzinę przed podaniem alergenu. Linie oznaczają średnią geometryczną, a słupki błędu to 95% przedziały ufności wszystkich uczestników. (Rysunek przedrukowany za zgodą Leaker et al., Mucosal Immunology, 2017). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Indukcja interferonu-γ podczas infekcji rinowirusem. Podczas prowokacji infekcyjnej zdrowych osób dorosłych (n = 11, niebieski) i astmatyków alergicznych (n = 28, czerwony) rinowirusem-16, do pomiaru poziomu interferonu-γ (IFN-γ) zastosowano pobieranie próbek z nosa. Dane są reprezentowane jako A) surowe wykresy spaghetti osób i B) poziomy mediany ze słupkami błędu oznaczającymi przedziały międzykwartylowe. (Rycina przedrukowana za zgodą Hansel et al.⁶). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Nososorpcja dyskryminuje podwyższony poziom interferonu-γ związany z zakażeniem RSV u niemowląt. Wchłanianie przez nos i aspirację do nosogardzieli (NPA) wykorzystano do pomiaru poziomów interferonu γ u niemowląt z zapaleniem oskrzelików związanym z zakażeniem syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) (czerwony, n = 12), patogenem układu oddechowego innym niż RSV (zielony, n = 12) i zdrowymi osobami z grupy kontrolnej (niebieski, n = 9). Dane analizowano za pomocą testu Kruskalla-Wallisa z poprawką Dunnsa dla wielokrotnych porównań (***p<0,001). Linie oznaczają wartości mediany, a słupki błędów są przedziałami międzykwartylowymi. (Rysunek zmodyfikowany za zgodą Thwaites et al.³⁰). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Mediatory stanu zapalnego w próbkach wchłaniania oskrzelowego podczas infekcji rinowirusem.
Po zakażeniu rinowirusem-16 zdrowych osób z grupy kontrolnej (n = 10, niebieski) i alergicznych ochotników z astmą (n = 23, czerwony), wchłanianie oskrzelowe zastosowano do pomiaru poziomów A) IFN-γ, B) CXCL11, C) IL-10 i D) IL-5 na początku badania i w 4. dniu zakażenia. Dane analizowane za pomocą testu rang podpisanych Wilcoxona (dopasowane próby) i testu Manna-Whitneya (niedopasowane próby). Rycina przedrukowana za zgodą Hansel et al.⁶ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wyniki uzyskane przy użyciu istniejących technik pobierania próbek z dróg oddechowych uważa się za bardzo zmienne; Do standaryzacji badań w^{tej dziedzinie potrzebne} są alternatywne techniki doboru próby5. NA i BA pozwalają na pobieranie próbek MLF w sposób nieinwazyjny i mają ekscytujący potencjał do pomiaru odpowiedzi immunologicznych w zdrowych i chorych drogach oddechowych. Techniki te oferują wiele potencjalnych zalet w porównaniu z istniejącymi technikami, w tym większą tolerancję, szybkość pobierania próbek, możliwość częstego powtarzania próbkowania, mniejszą zmienność między użytkownikami i zmniejszone rozcieńczenie mediatorów immunologicznych⁵. Czas trwania absorpcji i zastosowana technika przetwarzania powinny być zoptymalizowane dla każdego badania i rygorystycznie utrzymywane między zdarzeniami pobierania próbek. Dodatkowo, w przypadku BA, miejsce pobrania próbki w drogach oddechowych powinno być dokładnie odtworzone u różnych osób.

NA, a w szczególności BA, są wciąż stosunkowo nowymi technikami badań klinicznych. Jednak korzyści płynące z tych technik zaowocowały ich zastosowaniem w licznych badaniach, w tym staranną walidacją w odniesieniu do technik alternatywnych⁵. Urządzenia te są obecnie dostępne jako urządzenia z oznaczeniem CE, gotowe do powszechnego stosowania w badaniach nad układem oddechowym. Podczas gdy NA i BA skutkują znacznie mniejszymi objętościami próbek niż alternatywne techniki pobierania próbek, wyższe uzyskane stężenia mogą skutkować większą czułością dla mediatorów immunologicznych o niskiej liczebności.

W zależności od pożądanych zastosowań końcowych, próbki NA i BA mogą być bezpośrednio zamrażane w celu późniejszego przetworzenia, co zwiększa wykonalność badań w środowisku badań klinicznych. Protokół postępowania z próbkami może być również dostosowany do konkretnych zastosowań końcowych. Sugerowane techniki przetwarzania mogą być stosowane do zbierania białkowych lub lipidowych mediatorów immunologicznych lub kwasów nukleinowych, ale powinny być zoptymalizowane dla każdego badania. W szczególności MLF można eluować za pomocą różnych. Po pierwsze, bufor testu immunologicznego może być używany do pomiaru cytokin błony śluzowej, chemokin i przeciwciał ^6,45. o wyższych poziomach detergentów mogą być również stosowane w celu zagwarantowania lizy komórek, co pozwala na włączenie cytokin wewnątrzkomórkowych. do ekstrakcji chaotropowego RNA powinny być używane do określania infekcji wirusowej, wiremii, mRNA gospodarza i mikrobiomu. Alternatywnie rozpuszczalniki organiczne mogą być stosowane w lipidomice i spektrometrii mas.

Podsumowując, bezpośrednie wchłanianie MLF z powierzchni błony śluzowej jest ekscytującą techniką o potencjalnym zastosowaniu w chorobach układu oddechowego, żołądkowo-jelitowego, moczowo-płciowego i innych chorobach błony śluzowej. Jednak te obiecujące techniki absorpcji będą wymagały precyzyjnej walidacji techniki pobierania próbek i przetwarzania dla poszczególnych testów (biomarkerów) w każdym środowisku chorobowym. Ponadto te nowatorskie techniki precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej będą wymagały walidacji w porównaniu z konwencjonalnymi próbkami, takimi jak krew, oddech i plwocina. Dzięki tym technikom MLF może być używany do pomiaru drobnoustrojów, cytokin, chemokin, prostanoidów i przeciwciał.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasosorpcja (dla dorosłych, szerokość 7 mm)	Hunt Developments	NSFL-FXI-11	Dostępne są różne rozmiary dla różnych grup pacjentów/grup wiekowych.
Bronchosorpcja	Hunt Developments	BSFL-FXI-11	Minimalny rozmiar kanału bronchoskopu 2 mm; Maksymalna długość robocza 815mm
Corning  Costar  Spin-X  filtry probówkowe wirówkowe (bez membrany)	Sigma Aldrich	CLS9301-1000EA
Corning  Costar  Spin-X  filtry probówkowe wirówkowe (membrana 0,22um)	Sigma Aldrich	CLS8160-24EA	Do sterylizacji próbek zagrożonych infekcją.
Bufor testowy (elucji)	Millipore	AB-33k	Nie wymieniony na stronie internetowej Millipore, ale dostępny za pośrednictwem zapytań lub ogólnych firm zajmujących się zaopatrzeniem laboratoriów, takich jak Cedarlane. Zawiera 0,05% Tween-20 i 1% BSA.
NP-40 Bufor do lizy komórek	Life Technologies	FNN0021	Dodaj albuminę surowicy bydlęcej do 1% (w/v). Może odzyskać wyższe bezwzględne poziomy mediatora.
Bufor RLT (ekstrakcja RNA)	Qiagen	79216	Umożliwia odzyskiwanie RNA z próbek z nososorpcji i bronchosorpcji.
Kwas trifluorooctowy	Sigma Aldrich	302031-100ML-M Do	elucji próbek do zastosowań HPLC
o pojemności 2,0 ml	Do filtrów rurkowych Spin-X wymagane są probówki o pojemności 2,0 ml Costar 3213, tradycyjne probówki o pojemności 1,5 ml nie będą do nich pasować.