Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56421

⸱

31 stycznia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowana jest nowatorska technika szybkiego wyświetlania antygenu na powierzchni bakteryjnej, która polega na powierzchniowej biotynylacji, a następnie ekspozycji na interesujące białka podczas fuzji z monomeryczną awidyną. Ładowanie BCG wybranymi antygenami skutecznie poprawia jego immunogenność, co sugeruje, że dekoracja powierzchni może zastąpić tradycyjne podejścia genetyczne.

Streszczenie

Gruźlica (TB) jest poważną chorobą zakaźną i jedyną dostępną szczepionką M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) jest bezpieczna i skuteczna w ochronie przed ciężkim gruźliczym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych u dzieci i niektórymi formami rozsianej gruźlicy, ale nie chroni przed gruźlicą płuc, która jest najbardziej rozpowszechnioną formą choroby. Obiecujące strategie poprawy BCG opierają się obecnie albo na jego transformacji za pomocą genów kodujących immunodominujące antygeny specyficzne dla M. tuberculosis (Mtb), albo na uzupełnieniu genami kodującymi kofaktory, które stymulowałyby komórki prezentujące antygen. Główne ograniczenia tych podejść obejmują niską wydajność, niską stabilność i niepewny poziom bezpieczeństwa wektorów ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy alternatywne podejście do ulepszania szczepionek, które polega na uzupełnieniu BCG egzogennymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania na powierzchni bakterii, a nie na transformacji z plazmidami kodującymi odpowiednie geny. Najpierw interesujące białka są wyrażane w fuzji z monomeryczną awidyną w standardowych systemach ekspresji E. coli, a następnie wykorzystywane do dekoracji powierzchni biotynylowanego BCG. Doświadczenia na zwierzętach z użyciem powierzchni BCG ozdobionej zastępczym antygenem albuminy jaja kurzego wykazują, że zmodyfikowana bakteria jest w pełni immunogenna i zdolna do indukowania specyficznych odpowiedzi limfocytów T. Podsumowując, przedstawione tutaj dane zdecydowanie wspierają nowatorską i skuteczną metodę przekształcania obecnej szczepionki BCG, która zastępuje pracochłonne konwencjonalne podejście do uzupełniania egzogennymi kwasami nukleinowymi.

Wprowadzenie

Zaproponowano różne strategie zastąpienia obecnej szczepionki BCG przeciwko gruźlicy, w tym systemy adiuwantów białkowych, technologie wektorów wirusowych, atenuowane żywe szczepy M.tb i genetycznie modyfikowane szczepy BCG, albo w celu wprowadzenia genów nadmiernie eksprymujących antygeny BCG, które nie są wystarczająco wyrażane podczas infekcji1 lub antygeny specyficzne dla Mtb, które nie występują w BCG2. Inżynieria genetyczna napotyka jednak wiele barier, w tym niepewny poziom bezpieczeństwa, czasochłonny proces i niską wydajność wektorów ekspresji4,5. Jeśli chodzi o poprawę BCG, potrzebne jest alternatywne podejście, aby poprawić immunogenność bez konieczności niepewnych zmian genetycznych.

W tym badaniu wprowadzamy nową strategię wyświetlania interesujących rekombinowanych białek na powierzchni komórek BCG, która opiera się na dobrze znanej interakcji awidyny o wysokim powinowactwie z biotyną. Takie podejście pozwala na szybkie i powtarzalne przyłączanie rekombinowanych białek fuzyjnych awidyny do powierzchni biotynylowanego BCG, co ułatwia szerokie manipulacje BCG w celu osiągnięcia maksymalnej poprawy jego skuteczności przy zachowaniu doskonałych wyników bezpieczeństwa, obserwowanych przez dziesięciolecia stosowania.

Powinowactwo awidyny do biotyny jest niezwykle wysokie (Kd = 10−15 M), a raz uformowany, kompleks biotyna-awidyna jest bardzo stabilny i może zostać zakłócony tylko w warunkach denaturacji6. Jednak, aby ten rodzaj interakcji służył jako alternatywna metoda transferu genów, wymagane jest długotrwałe, ale odwracalne wyświetlanie rekombinowanych białek. W ten sposób wprowadziliśmy tutaj monomeryczną awidynę o niskim powinowactwie (Kd = 10-7 M), która prowadzi do odwracalnego uwalniania białka z ozdobionego powierzchnią BCG po spożyciu wewnątrz komórek prezentujących antygen. Aby udowodnić słuszność koncepcji, przetestowaliśmy tę metodę przy użyciu monomerycznego białka chimerycznego awidyny odpowiadającego antygenowi zastępczemu pochodzącemu z albuminy jaja kurzego (OVA)7,8. Wyniki pokazały, że powierzchnię komórki BCG można łatwo i szybko ozdobić monomerycznymi białkami fuzyjnymi awidyny, a to wiązanie z powierzchnią BCG jest stabilne i powtarzalne bez wykrywalnych zmian we wzroście i przeżywalności bakterii. Odkryliśmy również, że BCG ozdobiony monomeryczną awidyną połączoną z OVA (AviOVA) może indukować odpowiedź immunologiczną podobną do tej indukowanej przez BCG wykazującą genetyczną ekspresję tego samego antygenu zarówno in vitro, jak i in vivo. Ta technologia odwracalnego wyświetlania interesujących białek na powierzchni bakterii jest zatem skutecznym zamiennikiem tradycyjnych metod transferu genów i może stanowić platformę do szerokich manipulacji BCG i dalszych zastosowań w opracowywaniu szczepionek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta były utrzymywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Numer ubezpieczenia dobrostanu zwierząt to A11-0247.

1. Generacja monomerycznych białek fuzyjnych awidyny eksprymujących plazmidy

  1. Sub-klonuj monomeryczną sekwencję awidyny12 do plazmidu pDEST17 między miejscami "CTC" i "GAA", co odpowiada 133-134bp. (tj. między 6-histagiem a miejscem rekombinacji pDEST17 Attr1), aby otrzymać p17-Avi.
    UWAGA: Monomeryczna sekwencja DNA awidyny jest pokazana poniżej. Trzy mutacje wprowadzone do awidyny typu dzikiego w celu uzyskania awidyny monomerycznej są pokazane pogrubionymi znakami.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgccaca cagaaggagt ga
  2. Zaprojektuj startery otoczone miejscami AttB1 i AttB2 odpowiadającymi sekwencji DNA polipeptydu OVA757-1035 (epitopy ograniczone do I-Ab i H-2Kb). Sekwencje starterów to: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT oraz Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Sekwencje Attb1 i Attb2 są pogrubione).
    1. Sekwencja DNA polipeptydu757-1035 z amplifikacją PCR za pomocą powyższych starterów przy użyciu plazmidu pUC57-OVA jako matrycy.
    2. Sklonuj produkty PCR do pDONR-221 poprzez specyficzną dla miejsca reakcję rekombinacji in vitro (np. klonazę BP) w celu uzyskania pDONR-OVA.
  3. Przenieś interesujący gen do p17-Avi za pomocą reakcji LR Clonase w celu uzyskania p17-Avi-OVA.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacji BP i LR można znaleźć w instrukcji producenta.

2. Ekspresja, oczyszczanie i ponowne fałdowanie monomerycznej fuzji białek awidyny

  1. Przekształć plazmid p17-Avi-OVA w E. coli BL21 i indukować 250 ml hodowli E. coli BL21 za pomocą IPTG (0,1 M) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Liza bakterii i solubilizacja ciał inkluzyjnych
    1. Osadzać 250 ml indukowanej kultury BL21 przez 30 minut wirowania w temperaturze 4 000 x g i w temperaturze 4 °C.
    2. Zebrać osady w 10 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidyna-HCL, pH 1,5-2,5) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 95 °C. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze.
    3. Odwirować przez 30 minut przy 15 000 x g i temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.
  3. Oczyść Avi-OVA z supernatantu (frakcji rozpuszczonych ciał inkluzyjnych) za pomocą kolumn Ni-NTA.
    1. Rozcieńczyć ciała inkluzyjne w stosunku 1:2 buforem do lizy.
    2. Użyj 4 ml żywicy Ni-NTA na 250 ml ciał inkluzyjnych pochodzących z kultur.
    3. Przemyć 3x 10 ml buforu do lizy (pH 7,0).
    4. Eluować za pomocą 10 ml buforu elucyjnego (bufor do lizy pH 7,0 z 250 mM imidazolem).
  4. Ponownie zformować eluowane białko przez stopniowe rozcieńczanie (1:10) i szybkie wirowanie w buforze Tris (pH 7,5) zawierającym 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzylodimetyloamonio)propanosulfonian), 0,5 mM Tween 80, 500 mM argininy i 200 mM NaCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odsalanie i wymiana buforowa ponownie złożonego białka z buforu Tris do PBS z koncentratorami białek zgodnie z protokołami producenta.
  6. Usunąć agregaty przez odwirowanie przez 30 minut w temperaturze 3 500 x g i w temperaturze 4 °C, a porcje rozpuszczalnego białka przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Biotynylacja powierzchni komórek BCG

  1. Hoduj BCG w bulionie Middlebrook 7H9 z 10% OADC (roztwór kwasu oleinowego, albuminy i dekstrozy) i 0,05% Tween 80 w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsającej przy 50 obr./min, aż OD = 0,5-1,
    UWAGA: BCG jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 i wszystkie eksperymenty dotyczące BCG powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.
  2. Przemyj 109 BCG 3 razy 500 μl lodowatego PBS wolnego od endotoksyn plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8,0). Zawiesić granulat BCG w sterylnym PBS wolnym od endotoksyn.
  3. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj 1 ml 10 ml biotyny Sulfo-NHS SS w sterylnej przefiltrowanej wodzie.
    1. Inkubować bakterie z 1 ml 0,5 mM biotyny Sulfo-NHS SS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  4. Umyj oznakowane bakterie 3 razy 500 μl lodowatego zimnego PBST, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik biotynylacji.
    1. Ponownie zawiesić osad w 1 ml PBST.
  5. Aby ocenić skuteczność biotynylacji, należy zabarwić 108 biotynylowane BCG Streptavidin-FITC (1:100, 25 μL) w temperaturze pokojowej przez 20 min.
    1. Inkubować barwione bakterie w 1 ml 2% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zbadać poziomy biotynylacji za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

4. Fenotyp biotynylowanych prątków: wzrost i przetrwanie

  1. Hoduj szczepy BCG w bulionie Middlebrook 7H9 z 10% OADC (roztwór kwasu oleinowego, albuminy i dekstrozy) i 0,05% Tween 80 w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsającej przy 50 obr./min.
    1. Zapisać gęstość optyczną (OD600) kultury bakteryjnej w okresie 8 dni.
  2. Użyj BCG-Luc (wcześniej opisanego9) do wykrywania przeżywalności bakterii w makrofagach.
    1. Zakażone komórki RAW264.7 biotynylowanym BCG-Luc (MOI 10:1) lub nieleczonym BCG-Luc (kontrola) i inkubowane w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
    2. Umyj monowarstwy komórek, a następnie poddaj lizie 0,025% SDS, aby uwolnić połknięte bakterie.
    3. Pomiar produkcji bioluminescencji za pomocą systemu testowego lucyferazy i luminometru.
      UWAGA: Sygnał luminescencji wskazuje na żywotność bakterii. Proszę zapoznać się z instrukcją producenta, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat testu lucyferazy.

5. Wiązanie monomerycznego białka fuzji awidyny z biotynylowaną powierzchnią BCG

  1. Wymieszaj 5 x 108 biotynylowanych BCG z białkiem Avi (10 μg/ml końcowy w PBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsarki.
  2. Przemyć bakterie 3 razy 500 μl mrożonego zimnego PBST i zabarwić przeciwciałem anty-awidynowym królika (Ab) (rozcieńczenie 1:100, wcześniej opisane10) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie sprzężoną z kozią anty-króliczą IgG Ab w FITC w tych samych warunkach.
  3. Umyj bakterie 3 razy 500 μl PBST i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej, aby ocenić stopień dekoracji powierzchni.

6. Liofilizacja prątków

  1. Biotynylować bakterie zgodnie z krokami 3.1-3.4 i pokryć biotynylowane bakterie Avi-OVA zgodnie z krokiem 5.1.
  2. Podwielokrotne biotynylowane i powlekane bakterie (108), przemyć PBS i ponownie zawiesić w 0,5 ml pożywki liofilizacyjnej (25% pożywki Sauton, 75% H2O i 1,5% Na-glutaminianu).
  3. Przenieść bakterie do szklanych fiolek i zamrozić w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez noc.
  4. Liofilizować napełnione i zamrożone szklane fiolki przez 24 godziny za pomocą liofilizatora.
  5. Suszone próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej i w razie potrzeby rozpuścić w PBS.
  6. Powtórz krok 3.5, aby ocenić biotynylację i stabilność powłoki powierzchniowej.

7. Test fagocytozy

  1. Hoduj komórki makrofagów RAW 264.7 w szalkach hodowlanych o średnicy 10 cm w pożywce DMEM zawierającej 5% FCS, po 1% L-glutaminy, HEPES, aminokwasów endogennych oraz penicyliny i streptomycyny do 70-80% konfluencji.
  2. Wysiewaj 2 x 106 RAW 264,7 komórek makrofagów na 6-dołkowej płytce. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Wygeneruj DsRed BCG (wcześniej opisany9) ozdobiony Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) zgodnie z krokami 3.1-3.4 i 5.1.
  4. Zakażone komórki RAW DsRed BCG-Avi-OVA lub nieleczonym DsRed BCG w MOI 20:1 przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Umyj komórki trzy razy i trypsynizuj za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby usunąć częściowo oderwane bakterie.
  6. Utrwalić w 2,5% PFA w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Przemyć 3x PBS i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.

8. Wewnątrzkomórkowy transport biotynylowanego BCG ozdobionego OVA w makrofagach

  1. Mikroskopia fluorescencyjna
    1. Wysiew 3 x 105 RAW 264,7 komórek makrofagów na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowej płytce. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Zakażenie komórek makrofagów prątkami (MOI 10:1) w pożywce podtrzymującej bez antybiotyków w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 do 24 godzin.
    3. Umyj komórki i trypsynizuj, aby usunąć przyczepione do powierzchni, niepołknięte bakterie, jak w kroku 7.5.
    4. Utrwal zainfekowane komórki w 2,5% PFA w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj 3 przemycia PBS.
    5. Przepuszczalność komórek w buforze blokującym/permeabilizacyjnym (0,1% Triton X-100, 3% BSA w PBS) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Stosować specyficzne przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania (np. królicze przeciwciało anty-awidynę Ab) w dawce 10 μg/ml w buforze permeabilizacyjnym przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przeciwciało drugorzędowe (np. FITC-kozia anty-królicza IgG) przez 20 minut.
    6. Umyj komórki 3x PBS, raz wodą i zamontuj na szkiełkach w 10 μl wodnego podłoża montażowego, aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjne.
    7. Badaj preparaty za pomocą cyfrowej mikroskopii konfokalnej przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw planapochromatyczny 63x/1,4. Rejestruj obrazy za pomocą kamery cyfrowej sprzężonej z oprogramowaniem mikroskopu.
  2. Barwienie immunozłotem i mikroskopia elektronowa
    1. Wysiew 2 x 106 RAW 264,7 komórek makrofagów na płytkach 6-dołkowych.
    2. Napraw makrofagi zakażone BCG za pomocą 4% PFA przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
    3. Próbki należy przemyć dwukrotnie PBS.
    4. Zanurz próbki w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i odwadnij w 70% etanolu.
    5. Przenieść próbki na żywicę akrylową i polimeryzować w temperaturze 50 °C.
    6. Wytnij odcinki 60 nm za pomocą mikrotomu i zbierz skrawki na siatkach niklowych.
    7. Oznaczyć próbki 10 μg/ml przeciwciała awidyny przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc w roztworze inkubacyjnym (PBS i 0,1% BSA), a następnie przemyć roztworem inkubacyjnym F(ab')2 ultra-małej koziej anty-króliczej IgG (1/20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze inkubacyjnym.
    8. Umyć skrawki w wodzie destylowanej, zabarwić w 2% aldehydzie glutarowym, ponownie umyć, wysuszyć na powietrzu i zbadać mikroskopem elektronowym.

9. Szczepienia zwierząt i przetwarzanie narządów

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Przepuść biotynylowane i pokryte białkiem bakterie przez igłę 271/2G 10 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
  2. Weź 1 x 106 bakterii w 100 μl PBS wolnego od endotoksyn i uodpornij samicę myszy C57BL / 6 (I-Ab, H-2Kb, 5-6 tygodniowe) podskórnie w kark szyi.
    1. Wstrzyknąć myszom kontrolnym 100 μl samego PBS.
  3. Eutanazja uodpornionych myszy 20 dni po szczepieniu przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    1. Wyizoluj śledzionę i przenieś ją do pożywki RPMI.
  4. Rozgnieć śledzionę przez sitko o wielkości 70 μm za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
    1. Umyć 5 ml RPMI. Odwirować (800 x g, 3 min) w celu wyizolowania zawiesiny jednokomórkowej.
    2. Zubożyć RBC za pomocą zestawu do pozytywnej selekcji biotyny myszy z biotyną-Ter119 / komórkami erytroidalnymi Ab.
    3. Odwiruj i ponownie zawieś komórki w 10 ml pełnego RPMI (10% FCS, 1% L-glutamina, 1% penicylina, 1% streptomycyna i 50 μM 2-ME).

10. Barwienie tetrameru I-Ab w celu określenia częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu oraz barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych w celu określenia częstotliwości uwalniania cytokin przez limfocyty T specyficzne dla antygenu u uodpornionych zwierząt

  1. Barwienie tetramerowe
    1. Wybarwić splenocyty od myszy kontrolnych i immunizowanych (~20 x 106 komórek) tetramerami I-Ab-OVA 323-339 sprzężonymi z PE (rozcieńczenie 1/12,5) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w buforze wiążącym (PBS z 2% FCS i 0,1% NaN3).
    2. Dodaj AF647 CD4 Ab (1:25) i 7-AAD (w celu wykrycia martwych komórek) do splenocytów na 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej.
    4. Uzyskaj 500 000 zdarzeń w regionie CD4 dodatnim, aby określić częstotliwość zdarzeń tetramerowych.
      UWAGA: Całkowite splenocyty są definiowane przez plamę punktową SSC / FSC, żywe komórki przez wykluczenie pozytywnych zdarzeń 7-AAD, a podzbiory CD4 przez bramkowanie pozytywnych zdarzeń AF647.
  2. Częstotliwość wewnątrzkomórkowych limfocytów T uwalniających cytokiny specyficzne dla antygenu
    1. Przenieść około 1 × 107 splenocytów do 4 ml kompletnej pożywki RPMI na sześciodołkowych płytkach z rekombinowanym OVA lub bez niego (10 μg/ml) i inkubować przez 16 godzin.
    2. Leczyć komórki preparatem Brefeldin A (1:1 000) przez dodatkowe 5 godzin.
    3. Przemyć PBS i poddać barwieniu cytokinami wewnątrzkomórkowymi w następujący sposób:
      1. Próbki komórek barwić PE-CD8 lub PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 w buforze wiążącym) w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      2. Utrwalić w 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 20 min.
      3. Przepuszczalność za pomocą roztworu do przepuszczalności, zgodnie z instrukcjami producenta.
      4. Umyj komórki i oznacz IFN-γ Ab (1:50) sprzężonym z AF647 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      5. Umyć komórki i poddać analizie cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z zastosowaniem opisanych powyżej ogólnych procedur zbadano wykonalność biotinylacji powierzchni BCG oraz dekoracji zastępczym antygenem OVA. Następnie przetestowano immunogenność zmodyfikowanego BCG in vivo. Powierzchnia bakteryjna została łatwo oznakowana biotyną w celu szybkiej ekspozycji chimerycznych antygenów awidynowych, bez żadnych wykrywalnych zmian w fenotypach bakteryjnych. Otrzymane zmodyfikowane BCG jest wydajnie pochłaniane przez komórki prezentujące antygen i może ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisaliśmy niegenetyczne podejście do szybkiego i skutecznego wyświetlania białek egzogennych na powierzchni BCG w celu dodania specyficznych antygenów lub określonych właściwości funkcjonalnych, które mają skutecznie poprawić immunogenność bakterii. Wykazaliśmy, że powierzchnię komórki BCG można łatwo biotynylować w celu natychmiastowej dekoracji powierzchni białkami fuzyjnymi awidyny. Cała procedura może być wykonana w ciągu 2 godzin, podczas gdy transformacja genetyczna i selekcja pozytywnych klonów wyma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. R. Stokesowi za szczep BCG Pasteur i A. Talalowi za wsparcie techniczne. Dziękujemy również GenScript za pomoc w syntezie genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Technologie komórek macierzystych RPMI 1640 bez endotoksyn 36750
Sulfo-NHS SS biotynaThermo Fisher 21328
Streptawidyna sprzężona z FITCSigma-AldrichS3762
Fikoerytryna (PE) sprzężona I-Ab-OVA323-339 tetramer MBL Międzynarodowy TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON polihistydyna-Żywica oczyszczająca Tag Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 sprzężony szczurzy anty-mysz CD4BD Bioscience 
AF647 przeciw myszom IFN-gBD Bioscience 
AF647 szczur przeciw myszom I-A/I-EBD Bioscience 
PeCy7 szczur anty-mysi CD4BD Bioscience 
PE szczur anty-mysi CD8 AbBD Bioscience 
AF 647 szczurzy anty-mysi H-2kbBD Bioscience562832
Przeciwciało przeciw królikowi koniugowane w FITC ThermoFisher31635
AF 647 szczurze przeciwciało przeciw myszom CD4BD Bioscience 
Ultra-małe, sprzężone ze złotem kozie anty-królicze IgGMikroskopia elektronowa Nauki25100
Middlebrook 7H9 bulionBD Systemy diagnostyczne 271310
Systemy diagnostyczneOADCB11886
Tween 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264.7 mysie linie komórkowe makrofagówtypu amerykańskiego Kolekcja
plazmidowych pDEST17 Invitrogen11803012
plazmid pUC57-OVA Klonaza GenScriptSD1176
BP Invitrogen11789020
LR clonase Invitrogen11791043
plazmid pDONR221Kolumny Invitrogen12536017
Ni-NTA Qiagen31014
Koncentratory białka Pierce Thermo Fisher 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan IIAparat cyfrowy CCD Carl Zeiss Inc
 Retiga EX, mikroskop elektronowy QImaging
Tecnai G2 200kV FEI FirmaG2 200Kv 
70μ m Sitko do komórek Falcon Thermo Fisher 87712
Zestaw pozytywnej selekcji biotyny myszy EasyStep StemCell18556
biotyna-Ter119/Ertyroid przeciwciałoBioLegend116203
Brefeldin ABD Pharmingen555029
Cytofix/Cytoperm kit Pharmingen
Promegae2620
Turner Biosystem Mikrotom PromegaTD-20/20
Leica EM UC6  Liofilizator Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500Savant Instruments NL 50
Fiolki ze szkła boroscilicateWheaton Wheaton  VWR 66011-675
557681557735562367552775561095557681 BD kultur Mikroskop epifluorescencyjny System testowy lucyferazy Bright-Glo 554714 BD

Bibliografia

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja bia ekcytometria przep ywowaimmunogennoodpowied limfocyt w Tprezentacja antygenucz steczki MHCtest fagocytozy
Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.