Method Article

Określanie szybkości zaniku transkryptów w całym genomie w proliferujących i spoczynkowych ludzkich fibroblastach

DOI:

10.3791/56423

⸱

January 2nd, 2018

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół generowania proliferujących i spokojnych pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych, monitorowania tempa zaniku transkryptu i identyfikacji genów rozkładających się w różny sposób.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spoczynek to tymczasowy, odwracalny stan, w którym komórki przestały się dzielić, ale zachowują zdolność do namnażania się. Wiele badań, w tym nasze, wykazało, że spoczynek wiąże się z rozległymi zmianami w ekspresji genów. Niektóre z tych zmian zachodzą poprzez zmiany poziomu lub aktywności czynników transkrypcyjnych związanych z proliferacją, takich jak E2F i MYC. Wykazaliśmy, że rozpad mRNA może również przyczyniać się do zmian w ekspresji genów między komórkami proliferującymi i uśpionymi. W niniejszym protokole opisujemy procedurę ustanawiania rozmnażających się i spoczynkowych kultur fibroblastów napletka ludzkiej skóry. Następnie opisujemy procedury hamowania nowej transkrypcji w komórkach proliferujących i w stanie spoczynku za pomocą aktynomycyny D (ActD). Leczenie ActD stanowi proste i powtarzalne podejście do dysocjacji nowej transkrypcji od zaniku transkryptu. Wadą leczenia ActD jest to, że przebieg czasowy musi być ograniczony do krótkich ram czasowych, ponieważ ActD wpływa na żywotność komórek. Poziomy transkryptów są monitorowane w czasie w celu określenia szybkości zaniku transkryptu. Procedura ta pozwala na identyfikację genów i izoform, które wykazują zróżnicowany rozpad w fibroblastach proliferujących i w stanie spoczynku.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poziomy transkryptów w stanie stacjonarnym odzwierciedlają wkład zarówno syntezy transkryptów, jak i ich zaniku. Regulowany i skoordynowany rozkład transkryptu jest ważnym mechanizmem kontroli procesów biologicznych1,2,3,4. Na przykład wykazano, że tempo zaniku transkryptu przyczynia się do czasowej serii zdarzeń następujących po aktywacji przez czynnik martwicy nowotworu cytokin zapalnych5.

Wcześniej wykazaliśmy, że przejście między proliferacją a spoczynkiem w pierwotnych ludzkich fibroblastach jest związane ze zmianami w poziomach transkryptów wielu genów6. Niektóre z tych zmian odzwierciedlają różnice w aktywności czynników transkrypcyjnych między tymi dwoma stanami.

Zmiany w szybkości zaniku transkryptu mogą również przyczynić się do zmian w poziomie wyrażenia transkryptu w dwóch różnych stanach7,8. Opierając się na naszych wcześniejszych odkryciach, że przejście między proliferacją a spoczynkiem jest związane ze zmianami poziomów wielu mikroRNA9, zapytaliśmy, czy istnieje również wkład różnicowego rozpadu transkryptu w zmianach ekspresji genów w proliferujących i spoczynkowych fibroblastach.

Aby monitorować stabilność transkryptu, określiliśmy tempo rozpadu transkryptów w całym genomie w komórkach proliferujących i w stanie spoczynku. Aby to osiągnąć, monitorowaliśmy tempo rozpadu w proliferujących i spoczynkowych fibroblastach, wprowadzając inhibitor nowej transkrypcji i monitorując tempo, w jakim poszczególne transkrypty znikały w czasie. Zaletą tego podejścia jest to, że w porównaniu z metodami, które po prostu monitorują ogólną ekspresję genów, hamując syntezę nowych transkryptów, będziemy w stanie określić szybkość rozpadu tych transkryptów niezależnie od szybkości, z jaką są one transkrybowane.

Leczenie ActD w celu zahamowania nowej transkrypcji i określenia szybkości zaniku transkryptu zostało z powodzeniem zastosowane w wielu poprzednich badaniach. ActD został wykorzystany do analizy znaczenia stabilności RNA w zmianach obfitości transkryptów, które wynikają z leczenia cytokinami prozapalnymi5. Podobne podejście zastosowano również do analizy różnic w szybkości zaniku transkryptu w proliferujących i zróżnicowanych komórkach C2C12, które przyjmują zróżnicowany fenotyp mięśni10. Innym przykładem jest to, że globalny okres półtrwania mRNA został również wykryty w pluripotencjalnych i zróżnicowanych embrionalnych komórkach macierzystych myszy11. W tych przykładach wykazano, że rozpad mRNA jest ważny dla regulacji obfitości transkryptów i przejścia komórek do różnych stanów komórkowych.

Stosując metody opisane poniżej, odkryliśmy zmiany w szybkości zaniku transkryptu w około 500 genach, porównując fibroblasty w stanie proliferacji i spoczynku12. W szczególności odkryliśmy, że cele mikroRNA miR-29, który jest regulowany w dół w komórkach w stanie spoczynku, są stabilizowane, gdy komórki przechodzą w stan spoczynku. Opisujemy tutaj metodologię, którą zastosowaliśmy do określenia szybkości rozpadu w komórkach proliferujących i uśpionych. Metodologia ta jest przydatna do porównywania globalnych szybkości rozpadu mRNA w dwóch różnych, ale podobnych warunkach, gdy poszukuje się informacji o szybko rozpadających się genach. Można go również wykorzystać do odpowiedzi na inne pytania, takie jak wpływ warunków hodowli komórkowej na rozpad transkryptu, na przykład w hodowlach dwuwymiarowych i trójwymiarowych. Tempo rozpadu można określić w całym genomie za pomocą metod takich jak mikromacierze lub sekwencjonowanie RNA. Alternatywnie, qPCR w czasie rzeczywistym lub Northern blot mogą być wykorzystane do określenia szybkości rozpadu na podstawie genu lub izoformy po izoformie. Współczynniki te można następnie wykorzystać do obliczenia okresu półtrwania każdego monitorowanego genu i zidentyfikowania genów o szybkości rozpadu, które są różne w dwóch warunkach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne na Uniwersytecie Princeton i Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.

1. Przygotuj proliferujące i hamowane kontaktowo fibroblasty na czas ActD

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje przebieg czasowy z czterema punktami czasowymi. Trzy biologicznie niezależne próbki można pobrać w każdym punkcie czasowym, zbierając różne płytki do hodowli tkankowych w jednym eksperymencie lub eksperyment można powtórzyć wiele razy z różnymi kulturami komórek. Z naszego doświadczenia wynika, że jedno naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm (jedna płytka) zapewnia wystarczającą ilość RNA do analizy. W razie potrzeby dla każdej próbki można połączyć wiele szalek do hodowli tkankowych, aby zwiększyć liczbę komórek w każdym punkcie czasowym. Ponadto ten sam eksperyment można przeprowadzić z fibroblastami wyizolowanymi od różnych osobników jako prawdziwie niezależnych replik biologicznych.

  1. Ustal proliferujące i spoczynkowe kultury komórek do analizy rozpadu transkryptu. W przypadku komórek proliferujących należy dzielić komórki co trzy dni, podczas gdy komórki zahamowane kontaktowo stają się zahamowane kontaktowo.
    1. W przypadku komórek zahamowanych kontaktowo zmieniaj pożywkę co 2 dni przez 7 dni. Podziel proliferujące komórki na 2 dni przed tym, jak fibroblasty hamowane kontaktowo będą gotowe do pobrania. Przykładowy schemat hodowli komórkowej jest pokazany w Rysunek 1. Pozostałe kroki w tej sekcji zawierają szczegółowy protokół ustanawiania i dzielenia komórek.
  2. Wyizoluj pierwotne fibroblasty skóry od skóry noworodka zgodnie z ustalonymi protokołami13. Przejście fibroblastów w celu zapewnienia jednorodnej populacji.
    UWAGA: Fibroblasty można zamrażać i rozmrażać w razie potrzeby.
  3. W razie potrzeby rozmrozić lub ponownie pokryć fibroblasty. Hodować fibroblasty w DMEM z 10% surowicą w sterylnych warunkach w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Używaj fibroblastów, które były hodowane przez mniej niż 10 pasaży. Fibroblasty powinny zlewać się w <80% w dniu podziału komórek, aby utworzyć proliferujące i spoczynkowe populacje.
  4. Aby podzielić płytkę do hodowli tkankowej na wiele płytek, podgrzej PBS, trypsynę i pożywkę z surowicą w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  5. Odessać lub użyć pipety, aby usunąć pożywkę z każdej płytki do hodowli tkankowej z komórkami, które mają zostać ponownie platerowane.
  6. Odpipetować ciepły PBS na każdą płytkę (10 ml roztworu na płytkę 150 mm, 5 ml roztworu na płytkę 100 mm, 2 ml na dołek na płytkę 6-dołkową i 1 ml na dołek na płytkę 12-dołkową).
  7. Odessać lub pipetować w celu usunięcia PBS z każdej płytki do hodowli tkankowej.
  8. Delikatnie odpipetować 1x Trypsin-EDTA na każdą płytkę (8 ml roztworu na płytkę 150 mm, 3 ml roztworu na płytkę 100 mm, 2 ml na dołek na płytkę 6-dołkową i 1 ml na dołek na płytkę 12-dołkową).
    UWAGA: Zrób 1x Trypsin-EDTA, rozcieńczając sterylne 10x Trypsin-EDTA w sterylnym PBS. Końcowy roztwór 1x powinien zawierać 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA.
  9. Inkubuj trypsynę z komórkami przez 5 minut.
  10. Delikatnie postukaj w płytkę, aby usunąć komórki z płytki.
  11. Pipetować do ponownego zawieszenia komórek w zawiesinie pojedynczej komórki.
  12. Przenieść komórki w roztworze trypsyny do stożkowej probówki zawierającej taką samą objętość DMEM z 10% surowicą (8 ml roztworu na płytkę 150 mm, 3 ml roztworu na płytkę 100 mm, 2 ml na dołek na płytce 6-dołkowej i 1 ml na zagłębienie na płytce 12-dołkowej).
  13. Wiruj komórki w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g, aby usunąć trypsynę.
  14. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki i policzyć za pomocą hemacytometru w celu określenia stężenia komórek.
  15. Wysiew 5 x 105 komórek na 100 mm płytka do hodowli tkankowej do komórek proliferujących i hamowanych kontaktowo.
  16. Korzystając z tej metody, ustal proliferujące i hamowane kontaktowo próbki wymagane do analizy (Rysunek 1).

2. Kurs czasu ActD

  1. Zawiesić ActD w stężeniu podstawowym 1 mg/ml (dla 1 mg ActD należy użyć 950 μl sterylnego PBS i 50 μl sterylnego DMSO).
    UWAGA: Zamrożone roztwory podstawowe ActD powinny być stabilne przez miesiąc w temperaturze -20 °C. Rozcieńczone roztwory należy wyrzucić i nie przechowywać do dalszego użycia.
  2. Dodaj ActD do odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanego podłoża dla wszystkich płytek do hodowli komórkowych replik biologicznych, które zostały ustawione dla punktów czasowych 0, 120, 240 i 480 min (Rysunek 2). Dodać ActD w stężeniu 15 μg na ml pożywki. Dobrze wymieszaj, odessaj starą pożywkę i dodaj do komórek pożywkę zawierającą ActD.
    1. W przypadku preparatu o stężeniu 1 mg/ml dodać 15 μl ActD na każdy ml pożywki, np. na 10 ml pożywki na płytkę o średnicy 100 mm dodać 150 μl ActD.
  3. Aby pobrać próbkę z zerowym punktem czasowym, delikatnie odessać pożywkę ActD i pipetować podgrzany PBS na komórki. Odmierzyć pipetą 10 ml roztworu na płytkę 150 mm, 5 ml roztworu na płytkę 100 mm, 2 ml na dołek na płytkę 6-dołkową i 1 ml na dołek na płytkę 12-dołkową.
  4. Delikatnie odessać lub odpipetować PBS.
    UWAGA: Wszystkie etapy związane z izolacją RNA należy wykonywać przy użyciu wody wolnej od RNaz, probówek mikrowirówkowych wolnych od RNaz i pipet wolnych od RNaz. Podczas pracy z RNA należy często nosić i zmieniać rękawice.
  5. Dodać roztwór izotiocyjanianu fenolu-guanidyny (1 ml/10 cm płytka z 4 x 10 5 do 4 x 107 komórek) bezpośrednio do płytki do hodowli tkankowej.
    UWAGA: Roztwór izotiocyjanianu fenolu i guanidyny jest jednofazowym roztworem, który utrzymuje jakość RNA podczas lizy komórek i oddzielania od siebie RNA, DNA i białka.
    UWAGA: Fenol i izotiocyjanian guanidyny są. Stosuj odpowiednią ochronę.
  6. Kilkakrotnie odpipetować mieszaninę izotiocyjanianu fenolu i guanidyny w górę iw dół, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
    UWAGA: Lizat roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C przez okres do roku.
  7. Zebrać każdy punkt czasowy po upływie odpowiedniego czasu, stosując metodę opisaną w krokach 2.3-2.6.

3. Izolacja całkowitego RNA z lizatu roztworu izotiocyjanianu fenolu-guanidyny

  1. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie kompleksów RNA-białko.
    UWAGA: Etapy protokołu roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny można wykonać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
  2. Wprowadź transkrypty kontrolne ze skokami, które można wykryć za pomocą zastosowanej metodologii. Wprowadzić te kontrole do każdej próbki w znanej ilości i stężeniu.
    UWAGA: Zewnętrzna kontrola impulsów RNA Control consortium (ERCC) mix14 została specjalnie zaprojektowana jako kontrola skoków dla sekwencji RNA. Może być również stosowany do Northern blot lub qPCR w czasie rzeczywistym. Dostępne są również elementy sterujące typu spike-in zaprojektowane specjalnie dla technologii mikromacierzy (patrz Tabela materiałów).
  3. Przenieść mieszaninę roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml za pomocą pipety. Dodać 0,2 ml chloroformu do mieszaniny roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny na każdy 1 ml użytego roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny (np. dodać 0,3 ml chloroformu do 1,5 ml mieszaniny roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny).
  4. Potrząsać energicznie probówką mikrowirówki przez 15 s, a następnie inkubować mieszaninę izotiocyjanianu chloroformu, fenolu i guanidyny w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  5. Wirować próbki w temperaturze 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po początkowym wirowaniu próbka powinna podzielić się na 3 warstwy - czerwoną warstwę organiczną na dole, biało-różową interfazę pośrodku i przezroczystą warstwę wodną na górze (Rysunek 3).
  6. Przenieść warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml za pomocą mikropipety.
    UWAGA: Uważaj, aby nie zakłócić interfazy podczas tego procesu. Można pozostawić część frakcji wodnej. Lepiej jest pozostawić część frakcji wodnej niż uwzględnić również niektóre warstwy interfazowe, ponieważ włączenie warstwy interfazowej zanieczyściłoby RNA DNA. Warstwa wodna będzie stanowić około połowy początkowej objętości, a więc około 0,9 ml, jeśli mieszanina roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny / chloroformu wynosiła 1,8 ml.
  7. Odrzuć frakcje interfazowe i organiczne.
  8. Dodać równą objętość 2-propanolu do frakcji wodnej i odwrócić probówkę 10 razy. Dodać do 1 μl wodnego roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/ml na 20 μl próbki, zwłaszcza jeśli oczekuje się, że wydajność będzie niska, ponieważ pobrano mniej niż 106 komórek.
    UWAGA: Spowoduje to powstanie gęstego, solidnego granulatu, który jest łatwy do monitorowania po kolejnych krokach wirowania.
  9. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  10. Wirować próbki w temperaturze 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że pod koniec tego wirowania RNA wytrąciło się, tworząc białą osadkę na dnie probówki.
  11. Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć białego osadu RNA.
    UWAGA: Luźna końcówka pipety trzymana w ręku może być użyta do usunięcia nadmiaru etanolu. Jeśli osad RNA zostanie zakłócony, ale nie wyrzucony, badacz może powtórzyć wirowanie i ponownie usunąć supernatant. Unikaj wyrzucania granulki, ponieważ będzie to wymagało od badacza powtórzenia całej procedury.
  12. Przygotuj roztwór składający się z 75% etanolu i 25% wody wolnej od nukleaz. Dodać 1 ml 75% etanolu na 1 ml odczynnika w roztworze izotiocyjanianu fenolu-guanidyny, aby przepłukać osad.
  13. Wirować próbki w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Po usunięciu większości supernatantu należy użyć pipety, aby usunąć jak najwięcej etanolu, jednocześnie uważając, aby nie naruszyć osadu.
    UWAGA: Na tym etapie pastylka RNA jest mniej zwarta i ma tendencję do poruszania się. Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z osadem w tym momencie, aby uniknąć utraty RNA.
  15. Wiruj próbki 12 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby osadzać nadmiar etanolu.
  16. Usuń cały nadmiar etanolu z probówki za pomocą mikropipety, uważając, aby nie naruszyć granulki.
  17. Pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
  18. Dodaj 50 μl wody wolnej od nukleaz do osadu RNA i ponownie zawieś osad w wodzie wolnej od nukleaz
    19. .
  19. Potraktuj próbki 1 μl DNazy (2 jednostki/μl) w celu usunięcia DNA, a następnie dezaktywuj DNazę i kationy (patrz tabela materiałów).
  20. Próbki RNA należy przechowywać w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 2,0 ml w temperaturze -80 °C.

4. Analiza obfitości transkrypcji

  1. Określić ilościowo RNA i sprawdzić RNA pod kątem czystości za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Stosunek absorbancji przy 260 nm do 280 nm powinien wynosić około 2,0 dla RNA.
  2. Analizuj RNA za pomocą 1% żelu agarozowego lub równoważnej technologii, aby zobrazować zakres degradacji.
    UWAGA: Dwa wyraźne prążki reprezentujące 18S i 28S rRNA powinny być wyraźnie widoczne (Rysunek 4). Jeśli te prążki nie są widoczne, RNA może ulec degradacji. Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów związanych z degradacją RNA znajdują się w Dyskusji.
  3. Monitoruj obfitość transkryptów w zebranych porcjach RNA w porównaniu z wzbogaconym wzorcem wewnętrznym za pomocą mikromacierzy15, RNA-Seq16, real-time qPCR17, lub Northern blots18.
    1. Określ liczebność dla każdego transkryptu w każdym punkcie czasowym w porównaniu z zaostrzoną kontrolą znanej obfitości.
      UWAGA: W przypadku mikromacierzy wartości będą intensywnościami fluorescencji. W przypadku plam północnych prążki na kliszy rentgenowskiej można określić ilościowo. W przypadku qPCR w czasie rzeczywistym obfitość transkryptu można określić przez porównanie ze znanymi standardami za pomocą metody 2-σσCT19. W przypadku RNA-Seq znormalizowane wartości można określić jako FPKM lub fragmenty na kilozasadę eksonu na milion zmapowanych odczytów. W przypadku szybkości rozpadu specyficznych dla izoformy, dane RNA-Seq mogą być analizowane przy użyciu metodologii uwzględniających izoformy, takich jak DEXSeq20. Szybkość rozpadu specyficznego dla izoformy najlepiej określić za pomocą RNA-Seq. Jeśli mają być one określone na podstawie danych z mikromacierzy, dane muszą być analizowane na podstawie poszczególnych sond, a nie genów po genach. Analityk musi zachować ostrożność przy interpretacji informacji z ograniczonej liczby sond. Na przykład może istnieć 5 lub mniej sond, które informują o określonej izoformie. W takim przypadku analityk będzie musiał określić, czy zachowanie tych sond jest wystarczająco spójne, aby wyniki były wiarygodne.
  4. Wykonaj qPCR w czasie rzeczywistym na wyizolowanym RNA17 w pobranych próbkach, aby przeanalizować szybko rozpadające się geny, takie jak c-Myc i wolno rozpadający się gen, taki jak GAPDH, aby uzyskać pewność, że tempo rozpadu transkryptu zostało dokładnie wykryte.
    UWAGA: Dla dalszego potwierdzenia, specyficzne dla izoformy sondy qPCR w czasie rzeczywistym mogą być opracowywane i używane do monitorowania obfitości określonych izoform w czasie21.

5. Wyznaczanie stałej szybkości zaniku

  1. Dla każdego punktu czasowego przekształć logarytmicznie wartości liczebności dla każdego transkryptu (specyficznego dla genu lub izoformy).
    UWAGA: Przekształcenie wartości logarytmicznych spowoduje przekształcenie krzywych rozkładu wykładniczego w linie, które można dopasować do modelu rozkładu liniowego22.
  2. Dopasuj profil ekspresji dla każdego transkryptu (specyficznego dla genu lub specyficznego dla izoformy) do modelu rozpadu liniowego. Wzór na taki model to f(t) = C - r*t. W tym równaniu C jest stałą reprezentującą początkową ilość transkryptu, r jest szybkością spadku, a t jest czasem od rozpoczęcia eksperymentu. Na podstawie tego równania określ szybkość zaniku jako r*ln(10) (patrz reference11).
    UWAGA: Pakiet oprogramowania maSigPro jest podejściem opartym na regresji, zaprojektowanym do wykrywania znaczących różnic w profilu ekspresji genów w danych o przebiegu czasu23. Przykładowy kod i wyniki dla maSigPro są dostępne pod adresem: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
  3. Odfiltruj geny, które nie pasują do logarytmiczno-liniowego modelu rozpadu. Można to osiągnąć za pomocą ANOVA F-test.
    UWAGA: Test F opiera się na statystyce F, która jest definiowana jako zmienność między średnimi próbek podzielona przez zmienność w obrębie próbek. Skoryguj wartości p dla wielokrotnych porównań, stosując liniową procedurę fałszywego wykrywania Benjaminiego i Hochberga24. Wartość q większa niż 0,05 z testem F może być użyta jako punkt odcięcia dla genów, które nie pasują do modelu rozpadu logarytmiczno-liniowego.
  4. Wykonaj test F ANOVA, aby określić transkrypty ze znaczącym terminem interakcji między kategorycznym warunkiem cyklu komórkowego a czasem (wskaźnik fałszywych odkryć, FDR <0,05).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej informowaliśmy o wynikach analiz mikromacierzy szybkości zaniku transkryptów w proliferujących i hamowanych kontaktowo pierwotnych ludzkich fibroblastach w ciągu 8-godzinnego kursu12. Wykaz genów o znaczącej zmianie stabilności transkryptu, porównujących fibroblasty proliferujące i hamowane kontaktowo, znajduje się w tabeli uzupełniającej 1. Podano intensywności fluorescencji w czasie zerowym i w czasie po zabiegu ActD. Geny zostały włącz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spoczynek może być wywołany przez sygnały zewnętrzne, w tym wycofanie mitogenów lub surowicy, brak adhezji komórek i zahamowanie kontaktu. Hamowanie kontaktowe, jedna z wielu możliwych metod wywoływania stanu spoczynku, jest wysoce ewolucyjnie konserwatywnym procesem, w którym komórki opuszczają proliferacyjny cykl komórkowy w odpowiedzi na kontakt międzykomórkowy. Skupiamy się tutaj na hamowaniu kontaktu jako przykładzie metody wywoływania spoczynku. Wcześniejsze badania wykazały, że kontakt komórka-komórka może wpływać...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HAC był stypendystą Fundacji Rity Allen (http://www.ritaallenfoundation.org) Miltona E. Cassela. Praca ta została sfinansowana z grantów dla HAC z National Institute of General Medical Sciences Center of Excellence grant P50 GM071508 (P.I. David Botstein), grant Fundacji PhRMA 2007RSGl9572, grant National Science Foundation OCI-1047879 dla Davida Augusta, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, National Institute of General Medical Sciences R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine & Stem Cell Research, Iris Cantor Women's Health Center/UCLA, CTSI, NIH Grant UL1TR000124 oraz Towarzystwo Chłoniaka Białaczkowego. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P50CA092131. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. HAC jest członkiem Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine & Stem Cell Research, Instytutu Biologii Molekularnej UCLA oraz UCLA Bioinformatics Interdepartmental Program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Wirówki do probówek do mikrowirówek o wydajności 12 000 x g i 4° C
Sprzęt do uruchamiania żeli agarozowych
Sterylne płytki do hodowli tkankowych i probówki
Zmodyfikowany Eagle MediumLife Technologiesfirmy Dulbecco 11965-118
Surowica bydlęcaVWR35-010-CV
Sterylne pipety serologiczne, pipety i końcówki do hodowli tkankowych
Indywidualnie pakowane, jednorazowe pipety, końcówki do pipet i probówki do izolacji i analizy
Jednorazowe rękawiczki do noszenia podczas pracy z odczynnikami i próbkami
RNaseZapInvitrogenAM9780Do odkażania powierzchni roboczych z
probówek
Trypsyna-EDTA  Roztwór 10XMillipore Sigma9002-07-07
Sterylny PBSLife Technologies14190-250
TrizolThermo Fisher Scientific15596018
Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mghamuje transkrypcję
Sterylny rozpuszczalnik DMSOFisher Scientific31-761-00MLdo aktynomycyny D
ChloroformThermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc
produkt IsopropanolFisher ScientificBP2618500klasa biologii molekularnej
EtanolFisher ScientificBP28184biologia molekularna klasy
bezrakowej Glikogen (20 mg/ml roztwór wodny)Nośnik Thermo Fisher ScientificR0551do wytrącania
RNAZestaw TURBO bez DNAThermo Fisher ScientificAM1907usuwa DNA za pomocą DNazy, a następnie, w kolejnym kroku, inaktywuje DNA i usuwa kationy dwuwartościowe
AgarozaThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc
produkt Barwnik do żelu RNAThermo Fisher ScientificR0641nadaje się nawet do denaturacji markerów
RNA Millenium do elektroforezyThermo Fisher ScientificAM7150Drabinka RNA
Jednokolorowy zestaw kolców RNAAgilent Technology5188-5282Przykładowa kontrola skoków do analizy mikromacierzy Agient
Podstawa TrisFisher ScientificBP152-1klasa biologii molekularnej, do buforu TAE
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificA38-500do buforu TAE
EDTAFisher NaukowyBP120-500, do żeli
Bromek etydynyMillipore SigmaE7637do biologii molekularnej
Konsorcjum Zewnętrznych Kontroli RNA Mieszanka Spike In ThermoFisher Scientific4456740Kontrola skoków dla RNA Seq
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 próbek, 12 indeksów)IlluminaRS-122-2101do sekwencjonowania RNA
96-dołkowa 0,3 ml płytka PCRThermo Fisher ScientificAB-0600do qPCR w czasie rzeczywistym
Uszczelki samoprzylepne Microseal BBio-RadMSB1001do qPCR w czasie rzeczywistym
Zbiorniki odczynników wolne od rnazy/dnazyVWR89094-662do qPCR w czasie rzeczywistym
Bez rnazy/Dnazy Osiem pasków probówek i nasadekThermo Fisher ScientificAM12230do qPCR
w czasie rzeczywistymSuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010dla qPCR w czasie rzeczywistym
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880do qPCR w czasie rzeczywistym
stożkoweRNARNA eppendorf RNaza 2,0 ml stopień elektroforezy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
  2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
  3. Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75(2005).
  4. Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
  5. Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
  6. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83(2006).
  7. Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
  8. Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
  9. Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121(2012).
  10. Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
  11. Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
  12. Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123(2017).
  13. Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
  14. Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
  15. Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  18. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
  19. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  20. Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
  21. Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
  22. Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
  23. Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
  24. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
  25. Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
  26. Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115(2009).
  27. Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
  28. Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
  29. Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
  30. Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719(2014).
  31. Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
  32. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  33. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
  34. Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Decay RatesProliferating FibroblastsQuiescent FibroblastsActinomycin D TreatmentRNA Isolation ProtocolReal Time qPCR AnalysisHuman Dermal FibroblastsGene Expression ChangesRNA Purity CheckPhenol Guanidine Extraction

Related Articles