Zachowanie podobne do lęku u szczurów testowane przez labirynt na podwyższonym plusie różni się znacznie w zależności od środowiska testowego. Tutaj pokazujemy, jak ustawienia aparatury, zwłaszcza budowa ramienia, wpływają na zachowanie w labiryncie i wyjaśniamy niezawodny protokół wykrywania skutków leków przeciwlękowych. Raport ten przyczyni się do badań nad lękiem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Testowanie lęku u zwierząt u szczurów: wpływ otwartych półek na ramiona i przezroczystości ścian z zamkniętymi ramionami w teście labiryntu Elevated Plus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test podwyższonego labiryntu plus jest testem behawioralnym służącym do oceny lęku zwierząt u gryzoni. Chociaż test ten jest szeroko stosowany w dziedzinie nauk behawioralnych, często z różnych laboratoriów podaje się sprzeczne wyniki. Aby zidentyfikować przyczyny różnych wyników, wcześniej skupiliśmy się na cechach ramion, które różnią się w zależności od laboratorium, w szczególności na obecności/braku półek po bokach otwartych ramion oraz przezroczystości/nieprzezroczystości zamkniętych ścianek ramion. W poprzednim raporcie użyliśmy specjalnie zaprojektowanego pojemnika do porównania zachowania szczurów na różnych kombinacjach projektów otwartych i zamkniętych ramion w identycznych warunkach eksperymentalnych i wykazaliśmy, że różnice w cechach ramion zakłócają wyniki eksperymentalne. Krótko mówiąc, otwarte półki ramion znacznie zwiększyły zachowanie podobne do lęku u szczurów, podczas gdy przezroczyste ramiona mogły również zmniejszyć to zachowanie. Ponadto zweryfikowaliśmy wyższą czułość wykrywania działania leku przeciwlękowego w połączeniu z otwartym ramieniem bez półki + nieprzezroczystym zamkniętym ramieniem w porównaniu z kombinacją otwartego ramienia z półką + przezroczystego zamkniętego ramienia. W tym raporcie przedstawiamy nasz protokół testu podwyższonego labiryntu plus wraz z omówieniem kluczowych wyników z poprzedniego raportu i naszych doświadczeń eksperymentalnych. Wierzymy, że ten raport dostarczy przydatnych informacji dla badaczy, którzy zatrudnili lub planują korzystać z labiryntu elevated plus w swoich badaniach.
Wprowadzenie
Liczba pacjentów cierpiących na zaburzenia nastroju, w tym zaburzenia lękowe i depresję, rośnie. Chociaż rozwój tych zaburzeń obejmuje zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, szczegółowe mechanizmy patogenne nie są jeszcze w pełni poznane1. Dlatego badania muszą koncentrować się na odkryciu mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń nastroju, a także na opracowaniu skutecznych leków, które mają mniej skutków ubocznych.
Testy behawioralne dla zwierząt laboratoryjnych są przydatne do badania wyższych funkcji mózgu, w tym emocji. Ponieważ zachowanie zwierząt jest bardzo zmienne, wyniki eksperymentalne często różnią się między laboratoriami, nawet jeśli użyto identycznego szczepu wsobnego2. W związku z tym naukowcy muszą również zrozumieć podstawowe cechy stosowanych przez nich urządzeń eksperymentalnych, aby zapewnić wiarygodne i precyzyjne wyniki w laboratorium.
Test podwyższonego labiryntu plus został pierwotnie stworzony do badania reaktywności emocjonalnej u gryzoni3,4. Całe urządzenie znajduje się zwykle 500 mm nad podłogą i składa się z dwóch otwartych i dwóch zamkniętych ramion, które tworzą kształt plusa. Pomiary eksploracji ramion (w tym czas trwania i częstotliwość wejść na każde ramię), przebytej odległości i określonych zachowań, takich jak rozciągnięta postawa poddanych zwierząt, są rejestrowane w okresach obserwacyjnych. Za pomocą tych miar lęk zwierząt jest szacowany jako wynik eksperymentalny.
Test labiryntu podwyższonego plus jest używany na całym świecie, ale nie wszystkie laboratoria używają tego samego projektu aparatury5,6, a te różnice mogą wpływać na wyniki eksperymentu. Na przykład różnice obejmują obecność lub brak półek wzdłuż otwartych ramion i/lub użycie przezroczystych lub nieprzezroczystych ścian dla zamkniętych ramion5,6. Półki wzdłuż otwartych ramion i zastosowanie przezroczystych ścian dla zamkniętych ramion zostały opracowane, aby zapobiec wypadaniu zwierząt z aparatu7 i ułatwić obserwacje behawioralne wewnątrz zamkniętych ramion, odpowiednio8,9. Chociaż przeprowadzono pewne badania, w których sprawdzono, w jaki sposób różnice w budowie poszczególnych ramion mogą wpływać na zdolność wykrywania lęku u zwierząt1,2,5,10,11, łączny wpływ otwartych (z/bez krótkiej półki) i zamkniętych (przezroczystych/nieprzezroczystych) cech ramion na zachowanie zwierząt nie został jeszcze zbadany.
W niedawnym raporcie omówiliśmy wpływ tych kombinacji wzorów ramion na zachowanie podobne do lęku u szczurów12. Krótko mówiąc, otwarte półki ramion znacznie zwiększyły zachowanie podobne do lęku u szczurów, podczas gdy przezroczyste ramiona mogły również zmniejszyć to zachowanie. Ponadto zweryfikowaliśmy wyższą czułość wykrywania działania leku przeciwlękowego w połączeniu z otwartym ramieniem bez półki + nieprzezroczystym zamkniętym ramieniem w porównaniu z kombinacją otwartego ramienia z półką + przezroczystego zamkniętego ramienia. W tym raporcie przedstawimy nasz protokół dla testu podwyższonego plus, wraz z omówieniem kluczowych wyników z poprzedniego raportu. Wierzymy, że ten raport dostarczy przydatnych informacji dla tych, którzy zatrudnili lub planują korzystać z labiryntu elevated plus w swoich badaniach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Meiji (IACUC 14-0002(1)). Zwierzęta wykorzystane w reprezentatywnych wynikach przygotowano w następujący sposób: Samce szczurów rasy Sprague-Dawley zakupiono od firmy zajmującej się zwierzętami laboratoryjnymi i trzymano w grupach po 4 zwierzęta w standardowej klatce dla szczurów (W200 × D410 × H250 mm) przez co najmniej tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu behawioralnego. Pomieszczenie w pomieszczeniach dla zwierząt utrzymywano w standardowych warunkach otoczenia dla światła (harmonogram 12:12 jasny/ciemny z włączonymi światłami o godzinie 10:00), temperatura pokojowa (25,0 ± 0,5 °C), wilgotność (55 ± 10%) i wentylacja (10 razy/h), a zwierzęta miały dostęp ad libitum do pożywienia (Oriental Yeast Co. Ltd., Tokio, Japonia) i wody. Zwierzęta były trzymane w standardowej klatce dla szczurów (szer. 410 x gł. 250 x wys. 200 mm, Toyoriko Co., Ltd., Aichi, Japonia) z papierową ściółką (alpha-dri, LSG Corporatin, Tokio, Japonia).
1. Test labiryntu Elevated Plus
- Ustaw urządzenie do labiryntu na podwyższonym poziomie plus w niestandardowym kontenerze (W1,500 × D1,500 × H2,000 mm) (Rysunek 1A) z metalową ramą w kształcie plusa 500 mm nad podłogą, aby podeprzeć ramiona pasa startowego (Rysunek 1B), oświetlenie w suficie kontenera, aby oświetlić powierzchnię labiryntu do wymaganego natężenia światła (Rysunek 1C)) oraz cyfrową kamerę wideo w centralnym suficie, aby umożliwić monitorowanie na żywo testów behawioralnych (Rysunek 1C).
- Zamocuj ramiona (dł. 500 x szer. 100 mm) na ramie w kształcie plusa, a następnie zamocuj kwadratową platformę środkową (szer. 100 x gł. 100 mm) pośrodku czterech ramion ( Rysunek 1D - F).
UWAGA: W naszym laboratorium mamy dwa rodzaje ramion otwartych (dł. 500 x szer. 100 mm) i dwa rodzaje ramion zamkniętych (dł. 500 x szer. 100 x wys. 450 mm) (Rysunek 1D). Zamknięte ramiona mają przezroczyste lub nieprzezroczyste ściany (Rysunek 1D), a otwarte ramiona są zaprojektowane z krótką półką lub bez niej (H5 mm, Rysunek 1E). Kwadratowa platforma centralna (W100 × D100 mm) jest umieszczona w środku czterech ramion (Rysunek 1D - F). Tak więc, następujące cztery kombinacje ramion mogą być przygotowane zgodnie z celem eksperymentalnym: otwarte ramiona z półkami + zamknięte ramiona z przezroczystymi ścianami (Ledges/Transparent), otwarte ramiona z półkami + zamknięte ramiona z nieprzezroczystymi ścianami (Ledges/Opaque), otwarte ramiona bez półek + zamknięte ramiona z przezroczystymi ścianami (No-Ledges/Transparent) oraz otwarte ramiona bez półek + zamknięte ramiona z nieprzezroczystymi ścianami (No-Ledges/Opaque). Powierzchnia pasa startowego ramienia jest, aby umożliwić lepsze śledzenie zwierząt za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy zachowania, jak opisano w sekcji 2, Analiza behawioralna. - Dostosuj natężenie oświetlenia na powierzchni dystalnej części końcowej każdego ramienia i platformy centralnej do około 100 luksów.
- Przed każdym badaniem należy oczyścić całą aparaturę 70% roztworem etanolu i przetrzeć wodą destylowaną.
- Kliknij przycisk "nagrywania" na nagrywarce dysku twardego, aby uruchomić cyfrową kamerę wideo, która zarejestruje zachowanie szczura w celu analizy obrazowania wideo opisanej w Sekcji 2, Analiza behawioralna.
- Umieść zwierzę na centralnej platformie przodem do otwartego ramienia i pozwól na swobodną eksplorację na aparacie przez 5 minut.
- Kliknij przycisk "stop" na nagrywarce dysku twardego, aby zakończyć nagrywanie.
- Policz liczbę kału i oddanych moczu po powrocie badanego zwierzęcia do pomieszczenia dla zwierząt.
- Powtórz od kroku 1.4 do końca eksperymentu.
UWAGA: Przed rozpoczęciem każdego eksperymentu zawsze przeprowadza się próbny przebieg na sucho, aby sprawdzić, czy wszystkie ustawienia eksperymentalne są prawidłowo skonfigurowane, zanim jakiekolwiek zwierzęta doświadczalne zostaną wystawione na warunki doświadczalne. W przeciwnym razie, niektóre zwierzęta, zwłaszcza pierwsze zwierzę, mogą doświadczyć różnych warunków środowiskowych (np. odgłosy prawdopodobnie wywołane przez eksperymentatora podczas manipulacji i/lub sygnały zwierzęce, które mogą zostać pozostawione przez wcześniej badane zwierzę).
UWAGA: Eksperymentatorzy znajdują się w pobliżu pojemnika, gdy badane jest zwierzę. Tak więc, nawet jeśli eksperymentatorzy nie są widoczni, szczur może nadal być w stanie wyczuć ich za pomocą zapachu i/lub dźwięku.
2. Analiza behawioralna
Uwaga: Analiza behawioralna jest wykonywana za pomocą ręcznej obserwacji i automatycznego oprogramowania do analizy.
- Obserwacja ręczna
- Po umieszczeniu zwierzęcia na półce skalnej należy zwrócić uwagę na następujące kwestie: liczbę wejść (wejście na ramię definiuje się jako dowolny przypadek, gdy wszystkie 4 łapy znajdują się na ramieniu), czas spędzony na każdym ramieniu oraz liczbę pozycji rozciągniętych w kierunku otwartego ramienia, podczas cofania się z centralnej platformy w kierunku zamkniętego ramienia.
- Zmierz czas trwania i częstotliwość zachowań zdefiniowanych powyżej za pomocą stopera i policz przez 5 minut, licząc od momentu zamknięcia drzwi kontenera.
- Zautomatyzowana analiza
- Korzystając z dostępnego oprogramowania, zapisz następujące informacje: przebytą odległość, czas spędzony w różnych pozycjach na otwartych ramionach (bliższy, środkowy i dystalny segment od platformy centralnej) oraz analizę minuta po minucie czasu spędzonego na otwartych i zamkniętych ramionach.
- Kliknij przycisk "start" w oprogramowaniu do automatycznej analizy w tym samym czasie, gdy rozpoczyna się obserwacja ręczna (nagrywanie zatrzyma się automatycznie, jeśli ustawiony jest czas nagrywania).
UWAGA: Oprogramowanie do analizy behawioralnej użyte w tym badaniu śledzi zwierzę poprzez jego kontrast z polem tła; Zwierzę, któremu przypisano stały rozmiar, jest identyfikowane jako jaśniejszy obiekt, a ruch jego punktu środkowego może być w ten sposób wykorzystany do śledzenia zwierzęcia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W poprzednim badaniu porównaliśmy połączony wpływ krawędzi ramion otwartych oraz przezroczystości ścian ramion zamkniętych na zachowania eksploracyjne w labiryncie12. Szczury spędzały znacząco mniej czasu w ramionach otwartych bez krawędzi niż w ramionach otwartych z krawędziami (F[1, 60] = 13.49, P = 0.0005) (Rysunek 2A). Podobne wyniki uzyskano w odniesieniu do liczby wejść do ramion otwartych (F[1, 60] = 11.17, P &...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wraz ze wzrostem liczby pacjentów cierpiących na zaburzenia psychiczne, w tym zaburzenia lękowe, ważne jest, aby opracować nowatorskie badania w celu lepszego zrozumienia podstawowego mechanizmu lęku. Aby to osiągnąć, ważna jest również optymalizacja procedur eksperymentalnych. Dlatego, aby poprawić zastosowanie testu podwyższonego plusa labiryntu, wykazaliśmy wpływ cech ramienia na wyniki eksperymentalne na szczurach.
Podwyższony labirynt plus został pierwotnie stworzony w celu badania lęku z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Panu Akihiro Hirano za pomoc w produkcji dostosowanego do potrzeb klienta urządzenia. Autorzy pragną podziękować Panom Kosuke Takahashi i Panu Shingo Nakajimie za ich pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Research on Risk of Chemical Substances, Health and Laboratory Sciences Research Grants, Ministerstwo Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej, Japonia (H25-KAGAKU-IPPANN-003) oraz Research Project Grant A przez Instytut Nauki i Technologii Meiji University, Japonia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dostosowany pojemnik (W1500 i razy; D1500 i razy; H2000 mm) | NA | NA | Ręcznie robione przez pana Akihiro Hirano |
| Oświetlenie | NA | NA | Ręcznie robione przez pana Akihiro Hirano |
| Podwyższone plus aparatura labiryntowa | NA | NA | Ręcznie robione przez pana Akihiro Hirano |
| Cyfrowa kamera wideo | Watec | WAT-250D2 | Każda odpowiednia kamera wideo może być podłączona do nagrywarki z dyskiem twardym w celu nagrywania profili śledzenia. |
| Nagrywarka z dyskiem twardym | TOSHIBA | RD-R200 | Do cyfrowej kamery wideo można podłączyć dowolną odpowiednią nagrywarkę z dyskiem twardym. |
| Szczury Sprague-Dawley | Charles River Laboratories Japan, Inc. | NA | Do badania można użyć dowolnych odpowiednich szczurów |
| Standardowa klatka | szczurów Toyoriko | TP-105 | Każda odpowiednia klatka dla szczurów może być użyta do badania |
| Przyrząd do pomiaru natężenia światła | AS ONE | 1-5818-02 | Każdy odpowiedni przyrząd do pomiaru natężenia światła |
| EthoVision XT wersja 8.0 | Noldus | NA | Każde odpowiednie oprogramowanie do pomiaru zachowania zwierząt |
| Diazepam | Przemysł farmaceutyczny Taiyo | 1124402A2061 | Do badania można użyć dowolnego odpowiedniego leku |
| Tween 80 | Wako Pure Chemical Industries | 9005-65-6 | Do badania można użyć dowolnego odpowiedniego leku |
Bibliografia
- Nestler, E. J. Role of the Brain's Reward Circuitry in Depression: Transcriptional Mechanisms. Int Rev Neurobiol. 124, 151-170 (2015).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284 (5420), 1670-1672 (1999).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 327 (1), 1-5 (1984).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Violle, N., Balandras, F., Le Roux, Y., Desor, D., Schroeder, H. Variations in illumination, closed wall transparency and/or extramaze space influence both baseline anxiety and response to diazepam in the rat elevated plus-maze. Behav Brain Res. 203 (1), 35-42 (2009).
- Hogg, S. A review of the validity and variability of the elevated plus-maze as an animal model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 54 (1), 21-30 (1996).
- Martinez, J. C., Cardenas, F., Lamprea, M., Morato, S. The role of vision and proprioception in the aversion of rats to the open arms of an elevated plus-maze. Behav Processes. 60 (1), 15-26 (2002).
- Anseloni, V. Z., Brandao, M. L. Ethopharmacological analysis of behaviour of rats using variations of the elevated plus-maze. Behav Pharmacol. 8 (6-7), 533-540 (1997).
- Anseloni, V. Z., Motta, V., Lima, G., Brandao, M. L. Behavioral and pharmacological validation of the elevated plus maze constructed with transparent walls. Braz J Med Biol Res. 28 (5), 597-601 (1995).
- Hagenbuch, N., Feldon, J., Yee, B. K. Use of the elevated plus-maze test with opaque or transparent walls in the detection of mouse strain differences and the anxiolytic effects of diazepam. Behav Pharmacol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Fernandes, C., File, S. E. The influence of open arm ledges and maze experience in the elevated plus-maze. Pharmacol Biochem Behav. 54 (1), 31-40 (1996).
- Horii, Y., Kawaguchi, M. Higher detection sensitivity of anxiolytic effects of diazepam by ledge-free open arm with opaque walled closed arm elevated plus maze in male rats. Behav Brain Res. 294, 131-140 (2015).
- Santos, R. O., et al. Evaluation of the effect of acute sibutramine in female rats in the elevated T-maze and elevated plus-maze tests. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 114 (2), 181-187 (2014).
- Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Dev Psychobiol. 52 (8), 731-739 (2010).
- Horii, Y., et al. Male Hatano high-avoidance rats show high avoidance and high anxiety-like behaviors as compared with male low-avoidance rats. Exp Anim. 61 (5), 517-524 (2012).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
- Yang, Y., et al. Behavioral and pharmacological investigation of anxiety and maternal responsiveness of postpartum female rats in a pup elevated plus maze. Behav Brain Res. 292, 414-427 (2015).
- Albani, S. H., et al. Behavior in the elevated plus maze is differentially affected by testing conditions in rats under and over three weeks of age. Front Behav Neurosci. 9, 31(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
