Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Summary

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Abstract

Polisacharydy w ścianach komórkowych roślin są niezwykle trudne do analizy, a większość metod wymaga drogiego sprzętu, wykwalifikowanych operatorów i dużych ilości oczyszczonego materiału. W tym miejscu opisujemy prostą metodę uzyskiwania szczegółowych informacji strukturalnych polisacharydów, w tym rozdzielczości izomerów strukturalnych. W przypadku analizy polisacharydowej za pomocą elektroforezy żelowej (PACE) materiał ściany komórkowej roślin jest hydrolizowany hydrolazami glikozylu specyficznymi dla polisacharydu będącego przedmiotem zainteresowania (np. mannanazami dla mannanu). Wielkoformatowe żele poliakryloamidowe są następnie używane do oddzielania uwolnionych oligosacharydów, które zostały znakowane fluorescencyjnie. Żele mogą być wizualizowane za pomocą zmodyfikowanego systemu obrazowania żeli (patrz Tabela materiałów). Otrzymany w ten sposób odcisk palca oligosacharydu można porównać jakościowo lub, w przypadku replikacji, ilościowo. Informacje o wiązaniach i rozgałęzieniach można ustalić za pomocą dodatkowych hydrolaz glikozylowych (np. mannozydaz i galaktozydaz). Chociaż protokół ten opisuje metodę analizy struktury glukomannanu, można go zastosować do dowolnego polisacharydu, dla którego istnieją scharakteryzowane hydrolazy glikozylowe. Alternatywnie można go wykorzystać do scharakteryzowania nowych hydrolaz glikozylu przy użyciu zdefiniowanych substratów polisacharydowych.

Introduction

Analiza polisacharydowa metodą elektroforezy żelowej (PACE) to metoda szczegółowej charakterystyki polisacharydów^1,2,3. Polisacharydy ścian komórkowych roślin są niezwykle trudne do analizy, a większość metod wymaga drogiego sprzętu, wykwalifikowanych operatorów i dużych ilości oczyszczonego materiału. W tym miejscu opisujemy prostą metodę uzyskiwania szczegółowych informacji strukturalnych polisacharydów, w tym rozdzielczości izomerów strukturalnych.

Zrozumienie struktury polisacharydowej ściany komórkowej roślin jest niezbędne dla badaczy badających biosyntezę ściany komórkowej roślin lub rolę ściany komórkowej rośliny w rozwoju roślin. Ostatnio jednak skład ściany komórkowej roślin stał się interesujący dla szerszej grupy badaczy ze względu na skupienie się na wykorzystaniu biomasy roślinnej (zasadniczo ściany komórkowej) jako surowca do produkcji biopaliw i biochemikaliów⁴. Na przykład, skuteczna enzymatyczna scukrowywanie tego materiału wymaga szczegółowego zrozumienia struktur polisacharydowych, dzięki czemu można wybrać zoptymalizowane koktajle enzymatyczne⁵.

PACE ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami, co czyni go idealnym do szybkiej analizy złożonych struktur glikanów. Po pierwsze, nie wymaga oczyszczania omawianego polisacharydu, jak jest to wymagane w przypadku magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w stanie roztworu⁶. Po drugie, PACE może rozwiązywać izomery strukturalne, w przeciwieństwie do spektrometrii mas (MS, np. desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) i jonizacja elektronrozpylania (ESI)), które mogą być również trudne do przeprowadzenia za pomocą chromatografii cieczowej (LC)⁷. Po trzecie, PACE jest bardzo czuły, z niską rozdzielczością pikomoli, w przeciwieństwie do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub chromatografii bibułowej. Wreszcie, nie wymaga drogiego sprzętu ani specjalistycznej wiedzy, jak ma to miejsce w przypadku MS, NMR i LC.

Metoda PACE opiera się na specyficzności enzymów hydrolazy glikozylowej (GH), które celują w pewne wiązania glikozydowe w mieszaninie polisacharydów. Kiedy enzym GH działa na łańcuch polisacharydowy, ujawnia redukujący koniec, który można następnie derywatyzować chemicznie, w tym przypadku za pomocą znacznika fluorescencyjnego. Niezhydrolizowana część próbki staje się zatem niewykrywalna tą metodą. Znakowane oligosacharydy są następnie rozdzielane w wielkoformatowym żelu akrylowym za pomocą elektroforezy. Daje to doskonałą rozdzielczość bardzo podobnych cząsteczek, na przykład trisacharydy Glc-Man-Man i Glc-Man-Glc będą miały różne R_f.

PACE jest szeroko stosowany do charakteryzowania różnych struktur xylanu u różnych gatunków roślin⁸, do identyfikacji mutantów glikozylotransferazy u Arabidopsis6^,9,10,11, do przeprowadzania testów glikozylotransferazy⁹, oraz do charakteryzowania nowych aktywności GH^{12, 13}. Ostatnio użyliśmy go również do scharakteryzowania mannanu ściany komórkowej drożdży (Mahboubi i Mortimer, w przygotowaniu). Tutaj opisujemy metodę charakteryzowania struktury glukomannanu w ścianie komórkowej roślin, na podstawie poprzednich raportów^11,14.

Protocol

1. Zbiór materiału roślinnego

1. Zebrać świeży materiał roślinny (~20 mg) i natychmiast zanurzyć go w 96% (v/v) etanolu i inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut; to dezaktywuje wszelkie obecne enzymy rozkładające ścianę komórkową. W przypadku suchego materiału zacznij od kroku 2.
   UWAGA: Etanol jest łatwopalny.
   Uwaga: Pojedyncza łodyga lub liść rozety zapewni wystarczającą ilość materiału do analizy. Jednak mniej błędów powstaje, jeśli większa ilość tkanki jest łączona i analizowana, ponieważ jest to łatwiejsze do zważenia i obsługi
.
2. Dokładnie zapisuj typ tkanki i etap rozwoju, ponieważ struktura polisacharydów różni się w obu przypadkach. Na przykład w przypadku Arabidopsis thaliana (stosowanego tutaj) ugrupuj tkankę zgodnie z metodami Boyes i wsp.¹⁵
   Uwaga: W tym protokole użyliśmy dolnej połowy łodygi kwiatostanu, gdzie pierwsza krzemionka jest w pełni wydłużona, ale nie żółknie.

2. Przygotowanie pozostałości nierozpuszczalnej w alkoholu (AIR)

1. Przygotować AIR, zgodnie z metodą Mortimera i wsp.⁹ lub inną podobną metodą, w celu wytworzenia proszku pozbawionego rozpuszczalnych cukrów, takich jak sacharoza i skrobia.

3. Porcjowanie i wstępna obróbka POWIETRZA

Uwaga: Dokładna ilość powietrza potrzebna do każdej próbki będzie zależała od (a) obfitości interesującego nas polisacharydu w materiale i (b) średniej wielkości oligosacharydów uwalnianych przez GH. Metoda dodaje pojedynczą cząsteczkę fluorescencyjną do redukującego końca każdego oligosacharydu, więc liczba oligosacharydów określa czułość eksperymentu. Jako wskazówkę, dla glukomannanu w łodydze Arabidopsis trawionej za pomocą GH5/GH26 (zgodnie z opisem) zaleca się 500 μg¹¹, podczas gdy dla ksylanu w łodydze Arabidopsis trawionej GH11 zaleca się 100 μg, jak w badaniu Mortimera³.

1. Zważyć powietrze (10 - 15 mg) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać_H2Odo końcowego stężenia 2 mg/ml. Vortex, aby uzyskać równomierne zawieszenie. Jeśli jest to problematyczne, użyj szklanego homogenizatora, aby wspomóc ten proces.
2. Podaniec 500 μg do probówek do mikrofuge. Suszyć podwielokrotności za pomocą wirówki próżniowej (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 30 °C.
3. Wstępną obróbkę POWIETRZA 1 M NaOH (20 μl) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; powoduje to deacetylację polisacharydów i pęcznienie mikrowłókien celulozy, zaburzając strukturę biomasy i umożliwiając dostęp GH.
   UWAGA: Ten krok można pominąć w przypadku oczyszczonych polisacharydów. UWAGA – mocny kwas/zasada.
   1. Dołączyć podwielokrotność dla nieenzymatycznej kontroli POWIETRZA (traktowanej tak samo jak wszystkie próbki, z wyjątkiem etapu 4.1, który jest wyłączony).
4. Dodać 200 μl_H2Oi 20 μL 1 M HCl w celu zneutralizowania. Sprawdź, czy pH wynosi ~6-7, usuwając 1 μl i umieszczając go na papierowych paskach wskaźnika pH.
5. Dodać 50 μl 1 M buforu octanu amonu o pH 6,0 (lub innym pH odpowiednim dla GH użytych w badaniu) i_H2O, aby uzyskać całkowitą objętość 500 μL.
   Uwaga: Octan amonu jest używany, ponieważ sublimuje po suszeniu, a więc nie dodaje dodatkowej soli do próbki. Nadmiar soli może prowadzić do słabego kształtu pasma i rozdzielczości żelu PACE.

4. Hydroliza powietrza za pomocą hydrolaz glikozylu (GHs)

Uwaga: Jak wspomniano w dyskusji, czystość GHs jest krytyczna. Używaj wyłącznie enzymów oczyszczonych z heterologicznie wyrażanych, oczyszczonych z powinowactwa. Po otrzymaniu każdej partii od producenta, hydrolizować określone porcje substratu (np. 500 μg POWIETRZA) z rosnącą ilością GH przez noc (np. 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 μL) (3 jednostki/μL). Gdy występuje nadmiar GH, odcisk palca PACE będzie wyglądał identycznie. Nadmiar enzymu jest niezbędny do uzyskania powtarzalnego wyniku, ponieważ musi być pewien, że reakcja hydrolizy zbliża się do punktu końcowego.

1. Dodać z góry określoną ilość (patrz wyżej) mannanaz (GH5 i GH26¹¹) do podwielokrotności AIR w buforze z kroku 3.5, a także kontrolę dodatnią (30 μg glukomannanu konjac) i kontrolę ujemną bez AIR (mieszanina enzymów w pustej probówce). Wirować, a następnie krótko obracać, aby zebrać mieszaninę reakcyjną na dnie probówki.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (lub w temperaturze odpowiedniej dla wybranego GH) z delikatnym mieszaniem (~100 obr./min).
3. Zatrzymać reakcję przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 20 min.
   Uwaga: Zamknięcia nasadkowe mogą być używane do uszczelniania probówek do mikrofuge typu flip-top.
   1. Odwirować za pomocą laboratoryjnego mikrofugu z maksymalną prędkością przez 10 minut i zachować supernatant.
4. Zawiesić osad w 250 μl_H2O, odwirować jak wyżej i zachować supernatant.
5. Połączyć oba supernatanty i wysuszyć w wirówce próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C (~3 godziny lub przez noc bez ogrzewania).

5. Przygotowanie wzorców oligosacharydów

1. Przygotować 1 mM roztwory podstawowe w H₂O mannozy (Człowiek), mannobiozy (Człowiek₂), mannotriozy (Człowiek₃), mannotetraozy (Człowiek₄), mannopentaozy (Człowiek₅) i mannoheksaozy (Człowiek₆), wszystkie β,1-4 połączone. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
2. Przygotuj 3 różne stężenia mieszaniny Man_1-6, łącząc 1 μl (Standard S1), 2 μl (S2) lub 5 μl (S3) ze wszystkich sześciu.
3. Suszyć w wirówce próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C (~1 h).

6. Pochodna oligosacharydów

1. Przygotować roztwór podstawowy 0,2 M ANTS (kwas 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy) w_H2O:kwasie octowym 17:3. Podgrzej bulion do 60 °C, aby całkowicie rozpuścić ciało stałe. Przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem, przez 2 - 3 miesiące.
2. Przygotować 0,2 M roztwór podstawowy boranu 2-pikolinowego (2-PB) w DMSO. Jest to niezwykle higroskopijne, więc natychmiast po otrzymaniu proszku w DMSO należy ponownie zawiesić. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 - 2 lata. Rozmrozić porcje w zależności od potrzeb (przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie, a następnie wyrzucić).
3. Przygotować bufor do derywatyzacji_H2O: kwasu octowego: DMSO o godzinie 17:3:20.
4. Do każdej próbki dodać 5 μl ANTS, 5 μl 2-PB i 10 μL buforu do derywatyzacji. Krótko zakręć, aby zebrać się na dnie tuby, dokładnie wymieszaj, a następnie ponownie krótko zakręć. Zobacz Rysunek 1 dla opisu reakcji.
5. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
6. Suszyć w wirówce próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C (~2 h).
7. Zawiesić próbki i wzorcować w 100 μl 3 M mocznika. Przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem do czasu, gdy będzie to konieczne.

7. Przygotowanie żeli PACE

Uwaga: Montaż sprzętu do odlewania żelu zależy od marki. W tym przypadku stosujemy pionowy system elektroforezy (patrz Tabela Materiałów), wyposażony w płytki szklane o wymiarach 18 cm x 24 cm i przekładki 1,5 mm.

1. Zmontuj sprzęt do odlewania żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Przygotować 10x bufor PACE (1M Tris-Boran, pH 8,2) w następujący sposób: dodać 121,14 g Tris-Base do ~400 ml H₂O i wymieszać do rozpuszczenia. Doprowadzić pH do 8,2 przez dodanie stałego kwasu borowego (około 60 g), a następnie uzupełnić objętość do 1 l.
3. Przygotować 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS) w H₂O. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności rozmrozić raz, przechowywać w temperaturze 4 °C i wyrzucić po 2 tygodniach.
4. Przygotuj i wlej żel rozdzielczy. W przypadku powyższego sprzętu 1 żel odpowiada 50 ml. W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wymieszaj_H2O(20,2 ml), 5 ml 10x buforu PACE, 24,6 ml 40% akrylamidu/bis-akrylamidu (29:1 akrylamid:Bis). (Uwaga: toksyczny).
   1. Dodać 200 μl APS i 20 μl N,N,N,N'-tetrametylo-etylenodiaminy (TEMED). Delikatnie odwróć, aby wymieszać (aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza). Wlać żel za pomocą pipety serologicznej lub innej pipety o dużej objętości do ~4 cm poniżej górnej części szklanych płytek. Zwróć uwagę na możliwość uwięzienia pęcherzyków powietrza w żelu. Jeśli tak się stanie, przestań nalewać i przechyl/postukaj w żel, aby je uwolnić.
5. Pokryj żel izopropanolem (Uwaga: łatwopalny) lub ostrożnie H₂O. Pozostaw żel do polimeryzacji (20 - 30 minut), a następnie odlej wierzchnią warstwę. Jeśli użyto izopropanolu, przemyć 2x H₂O. Osuszyć nadmiar płynu bibułą.
6. Przygotuj i wlej żel do układania w stosy. Wymieszaj 6,8 ml H₂O, 1 ml 10 x bufor PACE, 2,8 ml akrylamidu/bis-akrylamidu (Uwaga: toksyczny), 80 μl APS i 8 μl TEMED w 15 ml probówce wirówkowej. Odwróć, aby wymieszać i nałożyć na spolimeryzowany żel rozdzielczy. Delikatnie włóż grzebienie, unikając zatrzymywania pęcherzyków powietrza pod zębami grzebienia.
7. Pozostawić żel do polimeryzacji (20-30 min), zawinąć w wilgotną chusteczkę, a następnie w folię spożywczą i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie to potrzebne. Przechowywać z grzebieniami na miejscu.
   Uwaga: Żele PACE można przechowywać maksymalnie 2 tygodnie (chociaż najlepiej krócej niż 1 tydzień), jeśli są wilgotne.

8. Uruchamianie żelu PACE

1. Użyj trwałego markera, aby oznaczyć pozycje studni na szkle, co pomoże w śledzeniu kolejności załadunku i określeniu, gdzie znajdują się studzienki po wyjęciu grzebienia.
2. Wyjmij grzebień. Napełnij studnie 1x buforem PACE.
3. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl załadować 2 μl wzorców i próbek do studzienek. Należy unikać korzystania z najbardziej zewnętrznych pasów, które mają tendencję do słabego prowadzenia próbek.
4. Zmontować górną komorę aparatu do pracy z żelem i umieścić żel w schłodzonym (~10 °C) zbiorniku roboczym (10 °C) zawierającym 1x bufor PACE. Napełnij górną komorę 1x buforem PACE.
5. Włącz zasilanie i uruchom żel pod napięciem 200 V (stałe V) przez 30 minut, a następnie zwiększ napięcie do 1000 V na 1 h 40 min. Chroń żele przed światłem (np. owijając zbiorniki w czarne worki na śmieci).
   Uwaga: Sprawdź na żelach ~5 min po włączeniu napięcia, a następnie kolejne 5 min po zwiększeniu napięcia do 1 000 V. Jeśli zasilacz nie jest w stanie utrzymać napięcia, prawdopodobnie występuje wyciek bufora. Usuń żel ze zbiornika. Zamontuj górną komorę, dokładnie sprawdzając rozmieszczenie wszystkich uszczelek. Duży odprysk na górnej krawędzi szklanej płyty może uniemożliwić dobre uszczelnienie płyty z uszczelką. Problem ten można zwykle tymczasowo rozwiązać, dodając kroplę 5 % (m/v) stopionej agarozy do rozdrobnionej części szkła, przed dodaniem górnej komory.

9. Wizualizacja żelu PACE

Uwaga: Użyj żelowego systemu obrazowania wyposażonego w długofalowe żarówki UV w transiluminatorze i filtr emisyjny dla kamery, który jest odpowiedni dla fluoroforu, tutaj 530 nm. Alternatywnie można również użyć skanera laserowego, zgodnie z opisem w Goubet².

1. Upewnij się, że system obrazowania żelu jest wolny od kurzu, przecierając go wilgotną, niestrzępiącą się chusteczką.
2. Wyjmij żel ze zbiornika PACE i view krótko, gdy żel jest jeszcze w szklanych płytkach (<80 ms), aby ustalić, czy czoło barwnika nadal znajduje się na żelu.
3. Otwórz żel za pomocą narzędzia klinowego i gdy żel nadal znajduje się na jednej szklanej płytce, użyj noża do pizzy, aby usunąć zarówno żel do układania, jak i, jeśli przód barwnika nadal znajduje się na żelu, spód żelu.
4. Umieść ~5 ml H₂O na powierzchni transiluminatora, a następnie przenieś żel bezpośrednio na transiluminator. Ustaw filtr na UV 605 i włącz długofalowy transilluminator UV (patrz Tabela materiałów) za pomocą oprogramowania.
   Uwaga: Zastosowany tutaj fluorofor ANTS ma wzbudzenie/emisję 353/520 nm.
5. Wykonaj kilka zdjęć w różnych czasach naświetlania (np. od 100 ms do 10 s). Upewnij się, że światło UV jest wyłączone między obrazami, klikając przycisk światła UV (aby je wyłączyć), aby uniknąć degradacji fluorescencji. Upewnij się, że co najmniej 2 obrazy nie mają nasyconych pasm (wskaże to oprogramowanie do obrazowania żelowego).
6. Zapisz pliki jako high-resolution.tif images.
   Uwaga: Obrazy można analizować za pomocą oprogramowania dostarczonego z systemem obrazowania żelowego lub za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Zapoznaj się z sekcją Wyniki, aby zapoznać się z omówieniem oceny ilościowej.

Results

Tutaj pokazujemy przykładowy przebieg żelu PACE zgodnie z protokołem, wraz z opisami pomocnymi w interpretacji danych i rozwiązywaniu problemów, a następnie ogólny przewodnik po udanej interpretacji żelu PACE^13,16. Reprezentatywny żel standardowego testu PACE na zawartość mannanu w ścianie komórkowej jest pokazany w Rysunek 2 i jest opisany tor po pasie.

Standardy
Pasy 1, 2 i 3 pokazują drabinę komercyjnie zakupionych oligosacharydów (Man₁- Man₆) o stężeniu pmol 5 (S1), 10 (S2) i 50 (S3). Otrzymując nową partię komercyjnego oligosacharydu, ważne jest, aby sprawdzić czystość żelu. Wiele oligosacharydów, zwłaszcza tetrasacharydów i dłuższych, może być w znacznym stopniu zanieczyszczonych oligosacharydami o innych stopniach polimeryzacji (DP), jak pokazano tutaj dla Man₆ (oznaczonego *). Podczas ilościowego oznaczania żelu ważne jest, aby mieć co najmniej 3 stężenia wzorców, ponieważ jest to niezbędne do obliczenia krzywej wzorcowej. Obliczanie krzywej standardowej może być również pomocne w zapewnieniu, że reakcja derywatyzacji jest zasadniczo na zakończeniu. Wzorce znanych stężeń pozwalają na porównania między żelami i są użyteczną kontrolą jakości separacji i jakości derywatyzacji.

Kontrola pozytywna
Tor 4 pokazuje trawienie glukomannanu konjac przez mannanazę. Glukomannan Konjac jest dostępny w handlu i chociaż nie ma takiej samej struktury, jak na przykład Arabidopsis, służy dwóm celom. Po pierwsze, jest to ważna kontrola trawienia enzymatycznego. Badacz powinien ustalić, jak wygląda komercyjny substrat strawiony za pomocą wybranych przez niego GH, gdy jest trawiony do końca (tj. do reakcji dodaje się ogromny nadmiar GH). Jeśli w przyszłych eksperymentach wzór ulegnie zmianie, może to wskazywać na utratę aktywności lub zanieczyszczenie zapasu GH. Po drugie, służy jako kontrola reakcji derywatyzacji w obecności enzymu i soli buforowych. Jeśli normy wyglądają dobrze, ale kontrola pozytywna jest słaba, może to oznaczać, że składnik reakcji hydrolizy hamuje derywatyzację.

Dziki typ (WT) Arabidopsis łodyga AIR + koktajl mannanasowy (GH5 + GH26)
Tor 5 pokazuje odcisk palca PACE rdzenia WT Arabidopsis (porównaj z odniesieniami^11,14).

csla9 Trzon rzodkiewnika POWIETRZE + koktajl mannazy (GH5 + GH26)
Pokazy na torze 6 pokazują odcisk palca PACE łodygi rośliny Arabidopsis, która nie ma głównej łodygi mannan synthase¹¹. Porównaj z odciskami palców WT i kontroli negatywnej. Podczas gdy większość mannana jest nieobecna w tej roślinie, niewielka ilość pozostaje, o czym świadczy zmniejszona intensywność pasma dla wszystkich oligosacharydów pochodzących z mannanazy Jest to syntetyzowane przez dodatkowe syntazy mannan (CSLA2, 3)¹¹.

Kontrola negatywna - tylko enzym<br /> Ścieżka 8 pokazuje pasma na żelu, które nie są specyficzne, a które pochodzą z zanieczyszczeń w koktajlu mannanazy i powinny być wyłączone z analizy (oznaczone *).

Kontrola negatywna - tylko WT AIR
Tor 9 pokazuje pasma na żelu, które nie są specyficzne i powinny być wyłączone z analizy (oznaczone *).

Kontrola negatywna - tylko csla9 AIR
Tor 10 pokazuje pasma na żelu, które nie są specyficzne i powinny być wyłączone z analizy (oznaczone *).

Powietrze z drewna sosnowego + koktajl mannazy (GH5 + GH26)
Pas 7 pokazuje odcisk palca PACE drewna sosnowego, które zawiera galaktoglukomannan. Ma to wyraźnie inny wzór uwalnianych oligosacharydów niż Arabidopsis, ze względu na swoją inną strukturę.

Kontrola negatywna - tylko sosna AIR
Tor 11 pokazuje pasma na żelu, które nie są specyficzne i powinny być wyłączone z analizy (oznaczone *).

Interpretacja żelu PACE jest stosunkowo prosta, ale wymaga znajomości następujących punktów. Aby uzyskać wiarygodne dane, zaleca się przeprowadzenie PACE na co najmniej 3 niezależnie hodowanych kontrpróbach biologicznych oraz na co najmniej 2 kontrpróbach technicznych na każdej kontrpróbie biologicznej. Opisane kontrole mają kluczowe znaczenie dla interpretacji, ponieważ należy wykluczyć niespecyficzne pasma. Zalecamy również ładowanie próbek w innej kolejności na replikowane żele, aby wykluczyć efekty wynikające z nierównomiernego oświetlenia przez transiluminator. Dokładna interpretacja wymaga analizy pasm, które nie są nasycone. Ponieważ niektóre oligosacharydowe odciski palców mogą zawierać zarówno polisacharydy o bardzo wysokiej, jak i niskiej obfitości, zalecamy analizę wielokrotnej ekspozycji tego samego żelu. Standardy mogą być używane do normalizacji między różnymi obrazami.

Dla niektórych typów eksperymentów może być pożądane ilościowe określenie ilości polisacharydu w preparacie AIR. Chociaż możliwe jest ilościowe określenie na podstawie żelu PACE, wymaga to wiedzy na temat dokładnej tożsamości molekularnej każdego oligosacharydu uwalnianego przez GH i jego lokalizacji w żelu PACE. Obecnie nie jest to w pełni znane dla mannanu, ale zostało to określone dla innych polisacharydów, np. xylan³. Normy zapewniają sposób normalizacji między żelami, nawet gdy nie przeprowadza się oceny ilościowej, a więc pomogą w każdej analizie jakościowej lub półilościowej.

Identyfikacja struktury poszczególnych oligosacharydów może być osiągnięta za pomocą koktajli GH. Sekwencyjne dodawanie kolejnych GH może ujawnić szczegóły dotyczące powiązań i podstawień uwolnionych oligosacharydów (np. dodanie β-1,4-glukozydazy, która działa na nieredukujący koniec, ujawni, które oligosacharydy w mieszaninie zawierają tę cechę). Dostępne enzymy obejmują galaktozydazy, glukuronidazy i glukozydazy (dodatkowe informacje można znaleźć w bazie danych CAZy¹⁶); patrz Hogg, D. i wsp.¹⁷ jako przykład.

Powyższy protokół może być wykorzystany do scharakteryzowania aktywności nieznanych GHs. W takim przypadku zdefiniowana biomasa, taka jak łodyga rzodkiewnika lub glukomannan konjac, powinna być użyta do przesiewania nieznanego GHs¹³.

Rysunek 1: To pokazuje schemat fluorescencyjnej derywatyzacji oligosacharydów za pomocą ANTS. Zmodyfikowano z Goubet². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywny żel PACE przedstawiający odcisk palca mannana od Arabidopsis, sosny i mutanta Arabidopsis (csla9), który zaburzono biosyntezę mannanu. AlR hydrolizowano koktajlem mannanazy, a uwolnione oligosacharydy derywatyzowano fluoroforem. Oligosacharydy oddzielono elektroforezą żelową na podstawie rozmiaru, kształtu i ładunku. Wykazano, że drabina mannooligosacharydów (Man1-6) pomaga w identyfikacji względnej ruchliwości uwolnionych oligosacharydów, a hydroliza oczyszczonego mannanu (pochodzącego z konjac) jest pokazana jako kontrola pozytywna. * = nieokreślone pasma. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

PACE to prosta metoda charakteryzowania struktury polisacharydowej. Może być stosowany do dowolnego polisacharydu, dla którego znane są GH o scharakteryzowanej aktywności, patrz liczne przykłady w literaturze 1,6,9,11. Tt został również zastosowany do charakterystyki nowych GHs 12,13,18 i glikozylotransferaz 9, wykorzystując zdefiniowane substraty polisacharydowe i akceptory.

Powtarzalne, możliwe do zinterpretowania wyniki zależą od trzech kluczowych kroków. Po pierwsze, stosowane GH powinny być wolne od działań zanieczyszczających. Najlepiej osiągnąć to poprzez stosowanie wyłącznie enzymów o ekspresji heterologicznej, oczyszczonych z powinowactwa. Po drugie, w przypadku większości eksperymentów ważne jest, aby hydroliza enzymatyczna substratów była na zakończeniu. Zapewni to, że ta sama biomasa zhydrolizowana tym samym GH da ten sam odcisk palca w każdym eksperymencie. Wreszcie w reakcji derywatyzacji powinien być nadmiar fluoroforu. Gwarantuje to, że dostępne końcówki redukcyjne są oznaczone na poziomie bliskim 100%. Spowoduje to wysoką odtwarzalność wyników, a także danych, które mają charakter ilościowy.

Jakość żelu i odczynnika ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia powtarzalnych danych. Złej jakości, zwłaszcza o nieprawidłowym pH, pęcherzyki powietrza w żelu i próbki z nadmiarem soli mogą wpływać na rozdzielczość i współczynnik retencji oligosacharydów. Jednak uwzględnienie zalecanych kontrolek opisanych w sekcji Protokół i wyniki umożliwi rozwiązywanie problemów.

PACE jest ograniczone ze względu na jego zdolność do identyfikacji oligosacharydów. W przypadku niektórych eksperymentów wystarczy prosty odcisk palca. Jednak, aby naprawdę określić ilościowo ilość glukomannanu w próbce AIR, na przykład, wymagana jest tożsamość wszystkich uwolnionych oligosacharydów, co jest czasochłonnym procesem. Jest to prostsze w przypadku mniej złożonych polisacharydów, takich jak ksylan³. Ze względu na to, że na rynku dostępnych jest niewiele wzorców oligosacharydowych, nie zawsze jest możliwe lub pożądane zidentyfikowanie wszystkich prążków. W tym przypadku PACE może dostarczyć bardzo komplementarnych danych do spektrometrii mas (tj. MALDI-CID⁹ lub ESI-MS⁷ i NMR⁶). W przypadku tych metod często pomocne jest wykonanie preparatu na dużą skalę, oddzielonego chromatografią wykluczania wielkości, a następnie analiza każdej frakcji zarówno za pomocą PACE, jak i przed MS lub NMR. Chociaż donoszono, że prążki mogą być wycinane i identyfikowane za pomocą MALDI-CID, w praktyce stwierdziliśmy, że ma to niski wskaźnik sukcesu (prawdopodobnie z powodu interakcji znakowanych oligosacharydów z żelem akryloamidowym pod wpływem światła UV).

Innym poważnym ograniczeniem PACE jest przepustowość. Aby uzyskać dobrej jakości, interpretowalne żele z odpowiednimi kontrolami, każdy żel będzie miał tylko ~10 próbek eksperymentalnych, a badacz może spodziewać się uruchomienia ~4 żeli PACE dziennie. Ostatnio opracowano wersję PACE wykorzystującą elektroforezę kapilarną (CE)¹⁹, która umożliwia przygotowanie próbek w płytkach 96-dołkowych. Jest z powodzeniem stosowany do charakteryzowania aktywności enzymów glikozylotransferazy i struktur polisacharydowych ^6,19, chociaż wymaga dostępu do maszyny CE, która może być kosztowna w zakupie i utrzymaniu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligosacharydy Standardy
Mannose	Sigma-Aldrich	CAS 3458-28-4
Mannobiose	Megazyme	CAS: 14417-51-7
Mannotrioza	Megazyme	CAS: 28173-52-6
Mannotetraoza	Megazyme	CAS: 51327-76-5
Mannopentaose	Megazyme	CAS: 70281-35-5
Mannhexaose	Megazyme CAS	: 70281-36-6
Glukomannan (Konjac; Niska lepkość)	Megazyme	P-GLCML
Nazwa<	silny>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inne specjalistyczne chemikalia
8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy kwas	sondy molekularne) Thermo	A350
2-pikolinoboran	TCI	B3018
40 % akrylamid/bis-akryloamid (29:1 akrylamid:Bis)	Bio-rad	1610146
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Specjalistyczne wyposażenie
Zestaw do odlewania żelu	Zestaw Hoefer	SE660	płytki szklane 18x24 cm, przekładki 0,75 mm
Chłodząca kąpiel wodna recyrkulacyjna	Hoefer	RCB20-plus 115v	Musi być w stanie utrzymać temperaturę na poziomie ~10 C
G:Box Chemi XRQ System obrazowania	Syngene	05-GBOX-CHEMI-XRQ	Zamów z filtrami odpowiednimi do fluorforu, a transiluminator powinien być wyposażony w długofalowe żarówki UV
Zasilacz wysokonapięciowy	Thermo	EC1000XL	1000V
Wirówka próżniowa(Speedvac)	Savant	SPD131
Pionowy system elektroforezy żelowej	Hoefer	SE660
Hydrolazy glikozylowe
Można je uzyskać od firm np. Megazyme (https://www.megazyme.com/) lub Prozomix (http://www.prozomix.com/) lub można je wyrazić we własnym zakresie, żądając plazmidu z odpowiednich badań grupa.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały laboratoryjne
15 ml Probówka wirówkowa ( Probówki wirówkowe Falcon, polipropylen, sterylne, Corning)	VWR	21008-918
Probówka wirówkowa 50 ml ( Probówki do wirówek Falcon, polipropylen, sterylne, Corning)	VWR	21008-951
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Software
Gel oprogramowanie do obrazowania ( Genesys)	Syngene