Artykuł metodologiczny

Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56424

⸱

16 października 2017

 ,  , 
1Joint BioEnergy Institute, 2Environmental and Systems Biology, BioSciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Streszczenie

Polisacharydy w ścianach komórkowych roślin są niezwykle trudne do analizy, a większość metod wymaga drogiego sprzętu, wykwalifikowanych operatorów i dużych ilości oczyszczonego materiału. W tym miejscu opisujemy prostą metodę uzyskiwania szczegółowych informacji strukturalnych polisacharydów, w tym rozdzielczości izomerów strukturalnych. W przypadku analizy polisacharydowej za pomocą elektroforezy żelowej (PACE) materiał ściany komórkowej roślin jest hydrolizowany hydrolazami glikozylu specyficznymi dla polisacharydu będącego przedmiotem zainteresowania (np. mannanazami dla mannanu). Wielkoformatowe żele poliakryloamidowe są następnie używane do oddzielania uwolnionych oligosacharydów, które zostały znakowane fluorescencyjnie. Żele mogą być wizualizowane za pomocą zmodyfikowanego systemu obrazowania żeli (patrz Tabela materiałów). Otrzymany w ten sposób odcisk palca oligosacharydu można porównać jakościowo lub, w przypadku replikacji, ilościowo. Informacje o wiązaniach i rozgałęzieniach można ustalić za pomocą dodatkowych hydrolaz glikozylowych (np. mannozydaz i galaktozydaz). Chociaż protokół ten opisuje metodę analizy struktury glukomannanu, można go zastosować do dowolnego polisacharydu, dla którego istnieją scharakteryzowane hydrolazy glikozylowe. Alternatywnie można go wykorzystać do scharakteryzowania nowych hydrolaz glikozylu przy użyciu zdefiniowanych substratów polisacharydowych.

Wprowadzenie

Analiza polisacharydowa metodą elektroforezy żelowej (PACE) to metoda szczegółowej charakterystyki polisacharydów1,2,3. Polisacharydy ścian komórkowych roślin są niezwykle trudne do analizy, a większość metod wymaga drogiego sprzętu, wykwalifikowanych operatorów i dużych ilości oczyszczonego materiału. W tym miejscu opisujemy prostą metodę uzyskiwania szczegółowych informacji strukturalnych polisacharydów, w tym rozdzielczości izomerów strukturalnych.

Zrozumienie struktury polisacharydowej ściany komórkowej roślin jest niezbędne dla badaczy badających biosyntezę ściany komórkowej roślin lub rolę ściany komórkowej rośliny w rozwoju roślin. Ostatnio jednak skład ściany komórkowej roślin stał się interesujący dla szerszej grupy badaczy ze względu na skupienie się na wykorzystaniu biomasy roślinnej (zasadniczo ściany komórkowej) jako surowca do produkcji biopaliw i biochemikaliów4. Na przykład, skuteczna enzymatyczna scukrowywanie tego materiału wymaga szczegółowego zrozumienia struktur polisacharydowych, dzięki czemu można wybrać zoptymalizowane koktajle enzymatyczne5.

PACE ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami, co czyni go idealnym do szybkiej analizy złożonych struktur glikanów. Po pierwsze, nie wymaga oczyszczania omawianego polisacharydu, jak jest to wymagane w przypadku magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w stanie roztworu6. Po drugie, PACE może rozwiązywać izomery strukturalne, w przeciwieństwie do spektrometrii mas (MS, np. desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) i jonizacja elektronrozpylania (ESI)), które mogą być również trudne do przeprowadzenia za pomocą chromatografii cieczowej (LC)7. Po trzecie, PACE jest bardzo czuły, z niską rozdzielczością pikomoli, w przeciwieństwie do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub chromatografii bibułowej. Wreszcie, nie wymaga drogiego sprzętu ani specjalistycznej wiedzy, jak ma to miejsce w przypadku MS, NMR i LC.

Metoda PACE opiera się na specyficzności enzymów hydrolazy glikozylowej (GH), które celują w pewne wiązania glikozydowe w mieszaninie polisacharydów. Kiedy enzym GH działa na łańcuch polisacharydowy, ujawnia redukujący koniec, który można następnie derywatyzować chemicznie, w tym przypadku za pomocą znacznika fluorescencyjnego. Niezhydrolizowana część próbki staje się zatem niewykrywalna tą metodą. Znakowane oligosacharydy są następnie rozdzielane w wielkoformatowym żelu akrylowym za pomocą elektroforezy. Daje to doskonałą rozdzielczość bardzo podobnych cząsteczek, na przykład trisacharydy Glc-Man-Man i Glc-Man-Glc będą miały różne Rf.

PACE jest szeroko stosowany do charakteryzowania różnych struktur xylanu u różnych gatunków roślin8, do identyfikacji mutantów glikozylotransferazy u Arabidopsis6,9,10,11, do przeprowadzania testów glikozylotransferazy9, oraz do charakteryzowania nowych aktywności GH12, 13. Ostatnio użyliśmy go również do scharakteryzowania mannanu ściany komórkowej drożdży (Mahboubi i Mortimer, w przygotowaniu). Tutaj opisujemy metodę charakteryzowania struktury glukomannanu w ścianie komórkowej roślin, na podstawie poprzednich raportów11,14.

Protokół

1. Zbiór materiału roślinnego

  1. Zebrać świeży materiał roślinny (~20 mg) i natychmiast zanurzyć go w 96% (v/v) etanolu i inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut; to dezaktywuje wszelkie obecne enzymy rozkładające ścianę komórkową. W przypadku suchego materiału zacznij od kroku 2.
    UWAGA: Etanol jest łatwopalny.
    Uwaga: Pojedyncza łodyga lub liść rozety zapewni wystarczającą ilość materiału do analizy. Jednak mniej błędów powstaje, jeśli większa ilość tkanki jest łączona i analizowana, ponieważ jest to łatwiejsze do zważenia i obsługi
    2. .
  2. Dokładnie zapisuj typ tkanki i etap rozwoju, ponieważ struktura polisacharydów różni się w obu przypadkach. Na przykład w przypadku Arabidopsis thaliana (stosowanego tutaj) ugrupuj tkankę zgodnie z metodami Boyes i wsp.15
    Uwaga: W tym protokole użyliśmy dolnej połowy łodygi kwiatostanu, gdzie pierwsza krzemionka jest w pełni wydłużona, ale nie żółknie.

2. Przygotowanie pozostałości nierozpuszczalnej w alkoholu (AIR)

  1. Przygotować AIR, zgodnie z metodą Mortimera i wsp.9 lub inną podobną metodą, w celu wytworzenia proszku pozbawionego rozpuszczalnych cukrów, takich jak sacharoza i skrobia.

3. Porcjowanie i wstępna obróbka POWIETRZA

Uwaga: Dokładna ilość powietrza potrzebna do każdej próbki będzie zależała od (a) obfitości interesującego nas polisacharydu w materiale i (b) średniej wielkości oligosacharydów uwalnianych przez GH. Metoda dodaje pojedynczą cząsteczkę fluorescencyjną do redukującego końca każdego oligosacharydu, więc liczba oligosacharydów określa czułość eksperymentu. Jako wskazówkę, dla glukomannanu w łodydze Arabidopsis trawionej za pomocą GH5/GH26 (zgodnie z opisem) zaleca się 500 μg11, podczas gdy dla ksylanu w łodydze Arabidopsis trawionej GH11 zaleca się 100 μg, jak w badaniu Mortimera3.

  1. Zważyć powietrze (10 - 15 mg) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaćH2Odo końcowego stężenia 2 mg/ml. Vortex, aby uzyskać równomierne zawieszenie. Jeśli jest to problematyczne, użyj szklanego homogenizatora, aby wspomóc ten proces.
  2. Podaniec 500 μg do probówek do mikrofuge. Suszyć podwielokrotności za pomocą wirówki próżniowej (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 30 °C.
  3. Wstępną obróbkę POWIETRZA 1 M NaOH (20 μl) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; powoduje to deacetylację polisacharydów i pęcznienie mikrowłókien celulozy, zaburzając strukturę biomasy i umożliwiając dostęp GH.
    UWAGA: Ten krok można pominąć w przypadku oczyszczonych polisacharydów. UWAGA – mocny kwas/zasada.
    1. Dołączyć podwielokrotność dla nieenzymatycznej kontroli POWIETRZA (traktowanej tak samo jak wszystkie próbki, z wyjątkiem etapu 4.1, który jest wyłączony).
  4. Dodać 200 μlH2Oi 20 μL 1 M HCl w celu zneutralizowania. Sprawdź, czy pH wynosi ~6-7, usuwając 1 μl i umieszczając go na papierowych paskach wskaźnika pH.
  5. Dodać 50 μl 1 M buforu octanu amonu o pH 6,0 (lub innym pH odpowiednim dla GH użytych w badaniu) iH2O, aby uzyskać całkowitą objętość 500 μL.
    Uwaga: Octan amonu jest używany, ponieważ sublimuje po suszeniu, a więc nie dodaje dodatkowej soli do próbki. Nadmiar soli może prowadzić do słabego kształtu pasma i rozdzielczości żelu PACE.

4. Hydroliza powietrza za pomocą hydrolaz glikozylu (GHs)

Uwaga: Jak wspomniano w dyskusji, czystość GHs jest krytyczna. Używaj wyłącznie enzymów oczyszczonych z heterologicznie wyrażanych, oczyszczonych z powinowactwa. Po otrzymaniu każdej partii od producenta, hydrolizować określone porcje substratu (np. 500 μg POWIETRZA) z rosnącą ilością GH przez noc (np. 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 μL) (3 jednostki/μL). Gdy występuje nadmiar GH, odcisk palca PACE będzie wyglądał identycznie. Nadmiar enzymu jest niezbędny do uzyskania powtarzalnego wyniku, ponieważ musi być pewien, że reakcja hydrolizy zbliża się do punktu końcowego.

  1. Dodać z góry określoną ilość (patrz wyżej) mannanaz (GH5 i GH2611) do podwielokrotności AIR w buforze z kroku 3.5, a także kontrolę dodatnią (30 μg glukomannanu konjac) i kontrolę ujemną bez AIR (mieszanina enzymów w pustej probówce). Wirować, a następnie krótko obracać, aby zebrać mieszaninę reakcyjną na dnie probówki.
  2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (lub w temperaturze odpowiedniej dla wybranego GH) z delikatnym mieszaniem (~100 obr./min).
  3. Zatrzymać reakcję przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 20 min.
    Uwaga: Zamknięcia nasadkowe mogą być używane do uszczelniania probówek do mikrofuge typu flip-top.
    1. Odwirować za pomocą laboratoryjnego mikrofugu z maksymalną prędkością przez 10 minut i zachować supernatant.
  4. Zawiesić osad w 250 μlH2O, odwirować jak wyżej i zachować supernatant.
  5. Połączyć oba supernatanty i wysuszyć w wirówce próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C (~3 godziny lub przez noc bez ogrzewania).

5. Przygotowanie wzorców oligosacharydów

  1. Przygotować 1 mM roztwory podstawowe w H2O mannozy (Człowiek), mannobiozy (Człowiek2), mannotriozy (Człowiek3), mannotetraozy (Człowiek4), mannopentaozy (Człowiek5) i mannoheksaozy (Człowiek6), wszystkie β,1-4 połączone. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
  2. Przygotuj 3 różne stężenia mieszaniny Man1-6, łącząc 1 μl (Standard S1), 2 μl (S2) lub 5 μl (S3) ze wszystkich sześciu.
  3. Suszyć w wirówce próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C (~1 h).

6. Pochodna oligosacharydów

  1. Przygotować roztwór podstawowy 0,2 M ANTS (kwas 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy) wH2O:kwasie octowym 17:3. Podgrzej bulion do 60 °C, aby całkowicie rozpuścić ciało stałe. Przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem, przez 2 - 3 miesiące.
  2. Przygotować 0,2 M roztwór podstawowy boranu 2-pikolinowego (2-PB) w DMSO. Jest to niezwykle higroskopijne, więc natychmiast po otrzymaniu proszku w DMSO należy ponownie zawiesić. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 - 2 lata. Rozmrozić porcje w zależności od potrzeb (przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie, a następnie wyrzucić).
  3. Przygotować bufor do derywatyzacjiH2O: kwasu octowego: DMSO o godzinie 17:3:20.
  4. Do każdej próbki dodać 5 μl ANTS, 5 μl 2-PB i 10 μL buforu do derywatyzacji. Krótko zakręć, aby zebrać się na dnie tuby, dokładnie wymieszaj, a następnie ponownie krótko zakręć. Zobacz Rysunek 1 dla opisu reakcji.
  5. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
  6. Suszyć w wirówce próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C (~2 h).
  7. Zawiesić próbki i wzorcować w 100 μl 3 M mocznika. Przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem do czasu, gdy będzie to konieczne.

7. Przygotowanie żeli PACE

Uwaga: Montaż sprzętu do odlewania żelu zależy od marki. W tym przypadku stosujemy pionowy system elektroforezy (patrz Tabela Materiałów), wyposażony w płytki szklane o wymiarach 18 cm x 24 cm i przekładki 1,5 mm.

  1. Zmontuj sprzęt do odlewania żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przygotować 10x bufor PACE (1M Tris-Boran, pH 8,2) w następujący sposób: dodać 121,14 g Tris-Base do ~400 ml H2O i wymieszać do rozpuszczenia. Doprowadzić pH do 8,2 przez dodanie stałego kwasu borowego (około 60 g), a następnie uzupełnić objętość do 1 l.
  3. Przygotować 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS) w H2O. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności rozmrozić raz, przechowywać w temperaturze 4 °C i wyrzucić po 2 tygodniach.
  4. Przygotuj i wlej żel rozdzielczy. W przypadku powyższego sprzętu 1 żel odpowiada 50 ml. W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wymieszajH2O(20,2 ml), 5 ml 10x buforu PACE, 24,6 ml 40% akrylamidu/bis-akrylamidu (29:1 akrylamid:Bis). (Uwaga: toksyczny).
    1. Dodać 200 μl APS i 20 μl N,N,N,N'-tetrametylo-etylenodiaminy (TEMED). Delikatnie odwróć, aby wymieszać (aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza). Wlać żel za pomocą pipety serologicznej lub innej pipety o dużej objętości do ~4 cm poniżej górnej części szklanych płytek. Zwróć uwagę na możliwość uwięzienia pęcherzyków powietrza w żelu. Jeśli tak się stanie, przestań nalewać i przechyl/postukaj w żel, aby je uwolnić.
  5. Pokryj żel izopropanolem (Uwaga: łatwopalny) lub ostrożnie H2O. Pozostaw żel do polimeryzacji (20 - 30 minut), a następnie odlej wierzchnią warstwę. Jeśli użyto izopropanolu, przemyć 2x H2O. Osuszyć nadmiar płynu bibułą.
  6. Przygotuj i wlej żel do układania w stosy. Wymieszaj 6,8 ml H2O, 1 ml 10 x bufor PACE, 2,8 ml akrylamidu/bis-akrylamidu (Uwaga: toksyczny), 80 μl APS i 8 μl TEMED w 15 ml probówce wirówkowej. Odwróć, aby wymieszać i nałożyć na spolimeryzowany żel rozdzielczy. Delikatnie włóż grzebienie, unikając zatrzymywania pęcherzyków powietrza pod zębami grzebienia.
  7. Pozostawić żel do polimeryzacji (20-30 min), zawinąć w wilgotną chusteczkę, a następnie w folię spożywczą i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie to potrzebne. Przechowywać z grzebieniami na miejscu.
    Uwaga: Żele PACE można przechowywać maksymalnie 2 tygodnie (chociaż najlepiej krócej niż 1 tydzień), jeśli są wilgotne.

8. Uruchamianie żelu PACE

  1. Użyj trwałego markera, aby oznaczyć pozycje studni na szkle, co pomoże w śledzeniu kolejności załadunku i określeniu, gdzie znajdują się studzienki po wyjęciu grzebienia.
  2. Wyjmij grzebień. Napełnij studnie 1x buforem PACE.
  3. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl załadować 2 μl wzorców i próbek do studzienek. Należy unikać korzystania z najbardziej zewnętrznych pasów, które mają tendencję do słabego prowadzenia próbek.
  4. Zmontować górną komorę aparatu do pracy z żelem i umieścić żel w schłodzonym (~10 °C) zbiorniku roboczym (10 °C) zawierającym 1x bufor PACE. Napełnij górną komorę 1x buforem PACE.
  5. Włącz zasilanie i uruchom żel pod napięciem 200 V (stałe V) przez 30 minut, a następnie zwiększ napięcie do 1000 V na 1 h 40 min. Chroń żele przed światłem (np. owijając zbiorniki w czarne worki na śmieci).
    Uwaga: Sprawdź na żelach ~5 min po włączeniu napięcia, a następnie kolejne 5 min po zwiększeniu napięcia do 1 000 V. Jeśli zasilacz nie jest w stanie utrzymać napięcia, prawdopodobnie występuje wyciek bufora. Usuń żel ze zbiornika. Zamontuj górną komorę, dokładnie sprawdzając rozmieszczenie wszystkich uszczelek. Duży odprysk na górnej krawędzi szklanej płyty może uniemożliwić dobre uszczelnienie płyty z uszczelką. Problem ten można zwykle tymczasowo rozwiązać, dodając kroplę 5 % (m/v) stopionej agarozy do rozdrobnionej części szkła, przed dodaniem górnej komory.

9. Wizualizacja żelu PACE

Uwaga: Użyj żelowego systemu obrazowania wyposażonego w długofalowe żarówki UV w transiluminatorze i filtr emisyjny dla kamery, który jest odpowiedni dla fluoroforu, tutaj 530 nm. Alternatywnie można również użyć skanera laserowego, zgodnie z opisem w Goubet2.

  1. Upewnij się, że system obrazowania żelu jest wolny od kurzu, przecierając go wilgotną, niestrzępiącą się chusteczką.
  2. Wyjmij żel ze zbiornika PACE i view krótko, gdy żel jest jeszcze w szklanych płytkach (<80 ms), aby ustalić, czy czoło barwnika nadal znajduje się na żelu.
  3. Otwórz żel za pomocą narzędzia klinowego i gdy żel nadal znajduje się na jednej szklanej płytce, użyj noża do pizzy, aby usunąć zarówno żel do układania, jak i, jeśli przód barwnika nadal znajduje się na żelu, spód żelu.
  4. Umieść ~5 ml H2O na powierzchni transiluminatora, a następnie przenieś żel bezpośrednio na transiluminator. Ustaw filtr na UV 605 i włącz długofalowy transilluminator UV (patrz Tabela materiałów) za pomocą oprogramowania.
    Uwaga: Zastosowany tutaj fluorofor ANTS ma wzbudzenie/emisję 353/520 nm.
  5. Wykonaj kilka zdjęć w różnych czasach naświetlania (np. od 100 ms do 10 s). Upewnij się, że światło UV jest wyłączone między obrazami, klikając przycisk światła UV (aby je wyłączyć), aby uniknąć degradacji fluorescencji. Upewnij się, że co najmniej 2 obrazy nie mają nasyconych pasm (wskaże to oprogramowanie do obrazowania żelowego).
  6. Zapisz pliki jako high-resolution.tif images.
    Uwaga: Obrazy można analizować za pomocą oprogramowania dostarczonego z systemem obrazowania żelowego lub za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Zapoznaj się z sekcją Wyniki, aby zapoznać się z omówieniem oceny ilościowej.

Wyniki

Poniżej przedstawiamy przykład elektroforezy w żelu PACE wykonanej zgodnie z protokołem, wraz z opisami ułatwiającymi interpretację danych i rozwiązywanie problemów, a następnie ogólny przewodnik po prawidłowej interpretacji żelu PACE13,16. Reprezentatywny żel ze standardowego testu PACE określającego zawartość mannanu w ścianie komórkowej został przedstawiony na Rysunku 2 i jest opisany analiza po analizie.

Standardy
Ścieżki 1, 2 i 3 przedstawiają drabinę komercyjnie zakupionych oligosacharydów (Man1- Man6) o stężeniach 5 (S1), 10 (S2) i 50 (S3) pmol. Po otrzymaniu nowej partii komercyjnego oligosacharydu ważne jest sprawdzenie jego czystości na żelu. Wiele oligosacharydów, szczególnie tetrasacharydy i dłuższe, może posiadać znaczne zanieczyszczenia oligosacharydami o innych stopniach polimeryzacji (DP), co pokazano tutaj dla Man6 (oznaczonego gwiazdką *). Podczas ilościowej analizy żelu ważne jest zastosowanie co najmniej 3 stężeń standardów, ponieważ jest to niezbędne do wyznaczenia krzywej wzorcowej. Obliczenie krzywej wzorcowej może być również pomocne w upewnieniu się, że reakcja pochodnowania w zasadzie dobiegła końca. Standardy o znanych stężeniach umożliwiają porównania między żelami i stanowią użyteczną kontrolę jakości rozdziału oraz jakości pochodnowania.

Kontrola pozytywna
Ścieżka 4 przedstawia trawienie glucomannanu konjakowego przez mannanazę. Glucomannan konjakowy jest dostępny w sprzedaży i choć nie posiada takiej samej struktury jak np. ten występujący w Arabidopsis, służy on dwóm celom. Po pierwsze, stanowi istotną kontrolę trawienia enzymatycznego. Badacz powinien ustalić, jak wygląda komercyjny substrat strawiony całkowicie przy użyciu wybranych enzymów GH (t.j., do reakcji dodano znaczny nadmiar GH). Jeśli w przyszłych eksperymentach wzorzec ulegnie zmianie, może to wskazywać na utratę aktywności lub zanieczyszczenie zapasu GH. Po drugie, służy jako kontrola reakcji pochodnej w obecności enzymu i soli buforowych. Jeśli standardy wyglądają prawidłowo, ale kontrola pozytywna jest słaba, może to oznaczać, że jakiś składnik reakcji hydrolizy hamuje proces pochodnienia.

Koktajl AIR + mannanaza (GH5 + GH26) dla łodygi Arabidopsis typu dzikiego (WT)
Ścieżka 5 przedstawia odcisk palca PACE łodygi Arabidopsis WT (porównaj z referencjami11,14).

csla9 Koktajl z mannanazy i AIR z łodygi Arabidopsis (GH5 + GH26)
Ścieżka 6 przedstawia odcisk palca PACE łodygi rośliny Arabidopsis pozbawionej głównej syntazy mannanu łodygi11. Porównaj z odciskami palców WT i kontrolą negatywną. Chociaż w tej roślinie brakuje większości mannanu, niewielka jego ilość pozostaje, co potwierdzają zmniejszone intensywności prążków dla wszystkich oligosacharydów pochodzących z mannanazy. Jest on syntetyzowany przez dodatkowe syntazy mannanu (CSLA2, 3)11.

Kontrola negatywna – sam enzym
Ścieżka 8 wykazuje na żelu nieswoiste prążki pochodzące z zanieczyszczeń w koktajlu mannanazy, które należy wykluczyć z analizy (oznaczone symbolem *).

Kontrola negatywna - samo WT AIR
Ścieżka 9 wykazuje na żelu prążki nieswoiste, które powinny zostać wykluczone z analizy (oznaczone symbolem *).

Kontrola negatywna - csla9 tylko AIR
Ścieżka 10 wykazuje na żelu prążki nieswoiste, które powinny zostać wykluczone z analizy (oznaczone *).

Koktajl AIR z drewna sosny + mannanaza (GH5 + GH26)
Ścieżka 7 przedstawia odcisk palca PACE drewna sosny, które zawiera galakto glukomannan. Wykazuje on wyraźnie inny wzór uwalnianych oligosacharydów niż Arabidopsis, co wynika z odmiennej struktury.

Kontrola negatywna - samo powietrze sosnowe (Pine AIR)
Ścieżka 11 wykazuje na żelu prążki nieswoiste, które powinny zostać wykluczone z analizy (oznaczone symbolem *).

Interpretacja żelu PACE jest stosunkowo prosta, ale wymaga uwzględnienia następujących kwestii. Aby uzyskać wiarygodne dane, zaleca się przeprowadzenie analizy PACE na co najmniej 3 niezależnie hodowanych powtórzeniach biologicznych, a dla każdego powtórzenia biologicznego zaleca się wykonanie co najmniej 2 powtórzeń technicznych. Opisane kontrole są kluczowe dla interpretacji, ponieważ należy wykluczyć prążki nieswoiste. Zalecamy również nakładanie próbek w różnej kolejności na żelach powtórzonych, aby wyeliminować efekty wynikające z nierównomiernego oświetlenia transiluminatorem. Prawidłowa interpretacja wymaga analizy prążków, które nie są nasycone. Ponieważ niektóre profile oligosacharydowe mogą zawierać polisacharydy o bardzo wysokiej i niskiej zawartości, zaleca się analizę wielu ekspozycji tego samego żelu. Standardy mogą być wykorzystane do normalizacji pomiędzy różnymi obrazami.

W przypadku niektórych rodzajów doświadczeń może być pożądane ilościowe oznaczenie zawartości polisacharydów w preparacie AIR. Chociaż jest możliwe przeprowadzenie kwantyfikacji na podstawie żelu PACE, wymaga to znajomości dokładnej tożsamości molekularnej każdego oligosacharydu uwalnianego przez glikozydohydrolazy (GH) oraz jego położenia na żelu PACE. W przypadku mannanu nie jest to obecnie w pełni znane, lecz ustalono to dla innych polisacharydów, np. ksylanu3. Standardy zapewniają możliwość normalizacji między żelami, nawet gdy nie przeprowadza się ilościowego oznaczenia, i w związku z tym pomogą w każdej analizie jakościowej lub półilościowej.

Identyfikację struktury poszczególnych oligosacharydów można przeprowadzić przy użyciu koktajli GH. Sekwencyjne dodawanie kolejnych GH może ujawnić szczegóły dotyczące wiązań i podstawień uwolnionych oligosacharydów (np. dodanie β-1,4-glukozydazy działającej na koniec nieredukujący pozwoli ustalić, które oligosacharydy w mieszaninie posiadają tę cechę). Dostępne enzymy obejmują galaktozydazy, glukuronidazy i glukozydazy (dodatkowe informacje znajdują się w bazie danych CAZy16); jako przykład można przywołać pracę Hogg, D. et al.17.

Powyższy protokół można wykorzystać do charakterystyki aktywności nieznanych GH. W takim przypadku do przesiewania nieznanych GH należy użyć określonej biomasy, takiej jak łodyga Arabidopsis lub glukomannan konjac13.

Schemat reakcji chemicznej ilustrujący proces aminowania; obejmuje struktury z NH2-ANTS i 2-PB.
Rycina 1: Przedstawiono schemat fluorescencyjnej derywatyzacji oligosacharydów za pomocą ANTS. Zmodyfikowano na podstawie pracy Goubet2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat żelu po reakcji łańcuchowej polimerazy; prążki oligosacharydów; porównanie ścieżek; analiza csla9.
Rysunek 2: Reprezentatywny żel PACE pokazujący odcisk palca mannanu z Arabidopsis, sosny oraz mutanta Arabidopsis (csla9) z zaburzoną biosyntezą mannanu. AlR poddano hydrolizie koktajlem mannanaz, a uwolnione oligosacharydy zderywowano fluorophorem. Oligosacharydy rozdzielono za pomocą elektroforezy żelowej na podstawie wielkości, kształtu i ładunku. W celu ułatwienia identyfikacji względnych mobilności uwolnionych oligosacharydów przedstawiono drabinę manno-oligosacharydów (Man1-6), a jako kontrolę pozytywną pokazano hydrolizę oczyszczonego mannanu (pochodzącego z konjac). * = prążki niespecyficzne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

PACE to prosta metoda charakteryzowania struktury polisacharydowej. Może być stosowany do dowolnego polisacharydu, dla którego znane są GH o scharakteryzowanej aktywności, patrz liczne przykłady w literaturze 1,6,9,11. Tt został również zastosowany do charakterystyki nowych GHs 12,13,18 i glikozylotransferaz 9, wykorzystując zdefiniowane substraty polisacharydowe i akceptory.

Powtarzalne, możliwe do zinterpretowania wyniki zależą od trzech kluczowych kroków. Po pierwsze, stosowane GH powinny być wolne od działań zanieczyszczających. Najlepiej osiągnąć to poprzez stosowanie wyłącznie enzymów o ekspresji heterologicznej, oczyszczonych z powinowactwa. Po drugie, w przypadku większości eksperymentów ważne jest, aby hydroliza enzymatyczna substratów była na zakończeniu. Zapewni to, że ta sama biomasa zhydrolizowana tym samym GH da ten sam odcisk palca w każdym eksperymencie. Wreszcie w reakcji derywatyzacji powinien być nadmiar fluoroforu. Gwarantuje to, że dostępne końcówki redukcyjne są oznaczone na poziomie bliskim 100%. Spowoduje to wysoką odtwarzalność wyników, a także danych, które mają charakter ilościowy.

Jakość żelu i odczynnika ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia powtarzalnych danych. Złej jakości, zwłaszcza o nieprawidłowym pH, pęcherzyki powietrza w żelu i próbki z nadmiarem soli mogą wpływać na rozdzielczość i współczynnik retencji oligosacharydów. Jednak uwzględnienie zalecanych kontrolek opisanych w sekcji Protokół i wyniki umożliwi rozwiązywanie problemów.

PACE jest ograniczone ze względu na jego zdolność do identyfikacji oligosacharydów. W przypadku niektórych eksperymentów wystarczy prosty odcisk palca. Jednak, aby naprawdę określić ilościowo ilość glukomannanu w próbce AIR, na przykład, wymagana jest tożsamość wszystkich uwolnionych oligosacharydów, co jest czasochłonnym procesem. Jest to prostsze w przypadku mniej złożonych polisacharydów, takich jak ksylan3. Ze względu na to, że na rynku dostępnych jest niewiele wzorców oligosacharydowych, nie zawsze jest możliwe lub pożądane zidentyfikowanie wszystkich prążków. W tym przypadku PACE może dostarczyć bardzo komplementarnych danych do spektrometrii mas (tj. MALDI-CID9 lub ESI-MS7 i NMR6). W przypadku tych metod często pomocne jest wykonanie preparatu na dużą skalę, oddzielonego chromatografią wykluczania wielkości, a następnie analiza każdej frakcji zarówno za pomocą PACE, jak i przed MS lub NMR. Chociaż donoszono, że prążki mogą być wycinane i identyfikowane za pomocą MALDI-CID, w praktyce stwierdziliśmy, że ma to niski wskaźnik sukcesu (prawdopodobnie z powodu interakcji znakowanych oligosacharydów z żelem akryloamidowym pod wpływem światła UV).

Innym poważnym ograniczeniem PACE jest przepustowość. Aby uzyskać dobrej jakości, interpretowalne żele z odpowiednimi kontrolami, każdy żel będzie miał tylko ~10 próbek eksperymentalnych, a badacz może spodziewać się uruchomienia ~4 żeli PACE dziennie. Ostatnio opracowano wersję PACE wykorzystującą elektroforezę kapilarną (CE)19, która umożliwia przygotowanie próbek w płytkach 96-dołkowych. Jest z powodzeniem stosowany do charakteryzowania aktywności enzymów glikozylotransferazy i struktur polisacharydowych 6,19, chociaż wymaga dostępu do maszyny CE, która może być kosztowna w zakupie i utrzymaniu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Metoda PACE została opracowana i zoptymalizowana przez różnych członków grupy Dupree (University of Cambridge, Wielka Brytania) na przestrzeni lat i doceniamy ich wkład. Prace te zostały sfinansowane w ramach DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) wspieranego przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych, na podstawie umowy DE-AC02-05CH11231 między Lawrence Berkeley National Laboratory a Departamentem Energii USA. Dziękujemy również Thea Pick i Vy Ngo za pomoc w przygotowaniu próbek csla9.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oligosacharydy Standardy
MannoseSigma-AldrichCAS 3458-28-4
MannobioseMegazymeCAS: 14417-51-7
MannotriozaMegazymeCAS: 28173-52-6
MannotetraozaMegazymeCAS: 51327-76-5
MannopentaoseMegazymeCAS: 70281-35-5
MannhexaoseMegazyme CAS: 70281-36-6
Glukomannan (Konjac; Niska lepkość)MegazymeP-GLCML
Nazwa<silny>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Inne specjalistyczne chemikalia
8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy kwassondy molekularne) ThermoA350
2-pikolinoboranTCIB3018
40 % akrylamid/bis-akryloamid (29:1 akrylamid:Bis)Bio-rad1610146
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Specjalistyczne wyposażenie
Zestaw do odlewania żeluZestaw HoeferSE660płytki szklane 18x24 cm, przekładki 0,75 mm
Chłodząca kąpiel wodna recyrkulacyjna HoeferRCB20-plus 115vMusi być w stanie utrzymać temperaturę na poziomie ~10 C
G:Box Chemi XRQ System obrazowaniaSyngene05-GBOX-CHEMI-XRQZamów z filtrami odpowiednimi do fluorforu, a transiluminator powinien być wyposażony w długofalowe żarówki UV
Zasilacz wysokonapięciowyThermoEC1000XL1000V 
Wirówka próżniowa(Speedvac)SavantSPD131
Pionowy system elektroforezy żelowejHoeferSE660
Hydrolazy glikozylowe
Można je uzyskać od firm np. Megazyme (https://www.megazyme.com/) lub Prozomix (http://www.prozomix.com/) lub można je wyrazić we własnym zakresie, żądając plazmidu z odpowiednich badań grupa.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały laboratoryjne
15 ml Probówka wirówkowa ( Probówki wirówkowe Falcon, polipropylen, sterylne, Corning)VWR21008-918
Probówka wirówkowa 50 ml ( Probówki do wirówek Falcon, polipropylen, sterylne, Corning)VWR21008-951
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
Gel oprogramowanie do obrazowania ( Genesys)Syngene
(

Bibliografia

  1. Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224 (1), 163-174 (2006).
  2. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).
  3. Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
  4. Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).
  5. Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).
  6. Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).
  7. Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).
  8. Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).
  9. Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).
  10. Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).
  11. Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).
  12. Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).
  13. Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481(2015).
  14. Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218 (1), 27-36 (2003).
  15. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).
  16. The Carbohydrate Active Enzyme Database. , www.cazy.org (2017).
  17. Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
  18. Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).
  19. Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Polisacharydy mannanoweciana kom rkowa ro linanaliza PACEglikozylohydrolazyrozdzia oligosacharyd wznakowanie fluorescencyjneelektroforeza w elu poliakrylamidowymtrawienie enzymatycznerozdzielanie izomer w strukturalnychtraktowanie mannanaz
Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.